專利名稱：促進靶miRNA生產的兩親肽和調控靶miRNA生產的方法
技術領域：
本發明涉及促進靶miRNA生產的兩親肽和使用該兩親肽調控靶miRNA生產的方法。2.
背景技術：
將編碼的DNA翻譯成蛋白質的RNA被稱為信使RNA(mRNA)，其只占總RNA的2%。 剩下的RNA(98%)為非編碼的RNA。這些不翻譯成蛋白質的RNA被認為是不重要的，并且它們的功能大多也是未知的。然而，已有這種非編碼RNA的重要功能報道，即通過和基因或蛋白質形成復合物，或作為被稱為核糖酶(ribozyme)的酶行使功能。目前，已有這些非編碼RNA通過特異性地與基因或基因產物互相作用的調控功能報道。因此，了解這些非編碼 RNA的不同功能和特征變得更為重要。這種小分子量非編碼RNA被稱為內源小RNA(miRNA) 或核糖開關(riboswitch)，其控制超過2%的所有基因的調控功能。最為公知的非編碼RNA為小RNA(miRNA)，在人類中有大約700中不同的miRNA。 miRNA是一種單鏈的RNA分子，由19 25個核苷酸組成。miRNA產生于內源的發夾狀轉錄本(Bartel,D. P. ,Cell 116 :281-297,2004 ；Kim,V. N.，Mol. Cells. 19 :1-15,2005)。miRNA 互補結合到靶mRNA上，作為轉錄后基因抑制子行使功能，導致翻譯被抑制，并且還降解 mRNA。也有報道認為miRNA可能和癌癥有關。在一些報道中，一些miRNA已經表現出與癌癥的發展或其代謝有關。因此，研究miRNA的功能正被認為是癌癥生物學中新的和重要的領域(Esquela-kerscher，A et al. , Nat. Rev. Cancer 6(4) :259_269，2006)。此夕卜，miRNA 的表達水平在細胞發育和分化過程中變化很大。miRNA在發育系統和疾病狀態中的重要性已經被 miRNA 表達譜圖(profiling)證實(Lu，J. et al. ,Nature 435 :834_838，2005)。研究表明，一種miRNA即let7a-l與肺癌或結腸癌有關，miR16_l與白血病或前列腺癌有關， miR24-l與白血病有關，而且let7a-l通過抑制RAS基因抑制一般的癌癥促進基因因子。至于miR16-l，能通過抑制致癌因子Bcl2抑制癌細胞的生長。因此，發現一種能調控miRNA數量的方法和試劑將會是一種有效目標治療藥物的候選方案(candidate)。總之，我們可以通過抑制引起目標疾病的miRNA和激活抑制疾病的miRNA來促進對疾病的抑制。在體內有兩種酶與miRNA的生產有關。一種被稱為Drosha，為細胞核內的核酸內切酶。第二種為Dicer，為細胞溶質(cytosol)中的核酸內切酶。這兩種酶為RNA水解酶， 無堿基序列的特異性。通過識別用于消化的雙鏈RNA的長度，使它們具有有限的特異性。最初的miRNA (miRNA前體)通過細胞核中的RNaseIII型Drosha酶形成大約70 90個核苷酸長度的莖環結構miRNA前體。然后，miRNA前體進入到細胞溶質，被Dicer酶切成更短的 21 25個核苷酸的miRNA，稱為成熟miRNA。既然miRNA的生產受這兩種酶的調控，因此理解這兩種酶的特異性對于miRNA生產是非常重要目標。如果靶miRNA引起如癌癥那樣的疾病，這兩種酶將可能是用于擴增或減少引起疾病的miRNA的很好靶蛋白。特別地，細胞溶質中加工miRNA的Dicer被認為是重要的靶標，因為它可在細胞溶質中直接與靶mRNA互作。然而，Dicer的問題在于該酶的加工是非特異性的，并且對miRNA前體的堿基序列無選擇性。另一個加工miRNA的酶Drosha具有與底物結合的分子伴侶(chaperon)蛋白質， 因此，有助于使非特異的底物變得更為特異。然而，Dicer具有識別發夾狀底物的莖長度的特異性，而對超過700種其它發夾狀內源底物缺乏特異性識別的能力。在體內，特異性地使 miRNA成熟的調控因子是很關鍵的，但到目前為止還沒有這類調控因子的報道。因此，本發明的發明人對能特異性地結合靶miRNA前體的配體開展了大量的研究，而且該配體有助于通過添加人造元素誘導使對miRNA前體的堿基序列不特異的Dicer 酶產生特異性而生產成熟的miRNA。在研究過程中本發明的發明人已經證實，通過取代在疏水區具有昭丨哚基的色氨酸而構建的兩親肽與靶miRNA前體形成緊密的特異性互作。這種特異性互作促進了 Dicer酶的活性，并特異性地增加了成熟miRNA的生產，由此完成了本發明。發明詳述本發明的一個目的在于提供促進靶miRNA生產的兩親肽和調控靶miRNA生產的方法。為了實現這一目的，本發明提供一種包含一種或多種兩親α螺旋肽的兩親肽文庫，其中，一個所述α螺旋肽含有4 12個Leu (亮氨酸，L)，而且在疏水氨基酸中，一個或多個亮氨酸殘基被Try (色氨酸，W)取代。本發明還提供一種檢測與發夾狀靶miRNA前體特異性結合的兩親肽的方法，該方法包括1)制備兩親肽文庫；2)合成發夾狀靶miRNA前體和作為對照的一種或多種發夾狀非靶miRNA前體；3)混合兩親肽、發夾狀靶miRNA前體或非靶miRNA前體和探針分子后，測定兩親肽結合miRNA前體的結合親和力；以及4)篩選結合靶miRNA前體的結合親和力大于結合非靶miRNA前體的結合親和力的兩親肽。本發明還提供一種檢測與兩親肽特異性地結合的miRNA前體的方法，該方法包括1)制備兩親肽文庫；2)合成待檢測的發夾狀靶miRNA前體和作為對照的一種或多種發夾狀非靶miRNA 前體以篩選所述兩親文庫；3)混合兩親肽、發夾狀靶miRNA前體或非靶miRNA前體和探針分子后，測定miRNA 前體結合兩親肽的結合親和力，以及4)篩選結合兩親肽的結合親和力大于非靶miRNA前體的靶miRNA。本發明還提供一種檢測增加靶miRNA生產的兩親肽的方法，該方法包括1)制備兩親肽文庫；2)培養用兩親肽處理后的細胞系；3)測定細胞系的靶miRNA的表達水平；
4)篩選與未處理對照組相比，增加靶miRNA表達水平的兩親肽。本發明還提供一種促進兩親肽特異的靶miRNA生產的組合物，該靶miRNA用上述方法篩選，所述方法包括作為活性化合物的兩親肽。本發明還提供一種促進兩親肽特異的靶miRNA生產的方法，該靶miRNA用上述方法篩選，所述方法包括給受試者施用兩親肽。本發明還提供一種用于因兩親肽特異的靶miRNA受到抑制引起的疾病的治療藥物或診斷試劑，該靶miRNA用上述方法篩選，所述治療藥物或診斷試劑包括作為活性化合物的兩親肽。本發明還提供制備用于促進兩親肽特異的靶miRNA生產的組合物中兩親肽的應用，該兩親肽用上述方法篩選。本發明還提供制備用于因兩親肽特異的靶miRNA受到抑制引起的疾病的治療藥物或診斷試劑中兩親肽的應用，該兩親肽用上述方法篩選。另外，本發明提供促進靶miRNA 前體體外加工的方法，包括1)體外用miRNA前體處理上述方法篩選的的兩親肽；以及2)使所述兩親肽和靶miRNA前體結合。
從下述的詳細說明并結合所附的附圖，將更加清楚地理解本發明上述和其它目的、特征和其它優點，其中圖1所示為通過M-fold預測的兩種miRNA前體pre-let7a_l (a)和 pre-miR16-l (b)的二級結構視圖。圖2所示為在肽2b、2c或Ie存在下，Dicer將miRNA前體轉化為成熟miRNA的標準化初始反應速率(V。)圖表。圖3所示為在不同濃度的肽2b下，Dicer將miRNA前體轉化為成熟miRNA的標準化初始反應速率(V。)圖表。圖4所示為通過Northern印跡方法測定的在肽2b、2c或Ie存在下生產的成熟 miRNA含量圖表。發明詳述通過下面優選的參考所附附圖的實施方案，將更加清楚地理解本發明的特征和優點。首先應當注意，基于發明人可以恰當地定義術語的概念以最佳地描述其自己的發明的原則，本申請中所使用的術語和詞語應當被解釋成與本發明的技術精神一致的含義或概念。另外，還應當理解，為不對本發明的重要內容產生不必要的混淆，與本發明有關的公知功能和結構的詳述說明將被省略。以下，將對本發明進行更為詳細的說明。本發明提供一種包含一種或多種兩親α螺旋肽的兩親肽文庫，其中，一個所述α 螺旋肽含有4 12個Leu (亮氨酸，L)，而且在疏水氨基酸中，一個或多個亮氨酸殘基被 Try (色氨酸，W)取代。所述兩親肽文庫優選含有一種或多種兩親肽，所述兩親肽的氨基酸序列為一個或兩個疏水氨基酸亮氨酸(L)和親水氨基酸賴氨酸(K)或甘氨酸(G)交替排列，其中兩個賴
6氨酸(K)被兩個色氨酸(T)取代，但不限于此。所述兩親肽文庫優選含有一種或多種肽，所述肽含有一個或多個具有SEQ ID NO 2-SEQ ID NO :9或SEQ ID N0:12_SEQ ID NO :21所示氨基酸序列的肽，更為優選的是，所述肽含有具有一個或多個SEQ ID N0:12-SEQ ID NO :21所示氨基酸序列的肽，最為優選的氨基酸序列如SEQ ID NO 13,16和18所示，但不總是限于此。所述兩親肽文庫優選與發夾狀miRNA前體特異地結合，并通過Dicer酶激活miRNA 前體的加工而誘導產生成熟的miRNA (小RNA)，但不限于此。miRNA 選自下組let-7a_l、miR16_l 和 miR24_l ；但不限于此。為了由賴氨酸(L)、亮氨酸(K)和甘氨酸(G)組成的α螺旋兩親肽制備一種與發夾狀靶miRNA前體特異地結合的肽，所述兩個疏水氨基酸亮氨酸(L)被具有吲哚基并能與 RNA堿基互作的色氨酸(W)取代。構建了篩選文庫(scanning library)(見表1)用于鑒定對于促進強且特異地結合有重要作用的色氨酸位點。通過熒光各向異性方法測定第一代肽對pre-let7a-l和 pre-miR16-l的結合親和力，所述的肽通過將亮氨酸替換成色氨酸而構建(見表2)。結果表明，當兩親肽(SEQ ID NO 1)的1#或14#的亮氨酸被色氨酸取代時，對 miRNA前體的結合親和力顯著提高。每個末端被色氨酸取代的兩親肽增加了對miRNA的結合親和力。然而，對靶miRNA前體結合特異性的增加卻沒有效果(見表3)。因此，含有一個色氨酸取代的兩親肽表現出結合親和力的增加，但并非選擇性維持不變。基于第一代肽，亮氨酸篩選文庫，本發明的發明人構建了第二代肽文庫，含有2個色氨酸取代。為了使兩親肽具有結合親和力和特異性，1位或14位的亮氨酸被色氨酸取代并且中間結構域的6個亮氨酸中的一個被色氨酸取代(表4)。使用熒光各向異性方法測定第二代肽對pre-let7a-l和pre-miR16_l結合親和力，肽沘對pre-let7a_l的結合能力最強。肽2b和2c對pre-miR16-l的結合能力為第一和第二強(表5)。通過解離常數計算出鑒別比，肽2b對pre-let7a-l的結合親和力最強。然而，肽2b對其它發夾狀miRNA前體的結合能力相對較弱，具有較高的鑒別比11。肽加能強且特異地結合pre-miR16-l，鑒別比為2.3。肽2g能強且特異地結合pre-miR124-l，鑒別比為2.3表明了識別的特異性。兩個亮氨酸殘基被色氨酸取代，這種含有兩個色氨酸的肽能與靶miRNA強且特異地互作。為了研究肽2b和肽2c對Dicer酶活性的影響，本發明的發明人在肽2b或2c存在下，通過處理同位素標記的miRNA前體、pre-let7a-l或pre-miR16-l，由反應產物的量測定了初始反應速率。結果表明，和未處理組相比，用肽2b和2c處理的組加速了 Dicer將 miRNA加工成成熟的miRNA。尤其是，當pre-let7a-l和2b互作時，顯著增加了成熟miRNA的生產(見圖幻，表明肽和miRNA前體之間有強且特異的結合。另外，當我們研究成熟miRNA 的生產與肽2b濃度的關系時，在初始反應響應中有取決于2b濃度的改變，而且在濃度大于 IOOnM時反應有一個迅速的增加(見圖3)。為了在細胞水平研究所述肽通過激活Dicer酶活性而增加成熟miRNA生產的效果，本發明的發明人用肽2b或2c處理結腸癌細胞株，通過Northern印跡對成熟miRNA生產的量進行了定量。結果表明，當細胞用所述肽處理后，增加了靶miRNA的生產。當用已被證明對pre-let7a-l有特異性結合親和力的2b處理后，成熟的let7a_l有顯著的增加(見圖4)。這些發現表明，特異地結合到miRNA前體的肽能特異性地誘導成熟靶miRNA的生產。因此，含有兩個色氨酸殘基的所述兩親肽文庫能有效地用于促進靶miRNA的生產。本發明提供一種檢測與發夾狀靶miRNA前體特異性結合的兩親肽的方法，其包括1)制備所述的兩親肽文庫；2)合成發夾狀靶miRNA前體和作為對照的一種或多種發夾狀非靶miRNA前體；3)混合兩親肽、發夾狀靶miRNA前體或非靶miRNA前體和探針分子后，測定所述兩親肽對miRNA前體的結合親和力，以及4)篩選對靶miRNA前體的結合親和力大于對非靶miRNA前體的結合親和力的兩親肽。根據上述的方法，步驟2)中的miRNA前體選自下組pre-let-7a_l、pre-miR16_l 和pre-miRM-1，但不限于此。根據上述的方法，步驟幻中的探針分子為含有熒光并被標簽標記的化合物，其與兩親肽競爭結合發夾狀靶miRNA前體，但不限于此。根據上述的方法，步驟幻中的結合親和力通過使用競爭結合方法的熒光各向異性測定，但不限于此。為了獲得強且選擇性地結合發夾狀靶miRNA前體，本發明的兩親肽含有兩個具吲哚基團的色氨酸殘基，增加了對形成發夾miRNA前體雙螺旋溝(groove)的溝的選擇性。構建的兩親肽表現出對靶miRNA前體的強且特異的結合。特異的結合親和力促進了 Dicer酶的活性并特異地增加了成熟靶miRNA的生產。因此，改變兩親肽的兩親特性將會是一種用于檢測與靶miRNA前體特異性強結合的肽的有用方法。本發明還提供一種檢測與兩親肽特異性結合的miRNA前體的方法，其包括1)制備所述兩親肽文庫；2)合成待檢測的發夾狀靶miRNA前體和作為對照的一種或多種發夾狀非靶miRNA 前體以篩選兩親文庫；3)混合所述兩親肽、發夾狀靶miRNA前體或非靶miRNA前體和探針分子后，測定 miRNA前體結合兩親肽的親和力，以及4)篩選對兩親肽的結合親和力大于非靶miRNA前體的靶miRNA。根據上述的方法，步驟幻中的探針分子為含有熒光并被標簽標記的化合物，其與兩親肽競爭結合發夾狀靶miRNA前體，但不限于此。根據上述的方法，步驟幻中的結合親和力通過使用競爭結合方法的熒光各向異性測定，但不限于此。為了獲得強且選擇性地結合發夾狀靶miRNA前體，本發明的兩親肽含有兩個具吲哚基團的色氨酸殘基，以增加對形成發夾miRNA前體雙螺旋溝(groove)的溝的選擇性。構建的兩親肽表現出對靶miRNA前體的強且特異的結合。特異的結合親和力促進了 Dicer酶的活性并特異地增加了成熟靶miRNA的生產，因此，可用于檢測作為兩親肽目標的miRNA。本發明還提供一種檢測增加靶miRNA生產的兩親肽的方法，其包括1)制備所述兩親肽文庫；2)培養用所述兩親肽處理后的細胞系；
3)測定所述細胞系的靶miRNA的表達水平；4)篩選與未處理對照組相比，促進靶miRNA表達水平的兩親肽。優選的是，兩親肽特異地結合發夾狀小RNA前體(pre-miRNA)，因此，通過激活 Dicer酶促進了成熟小RNA(miRNA)的生產，但不限于此。根據上述的方法，步驟2)中的細胞系優選為結腸癌細胞系，但不限于此。根據上述的方法，步驟3)中的miRNA選自下組pre-let-7a_l、pre-miR16_l和 pre-miRM-1，但不限于此。根據上述的方法，步驟幻中的表達水平為選自下組=Northern印跡、RT-PCR和微陣列，但不限于此。為了獲得強且選擇性地結合發夾狀靶miRNA前體，本發明的兩親肽含有兩個具吲哚基團的色氨酸殘基，以增加對形成發夾miRNA前體雙螺旋溝(groove)的溝的選擇性。構建的兩親肽表現出對靶miRNA前體的強且特異的結合。特異的結合親和力促進了 Dicer酶的活性并特異地增加了成熟靶miRNA的生產。因此，改變兩親肽的兩親特性將會是一種用于檢測強且特異地結合靶miRNA前體的肽的有用方法。此外，本發明提供一種促進兩親肽特異的靶miRNA生產的組合物，其包括作為活性化合物的兩親肽。本發明還提供兩親肽在用于制備促進兩親肽特異的靶miRNA生產的組合物中的應用。miRNA 選自下組let-7a_l、miR16_l 和 miR24_l，但不限于此。本發明的兩親肽被兩個具吲哚基的色氨酸殘基取代，增加了對發夾miRNA前體的雙螺旋溝的選擇性。構建的兩親肽表現出對靶miRNA前體的強且特異的結合，導致促進了 Dicer酶的活性，因此可有效地用于增加成熟靶miRNA的生產。本發明還提供一種增加兩親肽特異的靶miRNA生產的方法，其包括給受試者施用兩親肽。miRNA 選自下組let-7a_l、miR16_l 和 miR24_l，但不限于此。受試者優選為哺乳動物，更為優選的實驗動物包括老鼠、兔子、豚鼠、倉鼠、狗和貓，最為優選的是靈長類，如黑猩猩和大猩猩。本發明的兩親肽被兩個具吲哚基的色氨酸殘基取代，增加了對發夾miRNA前體的雙螺旋溝的選擇性。構建的兩親肽表現出對靶miRNA前體的強且特異的結合，導致促進了 Dicer酶的活性，因此可有效地用于增加成熟靶miRNA的生產。本發明還提供一種用于因兩親肽特異的miRNA受到抑制引起的疾病的治療藥物或診斷試劑，其包括作為活性化合物的兩親肽。本發明那個還提供治療因兩親肽特異的靶miRNA受到抑制引起的疾病的方法，包括給受試者施用兩親肽。本發明還提供兩親肽在制備用于因兩親肽特異的miRNA受到抑制引起的疾病的治療藥物或診斷制劑中的應用。miRNA 選自下組let-7a_l、miR16_l 和 miR24_l，但不限于此。所述疾病為選自下組結腸癌、前列腺癌、睪丸癌、小腸癌、結腸直腸癌、肛門癌、食道癌、胰腺癌、胃癌、腎癌、宮頸癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和白血病，但不限于此。
受試者優選為哺乳動物，更為優選的實驗動物包括老鼠、兔子、豚鼠、倉鼠、狗和貓，最為優選的是靈長類，如黑猩猩和大猩猩。本發明的兩親肽被兩個具吲哚基的色氨酸殘基取代，增加了對發夾miRNA前體的雙螺旋溝的選擇性。構建的兩親肽表現出對靶miRNA前體的強且特異的結合，導致促進了 Dicer酶的活性，因此可有效地用于制備因兩親肽特異的miRNA受到抑制引起的疾病的治療藥物或診斷制劑和治療因兩親肽特異的miRNA受到抑制引起的疾病。所述治療藥物除含有兩親肽外，還可含有一種或多種具有相同或相近的功能的活性化合物。所述治療藥物可包括藥用添加劑，如淀粉、明膠、微晶纖維素、乳脂糖、乳糖、聚維酮、膠態二氧化硅、磷酸鈣、甘露醇、阿拉伯膠、預糊化淀粉、玉米淀粉、纖維素粉、羥丙基纖維素、歐巴代(opadry)、羧基乙酸淀粉鈉、巴西棕櫚、鉛、合成硅酸鋁、硬脂酸、硬脂酸鎂、硬脂酸鋁、硬脂酸鈣、白糖、葡萄糖、山梨醇和滑石。所述藥用添加劑的含量為0.01-90wt%，但不限于此。本發明的藥物組合物可為口服或腸胃給藥的制劑。當將藥物組合物轉化成施用形式時，可使用填料、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑或表面活性劑。口服劑型包括，例如片劑、丸劑、顆粒劑和膠囊劑。固體口服劑型可包括至少一種或多種稀釋劑，如淀粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖或明膠。固體口服劑型還可包括潤滑劑，如硬脂酸鎂和滑石。液體口服劑型可包括懸浮劑、乳劑、糖漿劑和酏劑。這些制劑可包含常規的稀釋劑，例如水和液體石蠟或其它稀釋劑，如吸附劑、著色劑、增味劑、香料和防腐劑。用于腸外給藥的劑型可包括無菌水溶液、非水溶液、懸浮液、乳液、凍干制劑和栓劑。作為非水溶液和懸浮液的溶劑，可使用丙二醇、聚乙二醇、蔬菜油如橄欖油、或可注射的酯如ethyolate。 作為栓劑的基體，可使用Wit印sol、聚乙二醇(MacrogoDJi^ja (Tween)61、可可脂、月桂脂、甘油明膠等。本發明的藥物組合物可以0. 0001 100mg/kg，優選0. 001 10mg/kg的有效劑量對受試者進行施用，每天一至多次。劑量可根據多種因素進行改變，包括年齡、體重、健康狀況、性別和飲食習慣、給藥頻率和途徑、排泄和疾病的嚴重程度。所述治療藥物的給藥途徑可為口服給藥或腸外給藥。該藥物可以常規的藥物組合物形式進行腸外給藥，特別是通過腹腔注射、直腸內注射、皮下注射、靜脈注射、肌肉注射、乳房注射、大腦血管注射或胸內注射。所述治療藥物可單獨使用，或結合其它的治療方法，如手術、放射治療、激素治療、 化療和生物反應調劑物。此外，本發明提供一種促進體外靶miRNA前體加工的方法，其包括1)用根據前述的方法篩選的兩親肽處理體外存在的miRNA前體；以及2)結合兩親肽和靶miRNA前體。根據上述方法，步驟1)中的miRNA前體選自下組pre-let-7a-l、pre-miR16-l和 pre-miRM-1，但不限于此。本發明的兩親肽被兩個具吲哚基的色氨酸殘基取代，增加了對發夾miRNA前體的雙螺旋溝的選擇性。構建的兩親肽表現出對靶miRNA前體的強且特異的結合，導致促進了 Dicer酶的活性，因此可有效地用于增加體外成熟靶miRNA的加工。
10實施例下文中，將參考下述的實施例和試驗例對本發明進行更為詳細的說明。然而，下述的實施例和試驗例僅用于舉例說明，不應以任何方式限制本發明的范圍。實施例1第一代肽的合成通過使用link amide MBHA 樹脂(0. 4 0. 6mmol/g)，以 25 μ mol 的比例，用一般的固相合成方法合成肽。用于合成氨基酸的單體購自NovaBiochem。將肽的N-端乙酰化， 通過配備有337mM的氮氣激光和1. an的飛行管的Auto Flex II MALDI-T0F/T0F質譜儀 (Bruker Daltonics,Germany)測定肽。還通過 Agilent 1100 HPLC(高效液相色譜)分離肽并進行純度測定。具體地，表1 所示的肽 1 用 50mg(32ymol)的 link amide MBHA resin(0. 64mmol/ g)合成。樹脂用二氯甲烷(lml，5min)和二甲基甲酰胺(DMF，lml，5min)進行膨脹，然后， 5min攪拌兩次，用1.5ml的含有20%哌啶的DMF去除Fmoc保護基團。用二氯甲烷(1ml， 5次)，DMF(lml，2次)進行攪拌后進行過濾完全去除哌啶溶液。肽1中，通過將Fmoc保護的單體FmoCGly-0!K48mg，5當量(eq))(苯并三唑-1-基-氧-三-吡啶-磷代六氟磷酸酯，PyB0P，8^ig，5當量)溶于Iml的DMF中，對第一個氨基酸甘氨酸進行吸附，然后添加N， N-二異丙基乙胺(DIPEA，56μl，12當量)。將溶液添加到樹脂中，其中Fmoc保護的樹脂已經去除，通過旋轉攪拌在室溫下反應1小時。通過2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBQ檢測確定反應終點。反應終止后，用二氯甲烷(lml，5次)，DMF(lml，2次)進行攪拌后進行過濾去除溶液。如上所述，重復去除Fmoc和結合氨基酸的步驟，直到吸附最后的一個氨基酸。去除N-端的乙酰化，并將N-羥基苯并三唑(H0Bt，41. 2mg, 10當量)、無水乙酸09 μ 1)溶于 900 μ 1 DMF和100 μ 1的二氯甲烷中。將該溶液添加到樹脂中，室溫下攪拌1小時。為從固相中分離合成的肽，添加1. 5ml的裂解混合液(cleave cocktail) {三氟乙酸，(TFA)/三異丙基甲硅烷(TIS)/水=95 2.5 2.5}，并攪拌2小時。攪拌后，通過過濾去除樹脂， 用三氟乙酸進行洗滌(0.5ml，2次)，收集剩下的肽。氮氣下濃縮產生的溶液，然后用冷的二乙醚和正己烷(v/v = 50/50)沉淀所述肽。13，OOOrpm離心5min，收集丸狀的沉淀物，小心地傾去上清液。丸狀沉淀用IOml的冷的二乙醚和正己烷(v/v = 50/50)離心兩次，傾去溶液洗滌。獲得的丸狀沉淀風干后溶于0.2ml的二甲基亞砜(DMSO)中，用0.45 μ m的注射過濾器過濾后，進行HPLC純化。使用Waters 600HPLC作為固定相，使用XBridge Prep C185ym 0BD (19mmxl50mm, Waters)柱。使用緩沖液A，含0. 1 % TFA的水溶液和緩沖液B， 含有0.1% TFA的CH3CN之間的梯度作為流動相用于分離。在30 35%的梯度B條件下， 收集肽1，將肽凍干制備成白色粉末(4. 8mg，產率8% )。所有其它的肽也按上述的方法制備。肽1和色氨酸替換亮氨酸的肽(Ia-Ih)的氨基酸序列的計算重量和通過 MALDI-T0F質譜分析的實際重量如表1所示。表權利要求
1.包含一種或多種兩親α螺旋肽的兩親肽文庫，其中，一個所述α螺旋肽含有4 12個Leu (亮氨酸，L)，而且在疏水氨基酸中，一個或多個亮氨酸殘基被Try (色氨酸，W)取代。
2.根據權利要求1所述的兩親肽文庫，其中，所述兩親肽文庫包括一種或多種兩親α 螺旋肽，所述兩親α螺旋肽的氨基酸序列為以一個或兩個疏水的亮氨酸(L)和親水的賴氨酸(K)或甘氨酸(G)交替排列，其中兩個賴氨酸(K)被兩個色氨酸(A)取代。
3.根據權利要求1所述的兩親肽文庫，其中，所述兩親肽文庫包括一種或多種兩親α 螺旋肽，所述的兩親α螺旋肽的氨基酸序列如SEQ ID No :2 SEQ ID No :9，或SEQ ID No 12 SEQ ID No 21 所示。
4.一種檢測與發夾狀靶miRNA前體特異性結合的兩親肽的方法，所述方法包括1)制備權利要求1所述的兩親肽文庫；2)合成發夾狀靶miRNA前體和作為對照的一種或多種發夾狀非靶miRNA前體；3)混合所述兩親肽、發夾狀靶miRNA前體或非靶miRNA前體和探針分子后，測定兩親肽對miRNA前體的結合親和力；以及4)篩選對靶miRNA前體的結合親和力大于對發夾狀非靶miRNA前體的結合親和力的兩親肽。
5.一種檢測與兩親肽特異性結合的miRNA前體的方法，該方法包括1)制備權利要求1所述的兩親肽文庫；2)合成待檢測的發夾狀靶miRNA前體和作為對照的一種或多種發夾狀非靶miRNA前體以篩選所述兩親文庫；3)混合所述兩親肽、發夾狀靶miRNA前體或非靶miRNA前體和探針分子后，測定miRNA 前體對兩親肽的結合親和力；以及4)篩選對兩親肽的結合親和力大于非靶miRNA前體的靶miRNA前體。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其中，步驟幻中的miRNA前體選自下組 pre-let_7a_l、pre-miR16_l 禾口 pre-miR24_l0
7.根據權利要求4或5所述的方法，其中，步驟；3)中的探針為一種帶標簽的化合物，所述化合物能與兩親肽競爭結合發夾狀靶miRNA前體。
8.一種檢測增加靶miRNA生產的兩親肽的方法，該方法包括1)制備權利要求1所述的兩親肽文庫；2)培養用所述兩親肽處理后的細胞系；3)測定所述細胞系的靶miRNA的表達水平；以及4)篩選與未處理對照組相比，增加靶miRNA表達水平的兩親肽。
9.根據權利要求8所述的方法，其中，步驟2)中的細胞系為結腸癌細胞系。
10.根據權利要求8所述的方法，其中，步驟3)中的miRNA選自下組let-7a-l、 miR16-l和 miR24-l。
11.根據權利要求8所述的方法，其中，步驟；3)中的表達水平為選自下組Northern印跡、RT-PCR和微陣列。
12.一種用于促進對兩親肽特異的靶miRNA生產的組合物，其包括作為活性組分的根據權利要求4或8所述方法篩選的兩親肽。
13.一種用于促進對兩親肽特異的靶miRNA生產的方法，其包括給受試者施用根據權利要求4或8所述方法篩選的兩親肽。
14.一種用于因對兩親肽特異的miRNA受到抑制引起的疾病的治療藥物或診斷試劑， 其包括作為活性組分的根據權利要求4或8所述方法篩選的兩親肽。
15.根據權利要求14所述的治療藥物或診斷試劑，其中，所述疾病為選自下組結腸癌、前列腺癌、睪丸癌、小腸癌、結腸直腸癌、肛門癌、食道癌、胰腺癌、胃癌、腎癌、宮頸癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和白血病。
16.一種促進體外靶miRNA前體加工的方法，該方法包括1)用體外存在的miRNA前體處理根據權利要求4或8所述方法篩選的兩親肽；以及2)使兩親肽和靶miRNA前體結合。
17.根據權利要求4或8所述方法篩選的兩親肽在制備用于促進對兩親肽特異的靶 miRAN前體生產的組合物中的應用。
18.根據權利要求4或8所述方法篩選的兩親肽在制備用于因對兩親肽特異的靶 miRNA受到抑制引起的疾病的治療藥物或診斷試劑中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種可促進靶miRNA生產的兩親肽和使用該兩親肽調控靶miRNA生產的方法。更為具體的是，本發明的兩親肽與發夾狀靶miRNA特異地強結合。這種特異的結合親和力誘導Dicer酶的活性，從而特異地增加靶miRNA的生產。本發明可有效地用于在體內調控靶miRNA的生產量、用于miRNA的功能研究和用于制備靶miRNA相關疾病的治療藥物。
文檔編號C07K7/00GK102203116SQ200980142222
公開日2011年9月28日 申請日期2009年11月23日 優先權日2009年10月22日
發明者俞載勛, 玄純實, 金納麗 申請人:首爾大學教產學協力團