專利名稱：用于治療豚草變態反應的包含Amb a 1肽的疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于預防或治療對豚草的變態反應的組合物。
背景技術：
T細胞抗原識別需要抗原呈遞細胞(APC)在其細胞表面上呈遞與主要組織相容性復合物(MHC)的分子締合的抗原片段(肽)。T細胞使用其抗原特異性T細胞受體(TCR) 來識別由APC呈遞的抗原片段。這樣的識別作為免疫系統的觸發器起作用來產生一系列應答以根除已被識別的抗原。生物體如人類的免疫系統對外部抗原的識別可在某些情況下造成疾病，其被稱作特應性疾患。后者的實例是變應性疾病，包括哮喘、特應性皮炎和變應性鼻炎。在這一組疾病中，B淋巴細胞產生對外源產生的抗原結合的IgE類抗體(在人類中)，所述抗原在本文稱為變應原，因為這些分子引發變應性應答。變應原特異性IgE的產生依賴于也被變應原活化(并對其有特異性)的T淋巴細胞。借助于諸如嗜堿性細胞和肥大細胞的細胞對IgE 表面受體的表達，變應原特異性的IgE抗體結合到這些細胞表面。變應原對結合在表面的IgE分子的交聯造成這些效應細胞脫粒，導致炎癥介質諸如組胺、5-羥色胺和脂質介質如硫橋白三烯(sulphidoleukotriene)的釋放。除了 IgE依賴性事件，某些變應性疾病諸如哮喘的特征為IgE獨立性事件。目前用提供癥狀緩解或預防的劑來治療IgE介導的變應性疾病。這種劑的實例是抗組胺劑、β 2激動劑和糖皮質類固醇。此外，通過包括變應原成分或提取物的定期注射的去敏化程序來治療一些IgE介導的疾病。去敏化治療可誘導與IgE競爭變應原的IgG應答， 或可誘導阻斷針對變應原的IgE的合成的特定抑制性T細胞。這種形式的治療不是總有效， 并且具有激起嚴重副作用特別是一般變應性休克的風險。這可以是致命的，除非立即意識到并用腎上腺素治療。將減少或消除針對特定變應原的不想要的變應性-免疫應答的、而不改變對其它外來抗原的免疫反應性的、或不觸發本身變應性應答的治療性處理將對變應性個體大有益處。普遍認為，豚草變應原是包括哮喘、變應性鼻炎和變應性皮炎在內的人類和動物變應性疾病的主要原因。豚草花粉中存在的蛋白尤其重要。例如，美國大約75%的枯草熱患者對豚草花粉是變應性的。枯草熱是一種形式的季節性變態反應的統稱，其特征是噴嚏、 流鼻涕和目癢。術語“枯草熱”出現是因為這種形式的變應性疾病在“采干草季節”期間最流行，這對應許多植物的開花季節，此時其釋放最大量的花粉。這從夏末到早秋尤其流行， 尤其是從六月末到九月末(在北半球)。
已計算獲得，對于美國成年人，枯草熱是第5種主要的慢性病，是缺勤的主要原因，導致每年失去或減少近400萬個工作日，造成總生產力損失方面共超過7億美元的損失。變態反應還是最頻繁報告的兒童慢性疾患，限制了多于40%兒童的活動。每年在美國， 變態反應占多于1700萬門診辦公室拜訪；季節性變態反應諸如枯草熱占這些變態反應拜訪的多于一半。因此，治療性或預防性治療對于患有豚草變態反應或處于患豚草變態反應風險中的人們將大有益處。發明概述豚草變態反應通常是由豚草(Ambrosia artemisiifolia)造成的。豚草花粉中的主要變應原是Amb a 1。這種蛋白以大量不同同種型存在，Amb a 1. 1、1. 2、1. 3和1. 4。本發明的發明人已發現，來源于Amb a 1蛋白的肽片段的某些組合對于使個體對這些變應原去敏化特別有用。選擇本發明的多肽組合是由于它們的如下能力結合許多MHC II類分子、高度可溶、不觸發來自從一組豚草變應性個體提取的嗜堿性細胞的組胺釋放、和在一組豚草變應性個體的高比例受治療者中誘導細胞因子應答。因此，可向個體提供本發明的組合物、產物、載體和制劑以通過免疫耐受作用預防或治療對豚草的變態反應。通過計算機模擬方法選擇本發明的肽為可能的T細胞表位。當鑒定包含表位的區域時，進一步分析它們來確定其中哪些在四種不同Ambal同種型之間是高度保守的。然后進一步篩選這些候選多肽在免疫耐受中的潛在用途。更具體地，分析其溶解度特征、和誘導細胞因子從來源于豚草變應性個體的PBMC的釋放能力。在一些情形，改造肽序列以改進溶解度和/或減少二聚體形成。與基于肽免疫的去敏化方法相關的困難在于如何選擇變應原的合適的大小和區域作為用于免疫的肽的基礎。所選擇的肽的大小是關鍵的。如果肽太小，疫苗將不能有效引起免疫應答。如果肽太大，或如果將完整抗原引入個體，則存在引起副作用諸如過敏反應的風險，這可能是致命的。如果肽可溶性差，這種風險可能更大。已經選擇本發明的多肽以保持T細胞特異性，同時所述多肽的尺寸足夠小以不具備將使其保留完整分子的IgE結合表位的構象的顯著三級結構。因此，本發明的多肽不引起細胞諸如肥大細胞和嗜堿性細胞上相鄰的特異性IgE分子的顯著交聯，并已顯示不導致來自人類嗜堿性細胞的顯著組胺釋放。本發明的優勢是肽廣泛地靶向主要組織相容性復合物(MHC)分子的能力。T細胞受體(TCR)在其特異性方面是高度可變的。如同抗體分子一樣，經由細胞中的基因重組事件產生變異性。TCR識別結合到由主要組織相容性復合物(MHC)的基因所編碼的分子的短肽形式的抗原。這些基因產物是產生用于移植中的“組織型”的相同分子，并且還被稱為人類白細胞抗原分子(HLA)，該術語可被互換地使用。單獨的MHC分子具備肽結合溝，由于它們的形狀和電荷，其只能夠結合有限的一組肽。被一個MHC分子結合的肽可能不一定被其它MHC分子結合。當蛋白分子諸如抗原或變應原被抗原呈遞細胞諸如B淋巴細胞、樹突細胞、單核細胞和巨噬細胞吸收時，該分子在細胞中被酶促降解。降解過程產生所述分子的肽片段，如果它們具有合適的大小、電荷和形狀，則可能結合到某些MHC分子的肽結合溝之內，并隨后展示在抗原呈遞細胞表面上。如果肽/MHC復合物以足夠數量呈遞在抗原呈遞細胞表面上，則它們可能活化帶有合適的肽/MHC特異性T細胞受體的T細胞。由于MHC的多態性質，遠系繁殖群體諸如人類中的個體將在其細胞表面上表達不同組合的MHC分子。由于不同MHC分子可基于肽的大小、電荷和形狀而結合來自同一分子的不同肽，不同個體將展示與其MHC分子結合的不同庫的肽。鑒定遠系繁殖群體諸如人類中的通用MHC-結合肽表位比在近親繁殖的動物(諸如實驗小鼠的某些品系)中更困難。基于個體之間MHC的差異表達以及其帶來的肽結合與呈遞的固有差異，不太可能鑒定可用于人類去敏化治療的單種肽。本發明的另一益處是基于在豚草變應性個體新鮮分離的PBMC中觀察的應答來選擇肽和肽組合。不同于其中為了檢驗T細胞應答而從變應性患者建立克隆細胞系的人造情況，評價新鮮分離的PBMC的先體外后體內應答允許代表性地觀察不同肽的相對群體重要性而沒有培養過程引起的可能的變形。然而，本發明的肽組合通過靶向多種不同MHC分子而提供對人類群體覆蓋面廣泛的效力。這種廣泛的覆蓋面由本發明的肽組合在群體的許多個體中導致陽性細胞因子應答的能力來闡釋。因此，以本發明的肽配制的疫苗將具有廣泛的應用。本發明人的工作產生了具有以下特征的肽組合-該組合在來自一組豚草變應性個體的高比例受治療者中誘導細胞因子應答；-組合中的肽是可溶的；-組合中的肽在一組豚草變應性個體中不引起顯著的組胺釋放。因此，本發明提供用于通過免疫耐受作用預防或治療對豚草的變態反應的組合物，所述組合物包括選自SEQ ID NO 1至31的至少一種多肽。通常，該組合物包括至少四種多肽，其中所述多肽獨立地選自以下任一種(i)SEQ ID NO 1 至 31 的多肽；或(ii)根據⑴的多肽的變體，其中所述變體是長度為9至30個氨基酸的多肽，所述多肽包含由以下組成的區域-⑴的任何序列；或-與(i)的任何序列具有至少65%同源性的序列，該序列能夠使得個體免疫耐受(i)的任何序列；或(iii)根據⑴的多肽的變體，其中所述變體是長度為9至30個氨基酸的多肽，所述多肽包含由表示以下任一個的序列組成的區域-(i)的任何序列的片段；或-(i)的任何序列的片段的同系物，該序列能夠使得個體免疫耐受(i)的任何序列并具有至少9個氨基酸的長度，而且其中所述同系物與(i)的任何序列中任何9個連續氨基酸具有至少65%的同源性。附圖簡述
圖1顯示由IL-13或IFN-Y的產生測量的對本發明的不同肽組合應答的個體百分比。圖2顯示以本發明的不同肽刺激來自豚草變應性個體的PBMC時IL-10的平均產生量(pg/ml)。圖3顯示以不同肽組合刺激來自豚草變應性個體的PBMC時產生IL-10的水平(pg/ml) ο本文提及的序列的描述SEQ ID NO :1至31提供本發明的多肽序列。SEQ ID NO 32及其后提供另外的序列。發明詳述本發明涉及可用于免疫耐受作用的肽和肽組合。這樣的肽可包括以下顯示的序列、由以下顯示的序列組成或基本上由以下顯示的序列組成SEQ ID NO 1至31的任一個。 還可使用這些特定肽的變體。所述變體可包括以下序列、由以下序列組成或基本上由以下序列組成所述序列是SEQ ID NO 1至31任一個的片段或SEQ ID NO 1至31任一個的同系物的片段。在一個實施方案中，本發明涉及用于預防或治療對豚草的變態反應的組合物。組合物通常包括至少四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種、十一種或十二種、最多達十三種多肽，或由其組成。換言之，組合物包括四種至十三種多肽。多肽獨立地選自以下任一種(i)SEQ ID NO 1 至 31 的多肽；或(ii)根據⑴的多肽的變體，其中所述變體是長度為9至30個氨基酸的多肽，所述多肽包含由以下組成的區域-⑴的任何序列；或-與(i)的任何序列具有至少65%同源性的序列，該序列能夠使得個體免疫耐受 (i)的任何序列，或(iii)根據⑴的多肽的變體，其中所述變體是長度為9至30個氨基酸的多肽，所述多肽包含由表示以下任一個的序列組成的區域-(i)的任何序列的片段；或-(i)的任何序列的片段的同系物，該序列能夠使得個體免疫耐受(i)的任何序列并具有至少9個氨基酸的長度，而且其中所述同系物與(i)的任何序列中任何9個連續氨基酸具有至少65%的同源性。本發明還提供包括本發明的多肽的產物和制劑，以及組合物、產物和載體，所述組合物、產物和載體包括能夠表達用于通過免疫耐受作用預防或治療豚草變態反應的本發明的多肽的多核苷酸。這種免疫耐受作用通常將是針對存在于SEQ ID NO 1至31任一個中的表位(例如II類MHC表位)。豚草物種豚草物種豚草(Ambrosia artemisiifolia) (common ragweed)和在較低程度上的三裂葉豚草(Ambrosia trifida) (giant ragweed)在全世界造成高比例的豚草變態反應， 尤其是豚草花粉相伴的變態反應，諸如枯草熱。豚草是北美土生的，但已擴散到全世界的大多數大陸。在北半球，豚草從七月初至八月中開花，或直到更冷的天氣到來。豚草是一種先鋒植物，充分適應于開拓新的受影響的土地。盡管在自然生境中它通常被與其它植物的競爭限制，但在人類清除了現有植被的地方，豚草很快變得廣泛和侵略性地建立。因此，豚草沿著鄉村路邊、柵欄線、荒地地帶、新挖掘地、耕地、花園、和疏于修剪的草坪極為豐富。如此，其充分適應于寬范圍的氣候，能夠耐受寬的土壤PH范圍(從約4. 5至約8. 5)，還耐受高鹽度。豚草花粉變應原的肽片段豚草花粉中的主要變應原是Amb a 1。這種蛋白以大量不同同種型Amb a 1.1、 1. 2、1. 3和1. 4存在。這些同種型在實施例1中全部列出。本發明的發明人已經鑒定出Amb a 1中的區域，其包含結合MHC II類的T細胞表位，并在各同種型之間高度保守(參見實施例1的分析)。基于這一信息，來源于Amb a 1相關區域的肽適于通過免疫耐受作用預防或治療對Amb a 1所有同種型的豚草變態反應。術語“肽”和“多肽”在本文互換地使用。以上蛋白在本文還稱為“變應原”。表3、4和6列出本發明的肽的序列，其中適當地指出了每種肽所衍生自的親本蛋白。肽組合組合物通常包括本發明的至少三種、最多達十三種不同多肽的組合。因此，本發明的組合物可由三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種、十一種、十二種或十三種肽組成。選擇本發明的組合物中的多肽組合以提供對人類群體盡可能廣泛的覆蓋面，即， 本發明的組合物將在高比例的豚草變應性個體中，優選地一組或一群這樣的個體中多于 30 %、40 %、45 %、50 %、60 %或70 %的豚草變應性個體中產生免疫應答。豚草變應性個體的群體中的個體數目可以是任何適當的數目，通常為至少20、30、40、50、60、70、80或至少100 個個體。優選地該群體具有在白種人群體中有代表性的頻率范圍內的MHC等位基因頻率。 11個常見DRBl等位基因家族的參考群體等位基因頻率顯示在表1中(數據來自HLAFacts Book (HLA 事件簿)，Parham 和 Barber))。本發明的組合物通常包括-選自RGWOl、RGWOlA或RGWOlB的多肽的至少一種多肽，或其變體；禾口-選自RGW03、RGW03A或RGWOiBB的多肽的至少一種多肽，或其變體；和-選自RGW04或RGW04A的多肽的至少一種多肽，或其變體。任選地，組合物可另外包括選自RGW02、RGW09、RGW06 或 RGW06A、RGfflO, RGW10A、 RGW05或RGW05A的任何多肽的至少一種另外的多肽，或其變體。任選地，組合物可另外包括選自RGW07、RGW07C、RGW07D的任何多肽的至少一種另外的多肽，或其變體。所述至少一種另外的多肽優選地是RGW07D的多肽，或其變體。更具體地，在一個實施方案中，本發明因此提供包括三種至十三種多肽的組合物， 該多肽由以下組成a) RGffOURGffOlA或RGWOlB的多肽的至少一種，或其變體，優選地RGWOl ；和b) RGW03、RGW03A或RGWOiBB的多肽的至少一種，或其變體，優選地RGWOiBB ；和c) RGW04或RGW04A的任何多肽的至少一種，或其變體，優選地RGW04A ；和任選地d) RGW02、RGW09、RGW06、RGW06A、RGfflO, RGW10A、RGW05 或 RGW05A 的任何多Jft 的至少一種，優選兩種，最優選三種，或其變體，優選地RGW02和/或RGW06A和/或RGW05 ；和任選地e) RGW07、RGW07C、RGW07D的任何多肽的至少一種，或其變體，優選地RGW07D。換言之，本發明的一個具體的實施方案提供用于通過免疫耐受作用來預防或治療豚草變態反應的包括三種至十三種肽序列的組合物，其中該組合物由以下組成a)至少一種具有以下序列的多肽RGffOl GMIKSNDGPPI ；RGffOlA GLIKSHDGPPV ；RGffOlB GLIKSNDGPAA ；或其變體，和；b)至少一種具有以下序列的多肽RGW03 KDLLENGAIFVTSG ；RGW03A DVFENGAIFVPSG ；RGW03B RDLLENGAIFLPSG ；或其變體，和；c)至少一種具有以下序列的多肽RGW04 KAGMIPAEPGEA ；RGW4A SAGMIPAEPGEA ；或其變體，和任選地；d)至少一種具有以下序列的多肽RGW02 GSSQIWIDHSSLSKS ；RGW04 KAGMIPAEPGEA ；RGW4A SAGMIPAEPGEA ；RGW06 VVNSDKTIDGRGVKVE ；RGW06A AINNDKTIDGRGAKVE ；RGW09 ETRRSLKTSGAYN ；RGfflO FGFFQVVNNNYD ；RGfflOA HGFFQVVNNNYD ；RGW05 KEGTLRFAAAQNRP ；RGW05A KEGTLRFGAAQNRP ；或其變體，和任選地；e)至少一種具有以下序列的多肽RGW07 GEAAIKLTSSAGVLS ；RGW07C KGEAAIKLTSSAGVLSK ；RGW07D KGEAAIKLTSSAGVLSKK ；或其變體。將理解的是，以上的(a)到(e)代表用于鑒定本發明的合適組合的嚴格性和高度選擇性標準。例如，如果想要從本發明序列隨機地選擇六種肽，將有將近100萬個可能組合可以選擇。相比之下，考慮在其中應用上述標準的六種多肽的組合的一種實例是有用的。例如，考慮一種組合，其中選擇以下多肽i) RGffOU RGffOlA 或 RGWOlB 的多肽的任何一種，和 RGW03、RGW03A 或 RGW03B 的多肽的任何一種，和RGW04與RGW04A的多肽的任何一種；和ii)選自 RGW02、RGW09、RGW06、RGW06A、RGWlO、RGW10A、RGW05 或 RGW05A 的任何多肽的三種另外多肽；以及最后基于這樣的選擇，可能的組合的數目占不應用本發明人確定的標準的情況下總的可得組合的極小部分。基于上述，本發明特別優選的組合包括RGW01、RGW03B、RGW04A、RGW02、RGW05和 RGW06A的多肽或其變體，或者由其組成。進一步的優選組合包括RGWOl、RGW03B、RGW04A、RGW02、RGW05、RGW06A 和 RGW07D
的多肽，或者由其組成。取決于上述，組合物可任選地包括另外的多肽，最多總共十三種獨特多肽。這些另外的多肽與其它序列相關(即，通常是所述其他序列的同系物和/或片段)，其中所述其他序列即不在已經選擇的多肽中的SEQ ID N0:1至31。另外的肽通常是SEQ ID NO 1至31 的肽之一的功能變體。另外的多肽可以與SEQ ID NO :1至31任一個相同。因此，組合物可包括多達十三種不同的、SEQ ID NO :1至31中任一個提供的多肽。然而，任選的另外的多肽不必與SEQ ID NO :1至31任一個100%相同。它們優選地與未在此前選擇的多肽中選擇的SEQ ID NO :1至31任一個中至少9個(例如至少10、11、12或13)或更多個連續氨基酸至少65%相同。這些連續的氨基酸可包括例如結合于本文提及的任何MHC分子的II類 MHC表位。換言之，該組合物可任選地包括另外的多肽，最多總共十三種獨特多肽，其中所述另外的多肽(i)包括與在以上(a)至(e)中未被選擇的以上SEQ ID NO 1至31任一個中至少9個或更多個連續氨基酸具有至少65%的序列同一性的序列；并且(ii)長度是9至30個氨基酸。其中每種不同多肽是為了同時、分別或順序地用于通過免疫耐受作用預防或治療豚草變態反應。因此更具體地，為了同時、分別或順序地用于通過免疫耐受作用預防或治療豚草變態反應，本發明提供含有如以上(a)至(e)定義的三種至十三種多肽的產物；和任選地(f) 一種多肽:(i)所述多肽包含與在以上a)至d)中未被選擇的SEQ ID NO 1至31任一個中至少9個或更多個連續氨基酸具有至少65%序列同一性的序列；并且(ii)長度是9至30個氨基酸；和任選地(g)如f)中定義，但另外地在以上f)中未被選擇的多肽；和任選地(h)如f)中定義，但另外地在以上f)至g)中未被選擇的多肽；和任選地(i)如f)中定義，但另外地在以上f)至h)中未被選擇的多肽；和任選地(j)如f)中定義，但另外地在以上f)至i)中未被選擇的多肽；和任選地(k)如f)中定義，但另外地在以上f)至j)中未被選擇的多肽；和任選地(1)如f)中定義，但另外地在以上f)至k)中未被選擇的多肽；和任選地(m)如f)中定義，但另外地在以上f)至1)中未被選擇的多肽；和任選地(η)如f)中定義，但另外地在以上f)至m)中未被選擇的多肽；和任選地(ο)如f)中定義，但另外地在以上f)至η)中未被選擇的多肽；和任選地(ρ)如f)中定義，但另外地在以上f)至ο)中未被選擇的多肽。本發明的另一實施方案是用于通過免疫耐受作用預防或治療對豚草的變態反應的、包括一種或多種多肽的組合物，其中所述多肽選自以下任一種(i)SEQ ID NO 1至31的任何多肽；或(ii)根據⑴的多肽的變體，其中所述變體是長度為9至30個氨基酸的多肽，所述多肽包含由以下組成的區域-⑴的任何序列；或-與(i)的任何序列具有至少65%同源性的序列，該序列能夠使得個體免疫耐受 (i)的任何序列，或(iii)根據⑴的多肽的變體，其中所述變體是長度為9至30個氨基酸的多肽，所述多肽包含由表示以下任一個的序列組成的區域-⑴的任何序列的片段；或-⑴的任何序列的片段的同系物，該序列能夠使得個體免疫耐受(i)的任何序列并具有至少9個氨基酸的長度，而且其中所述同系物與(i)的任何序列中任何9個連續氨基酸具有至少65%的同源性。本發明的組合物或產物可包括以上定義的任何序列的變體。所述變體通常包括 SEQ ID NO 1至31的相應肽中存在的1、2、3或更多個II類MHC表位。本文提及了功能變體。這樣的變體可能能夠使個體免疫耐受SEQ ID N0:1至31 的相應肽中存在的II類MHC表位，并因此通常將包括如下序列其結合到相同II類MHC分子和/或被識別SEQ ID NO :1至31的多肽中相應的表位的T細胞所識別。SEQ ID NO 1至31的變體可以是由截短所衍生的片段。截短是指從SEQ ID NO. 1 至31的多肽的N和/或C-末端除去一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、 十個或更多個氨基酸。還可通過一個或多個內部缺失來產生片段，條件是構成T細胞表位的核心9個氨基酸基本未被破壞。例如，SEQ ID NO 1的變體可包括SEQ ID NO 1的片段，即較短的序列。這可包括從SEQ ID NO :1的N-末端或從SEQ ID NO 1的C-末端缺失一個、兩個、三個、四個、五個、 六個、七個、八個、九個、十個或更多個氨基酸。這樣的缺失可從SEQ ID NO :1的兩端進行。 SEQ ID NO 1的變體可包括延伸超出SEQ ID NO 1的末端的另外的氨基酸(例如來自衍生肽的親本蛋白的序列)。變體可包括以上討論的缺失和添加的組合。例如，可從SEQ ID NO 1的一端缺失氨基酸，但可在SEQ ID NO :1的另一端添加來自全長親本蛋白序列的另外的氨基酸。以上變體的相同討論還適用于SEQ ID N0:2至31。SEQ ID NO 20的優選變體是肽 KKGEAAIKLTSSAGVLSK。變體肽可包括SEQ ID NO 1至31任一個或其片段的氨基酸序列中的一個或多個氨基酸取代。變體肽可包括與SEQ ID NO :1至31任一個中至少9個或更多個連續氨基酸具有至少65%序列同一性的序列。更優選地，合適的變體可包括與SEQ ID NO :1至31任一個的至少9個連續氨基酸至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 % 或至少98%的氨基酸同一性。這一水平的氨基酸同一性可見于肽的任何區段，盡管它優選地是核心區域。氨基酸同一性的水平是至少9個連續氨基酸的范圍內，但它可以是至少10、 11、12、13、14、15或至少16或17個氨基酸，這取決于比較的肽的大小。因此，任何以上指明的同一性水平可跨越序列的完整長度。
關于氨基酸序列，“序列同一性”是指當使用ClustalW(Thompson等人，Nucleic Acids Res. 1994 Nov 11 ；22 (22) :4673-80)用以下參數評價時具有指定值的序列成對的比對參數-方法準確，矩陣PAM，缺口開放罰分10. 00，缺口延伸罰分0. 10 ；多比對參數-矩陣PAM，缺口開放罰分10. 00，延遲百分比同一性30，處罰末端缺口 開，缺口間距0，負矩陣不，缺口延伸罰分0. 20，殘基特異性缺口罰分開，親水缺口罰分開，親水殘基GPSNDQEKR。在特定殘基的序列同一性意在包括僅僅被衍生化的相同殘基。變體肽可包括SEQ ID NO :1至31任一個中的1、2、3、4、5或更多個或者多達10個氨基酸取代。取代變體優選地包括用相同數目的氨基酸代替一個或多個氨基酸并進行保守的氨基酸取代。例如，氨基酸可被具有相似特征的替代性氨基酸取代，例如，另一堿性氨基酸、另一酸性氨基酸、另一中性氨基酸、另一帶電荷氨基酸、另一親水氨基酸、另一疏水氨基酸、另一極性氨基酸、另一芳香族氨基酸或另一脂肪族氨基酸。可用于選擇合適的取代基的 20種主要氨基酸的一些特征如下
權利要求
1.一種用于通過免疫耐受作用預防或治療對豚草的變態反應的組合物，該組合物包括(i)選自RGW03B、RGW03A或RGW03(SEQID NO. 9、8或7)的至少一種原始多肽或其變體；(ii)選自RGWO1、RGWOIA或RGWOlB(SEQ ID NO. 1、2或3)的至少一種原始多肽或其變體；iii)選自RGW04或RGW04A(SEQ ID No :10或11)的至少一種原始多肽或其變體；禾口 (iv)任選地，獨立地選自SEQ ID NO. 4-6和12-31的任一種的一種或多種原始多肽或其變體；其中所述變體是(a)長度為9至20個氨基酸的多肽，所述多肽包含由以下所組成的區域 -等效的原始肽序列；或-與等效的原始肽序列具有至少65%同源性的同源序列，所述序列能夠使得個體免疫耐受所述等效的原始肽序列，或(b)長度為9至20個氨基酸的多肽，所述多肽包含由表示以下任一個的序列所組成的區域-等效的原始肽序列的片段；或 -等效的原始肽序列的片段的同系物，所述序列能夠使得個體免疫耐受所述等效的原始肽序列并具有至少9個氨基酸的長度，而且其中所述同系物與所述等效的原始肽序列中任何9個連續氨基酸具有至少65%的同源性。
2.根據權利要求1所述的組合物，其中所述組合物a)能夠使得一組豚草變應性個體的群體中至少50%或至少60%免疫耐受；和/或b)包括至少一種另外的多肽，最多總共十三種獨特的/不同的多肽，其中所述另外的多肽-包含與以上SEQ ID NO :1至31中任一個的至少9個或更多個連續氨基酸具有至少 65%的序列同一性、在⑴至(iv)中未被選擇的序列；且 -長度是9至30個氨基酸；和/或c)包括最多達十三種多肽。
3.根據權利要求1或2所述的組合物，所述組合物包括至少一種根據權利要求2(b)的多肽，所述多肽長度是9至20或13至17個氨基酸，和/或其中所述多肽與SEQ ID NO=I 至31中任一個的至少9個或更多個連續氨基酸具有至少70%的序列同一性。
4.根據前述權利要求任一項所述的組合物，所述組合物包括多肽RGWOl或權利要求 1(a)或(b)定義的其變體；多肽RGWOiBB或權利要求1(a)或(b)定義的其變體；和多肽 RGW04A或權利要求1 (a)或(b)定義的其變體。
5.根據前述權利要求任一項所述的組合物，所述組合物包括選自RGW02、RGW09、 RGW06、RGW06A、RGW10 或 RGW10A、RGW05 或 RGW05A 的多肽(SEQ ID NO. 4、26、14、15、27、12 或 13)、或權利要求1(a)或(b)定義的其變體的至少一種多肽；任選地還包括RGW07、RGW07C 或RGW07D的多肽(SEQ ID NO. 16、19或20)、或權利要求1 (a)或(b)定義的其變體。
6.根據前述權利要求任一項所述的組合物，所述組合物包括RGWOl或權利要求1(a)或 (b)定義的其變體；RGWOiBB或權利要求1 (a)或(b)定義的其變體；RGW04A或權利要求1 (a) 或(b)定義的其變體；RGW02或權利要求1 (a)或(b)定義的其變體；RGW05或權利要求1 (a) 或(b)定義的其變體；RGW06A或權利要求1 (a)或(b)定義的其變體；和RGW07D或權利要求1(a)或(b)定義的其變體。
7.根據前述權利要求任一項所述的組合物，其中(i)所述多肽中的一種或多種具有選自以下的一種或多種修飾(a)N末端乙酰化；(b)C末端酰胺化；(c)精氨酸和/或賴氨酸側鏈胺上的一個或多個氫被亞甲基代替；(d)糖基化；和(e)磷酸化；和/或( )所述肽的至少一種已被改造為可溶以使其包含(a)在T細胞表位側翼的所述肽的殘基的N末端一個至六個連續氨基酸，它們與衍生所述肽的蛋白序列中所述殘基的N末端緊接的兩個至六個連續氨基酸相對應；和/或(b)在T細胞表位側翼的所述肽的殘基的C末端一個至六個連續氨基酸，它們與衍生所述肽的蛋白序列中所述殘基的C末端緊接的一個至六個連續氨基酸相對應；或(c)在T細胞表位側翼的所述肽的殘基的N末端和/或C末端，選自精氨酸、賴氨酸、組氨酸、谷氨酸和天冬氨酸的至少一個氨基酸，其中所述多肽具有至少3. 5mg/ml的溶解度，而且所述T細胞表位具有少于3. 5mg/ml 的溶解度；和/或(iii)所述肽的至少一種已被改造為可溶以使另外地(a)所述肽的天然序列中的任何半胱氨酸殘基被絲氨酸或2-氨基丁酸代替；和/或(b)缺失了在所述肽的天然序列的N末端和/或C末端的最多三個氨基酸中、不包含在 T細胞表位中的任何疏水殘基；和/或(c)缺失了在所述肽的天然序列的N末端和/或C末端的最多四個氨基酸中包含序列 Asp-Gly的、不包含在T細胞表位中的任何兩個連續氨基酸；和/或(iv)每種多肽具有在0. 03nmol/ml 至 200nmol/ml、0. 3nmol/ml 至 200nmol/ml 或 30nmol/ml至120nmol/ml的范圍內的濃度。
8.一種用于通過免疫耐受作用預防或治療對豚草的變態反應的組合物，所述組合物包括至少三種多核苷酸序列，所述多核苷酸序列在被表達時導致權利要求1至7任一項定義的組合物的產生，其中任選地，能夠表達不同多肽的每種多核苷酸序列存在于相同或不同的多核苷酸載體中。
9.一種用于通過免疫耐受作用預防或治療對豚草的變態反應的載體，所述載體包括各自編碼權利要求1或2定義的不同多肽的三種到十三種不同的多核苷酸序列，其中至少一種多核苷酸編碼選自以下多肽組的每一組的多肽a)RGWOl、RGWOIA 或 RGWOlB (SEQ ID N0:l、2 或 3)或權利要求 1 (a)或(b)定義的其變體；b)RGW0;3B、RGW03A或 RGW03(SEQ ID N0:9、8 或 7)或權利要求 1 (a)或(b)定義的其變體；和c)RGW04或RGW04A(SEQ ID NO :10或11)或權利要求1 (a)或(b)定義的其變體。
10.一種包括三種到十三種多肽的產物，其中至少一種多肽選自以下多肽組的每一組a)RGWOl、RGWOIA或 RGWOlB(SEQ ID N0:l、2 或 3)或權利要求 1 (a)或(b)定義的其變體；b)RGW0;3B、RGW03A或 RGW03(SEQ ID N0:9、8 或 7)或權利要求 1 (a)或(b)定義的其變體；和c)RGW04或RGW04A(SEQ ID NO :10或11)或權利要求1 (a)或(b)定義的其變體；其中每種不同多肽是為了同時、分別或順序地用于通過免疫耐受作用預防或治療對豚草的變態反應。
11.一種包括各自編碼權利要求1或2定義的不同多肽的三種到十三種多核苷酸序列的產物，其中至少一種多核苷酸編碼選自以下多肽組的每一組的多肽a)RGWOl、RGWOIA或 RGWOlB(SEQ ID N0:l、2 或 3)或權利要求 1 (a)或(b)定義的其變體；b)RGW0;3B、RGW03A或 RGW03(SEQ ID N0:9、8 或 7)或權利要求 1 (a)或(b)定義的其變體；和c)RGW04或RGW04A(SEQ ID NO :10或11)或權利要求1 (a)或(b)定義的其變體； 而且其中每種不同多肽是為了同時、分別或順序地用于預防或治療人類對豚草的變態反應。
12.一種用于通過免疫耐受作用預防或治療對豚草的變態反應的藥物制劑，所述藥物制劑包括根據權利要求1至8任一項的組合物；根據權利要求9的載體；或根據權利要求 10或11的產物；和藥學上可接受的運載體或稀釋劑；其中任選地，所述組合物、載體或產物被配制為用于口服施用、鼻內施用、表皮施用、皮下施用、舌下施用、皮內施用、口腔施用或用于通過吸入或通過注射施用。
13.如權利要求1至8任一項定義的組合物或如權利要求10或11定義的產物，所述組合物或產物另外地包括另外的多肽變應原，用于使得個體免疫耐受所述另外的多肽變應原。
14.一種確定T細胞是否識別權利要求1定義的組合物的體外方法，所述方法包括將所述T細胞與所述組合物接觸并檢測所述T細胞是否被所述組合物刺激。
15.一種確定個體是否患有疾患或處于疾患風險中的體外方法，其中所述疾患以應答于豚草變應原的變應性癥狀為特征，所述方法包括測試個體是否具有對權利要求1至18任一項定義的組合物應答的T細胞，從而確定所述個體是否患有疾患或處于疾患風險中；其中任選地，針對所述組合物的T細胞免疫應答通過如下來測量在允許所述組合物與所述T細胞相互作用的條件下將所述組合物與從受治療者獲取的樣品中的T細胞接觸； 并確定是否有任何T細胞被刺激了，從而確定是否存在T細胞免疫應答。
全文摘要
本發明涉及用于通過免疫耐受作用預防或治療對豚草的變態反應的組合物。所述組合物是基于來源于豚草花粉中主要變應原Amb a 1的肽片段的組合。本發明還涉及可用于聯合提供本發明多肽的產物、載體和制劑。本發明還涉及確定T細胞是否識別本發明多肽的體外方法，和確定個體是否患有疾患或處于疾患風險中的體外方法，其中所述疾患以應答于豚草變應原的變應性癥狀為特征。
文檔編號C07K7/08GK102170897SQ200980139316
公開日2011年8月31日 申請日期2009年8月14日 優先權日2008年8月15日
發明者保羅·萊德勒, 羅德里克·彼得·哈夫納, 馬克·拉爾什 申請人:切爾卡西亞有限公司