專利名稱：可維持從核苷酸模板酶促合成雙鏈核苷酸的非天然聚合酶底物及其使用的方法
可維持從核苷酸模板酶促合成雙鏈核苷酸的非天然聚合酶
底物及其使用的方法本申請要求2008年4月四號提交的臨時美國專利申請號61/048，808及2008年 9月四號提交的臨時美國專利申請號61/136，732的權益。本申請通過引用上述每個申請 引入他們的全部內容。按照37C. F. R. § 1. 52(e) (5)的規定，創立于2009年1月16日、大小為7，129字 節、名為68523_kq_LiSting. txt的序列表文本文件的全部內容通過引用引入本文。本申請使用的各部分的標題僅用于組織用途，而不應解釋為以任何方式限制本申 請描述的主題。
領域本申請一般而言涉及聚合酶底物及使用所述底物來測定諸如DNA或RNA的核酸序 列的方法。核酸測序通常包括克隆感興趣的核酸以便制備限定的核酸片段的大批樣品(bulk samples)，隨后分析所述大批核酸。業已提出合成測序(sequencing by synthesis)作為 達到快速從頭測序(de novosequencing)的方法。合成測序可包括所擴增核酸單分子集合 的分析或核酸單分子的分析；并且理論上可用來檢測天然基因組DNA，而無需細菌克隆或 其它形式的擴增。但是，仍然存在合成測序和單分子核酸測序改進方法的需求。
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間述本申請提供以以下式(I)代表的化合物
權利要求
1. 一種由以下式⑴代表的化合物
2.權利要求1的化合物，其中R1是選自以下基團的中性形式的有機取代基取代或未 取代的烷基、取代或未取代的芳族基、取代或未取代的雜環、取代或未取代的芳族雜環、或 其陰離子或陽離子形式。
3.權利要求2的化合物，其中化學上不穩定基團L2的裂解留下連接于堿基的具有末端 基團F的連接子殘基部分。
4.權利要求3的化合物，其中末端基團F不是氨基。
5.權利要求3的化合物，其中末端基團F是羥基。
6.權利要求1的化合物，其中1是2或3。
7.權利要求1的化合物，其中該化合物具有下式(II)代表的結構
8.權利要求1的化合物，其中L2包含選自以下的化學上不穩定基團-C(0)-S-;-C(0) 0- ；-CH-(SCH3)-Ph-和[R0]2P(0)S-；其中Wi是取代的苯基或取代的芳環；而其中禮是選自 以下基團的中性形式的有機取代基取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳族基、取代或 未取代的雜環、取代或未取代的芳族雜環、或其陰離子或陽離子形式。
9.權利要求2的化合物，其中L1在堿基與雜原子F之間形成永久鍵合，而L2在雜原子 之間形成短暫鍵合。
10.權利要求9的化合物，其中雜原子是0、S或N。
11.權利要求9的化合物，其中L1包含下式代表的部分
12.權利要求9的化合物，其中L1包含下式代表的部分
13.權利要求9的化合物，其中L2-I包含下式代表的部分
14.權利要求1的化合物，其中該化合物具有以下式(VI)代表的結構
15.權利要求1的化合物，其中化學上不穩定基團L2經Ag+活化從而裂解F-L2。
16.權利要求1的化合物，其中L2包含選自以下的部分
17.權利要求1的化合物，其中L2包含下式的部分
18.一種核酸測序方法，其包括以下步驟(a)將引物與靶多核苷酸雜交以形成引物-靶雙鏈體，其中靶多核苷酸的3’或5’端連 接于固相支持體；(b)將引物-靶雙鏈體與聚合酶以及一種或多種核苷酸類似物接觸，從而摻入核苷酸 類似物到引物的3’末端，由此形成延伸的引物鏈，其中所摻入的核苷酸類似物終止聚合酶 反應，并且其中所述一種或多種核苷酸類似物的每一種包含(i)選自腺嘌呤、鳥嘌呤、胞 嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶及他們的類似物的堿基；(ii)通過可裂解連接子連接于堿基或其 類似物的標記；(iii)脫氧核糖；和(iv) 一個或多個磷酸基；其中所述標記為堿基特有的， 并且其中多磷酸末端取代基、連接子和/或所述標記的組合抑制另一核苷酸類似物摻入到 延伸的引物鏈的模板定向聚合酶摻入反應；(c)洗滌固相支持體表面以移除未摻入的核苷酸類似物；(d)檢測連接于剛摻入的核苷酸類似物的特有標記，藉此識別剛摻入的核苷酸類似物；(e)裂解剛摻入的核苷酸類似物與特有標記之間的可裂解連接子，從而允許另一核苷 酸類似物摻入到延伸的引物鏈中；(f)洗滌固相支持體表面以移除裂解的化合物片段；及 (e)重復步驟(b)、(c)、(d)、(e)和(f)。
19.權利要求18的方法，其中所述一種或多種核苷酸類似物的每一種具有以下式(I)代表的結構
20.權利要求19的方法，其中R1是選自以下基團的中性形式的有機取代基取代或未 取代的烷基、取代或未取代的芳族基、取代或未取代的雜環、取代或未取代的芳族雜環、或 其陰離子或陽離子形式；L3是H，1是2，而m是5。
21.權利要求19的方法，其中所述一種或多種核苷酸類似物包含第一核苷酸類似物， 其中B是具有第一標記的腺嘌呤；第二核苷酸類似物，其中B是具有第二標記的鳥嘌呤；第 三核苷酸類似物，其中B是具有第三標記的胞嘧啶；以及第四核苷酸類似物，其中B是具有 第四標記的胸腺嘧啶。
22.權利要求21的方法，其中第一、第二、第三和第四標記的每一種都是熒光標記。
23.權利要求19的方法，其中R1是抑制向延伸中的寡核苷酸3’末端摻入核苷三磷酸 的模板定向聚合酶摻入反應速率的基團，這種抑制發生在L2-Ii2從先前摻入事件裂解之前。
24.權利要求23的方法，其中R1是報道分子或猝滅劑。
25.權利要求1的化合物，其中R1是抑制向延伸中的寡核苷酸3’末端摻入核苷三磷酸 的模板定向聚合酶摻入反應速率的基團，這種抑制發生在L2-Ii2從先前摻入事件裂解之前。
26.權利要求25的化合物，其中R1是報道分子或猝滅劑。
27.權利要求1的化合物，其中所述的化合物具有以下式(VI)代表的結構
28.權利要求27的化合物，其中R1是選自以下基團的中性形式的有機取代基取代或 未取代的烷基、取代或未取代的芳族基、取代或未取代的雜環、取代或未取代的芳族雜環、 或其陰離子或陽離子形式。
29.權利要求7的化合物，其中R1不是H。
30.權利要求四的化合物，其中R1是選自以下基團的中性形式的有機取代基取代或 未取代的烷基、取代或未取代的芳族基、取代或未取代的雜環、取代或未取代的芳族雜環、 或其陰離子或陽離子形式。
31.權利要求18的方法，其中所述一種或多種核苷酸類似物的每一種具有以下式(II) 代表的結構
32.權利要求31的方法，其中R1是取代或未取代的烴基。
33.權利要求32的方法，其中R1是取代或未取代的甲基、炔丙基或苯甲基。
34.權利要求31的方法，其中所述一種或多種核苷酸類似物的每一種具有以下式(VI) 代表的結構
全文摘要
本申請描述了可維持從核酸模板酶促合成雙鏈核酸的核苷酸類似物。所述核苷酸類似物包含(i)選自以下的堿基腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶及他們的類似物；(ii)通過可裂解連接子連接于堿基或堿基類似物的標記；(iii)脫氧核糖；以及(iv)一個或多個磷酸基。所述連接子和/或標記抑制另一核苷酸底物向延伸的引物鏈的模板定向聚合酶摻入。此外，連接子的裂解留下連接于堿基的殘基，所述殘基不存在于在天然核苷酸中而且不抑制引物鏈的延伸。3’羥基未被封閉，因此，所述核苷酸類似物可在合成測序方法中用做可逆終止子。本申請也描述了利用所述底物的DNA測序方法。
文檔編號C07H19/073GK102124018SQ200980125926
公開日2011年7月13日 申請日期2009年1月16日 優先權日2008年4月29日
發明者B·羅森布盧姆, J·陳, P·肯尼, S·I·罕, S·M·門琴, 林英聯, 馬兆春, 黃波立 申請人:生命科技公司