專利名稱：進行激活素-ActRIIa拮抗劑給藥和監測受治療患者的方法
進行激活素-ActRI Ia拮抗劑給藥和監測受治療患者的方
法相關申請
本申請要求2008年6月沈日提交的美國臨時申請號61/133，354的權益，該申請的說 明書在此通過全文引用并入本文。
背景技術：
轉化生長因子-β (TGF-β)超家族包含多種生長因子，它們具有共同的序列元件和結 構基序。已知這些蛋白在脊椎動物和無脊椎動物中對多種細胞類型施加生物作用。該超家 族的成員在胚胎發育過程中在模式形成和組織特化方面行使重要功能，并且能夠影響多種 分化過程，包括脂肪生成、肌發生、軟骨發生、心臟生成、血細胞生成、神經發生和上皮細胞 分化。該家族分成兩大分支BMP/GDF和TGF-β/激活素/BMPlO分支，其成員具有多樣的， 通常互補的作用。通過操縱TGF-β家族成員的活性，通常可以導致生物中的顯著生理學改 變。例如，皮埃蒙特和比利時藍牛品種攜帶⑶F8(也稱作肌肉抑制素(myostatin))基因中的 功能喪失突變，其導致肌肉量的顯著增加。Grobet等人，NatGenet. 1997，17(1) :71-4. 此外，在人類中，GDF8的無活性等位基因與增加的肌肉量相關，并且，據報道，與優越的強度 相關。Schuelke 等人，N Engl J Med 2004，350:2682-8。通過激動或拮抗由合適的TGF-β家族成員介導的信號傳導，可以實現肌肉、骨、 軟骨和其它組織中的改變。本公開內容的一個目的是提供用于給患者施用TGF-β超家族 的調節劑的替代方法。發明_既述
本公開內容部分涉及給患者施用激活素拮抗劑以及ActRIIa拮抗劑(統稱為“激活 素-ActRIIa拮抗劑”)的方法，考慮到所述拮抗劑可以對多種組織，包括紅細胞所具有的 作用，施用的方式是適當的。本公開內容部分證明了激活素-ActRIIa拮抗劑可以提高紅 細胞和血紅蛋白水平并且也增加骨密度。這種雙重作用在具有貧血和骨丟失這兩者的患 者，例如很多癌患者(其中貧血和骨丟失可以是腫瘤的后果或放療或化療的后果)、骨質疏 松患者和腎功能衰竭患者中特別有利。具體地，本公開內容證明了 ActRIIa的可溶形式充 當激活素的抑制劑，并且當體內施用時，提高紅細胞水平。盡管可溶性ActRIIa可以通過 除激活素拮抗作用之外的機制影響紅細胞水平，但本公開內容證明了可以基于激活素拮抗 作用或ActRIIa拮抗作用或這兩者選擇期望的治療劑。所述藥劑統稱為激活素-ActRIIa 拮抗劑。如本文和公開的專利申請 W0/2009/038745, W0/2008/100384, W0/2008/094708, W0/2008/076437, W0/2007/062188 和 W0/2006/012627 中描述的，激活素-ActRIIa 拮抗劑 也具有多種其它的治療用途，包括，例如，促進骨生長、降低FSH水平、治療多發性骨髓瘤和 治療乳腺癌。在某些情況下，當施用激活素-ActRIIa拮抗劑來促進骨生長或治療乳腺癌 時，可能期望在施用激活素-ActRIIa拮抗劑的過程中監測對紅細胞的作用，或確定或調整 激活素-ActRIIa的給藥，從而減少對紅細胞的不希望的作用。例如，紅細胞水平、血紅蛋白 水平或血細胞比容水平的過度升高可能導致血壓升高或其它不希望的副作用。也可能期望 限制對具有合適的血液學參數的患者進行激活素-ActRIIa激動劑的給藥。例如，可能期望僅僅將給藥限于血紅蛋白水平低于正常值(例如，低于12 g/dL、低于11 g/dL、低于10 g/dL 或低于9 g/dL或更低)的那些患者。因此，在某些實施方案中，本公開內容提供了管理已經用激活素-ActRIIa拮抗劑 治療過的患者，或作為用激活素-ActRIIa拮抗劑治療的候選者的患者的方法，所述激活 素-ActRIIa拮抗劑包括例如結合激活素的ActRIIa多肽、抗激活素抗體、抗ActRIIa抗體、 靶向激活素或ActRIIa的小分子和適體，以及減少激活素或ActRIIa表達的核酸，所述方法 是通過在患者中監測一種或多種與紅細胞水平升高相關的血液學參數，諸如，例如紅細胞 水平、血壓或鐵儲存(iron stores)而進行的。在某些方面，本公開內容提供多肽，包括與激活素結合的可溶性、結合激活素的 ActRIIa多肽。可將ActRIIa多肽配制成包含該結合激活素的ActRIIa多肽和藥學可接受 的載體的藥物制劑。該結合激活素的ActRIIa多肽可以小于1微摩爾或小于100、10或1 納摩爾的Kd與激活素結合。任選地，相對于⑶Fll和/或⑶F8，該結合激活素的ActRIIa 多肽選擇性地結合激活素，并任選地以比結合⑶Fll和/或⑶F8的Kd至少低10倍、20倍 或50倍的Kd結合激活素。盡管不希望受到特定作用機制的束縛，預期ActRIIa-Fc中這種 激活素抑制相對于GDF11/GDF8抑制的選擇性程度解釋了對骨或紅細胞生成的作用，而對 肌肉沒有一致可測的作用。在許多實施方案中，將選擇ActRIIa多肽，從而在達到對紅細胞 水平的理想作用的劑量下，引起肌肉中小于15%、小于10%或小于5%的增長。在其它實施 方案中，對肌肉的作用是可接受的，并且不需要針對其進行選擇。如通過大小排阻層析所 評估的，該組合物相對于其它多肽成分可具有至少95%的純度，任選地，該組合物具有至少 98%的純度。用于此類制劑的結合激活素的ActRIIa多肽可以是本文公開的那些多肽的任 意種，例如具有(即，包含)選自SEQ ID NOs: 2、3、7、12或13的氨基酸序列的多肽，或具有 (即，包含)與選自SEQ ID NOs: 2、3、7、12或13的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、 97%或99%同一性的氨基酸序列的多肽。結合激活素的ActRIIa多肽可包含天然ActRIIa 多肽的功能性片段，例如包含選自SEQ ID NOs: 1-3的序列或SEQ ID NO: 2的序列的至少 10,20或30個氨基酸，缺乏C-末端10至15個氨基酸(“尾”)的功能性片段。可溶性、結合激活素的ActRIIa多肽可包括相對天然存在的ActRIIa多肽在氨基 酸序列(例如，在配體結合域)中的一個或多個改變。分別在WO 2006/0U627的第59-60頁 和55-58頁(通過引用并入本文)和美國專利序列號12/012,652 (通過引用并入本文)中提 供了改變的ActRIIa多肽的實例。氨基酸序列中的改變可以例如，當在哺乳動物、昆蟲或其 它真核細胞中產生時改變多肽的糖基化，或者相對于天然存在的ActRIIa多肽改變多肽的 蛋白酶剪切。結合激活素的ActRIIa多肽可以是融合蛋白，其具有作為一個結構域的ActRIIa 多肽(例如，ActRIIa的配體結合部分)和提供理想特性(例如改善的藥代動力學、更容易的 純化、對特定組織的靶向等)的一個或多個其它結構域。例如，融合蛋白的結構域可增強 以下一項或多項體內穩定性、體內半衰期、攝取/施用、組織定位或分布、蛋白復合物的形 成、融合蛋白的多聚化和/或純化。結合激活素的ActRIIa融合蛋白可包含提供理想特性 (例如改善的藥代動力學、改善的溶解度或改善的穩定性)的免疫球蛋白Fc結構域(野生型 或突變體)或血清白蛋白或其它多肽部分。在優選的實施方式中，ActRIIa-Fc融合體包含 位于Fc結構域和胞外ActRIIa結構域之間的相對非結構化的接頭。該非結構化的接頭可以是相對不含二級結構的、1、2、3、4或5個氨基酸的人工序列或長度在5到15、20、30、50或更 多氨基酸之間的人工序列，或者兩者的混合物。接頭可富含甘氨酸和脯氨酸殘基，并可以例 如，含有蘇氨酸/絲氨酸和甘氨酸的單序列或蘇氨酸/絲氨酸和甘氨酸的重復序列(例如， TG4(SEQ ID NO: 15) ^ SG4(SEQ ID NO: 16)單序列或重復序列)。融合蛋白可包含純化子 序列(subsequence)，例如表位標記、FLAG標記、聚組氨酸序列和GST融合體。任選地，可溶 性ActRIIa多肽包含選自如下的一種或多種修飾的氨基酸殘基糖基化氨基酸、聚乙二醇 化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸、與脂質部分綴合的氨基酸以 及與有機衍生劑綴合的氨基酸。藥物制劑還可包含一種或多種額外化合物，例如用于治療 骨病癥的化合物或用于治療貧血的化合物。優選地，藥物制劑基本不含熱原。一般而言，優 選在哺乳動物細胞系中表達ActRIIa蛋白，該細胞系合適地介導ActRIIa蛋白的天然糖基 化，從而減少患者中的不利免疫應答的可能性。人和CHO細胞系已被成功使用，預期其它常 見的哺乳動物表達系統將是有用的。如本文所述的，ActRIIa蛋白是指具有理想特性的ActRIIa-Fc，所述特性包括在 動物模型和人患者中相對GDF8和/或GDF11，對激活素的選擇性結合、高親和力配體結合和 大于兩周的血清半衰期。在某些實施方式中，本發明提供ActRIIa-Fc多肽和包含此類多肽 和藥學可接受的賦形劑的藥物制劑。在某些方面，本公開內容提供編碼可溶性的結合激活素的ActRIIa多肽的核 酸。分離的多核苷酸可包含例如上文所述的可溶性、結合激活素的ActRIIa多肽的編碼序 列。例如，分離的核酸可包含編碼ActRIIa的胞外域(例如，配體結合域)的序列以及編碼 ActRIIa的部分或全部跨膜結構域和/或胞質域的序列(除定位在該跨膜結構域或胞質域 中或定位在該胞外域與該跨膜結構域或胞質域之間的終止密碼子)。例如，分離的多核苷酸 可包含全長ActRIIa多核苷酸序列，例如，SEQ ID NO: 4，或ActRIIa的部分截短的形式， 例如包含SEQ ID NO: 5的核酸序列的核酸，其對應于ActRIIa的胞外域。所述分離的多核 苷酸可以進一步包含在3’-末端之前至少六百個核苷酸處或其它位置的轉錄終止密碼子， 從而使該多核苷酸的翻譯產生任選地融合至全長ActRIIa的截短部分的胞外域。優選的 ActRIIa的核酸序列為SEQ ID NO: 14。本文公開的核酸可以可操作地連接至啟動子從而 進行表達，且本公開內容提供用此類重組多核苷酸轉化的細胞。所述細胞優選為哺乳動物 細胞，例如CHO細胞。在某些方面，本公開內容提供制備可溶性、結合激活素的ActRIIa多肽的方法。所 述方法可包括在合適的細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或人細胞中表達本文公開的任 意核酸(例如，SEQ ID NO: 4、5或14)。此類方法可包括a)在適于表達所述可溶性ActRIIa 多肽的條件下培養細胞，其中用可溶性ActRIIa表達構建體轉化所述細胞；和b)回收如此 表達的可溶性ActRIIa多肽。可溶性ActRIIa多肽可作為粗制的、部分純化的或高度純化 的級分回收。可通過一系列純化步驟實現純化，所述純化步驟包括例如，任意順序的如下步 驟中的一個、兩個或三個或更多個蛋白A層析、陰離子交換層析(例如Q瓊脂糖)、疏水作用 層析(例如苯基瓊脂糖)、大小排阻層析以及陽離子交換層析。可溶性ActRIIa可以配制為 液體或固體(如凍干的)形式。在某些方面，本公開內容提供了對患者進行激活素-ActRIIa拮抗劑給藥的方法， 該方法包括以選定的量和間隔對患者進行給藥，從而減少導致在兩周內血紅蛋白水平的升高大于0. 5 g/dL、l g/dl或1· 5 g/dL的風險。在某些方面，本公開內容提供了給患者施用ActRIIa-Fc融合蛋白的方法，該方法 包括以不高于每60天一次、每90天一次或每120天一次的頻率施用ActRIIa融合蛋白。在 某些實施方案中，患者可以是需要骨生長的患者或患有乳腺癌或多發性骨髓瘤或有發展乳 腺癌或多發性骨髓瘤的風險的患者，或需要具有降低的FSH的患者。附圖簡述
圖1顯示了在CHO細胞中表達的ActRIIa-hFc的純化。所述蛋白純化為單一的、充分 確定的峰，其通過大小區分柱(sizing column)(左圖)和考馬斯染色的SDS-PAGE (右圖) 顯現(左泳道分子量標準；右泳道ACtRIIa-hFC)。圖2顯示了通過BiaCore 測定而測量的ActRIIa-hFc與激活素及⑶F-11的結
口 O圖3顯示了 ActRIIa-hFc對雌性非人靈長動物的紅細胞計數的作用。在第0天、 第7天、第14天和第21天用安慰劑或1 mg/kgUO mg/kg或30 mg/kg的ActRIIa-hFc治 療雌性獼猴(四組，每組五只猴)。圖3A顯示紅細胞(RBC)計數。圖:3B顯示血紅蛋白水平。 統計學顯著性是相對于每個治療組的基線。在第57天，每個組保留兩只猴。圖4顯示了 ActRIIa-hFc對雄性非人靈長動物的紅細胞計數的作用。在第0天、 第7天、第14天和第21天用安慰劑或1 mg/kg、10 mg/kg或30 mg/kg的ActRIIa-hFc治 療雄性獼猴(四組，每組五只猴)。圖4A顯示紅細胞(RBC)計數。圖4B顯示血紅蛋白水平。 統計學顯著性是相對于每個治療組的基線。在第57天，每個組保留兩只猴。圖5顯示了 ActRIIa-hFc對雌性非人靈長動物的網織紅細胞計數的作用。在第0 天、第7天、第14天和第21天用安慰劑或1 mg/kg、10 mg/kg或30 mg/kg的ActRIIa-hFc 治療獼猴(四組，每組五只猴)。圖5A顯示絕對網織紅細胞計數。圖5B顯示網織紅細胞相對 于RBC的百分比。統計學顯著性是相對于每個組的基線。在第57天，每個組保留兩只猴。圖6顯示了 ActRIIa-hFc對雌性非人靈長動物的網織紅細胞計數的作用。在第0 天、第7天、第14天和第21天用安慰劑或1 mg/kg、10 mg/kg或30 mg/kg的ActRIIa-hFc 治療獼猴(四組，每組五只猴)。圖6A顯示絕對網織紅細胞計數。圖6B顯示網織紅細胞相對 于RBC的百分比。統計學顯著性是相對于每個組的基線。在第57天，每個組保留兩只猴。圖7顯示了實施例5中描述的人類臨床試驗所得的結果，其中曲線下面積(AUC) 和ActRIIa-hFc的施用劑量具有線性關系，而與ActRIIa-hFc是通過靜脈內(IV)施用還是 皮下(SC)施用無關。圖8顯示了 IV或SC施用的患者中的ActRIIa-hFc血清水平的比較。圖9顯示了反應于不同劑量水平的ActRIIa-hFc的骨堿性磷酸酶(BAP)水平。BAP 是合成代謝骨生長的標志。圖10描繪了從實施例5所述人臨床試驗的血細胞比容水平基線的中值改變。 ActRIIa-hFc以所示的劑量靜脈內(IV)施用。圖11描繪了從實施例5所述人臨床試驗的血紅蛋白水平基線的中值改變。 ActRIIa-hFc以所示的劑量靜脈內(IV)施用。圖12描繪了從實施例5所述人臨床試驗的RBC (紅細胞)計數基線的中值改變。 ActRIIa-hFc以所示的劑量靜脈內(IV)施用。
圖13描繪了從實施例5所述人臨床試驗的網織紅細胞計數基線的中值改變。 ActRIIa-hFc以所示的劑量靜脈內(IV)施用。圖14顯示了具有本文推測的殘基的人ActRIIA和ActRIIB的比對，所述推測是基 于用方框表示的、直接接觸配體的多個ActRIIB和ActRIIA晶體結構(配體結合袋)的復合 分析。圖15顯示化療誘導的貧血的小鼠模型中ActRIIA-mFc對血細胞比容的作用。數 據是平均值士 SEM。*，在同一時間點與載體相比P < 0.05。在化療前單劑ActRIIA-mFc 防止了原本會在施用化療劑紫杉醇后觀察到的血細胞比容水平的下降。圖16顯示化療誘導的貧血的小鼠模型中ActRIIA-mFc對血細胞比容的劑量依賴 性作用。數據是平均值士 SEM。#，在同一時間點與載體相比P < 0.01; *#，在同一時 間點與載體相比P < 0.001。在施用紫杉醇2周后，ActRIIA-mFc治療提高了血細胞比容水 平，該提高是劑數的函數。圖17顯示慢性腎疾病的部分腎切除的(NEPHX)小鼠模型中ActRIIA-mFc對血細 胞比容的作用。數據是平均值士 SEM。*，在同一時間點與載體相比P < 0.05。ActRIIA-mFc 治療防止了原本會在4周時觀察到的血細胞比容水平的下降，并且在8周時產生了血細胞 比容的有益趨勢。發明詳述 1. ■
轉化生長因子-β (TGF-β)超家族包含多種生長因子，它們具有共同的序列元件和 結構基序。已知這些蛋白在脊椎動物和無脊椎動物中對多種細胞類型施加生物作用。該超 家族的成員在胚胎發育過程中在模式形成和組織特化方面行使重要功能，并且能夠影響多 種分化過程，包括脂肪生成、肌發生、軟骨發生、心臟生成、血細胞生成、神經發生和上皮細 胞分化。該家族分成兩大分支BMP/GDF和TGF- β /激活素/BMPlO分支，其成員具有多樣 的，通常互補的作用。通過操縱TGF-β家族成員的活性，通常可以導致生物中的顯著生理 學改變。例如，皮埃蒙特和比利時藍牛品種攜帶GDF8 (也稱作肌肉抑制素)基因中的功能 喪失突變，其導致肌肉量的顯著增加。Grobet等人，NatGenet. 1997，17(1):71_4。此 外，在人類中，GDF8的無活性等位基因與增加的肌肉量相關，并且，據報道，與優越的強度相 關。Schuelke 等人，N Engl J Med 2004，350:2682-8。激活素是二聚多肽生長因子，其屬于TGF-β超家族。存在三種主要的激活素 形式(Α，B和ΑΒ)，其為兩種密切相關的β亞基的同/異二聚體(分別為βΑβΑ，βΒβΒ和 βΑβΒ)。人基因組還編碼激活素C和激活素Ε，它們主要在肝中表達，同樣已知包括i3c 或β e的異二聚體形式。在TGF-β超家族中，激活素是獨特的和多功能的因子，它能刺激 卵巢和胎盤細胞中的激素生成，支持神經元細胞存活，根據細胞類型正面或負面影響細胞 周期進程，并至少在兩棲動物胚胎中誘導中胚層的分化(DePaolo等人，1991，Proc Soc Ep Biol Med. 198:500-512 ;Dyson等人，1997，Curr Biol. 7:81-84 ；Woodruff, 1998,Biochem Pharmacol. 55:953-963)。此外，業已發現從刺激后的人單核細胞白血病細胞中分離的紅 細胞分化因子(EDF)與激活素A相同(Murata等人，1988，PNAS，85 2434)。業已表明激活 素A促進骨髓中的紅細胞生成。在一些組織中，激活素信號傳導被它的相關異二聚體，即抑 制素所拮抗。例如，在從腦垂體釋放促卵泡激素(FSH)的過程中，激活素促進FSH分泌和合成，而抑制素阻止FSH的分泌和合成。其它可調節激活素生物活性和/或結合激活素的蛋 白包括促濾泡素抑制素(FS)、促濾泡素抑制素相關蛋白(FSRP)和α 2-巨球蛋白。TGF-β信號由I型和II型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體的異聚復合物介導，該復合 物在受到配體刺激時磷酸化和激活下游Smad蛋白(Massagu6，2000，Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 :169-178)。這些I型和II型受體為跨膜蛋白，由具有富含半胱氨酸的區域的結 合配體的胞外域、跨膜結構域、具有預測的絲氨酸/蘇氨酸特異性的胞質域所組成。I型受 體為信號傳導所必需；在結合配體和I型受體的表達中需要II型受體。I和II型激活素 受體在配體結合后形成穩定的復合物，導致I型受體被II型受體磷酸化。兩種相關的II型受體(ActRlDJPActRIlE^PActRnb已被鑒定為激活素的 II 型受體(Mathews 和 Vale，1991，Cell 65973-982 ;Attisano 等人，1992，Cell 68: 97-108)。除了激活素外，ActRIIa和ActRnb能夠與一些其它的TGF-β家族蛋白(包括 BMP7、Nodal、GDF8 和 GDF11)進行生物化學相互作用(Yamashita 等人，1995，J. Cell Biol. 130:217-226 ;Lee 和 McPherron，2001 , Proc. Natl. Acad. Sci. 98:9306-9311 ；Yeo 和 Whitman, 2001 ,Mol. Cell 7: 949-957 ;0h 等人，2002，Genes Dev. 16:2749-54)。ALK4 是 激活素(特別是激活素Α)的主要的I型受體，而ALK-7也可作為激活素(特別是激活素B) 的受體。如本文所證實，相對其它TGF-b家族成員(例如⑶F8或⑶Fl 1)顯示與激活素A的 結合的實質優先性的可溶性ActRIIa多肽(sActRIIa)能夠有效提高體內紅細胞水平。盡 管不希望受限于任何具體機理，考慮到在這些研究中所用的具體sActRIIa構建體所顯示 的極強激活素結合(皮摩爾解離常數)，預期sActRIIa的作用主要由激活素拮抗劑作用所引 起。不考慮機理，從本公開內容可顯而易見地看出=ActRIIa-激活素拮抗劑提高了嚙齒動 物、猴和人的紅細胞水平。應指出血細胞生成是一種復雜的過程，它受到多種因素的調節， 包括促紅細胞生成素、G-CSF和鐵的體內穩態。術語“提高紅細胞水平”和“促進紅細胞形 成”指臨床可觀察的度量，例如血細胞比容、紅細胞計數和血紅蛋白測量值，其意在對于發 生該種改變的機理是中立的。本文報道的關于非人類靈長動物的數據也可在小鼠、大鼠和人中重復，因此，本公 開內容提供了采用ActRII多肽和其它激活素-ActRII拮抗劑在從嚙齒動物到人的哺乳動 物中促進紅細胞生成和提高紅細胞水平的方法。除了刺激紅細胞水平，激活素-ActRIIa拮抗劑也可以用于多種治療應用，包括， 例如，促進骨生長(參見PCT公開號W02007/062188，其通過全文引用并入本文)，并且治療 乳腺癌(參見PCT申請號PCT/US2008/001429，其通過全文引用并入本文)。在某些情況下， 當為了增加骨或治療乳腺癌的目的而施用激活素-ActRIIa拮抗劑時，可能期望減少或最 小化或監測對紅細胞的作用。在一些情況下，對紅細胞和骨或其它組織的雙重作用將是期 望的，但是通常認識到藥物促進的紅細胞的增加，即使最高達到通常認為是正常的水平，也 可能對患者有不利影響，因此通常小心監測或管理。通過監測正在用激活素-ActRIIa拮抗 劑治療的患者或作為用激活素-ActRIIa拮抗劑治療的候選者的患者的多種血液學參數， 可以基于個體患者的需要、基線血液學參數和治療目的確定合適的劑量(包括施用的量和 頻率)。此外，通過促進患者護理、確定合適的維持劑量(量和頻率)等，隨時間的治療進程和 對一種或多種血液學參數的影響可能對于管理正在進行激活素-ActRIIa拮抗劑給藥的患者是有用的。激活素-ActRIIa拮抗劑包括，例如，結合激活素的可溶性ActRIIa多肽、結合 激活素(特別是激活素A和B亞基，也稱為βΑ和βΒ)并破壞ActRIIa結合的抗體、結 合ActRIIa并破壞激活素結合的抗體、選擇用于激活素或ActRIIa結合的非抗體蛋白 (此類蛋白及其設計和選擇的方法的實例參見例如W0/2002/088171、W0/2006/055689和 恥/2002/03四25)、選擇用于激活素或ActRIIa結合的隨機化的肽，其通常附著在Fc結構域 上。具有激活素或ActRIIa結合活性的兩種不同蛋白(或其它部分)，特別是分別阻斷I型 (例如可溶性I型激活素受體)和II型(例如可溶性II型激活素受體)結合位點的激活素 結合劑，可連接在一起建立雙功能結合分子。抑制該激活素-ActRIIa信號傳導軸的核酸適 體、小分子和其它試劑也包括為激活素-ActRIIa拮抗劑。多種蛋白具有激活素-ActRIIa 拮抗劑活性，包括抑制素(即抑制素α亞基)(盡管抑制素并不在所有的組織中普遍拮抗激 活素)、促濾泡素抑制素(例如促濾泡素抑制素-288和促濾泡素抑制素-315)、FSRP, FLRG、 激活素C、α O)-巨球蛋白、以及Μ108Α (在位置108處由甲硫氨酸改變為丙氨酸)突變激 活素Α。一般而言，激活素的替代形式(特別是在I型受體結合域中具有改變的那些形式) 能夠結合II型受體且不能形成活性三元復合物，因此充當拮抗劑。此外，抑制激活素Α、 B、C或E或者特別是抑制ActRIIa表達的核酸，例如反義分子、siRNA或核酶可被用作激活 素-ActRII拮抗劑。相對于其它TGF-b家族成員，特別是相對于⑶F8和⑶Fl 1，待使用的激 活素-ActRIIa拮抗劑可對抑制激活素介導的信號傳導顯示選擇性。在本發明的上下文中以及在使用每個術語的特定的上下文中，在本說明書中所用 的術語通常具有其在本領域中的普通含義。在下文以及說明書的其它部分討論了某些術 語，以在描述本發明的組合物和方法以及如何制造和使用它們的方面為從業者提供額外的 指導。術語的任何使用范圍或含義將從使用該術語的特定上下文顯而易見。“約”和“大約”一般應表示考慮到測量法的性質和精確性，測得的量的可接受誤差 程度。典型地，示例性誤差程度為在給定的數值或數值范圍的20%以內，優選在10%以內， 更優選在5%以內。或者，特別是在生物系統中，術語“約”和“大約”可表示在一定數量級內，優選在 給定值的5倍以內，更優選在2倍以內的值。除非另有說明，本文給出的數量為近似值，表 示在未明確指出時，可推出術語“約”或“大約”。本發明的方法可包括對序列彼此比較的步驟，包括將野生型序列與一種或多種突 變體(序列變體)進行比較。此類比較通常包括聚合物序列的比對，例如，采用本領域熟知的 序列比對程序和/或算法(例如，稍加舉例，BLAST、FASTA和MEGALIGN)進行。本領域技術 人員可容易地理解在此類比對中，當突變包含殘基插入或缺失時，該序列比對將在不包含 該插入或缺失的殘基的聚合物序列中引入“空位”(通常由破折號或“A”表示)。以及其所有的語法形式和拼寫變化表示的“同源性”均指具有“共同進化起源”的 兩種蛋白(包括來自相同生物物種的超家族的蛋白，以及來自不同生物物種的同源性蛋白) 之間的關系。此類蛋白(及其編碼核酸)具有序列同源性，這反映在它們的序列相似性，不管 是在同一性百分比方面還是在特定殘基或基序以及保守位置的存在方面。以其所有的語法形式表示的術語“序列相似性”指可共有或可不共有共同進化起 源的核酸或氨基酸序列之間的同一性或對應性程度。
然而，在通常的使用以及在本申請中，當術語“同源性”被副詞例如“高度”修飾時， 可表示序列相似性，并可涉及或可不涉及共同進化起源。2. ActRIIa 多肽
在某些方面，本發明涉及ActRIIa多肽。本文所用的術語“ActRIIa”指來自任意物種的 IIa型激活素受體(ActRIIa)蛋白以及通過誘變或其它修飾從所述ActRIIa蛋白衍生的變 體的家族。本文提及ActRIIa時，應理解為提及目前鑒定的形式中的任意一種。該ActRIIa 家族的成員通常為跨膜蛋白，由具有富含半胱氨酸的區域的配體結合胞外域、跨膜結構域 以及具有預測的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的胞質域組成。術語“ActRIIa多肽”包括包含ActRIIa家族成員的任何天然存在的多肽及其保留 了有用活性的任意變體(包括突變體、片段、融合物以及肽模擬(P^tidomimetic)形式)的 多肽。參見，例如W0/2006/0U627。例如，ActRIIa多肽包括由任意已知ActRIIa的序列所 衍生的、具有與ActRIIa多肽的序列有至少約80%同一性、任選至少85%、90%、95%、97%、99% 或更高同一性的序列的多肽。例如，本發明的ActRIIa多肽可結合ActRIIa蛋白和/或激活 素并抑制其功能。可針對在體內促進紅細胞形成的活性選擇ActRIIa多肽。ActRIIa多肽 的實例包括人ActRIIa前體多肽(SEQ ID NO: 1)和可溶性人ActRIIa多肽(例如，SEQ ID NOs: 2、3、7 和 12)。人ActRIIa前體蛋白序列如下
權利要求
1.管理已經用激活素-ActRIIa拮抗劑治療過的患者或作為用激活素-ActRIIa拮抗劑 治療的候選者的患者的方法，該方法包括在患者中監測一種或多種與升高的紅細胞水平相 關的血液學參數。
2.權利要求1的方法，其中所述血液學參數是以下一種或多種紅細胞水平、血壓或鐵儲存。
3.權利要求1的方法，該方法進一步包括給患者施用激活素-ActRIIa拮抗劑，施用的 量對于患者中所述血液學參數的觀察到的水平是合適的。
4.權利要求1的方法，其中，如果患者具有升高到基線之上的血壓或是高血壓患者，則 減少、延遲或終止激活素-ActRIIa拮抗劑的給藥。
5.權利要求1的方法，其中，如果患者具有升高到基線之上的血壓或是高血壓患者，則 在施用激活素-ActRIIa拮抗劑之前用降壓劑治療患者。
6.權利要求1的方法，其中如果患者具有不受控制的高血壓，則減少、延遲或終止激活 素-ActRIIa拮抗劑的給藥。
7.權利要求1的方法，其中如果患者具有高于相似年齡和性別的患者的正常范圍的紅 細胞水平，則減少、延遲或終止激活素-ActRI I a拮抗劑的給藥。
8.權利要求1的方法，其中如果患者具有高于15g/dl的血紅蛋白水平，則減少、延遲或 終止激活素-ActRIIa拮抗劑的給藥。
9.權利要求1的方法，其中如果患者具有高于10、11或12g/dl的血紅蛋白水平，則減 少、延遲或終止激活素-ActRIIa拮抗劑的給藥。
10.權利要求1的方法，其中如果患者具有低于相似年齡和性別的患者的正常范圍的 鐵儲存，則減少、延遲或終止激活素-ActRIIa拮抗劑的給藥。
11.權利要求1的方法，其中如果患者具有低于20%的轉鐵蛋白飽和度，則減少、延遲或 終止激活素-ActRIIa拮抗劑的給藥。
12.權利要求1的方法，其中如果患者具有低于100ng/ml的鐵蛋白水平，則減少、延遲 或終止激活素-ActRIIa拮抗劑的給藥。
13.權利要求1的方法，其中如果患者具有低于相似年齡和性別的患者的正常范圍的 鐵儲存，則在激活素-ActRIIa拮抗劑給藥前用鐵補充劑治療患者。
14.權利要求1的方法，其中如果患者具有低于20%的轉鐵蛋白飽和度，則在激活 素-ActRIIa拮抗劑給藥前用鐵補充劑治療患者。
15.權利要求1的方法，其中如果患者具有低于100ng/ml的鐵蛋白水平，則在激活 素-ActRIIa拮抗劑給藥前用鐵補充劑治療患者。
16.權利要求1的方法，其中監測紅細胞水平包括監測以下一種或多種血紅蛋白水平 和血細胞比容水平。
17.權利要求1的方法，其中監測血壓包括監測以下一種或多種收縮壓、舒張壓或平 均動脈壓。
18.權利要求1的方法，其中監測鐵儲存包括監測以下一種或多種轉鐵蛋白飽和度、 鐵蛋白水平或總鐵結合力。
19.用激活素-ActRIIa拮抗劑對患者進行給藥的方法，該方法包括以選擇的量和間隔 對患者進行給藥，從而減少導致在兩周內血紅蛋白水平的升高大于1 g/dl的風險。
20.權利要求1-19的任一項的方法，其中所述患者患有貧血。
21.權利要求1-19的任一項的方法，其中所述患者需要骨生長、增加的骨密度或增加 的骨強度。
22.權利要求1-19的任一項的方法，其中所述患者患有骨相關病癥。
23.權利要求1-19的任一項的方法，其中所述患者患有癌。
24.權利要求23的方法，其中所述患者患有乳腺癌。
25.權利要求1-19的任一項的方法，其中所述激活素-ActRIIa拮抗劑是與選自激活素 和ActRIIA的靶蛋白結合的抗體。
26.權利要求1-19的任一項的方法，其中所述激活素-ActRIIa拮抗劑是抑制素或抑制 素的保守變體。
27.權利要求1-19的任一項的方法，其中所述激活素-ActRIIa拮抗劑是包含結合并拮 抗激活素的促濾泡素抑制素結構域的蛋白。
28.權利要求1-19的任一項的方法，其中所述激活素-ActRIIa拮抗劑是選自下組的蛋 白促濾泡素抑制素、促濾泡素抑制素相關基因(FLRG)和前述物質的保守變體。
29.權利要求1-19的任一項的方法，其中所述激活素-ActRIIa拮抗劑是選自下組的 ActRIIa 多肽a)包含與SEQID NO: 2具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽；b)包含與SEQID NO: 3具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽；和c)包含選自SEQID NO: 2的至少50個連續氨基酸的多肽；d)包含與SEQID NO: 7具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽；e)包含與SEQID NO: 12具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽；和f)包含選自SEQID N0: 7的至少50個連續氨基酸的多肽。
30.權利要求四的方法，其中所述多肽具有一種或多種以下特征i)以至少10" M的Kd結合ActRIIa配體；禾口 )抑制細胞中的ActRIIa信號傳導。
31.權利要求四的方法，其中所述多肽是融合蛋白，其除了包含ActRIIa多肽結構域 外，還包含一種或多種多肽部分，所述多肽部分增強以下一種或多種體內穩定性、體內半 衰期、攝取/施用、組織定位或分布、蛋白復合物的形成和/或純化。
32.權利要求四的方法，其中所述融合蛋白包括選自免疫球蛋白Fc結構域和血清白蛋 白的多肽部分。
33.權利要求四的方法，其中所述多肽包括一個或多個選自下組的修飾的氨基酸殘 基糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸、 與脂質部分綴合的氨基酸和與有機衍生劑綴合的氨基酸。
34.權利要求四的方法，其中所述激活素-ActRIIa拮抗劑是ActRIIa-Fc融合蛋白，其 包含選自下組的氨基酸序列a)SEQ ID NO: 3的氨基酸序列，b)SEQ ID N0: 2的氨基酸序列，c)SEQ ID N0: 7的氨基酸序列，d)與SEQID N0: 7的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，e)與SEQID NO: 7的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，f)SEQ ID NO: 12的氨基酸序列，和g)SEQ ID NO: 13的氨基酸序列。
35.給患者施用ActRIIa-Fc融合蛋白的方法，該方法包括以不高于每60天一次的頻率 施用ActRIIa-Fc融合蛋白。
36.權利要求35的方法，其中以不高于每90天一次的頻率給患者施用激活素拮抗劑。
37.權利要求35的方法，其中以不高于每120天一次的頻率給患者施用激活素拮抗劑。
38.給有需要的患者施用ActRIIa-Fc融合蛋白的方法，該方法包括給血紅蛋白水平低 于10 g/dL的患者施用ActRIIa-Fc融合蛋白。
39.權利要求38的方法，其中所述患者的血紅蛋白水平低于11g/dL。
40.權利要求38的方法，其中所述患者的血紅蛋白水平低于12g/dL。
41.權利要求38-40的任一項的方法，其中所述患者需要骨生長、增加的骨密度或增加 的骨強度。
42.權利要求38-40的任一項的方法，其中所述患者患有骨相關病癥。
43.權利要求38-40的任一項的方法，其中所述患者患有癌。
44.權利要求38-40的任一項的方法，其中所述患者患有乳腺癌。
全文摘要
在某些方面，本發明提供了對患者進行激活素-ActRIIa拮抗劑給藥的方法和管理用激活素-ActRIIa拮抗劑治療的患者的方法。在某些方面，所述方法涉及測量患者中的一種或多種血液學參數。
文檔編號C07K14/00GK102131822SQ200980133293
公開日2011年7月20日 申請日期2009年6月26日 優先權日2008年6月26日
發明者M·L·謝爾曼, N·伯爾格施泰因 申請人:阿塞勒隆制藥公司