用于制造核心巖藻糖基化降低的抗體和抗體衍生物的方法和組合物的制作方法

專利名稱：用于制造核心巖藻糖基化降低的抗體和抗體衍生物的方法和組合物的制作方法
用于制造核心巖藻糖基化降低的抗體和抗體衍生物的方法
和組合物相關申請的交叉參考本申請要求2008/5/2提交的美國序列號61/050，173 ；2008/8/ 提交的美國序列 號61/092，700和2008/10/21提交的美國序列號61/107，289的優先權，將其內容內納入本
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背景技術：
重組治療蛋白是通過許多不同方法制造的。一種優選方法是從哺乳動物宿主細胞 系制造重組蛋白。工程改造了諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞之類的細胞系來表達感興趣的 治療蛋白質。不同細胞系在制造重組蛋白時的優缺點各有不同，包括蛋白質特征和產率。在 選擇市售生產細胞系時通常要平衡考慮對高產率的需要和遞送具有給定產物所需性質的 一致產物品質的能力。具有一致的、高品質特性和高效價過程的一類重要的治療重組蛋白 是單克隆抗體。可對在哺乳動物宿主細胞中制造的單克隆抗體進行各種翻譯后修飾，包括 糖基化。單克隆抗體，如IgGl，在每條重鏈(每個完整抗體有兩條重鏈)的天冬酰胺 297 (Asn297)上有N-連接的糖基化位點。連接在抗體Asn297上的聚糖通常有復雜的雙觸 角(biantermary)結構，其具有非常少的或沒有二等分N-乙酰葡糖胺(二等分GIcNAc)和 少量末端唾液酸及可變量的半乳糖。聚糖通常也具有較高的核心巖藻糖基化水平。降低抗 體的核心巖藻糖基化顯示能改變Fc效應功能，尤其是Fc γ受體結合和ADCC活性。這一發 現導致人們對工程改造細胞系發生興趣，從而制造了核心巖藻糖基化降低的抗體。工程改造細胞系以降低核心巖藻糖基化的方法包括基因敲除、基因敲入和RNA干 擾(RNAi)。在基因敲除中，編碼FUT8(al，6-藻糖基轉移酶)的基因被滅活。FUT8催化巖 藻糖殘基從⑶P-巖藻糖轉移到N-聚糖的Asn-連接(N-連接)GlcNac的6位。據稱，FUT8 是唯一負責將巖藻糖加到N-連接雙觸角糖類Asn297上的酶。基因敲入是加入編碼酶，如 GNTIII或高爾基體α甘露糖苷酶II的基因。提高細胞中該酶的水平使單克隆抗體從巖 藻糖基化途徑轉向(導致核心巖藻糖基化降低)，并具有升高量的二等分N-乙酰葡糖胺。 RNAi通常也靶向FUT8基因表達，導致mRNA轉錄水平降低或完全敲除基因表達。除了工程改造細胞系，還包括使用作用于糖基化途徑的酶的小分子抑制劑。抑制 劑，如凱特諾斯胺(catanospermine)，早期作用于糖基化途徑，產生具有未成熟聚糖(例 如，甘露糖水平高)和低巖藻糖基化水平的抗體。通過這些方法制得的抗體通常缺乏成熟 抗體相關的復雜的N-連接聚糖結構。相反，本發明提供了用于制造具有復雜的N-連接聚糖但核心巖藻糖基化降低的 重組抗體的小分子巖藻糖類似物。
發明概述本發明提供了制備核心巖藻糖基化降低的抗體和抗體衍生物的方法和組合物。所 述方法和組合物的提出部分基于實施例中描述的意外結果，所述實施例顯示，在存在巖藻 糖類似物(具有式I、II、III、IV、V或VI)時培養表達抗體或抗體衍生物的宿主細胞能產 生核心巖藻糖基化降低(即，通過復雜N-糖苷-連接糖鏈還原端的N-乙酰葡糖胺連接于 Fc區的該糖鏈的N-乙酰葡糖胺的巖藻糖基化降低)的抗體。與從不存在巖藻糖類似物時 培養的這種宿主細胞制造的抗體或抗體衍生物相比，這種抗體和抗體衍生物可具有提高的 效應功能(ADCC)。另一方面，提供了抗體和抗體衍生物的組合物。所述抗體和抗體衍生物可通過本 文所述方法制造。另一方面，提供了巖藻糖類似物。可將所述巖藻糖類似物加入哺乳動物細胞培養 基以抑制或降低核心巖藻糖基化。還提供了含有有效量這種巖藻糖類似物的細胞培養基。通過閱讀以下詳細描述、特定實施方式的非限制性實施例以及附圖能更充分地理 解本發明的這些方面和其他方面。附圖簡要說明

圖1顯示了從對照㈧和炔基巖藻糖過乙酸酯(AlkF)-處理的宿主細胞(B和C) 制造的抗-CD70抗體(hlF6)中分離的聚糖的分析結果(電泳圖)。圖中顯示了聚糖的身份 和相對分布。“GO”表示在兩個非還原端沒有半乳糖的碳水化合物結構。“G1”表示其中一 個非還原端有半乳糖的碳水化合物結構(兩種異構體的混合物)。“G2”表示其中兩個非還 原端都有半乳糖的碳水化合物結構。“G0-F”表示在兩個非還原端都沒有半乳糖且沒有核心 巖藻糖基化的碳水化合物結構。圖IA 從對照(未處理)hlF6抗體分離的聚糖。圖1B:從 存在50 μ m炔基巖藻糖過乙酸酯時表達的hlF6抗體分離的聚糖。圖IC 從存在50 μ m炔基 巖藻糖過乙酸酯時表達并用β -半乳糖苷酶處理以除去Gl和G2聚糖中半乳糖的hlF6抗 體分離的聚糖。圖2顯示了從存在炔基巖藻糖過乙酸酯(AlkF)時培養的宿主細胞制造的抗體的 效應功能測定(ADCC)結果。通過51Cr釋放試驗確定對照抗-⑶70抗體(黑色圓圈)、從存 在50 μ M和100 μ M AlkF時培養的宿主細胞獲得的抗-⑶70抗體(分別用空心圓圈和三角 表示)以及非結合對照IgG(黑色菱形)的特異性溶解。⑶70+786-0靶細胞與富含NK的 PBMC以效應物靶細胞之比為10 1混合。圖3顯示了對照抗-⑶70抗體以及從存在50 μ M炔基巖藻糖過乙酸酯(AlkF)時培 養的宿主細胞獲得的抗體的Fc γ受體結合試驗的結果。各受體的相對親和力通過標記的 親代受體與升高濃度的未標記親代抗-CD70 mAb (黑色方形)或非核心巖藻糖基化抗-CD70 mAb (黑色三角形)之間的競爭性結合試驗確定。圖3Α顯示了對人Fc γ受體(⑶16)-表達 細胞的結合競爭性。圖:3Β顯示了對鼠Fc γ受體(⑶16)-表達細胞的結合競爭性。圖4顯示了在不存在或存在炔基巖藻糖過乙酸酯時培養的四種抗體的 LC-MS(Q-Tof)分析結果(分別在每幅圖的上半部分和下半部分中顯示)。G0、G1和GO-F如 上文所述。“G1-F”表示其中一個非還原端有半乳糖且沒有核心巖藻糖基化的碳水化合物結 構(兩種異構體的混合物)。圖4A 抗-⑶70抗體。圖4B 抗-⑶19抗體。圖4C 抗-⑶30 抗體。圖4D:抗-⑶33抗體。
圖5顯示了在具有158V和128F表型的NK細胞(分別見圖A和B)上進行的在 不存在或存在炔基巖藻糖過乙酸酯時培養的人源化CD19抗體(分別是核心巖藻糖基化的 (方形)或非核心巖藻糖基化的(三角形))的效應功能(ADCC)試驗結果。圖6顯示了炔基巖藻糖過乙酸酯(“Alk Fuc過乙酸酯”)在表達hlF6抗體的宿 主細胞培養物上的滴定結果以及對具有核心巖藻糖基化(GO)的Ab產生的影響。發明詳述術語"抗體"表示(a)免疫球蛋白多肽和免疫球蛋白多肽的免疫學活性部分， 即免疫球蛋白家族的多肽或其部分，包含免疫特異性結合域特定抗原(例如，CD70)的抗原 結合位點和包括復雜N-糖苷-連接糖鏈的Fc結構域，或(b)這種免疫球蛋白多肽或免疫 特異性結合抗原(例如，CD70)的片段的保守性取代衍生物。抗體的描述通常參見例如， Harlow & Lane，《抗體實驗室手冊》(Antibodies :A Laboratory Manual) ( 7令泉港實驗室 出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，1988)。除非與文章內容明顯不同，當提 及抗體時還包括下面更加詳細描述的抗體衍生物。“抗體衍生物"表示如上文所定義的抗體(包括抗體片段)，或包含復雜N-糖苷 連接糖鏈的抗體的Fc結構域或Fc區，通過共價結合異源分子進行修飾，例如，通過結合異 源多肽(例如，異源蛋白的配體結合結構域)，或者通過糖基化(核心巖藻糖基化除外)、去 糖基化(非核心巖藻糖基化除外)、乙酰化、磷酸化或者正常情況下與抗體或者Fc結構域或 Fc區無關的其他修飾。術語“單克隆抗體”指衍生自單個細胞克隆，包括任何真核或原核細胞克隆或噬菌 體克隆的抗體，但不限制其產生方法。因此，本文所用術語“單克隆抗體”不限于通過雜交 瘤技術產生的抗體。術語“Fe區”表示抗體的恒定區，例如，ChI-絞鏈-CH2_Ch3結構域，任選具有CH4結 構域，或這種Fc區的保守性取代的衍生物。術語“Fe結構域”表示抗體的恒定區結構域，例如，CH1、絞鏈、Ch2、Ch3或CH4結構 域，或這種Fc結構域的保守性取代衍生物。“抗原”是抗體特異性結合的分子。術語“特異性結合”指抗體或抗體衍生物以高度選擇性方式與其相應靶抗原結合， 但不與各種其它抗原相互作用。通常，抗體或抗體衍生物的結合親和力為至少約lxl(TM， 優選ΙΟΙ-ΙΟ、、ΙΟ,Μ、10_"M或IO-12M,并以其對除預定抗原或密切相關抗原之外的非特異 性抗原(如BSA、酪蛋白)的結合親和力至少兩倍的親和力結合預定抗原。術語“抑制”指發生可檢測的下降，或完全阻止。文中，“炔基巖藻糖過乙酸酯”指任何形式或所有形式的炔基巖藻糖(5-乙炔基阿 拉伯糖)，其在R1-4位具有乙酸酯基團(見下文中的式I和II)，包括6-乙炔基-四氫-2H-吡 喃-2，3，4，5-四基四乙酸酯，包括(2S，3S，4R，5R，6S)和(2R，3S，4R，5R，6S)異構體，以及 5- ((S)-1-羥基丙-2-炔基)-四氫呋喃_2，3，4-三基四乙酸酯，包括(2S, 3S，4R，5R)和 (2R,3S,4R,5R)異構體，以及醛糖形式，文中另有說明除外。術語“炔基巖藻糖三乙酸酯”、 “炔基巖藻糖二乙酸酯”和“炔基巖藻糖單乙酸酯”分別表示炔基巖藻糖的三_、二-和單-乙 酸酯形式。
除非文中另有說明，術語“烷基”指具有約1-20個碳原子(以及其間的碳原子范 圍和碳原子具體數目的所有組合和再組合)，優選約1-3、1-8或1-10個碳原子的取代或未 取代的飽和直鏈或支鏈烴。烷基的例子是甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁 基、叔丁基、正戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2- 丁基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正 癸基、3-甲基-2- 丁基、3-甲基-1- 丁基、2-甲基-1- 丁基、1-己基、2-己基、3-己基、2-甲 基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基_3_戊基、2，3-二 甲基-2- 丁基和3，3- 二甲基-2- 丁基。單獨出現或作為另一基團一部分的烷基可任選地被一個或多個基團，優選被1-3 個基團(以及選自鹵素的任何額外取代基)取代，這些基團包括但不限于鹵素、-(^(C1-C8 烷基)、-0-(C2-C8 烯基)、-0-(C2-C8 炔基)、芳基、-C(0)R，、-OC(O)R，、-C(0)OR，、-C(0) NH2, -C(O) NHR \ -C (O)N (R' )2、-NHC (0)R，、-SR，、-SO3R' > -S(O)2R', -S(O)R', -OH、= 0、-NH2、-NH(R，)、-N(R，)2 和-CN ；其中各 R，獨立選自-I-C1-C8 烷基、-C2-C8 烯基、-C2-C8 炔 基或芳基。在一些實施方式中，-0- (C1-C8烷基)、-0- (C2-C8烯基)、-0- (C2-C8炔基)、芳基和 R’基團可進一步被取代。這種進一步的取代基包括，例如K1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8 炔基、鹵素、-0- (CfC8 烷基)、-0- (C2-C8 烯基)、-0- (C2-C8 炔基)、-芳基、-C (0) R”、-OC (0) R”、-C (0) OR”、-C (O)NH2、-C (O)NHR”、-C (O)N(R”)2、-NHC (0) R”、-SR”、-S03R”、_S (0) 2R”、-S (0) R，，、-OH、-NH2、-NH (R”)、-N (R”) 2 和 _CN，其中各 R”獨立選自 H^C1-C8 烷基、-C2-C8 烯基、-C2-C8 炔基或芳基，其中所述進一步的取代基優選是未取代的。在一些實施方式中，-。-((^-(；烷 基)、-0-(C2-C8烯基)、-0-(C2-C8炔基)、芳基和R’基團未被進一步取代。除非文中另有說明，術語“烯基”和“炔基”指具有2-20個碳原子(以及其間的 碳原子范圍和碳原子具體數目的所有組合和再組合)，優選2-3、2-4、2-8或2-10個碳原子 的取代或未取代的直鏈或支鏈碳鏈。烯基鏈的鏈中具有至少一個雙鍵，炔基鏈的鏈中具有 至少一個三鍵。烯基的例子包括但不限于乙烯或乙烯基、烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯 基、-異丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、3-甲基-1- 丁烯基、-2-甲基-2- 丁烯基和-2， 3- 二甲基-2- 丁烯基。炔基的例子包括但不限于乙炔基、炔丙基、乙炔基、丙炔基、-1- 丁 炔基、-2- 丁炔基、-1-戊炔基、-2-戊炔基和-3-甲基1- 丁炔基。單獨出現或作為另一基團一部分的烯基和炔基可任選地被一個或多個基團，優 選被1-3個基團(以及選自鹵素的任何額外取代基)取代，這些基團包括但不限于鹵 素、-0- (C1-C8 烷基)、-0- (C2-C8 烯基)、-O- (C2-C8 炔基)，芳基、-C (0) R，、-OC (0) R，、-C (0) OR，、-C (0) NH2、-C (0) NHR，、-C (0) N(R，)2、-NHC (0) R，、-SR，、-SO3R'、-S (0) 2R，、-S (0) R，、-OH、 =0、-NH2、-NH (R，)、-N (R，)2 和-CN ；其中各 R，獨立選自-H、-C1-C8 烷基、-C2-C 烯基、-C2-C8 炔 基或芳基。在一些實施方式中，-0- (C1-C8烷基)、-0- (C2-C8烯基)、-0- (C2-C8炔基)、芳基和 R’基團可進一步被取代。這種進一步的取代基包括，例如K1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8 炔基、鹵素、-ο- (C「C8 烷基)、-0- (C2-C8 烯基)、-0- (C2-C8 炔基)、-芳基、-C (0) R”、-OC (0) R”、-C (0) OR”、-C (0)NH2、-C (0) NHR”、-C (0)N(R”)2、-NHC (0) R”、-SR”、-S03R”、_S (0) 2R”、_S (0) R，，、-OH、-NH2、-NH (R”)、-N (R”) 2 和 _CN，其中各 R”獨立選自 H^C1-C8 烷基、-C2-C8 烯基、-C2-C8 炔基或芳基，其中所述進一步的取代基優選是未取代的。在一些實施方式中，-。-((^-(；烷 基)、-0-(C2-C8烯基)、-0-(C2-C8炔基)、-芳基和R’基團未被進一步取代。除非文中另有說明，術語“亞烷基”指具有1-20個碳原子(以及其間的碳原子范圍和碳原子具體數目的所有組合和再組合)，優選1-8或1-10個碳原子，并具有通過除去 母體烷的同一個或兩個不同碳原子上的兩個氫原子產生的兩個單價游離基中心的取代或 未取代的飽和支鏈或直鏈烴基。典型的亞烷基包括但不限于亞甲基、亞乙基、亞丙基、亞丁 基、亞戊基、亞己基、亞庚基、亞辛基、亞壬基、亞癸基、亞1，4_環己基等。單獨出現或作為另一基團一部分的亞烷基可任選地被一個或多個基團，優選 被1-3個基團(以及選自鹵素的任何額外取代基)取代，這些基團包括但不限于鹵 素、-0- (C1-C8 烷基)、-0- (C2-C8 烯基)、-O- (C2-C8 炔基)，芳基、-C (0) R’、-OC (0) R’、-C (0) OR，、-C(O) NH2, -C(O)NHR', _C(0)N(R，)2、-NHC(O)R', -SR，、-SO3R'> -S(O)2R', -S(O) R，、-OH、= 0、-NH2, -NH(R，)、_N(R，)2 和-CN ；其中各 R，獨立選自-H、-C1-C8 烷 基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基。在一些實施方式中，-0-(C1-C8烷基)、-0-(C2-C8烯 基)、-0-(C2-C8炔基)、芳基和R’基團可進一步被取代。這種進一步的取代基包括，例如 C1-C8 烷基、-C2-C8 烯基、-C2-C8 炔基、鹵素、-ο- (C1-C8 烷基)、-ο- (C2-C8 烯基)、-ο- (C2-C8 炔 基)、-芳基、-C (0) R”、-OC (0) R”、-C (0) OR”、-C (0) NH2、-C (0) NHR”、-C (0) N (R”)2、-NHC (0) R”、-SR”、-S03R”、-S (0)2R”、-S (0)R”、-OH、-NH2、-NH (R”)、_N(R”)2 禾口 _CN，其中各 R” 獨立 選自H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或芳基，其中所述進一步的取代基優選是未取 代的。在一些實施方式中，-0-(C1-C8烷基)、-0-(C2-C8烯基)、-0-(C2-C8炔基)、-芳基和 R’基團未被進一步取代。除非文中另有說明，術語“芳基”指通過除去母體芳環系統的一個碳原子上的一個 氫原子獲得的6-20個碳原子(以及其間的碳原子范圍和碳原子具體數目的所有組合和再 組合)的取代或未取代的單價芳族烴基。示范性結構中，某些芳基用“Ar”表示。典型的芳 基包括但不限于衍生自苯、取代的苯、苯基、萘、蒽、聯苯基等的基團。單獨出現或作為另一基團一部分的芳基可任選地被一個或多個基團，優選被1-5、 或者甚至1-2個基團取代，這些基團包括但不限于滷素、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8 炔基、-O" (C1-C8 烷基)、-O- (C2-C8 烯基)、-O- (C2-C8 炔基)、-芳基、-C (0) R’、-OC (0) R，、-C (0) OR，、-C (0) NH2、-C (0) NHR，、-C (0) N (R，)2、-NHC (0)R，、-SR，、_S03R，、-S(0)2R，、-S(0) R，、-OH、-NO2、-NH2、-NH(R，)、_N(R，)2 禾口 -CN，其中各 R，獨立選自 H、-C1-C8 烷基、-C2-C8 烯 基、-C2-C8炔基或芳基。在一些實施方式中，C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-0-((^-(^ 烷基),-0-(C2-C8烯基)、-0-(C2-C8炔基)、芳基和R’基團可被進一步取代。這種進一步的 取代基包括，例如^C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、鹵素、-0- (C1-C8烷基)、-0- (C2-C8 烯基)、-O" (C2-C8 炔基)、-芳基、-C (0) R”、-OC (0) R”、-C (0) OR”、-C (0) NH2、-C (0) NHR”、-C (0) N(R”)2、-NHC (0) R”、-SR”、-SO3R-S (0) 2R”、-S (0) R”、-OH、-NH2、-NH(R”)、-N(R” ) 2 和 _CN， 其中各R”獨立選自H^C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或芳基，其中所述進一步的取代 基優選是未取代的。在一些實施方式中，-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、-0-(C1-C8烷 基)、-0-(C2-C8烯基)、-0-(C2-C8炔基)、芳基和R’基團未被進一步取代。除非文中另有說明，術語“雜環”指具有3-7、或3-10個環原子(也稱為環成員) 的取代或未取代的單環系統，其中至少一個環原子是選自N、0、P或S的雜原子(包括其間 的碳原子和雜原子的范圍和具體數目的所有組合和再組合)。雜環可具有獨立選自N、0、P 或S的1-4個環雜原子。雜環中的一個或多個N、C或S原子可以被氧化。單環雜環優選具 有3-7個環成員(例如，2-6個碳原子和1-3個獨立選自Ν、0、Ρ或S的雜原子)。包含雜原子的環可以是芳環或非芳環。除非另有說明，雜環在可產生穩定結構的任何雜原子或碳原 子連接于其側鏈基團。雜環的描述參見Paquette，“現代雜環化學原理”(Principles of Modern Heterocyclic Chemistr) (W. A. Benjamin，紐約，1968)，特別是第 1、3、4、6、7 和 9 章；“雜環 it^^^iit^(The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs)(約翰威利父子公司(John Wiley & Sons)，紐約，1950至今)，具體是第13、 14、16、19 和 28 卷；和 J. Am. Chem. Soc. 82 :5566 (1960)。“雜環”基團的例子包括但不限于批啶基、二氫吡啶基、四氫吡啶基(哌啶基)、 噻唑基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、巖藻糖基、氮雜環丙烷基 (azirdinyl)、氮雜環丁烷基、環氧乙烷基(oxiranyl)、氧雜環丁烷基(oxetanyl)和四氫呋喃基。單獨出現或作為另一基團一部分的雜環基團可任選地被一個或多個基團，優 選被1-2個基團取代，這些基團包括但不限于^C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、鹵 素、-0- (C1-C8 烷基)、-0- (C2-C8 烯基)、-O- (C2-C8 炔基)、-芳基、-C (0) R，、-OC (0) R，、-C (0) OR，、-C(O) NH2, -C(O)NHR', _C(0)N(R，)2、-NHC(O)R', -SR，、-SO3R'> -S(O)2R', -S(O) R，、-OH、-NH2, -NH(R，)、_N(R，)2 禾口 _CN，其中各 R，獨立選自 H、-C1-C8 烷基、-C2-C8 烯 基、-C2-C8炔基或芳基。在一些實施方式中，O-(C1-C8烷基),-ο-(C2-C8烯基),-ο-(C2-C8炔 基)、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、芳基和R’基團可被進一步取代。這種進一步的 取代基包括，例如^C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、鹵素、-O- (C1-C8烷基)、-O- (C2-C8 烯基)、-O- (C2-C8 炔基)、-芳基、-C (0) R”、-OC (0) R”、-C (0) OR”、-C (0) NH2、-C (0) NHR”、-C (0) N(R”)2、-NHC (0) R”、-SR”、-SO3R-S (0) 2R”、-S (0) R”、-OH、-NH2、-NH(R”)、-N(R” ) 2 和 _CN， 其中各R”獨立選自H^C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或芳基，其中所述進一步的取代 基優選是未取代的。在一些實施方式中，-0-(C1-C8烷基)、-0-(C2-C8烯基)、-0-(C2-C8炔 基)、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、芳基和R’基團未被取代。例如但不限于，碳-鍵合雜環可以在以下位置發生鍵合吡啶的2、3、4、5或6位； 噠嗪的3、4、5或6位；嘧啶的2、4、5或6位；吡嗪的2、3、5或6位；呋喃、四氫呋喃、噻吩、 噻吩、吡咯或四氫吡咯的2、3、4或5位；B惡唑、咪唑或噻唑的2、4或5位；異嗎唑、吡唑或異 噻唑的3、4或5位；氮雜環丙烷的2或3位；氮雜環丁烷的2、3或4位。碳鍵合雜環的例子 可包括2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、5-吡啶基、6-吡啶基、3-噠嗪基、4-噠嗪基、5-噠 嗪基、6-噠嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、6-嘧啶基、2-吡嗪基、3-吡嗪基、5-吡嗪 基、6-吡嗪基、2-噻唑基、4-噻唑基或5-噻唑基。例如但不限于，氮鍵合雜環可以在氮雜環丙烷、氮雜環丁烷、吡咯、吡咯烷、2-吡 咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑烷、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、 哌啶、哌嗪、吲哚、二氫吲哚或IH-吲唑的1位；異吲哚或異二氫吲哚的2位；以及嗎啉 的4位鍵合。更一般地，氮鍵合雜環包括1-氮雜環丙烷基(aziridyl)、l-氮雜環丁烷基 (azetidyl)、1-吡咯基、咪唑基、吡唑基和1_哌啶基。除非另有說明，術語“碳環”指具有3-6個環原子(以及其間的碳原子范圍和碳原 子具體數目的所有組合和再組合)且所有環原子都是碳原子的取代或未取代的、飽和或不 飽和的非芳族單環系統。
單獨出現或作為另一基團一部分的碳環基團可任選地被，例如，一個或多個基團， 優選被1或2個基團(以及選自鹵素的任何額外取代基)取代，這些基團包括但不限于 鹵素、-C1-C8 烷基、-C2-C8 烯基、-C2-C8 炔基、-0- (C1-C8 烷基)、-O- (C2-C8 烯基)、-O- (C2-C8 炔基)、芳基、-C (0) R，、-OC (0) R，、-C (0) OR，、-C (0) NH2、-C (0) NHR，、-C (0) N(R，)2、-NHC (0) R，、-SR，、-SO3R，、-S(O)2R，、-S(O)R，、-OH、= O、-NH2、-NH(R，)、-N(R，)2 禾口 -CN，其中各 R， 獨立選自H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基或-芳基。在一些實施方式中，-C1-C8烷 基、-C2-C8 烯基、-C2-C8 炔基、-0-((^-(^ 烷基)、-0-(C2-C8 烯基)、-0-(C2-C8 炔基)、-芳基和 R’基團可被進一步取代。這種進一步的取代基包括，例如K1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8 炔基、鹵素、-0- (c「c8 烷基)、-ο- (C2-C8 烯基)、-ο- (C2-C8 炔基)、-芳基、-C (0) R”、-OC (0) R”、-C (0) OR”、-C (O)NH2、-C (O)NHR”、-C (O)N(R”)2、-NHC (0) R”、-SR”、-S03R”、_S (0) 2R”、-S (0) R，，、-OH、-NH2、-NH (R”)、-N (R”) 2 和 _CN，其中各 R”獨立選自 H^C1-C8 烷基、-C2-C8 烯基、-C2-C8 炔基或芳基，其中所述進一步的取代基優選是未取代的。在一些實施方式中，-C1-C8烷 基、-C2-C8 烯基、-C2-C8 炔基、-O- (C1-C8 烷基)、-O- (C2-C8 烯基)、-O- (C2-C8 炔基)、芳基和 R’基團未被取代。單環碳環取代基的例子包括-環丙基、-環丁基、-環戊基、1-環戊-1-烯基、1-環 戊-2-烯基、1-環戊-3-烯基、環己基、-1-環己-1-烯基、-1-環己-2-烯基、-1-環己-3-烯 基、-環庚基、-環辛基、-1，3-環己二烯基、-1，4-環己二烯基、-1,3-環庚二烯基、-1,3, 5-環庚三烯基和-環辛二烯基。當任何變量在任何組分或任何式子中出現一次以上時，它每次出現時的定義相互 獨立。只有當取代基和/或變量的組合產生穩定化合物時，才允許這種組合。除非文中另有說明，連字號㈠指側鏈分子的連接點。因此，術語"-(C1-Cltl亞烷 基)芳基”或"-C1-Cltl亞烷基(芳基)”指本文定義的C1-Cltl亞烷基，其中亞烷基在該亞烷 基的任何碳原子上連接于側鏈分子且連接于該亞烷基碳原子的一個氫原子被本文定義的 芳基取代。當某特定基團被“取代”時，該基團可具有一個或多個取代基，優選1-5個取代基， 更優選1-3個取代基，最優選1-2個取代基，取代基獨立地選自取代基列表。然而，該基團 通常可具有任何數量的選自鹵素的取代基。特定分子位置上的任何取代基或變量的定義應獨立于它在該分子其他位置上的 定義。應理解，本領域普通技術人員可選擇本發明化合物上的取代基和取代方式，以提供化 學性質穩定并容易用本領域已知技術和本文所述方法合成的化合物。術語“藥學上可接受的”指被聯邦或州政府管理機構批準，或美國藥典或其它通常 接受的藥典所列以便用于動物，更具體是用于人。術語“藥學相容成分”指與抗體或抗體衍 生物共同給予的藥學上可接受的稀釋劑、輔料、賦形劑或運載體。術語"生物上可接受的"表示適用于培養用來制造抗體的細胞系。生物上可接受 的鹽的例子包括，但不限于硫酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、硝 酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、異煙酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、酸式檸檬酸鹽、酒石酸 鹽、油酸鹽、鞣酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、龍膽酸鹽、延胡 索酸鹽、葡糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、蔗糖酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、谷氨酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸 鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽和雙羥萘酸鹽(即1，1’ -亞甲基雙-(2-羥基-3-萘甲酸鹽))。生物上可接受的鹽可包含其他分子，如乙酸根離子、琥珀酸根離子或其他抗衡離子。所述抗 衡離子可以是穩定母體化合物上的電荷的任何有機或無機部分。此外，生物學上可接受的 鹽在其結構中可具有一個以上的荷電原子。當生物學上可接受的鹽中具有多個荷電原子時 可具有多個抗衡離子。因此，生物學上(可接受的)鹽可具有一個或多個荷電原子和/或 一個或多個抗衡離子。“生物上可接受的溶劑合物”或“溶劑合物”表示一個或多個溶劑分子與巖藻糖類 似物的結合體。形成生物上可接受的溶劑合物的溶劑的例子包括，但不限于水、異丙醇、乙 醇、甲醇、DMS0、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。“小的吸電子基”是指在取代基連接位點的電負性大于，例如，氫原子或羥基或相 對于巖藻糖中該位點存在的取代基的任何取代基。通常，小的吸電子基有10個或更少的 原子(不包括氫)并包括諸如以下的基團硝基；氰基和氰基烷基(例如，-CH2CH2CN)；鹵 素；乙炔和其他的炔烴或鹵代炔烴(例如，-C ε CCF3)；烯烴或鹵代烯烴；丙二烯；羧酸，它 的酯、酰胺以及鹵素取代形式；磺酸和膦酸，它的酯、酰胺以及鹵素取代形式；鹵代烷基(例 如，-CF3、-CHF2、-CH2CF3)，酰基和鹵代酰基(例如，-C (0) CH3和-C (0) CF3)；烷基磺酰基和鹵 代烷基磺酰基(例如，-S (O)2烷基和-S(O)2鹵代烷基)；芳氧基(例如，苯氧基和取代的苯 氧基)；芳烷氧基(例如，芐氧基和取代的芐氧基)；以及環氧乙烷。優選具有8、7、6或更少 的原子(不包括氫)的小吸電子基。本發明的治療劑通常是基本純的，不含不需要的污染物。這意味著藥劑通常至少 約50% w/w(重量/重量)純，且基本不含干擾蛋白質和污染物。有時所述藥劑至少約80% w/w純，更優選至少90%或約95% w/w純。采用常規蛋白質純化技術可獲得至少99% w/ w的同源肽。MM本發明提供了制備核心巖藻糖基化降低的抗體和抗體衍生物的組合物和方法。 所述方法的提出部分基于實施例中描述的意外結果，所述實施例顯示，在包含巖藻糖類似 物的培養基中培養表達目的抗體或抗體衍生物的宿主細胞能產生核心巖藻糖基化降低的 抗體和抗體衍生物。文中，“核心巖藻糖基化”指在N-連接聚糖還原端的N-乙酰葡糖胺 (“GlcNAc”)上加入巖藻糖(“巖藻糖基化”)。還提供了通過這種方法產生的抗體和抗體 衍生物。在其他方面，提供了巖藻糖類似物和含有有效量巖藻糖類似物的培養基。在一些實施方式中，連接到Fc區(或結構域)的復雜N-糖苷-連接糖鏈的巖藻 糖基化被降低。文中，“復雜N-糖苷-連接糖鏈”通常結合于天冬酰胺297 (根據Kabat編 號)，但復雜N-糖苷連接糖鏈也可連接于其他天冬酰胺殘基。文中，所述復雜N-糖苷-連 接糖鏈具有雙觸角復合糖鏈，其大都具有以下結構
權利要求
1. 一種制造核心巖藻糖基化降低的修飾抗體或抗體衍生物的方法，所述方法包括 在包含有效量的巖藻糖類似物的培養基中，在合適生長條件下培養宿主細胞，其中所 述宿主細胞表達具有Fc結構域的抗體或抗體衍生物，所述Fc結構域具有至少一個復雜的 N-糖苷-連接糖鏈，而該糖鏈通過其還原端的N-乙酰葡糖胺連接于該Fc結構域，和 從所述細胞分離所述抗體或抗體衍生物， 其中所述巖藻糖類似物選自下組以下結構式⑴或(II)之一
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述細胞是重組宿主細胞。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述宿主細胞是中國倉鼠卵巢細胞。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主細胞是雜交瘤。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主細胞用補料分批培養基培養。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主細胞用連續補料培養基培養。
7.如權利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述培養基的體積至少為100升。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述培養基的體積至少為500升。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述培養基中添加了巖藻糖類似物以維持 其有效濃度。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述培養基包含至少兩種巖藻糖類似物。
11.如實施方式1所述的方法，其特征在于，所述培養基是無動物蛋白培養基。
12.如權利要求1所述的方法，其特征在于，少于20%的巖藻糖類似物被摻入所述抗體 或抗體衍生物的復雜N-糖苷-連接糖鏈。
13.如權利要求1所述的方法，其特征在于，少于5%的巖藻糖類似物被摻入所述抗體或抗體衍生物的復雜N-糖苷-連接糖鏈。
14.如權利要求1所述的方法，還包括從所述培養基中分離所述抗體或抗體衍生物。
15.如權利要求14所述的方法，包括用A蛋白柱純化所述抗體或抗體衍生物。
16.如權利要求14所述的方法，包括用陽離子或陰離子交換柱或疏水相互作用柱純化 所述抗體或抗體衍生物。
17.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗體是完整抗體。
18.如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述抗體是IgGl。
19.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗體是單鏈抗體。
20.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗體包含重鏈和輕鏈可變區和Fc區。
21.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗體衍生物包含抗體Fc區和非免疫球 蛋白的配體結合結構域。
22.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述巖藻糖類似物具有以下結構式(I)或 (II)
23.如權利要求22所述的方法，其中，R1-R4各自獨立選自下組-OH、-OC(O)H、-OC(O) C1-C10 烷基、-OC (0) C2-C10 烯基、-OC (0) C2-C10 炔基、-OC (0)芳基、-OC (0)雜環、-OC (0) C1-C10 亞烷基(芳基)、-OC (0) C2-C10 亞烷基(芳基)、-OC (0) C2-C10 炔基(芳基)、-OC (0) c「c10 亞烷基雜環、-OC(O) C2-C10 亞烯基(雜環)、-OC(O) C2-C10 炔基雜環、-OC(O) CH2O(CH2CH2O) nCH3 和-OC(0) CH2CH2O (CH2CH2O)nCH3 ；R5 選自下組-C = CH、-C = CCH3> -CH2C = CH、-C(O) OCH3> -CH(OAc)CH3> _CN、-CH2CN, -CH2X(其中 X 是 Br、Cl 或 I)和甲基環氧乙烷。
24.如權利要求22所述的方法，其特征在于，R1-R4各自獨立選自下組-OH和-OC(O) C「C10焼基。
25.如權利要求M所述的方法，其特征在于，R1-R4各自獨立選自下組-OH和-OAc。
26.如權利要求22所述的方法，其特征在于，R5選自下組-C^ CH和-C ^ CCH3。
27.如權利要求22所述的方法，其特征在于，R5是-C(0)0CH3。
28.如權利要求22所述的方法，其特征在于，R5選自下組-CN和-CH2CN。
29.如權利要求22所述的方法，其特征在于，R5是_CH2CN。
30.如權利要求22所述的方法，其特征在于，R5是-CH2X,其中X是Br、Cl或I。
31.如權利要求30所述的方法，其特征在于，R5是-CH2X,其中X是Br或I。
32.如權利要求31所述的方法，其特征在于，R5是-CH2X(其中X是Br)。
33.如權利要求22所述的方法，其特征在于，R5是-甲基環氧乙烷。
34.如權利要求22所述的方法，其特征在于，R5是-CH(OAc)CH3。
35.如權利要求22所述的方法，其特征在于，R5是-Cε CH, R1-R4是-OAc。
36.一種用于制造核心巖藻糖基化降低的抗體和抗體衍生物的哺乳動物細胞培養基， 其包含有效量的巖藻糖類似物其中所述巖藻糖類似物選自下組以下結構式⑴或(II)之一
37.如權利要求36所述的培養基，其特征在于，R5是-Cε CH, R1-R4是-OAc。
38.如實施方式36所述的培養基，其中未添加動物蛋白。
39.如實施方式36所述的培養基，其中未添加血清。
40.如實施方式36所述的培養基，其中未添加巖藻糖。
41.如實施方式36所述的培養基，其為粉末。
42.如實施方式36所述的培養基，其為液體。
43.如權利要求36所述的培養基，其特征在于，R1-R4各自獨立選自下組-OH和-OC(O) CfC10焼基。
44.如權利要求36所述的培養基，其特征在于，R1-R4各自獨立選自下組-OH和-OAc。
45.如權利要求36所述的培養基，其特征在于，R5選自下組-Cε CH和-C Ε CCH30
46.如權利要求36所述的培養基，其特征在于，R5是-C(0)0CH3。
47.如權利要求36所述的培養基，其特征在于，R5選自下組-CN和-CH2CN。
48.如權利要求36所述的培養基，其特征在于，R5是_CH2CN。
49.如權利要求36所述的培養基，其特征在于，R5是-CH2X,其中X是Br、Cl或I。
50.如權利要求49所述的培養基，其特征在于，R5是-CH2X,其中X是Br或I。
51.如權利要求50所述的培養基，其特征在于，R5是-CH2X,其中X是Br。
52.如權利要求36所述的培養基，其特征在于，R5是-甲基環氧乙烷。
53.如權利要求36所述的培養基，其特征在于，R5是-CH(OAc)CH3。
54.如權利要求36所述的培養基，其特征在于，R5是-Cε CH, R1-R4是-OAc。
55.一種具有以下結構式(I)或(II)的巖藻糖類似物
56.如權利要求55所述的巖藻糖類似物，其特征在于，R1-R4各自獨立選自下組-0H 和-OC(O) C1-C10 烷基。
57.如權利要求55所述的巖藻糖類似物，其特征在于，R1-R4各自獨立選自下組-0H 禾口 -OAc0
58.18.如權利要求55所述的巖藻糖類似物，其特征在于，R5選自下組-C ε CH 和-C 三 CCH3。
59.如權利要求55所述的巖藻糖類似物，其特征在于，R5是-C(0)0CH3。
60.如權利要求55所述的巖藻糖類似物，其特征在于，R5選自下組-CN和-CH2CN。
61.如權利要求55所述的巖藻糖類似物，其特征在于，R5是_CH2CN。
62.如權利要求55所述的巖藻糖類似物，其特征在于，R5是-CH2X,其中X是Br、Cl或I。
63.如權利要求55所述的巖藻糖類似物，其特征在于，R5是-CH2X,其中X是Br或I。
64.如權利要求55所述的巖藻糖類似物，其特征在于，R5是-CH2X,其中X是Br。
65.如權利要求55所述的巖藻糖類似物，其特征在于，R5是甲基環氧乙烷。
66.如權利要求55所述的巖藻糖類似物，其特征在于，R5是-CH(0Ac)CH3。
67.一種制造核心巖藻糖基化降低的修飾抗體或抗體衍生物的方法，所述方法包括 在包含有效量巖藻糖類似物的培養基中，在合適生長條件下培養宿主細胞，其中所述宿主細胞表達具有Fc結構域的抗體或抗體衍生物，所述Fc結構域具有至少一個復雜N-糖 苷-連接糖鏈，而該糖鏈通過其還原端的N-乙酰葡糖胺連接該!^c結構域，和 從所述細胞分離所述抗體或抗體衍生物，其中所述巖藻糖類似物選自下組以下結構式(III)或(IV)之一
68.如權利要求67所述的方法，其特征在于，R1是F。
69.如權利要求67所述的方法，其特征在于，R2是F。
70.如權利要求67所述的方法，其特征在于，R3是F。
71.如權利要求67所述的方法，其特征在于，R2和鏟各自是F。
72.如權利要求67所述的方法，其特征在于，R1和R2a各自是F。
73.一種具有選自結構式(III)或(IV)的結構式的化合物
74.如權利要求73所述的化合物，其特征在于，R1是F。
75.如權利要求73所述的化合物，其特征在于，R2是F。
76.如權利要求73所述的化合物，其特征在于，R3是F。
77.如權利要求73所述的化合物，其特征在于，R1是F，R2是F。
78.如權利要求73所述的化合物，其特征在于，R2和R2a各自是F。
79.如權利要求73所述的化合物，其特征在于，R1、R3和R4各自獨立選自下組_0H 和-OAc ； R2 是 F ；且 R5 是-CH3。
80.如權利要求73所述的化合物，其特征在于，R1、R3和R4各自獨立選自下組-0H 和-OAc ； R2是F ；R2a和Rh各自為H ；且R5是-CH30
81.一種用于制造核心巖藻糖基化降低的抗體和抗體衍生物的哺乳動物細胞培養基， 其包含有效量的巖藻糖類似物，其中所述巖藻糖類似物選自下組以下結構式(III)或
82.如權利要求81所述的培養基，所述培養基 (i)不含添加的動物蛋白；( )不含血清；(iii)不含添加的巖藻糖；和(iv)是粉末或液體。
83.如權利要求81所述的培養基，其特征在于，R1、R2、R2a、R3和R3a中至少有一個是氟 或氯。
84.如權利要求81所述的培養基，其特征在于，IMR2^R3和R3a中兩個是氟或氯。
85.—種制造核心巖藻糖基化降低的修飾抗體或抗體衍生物的方法，所述方法包括 在包含有效量巖藻糖類似物的培養基中，在合適生長條件下培養宿主細胞，其中所述宿主細胞表達具有Fc結構域的抗體或抗體衍生物，所述Fc結構域具有至少一個復雜N-糖 苷-連接糖鏈，而該糖鏈通過其還原端的N-乙酰葡糖胺連接于該Fc結構域，和 從所述細胞分離所述抗體或抗體衍生物， 其中所述巖藻糖類似物選自下組以下結構式(V)或(VI)之一
86.如權利要求85所述的方法，其特征在于，R2a和R3a各自是氫。
87.如權利要求85所述的方法，其特征在于，R5選自下 組-CH3、-CH2CH3> -CH2C = CH、-CH = CHCH3> -環丙基、-環氧乙烷、被甲基取代的_環氧乙 烷、-CH2F, -CH2Cl、-CH2Br、-CH2I、-CH = C = CH2, -CH2N3 和-CH2CH2N3O
88.如權利要求85所述的方法，其特征在于，所述小的吸電子基選自下組氟、氯、 溴、-CHF2、-CH = C = CH2^-C = CH,-C = CCH3、-CH2C = CH,-CO2H,-C (0) OC1-C4 烷基、-CH (OAc) 013、-^-012^-01込(其中1是肚、(1或I)和甲基環氧乙烷。
89.如權利要求85所述的方法，其特征在于，R\R2, R2\ R3, R3a和R4中至少有兩個是小 的吸電子基。
90.如權利要求85所述的方法，其特征在于，所述巖藻糖類似物選自表1、2和3的化合物。
91.一種用于制造核心巖藻糖基化降低的抗體和抗體衍生物的哺乳動物細胞培養基， 其包含有效量的巖藻糖類似物，其中所述巖藻糖類似物選自下組如權利要求85所述的以 下結構式(V)或(VI)之一，且所述有效量是足以制造核心巖藻糖基化降低的抗體和抗體衍 生物的量。
92.如權利要求91所述的哺乳動物細胞培養基，其特征在于，所述小的吸電子基選 自下組氟、氯、溴、_CHF2、-CH = C = CH2, -C = CH、-C = CCH3> -CH2C = CH、-CO2H, -C(O) OC1-C4 烷基、-CH(OAc)CH3> -CN、-CH2CN, _CH2X(其中 X 是 Br、Cl 或 I)、磺酸、磺酸酯、磺酰 胺、-SO2-C1-C4烷基、膦酸、膦酸酯、次膦酸、次膦酸酯和甲基環氧乙烷。
93.如權利要求91所述的哺乳動物細胞培養基，其特征在于，R1、! 2、!^、! 3、!^、! 4和R5 中至少有兩個是獨立選擇的小的吸電子基。
94.如權利要求91所述的哺乳動物細胞培養基，其特征在于，所述巖藻糖類似物選自 表1、2和3的化合物。
95.一種具有以上權利要求中提供的結構式I、II、III、IV、V或VI中任一個的化合物， 化合物 6、7、9、10、22、24、26、54、56-58、61-62、65 和 66 以及 2-氟-2-脫氧巖藻糖除外。
全文摘要
本發明提供了制備核心巖藻糖基化降低的抗體和抗體衍生物的方法和組合物。
文檔編號C07H13/06GK102076865SQ200980124932
公開日2011年5月25日 申請日期2009年5月1日 優先權日2008年5月2日
發明者B·托克, D·R·本杰明, D·薩斯曼, P·J·伯克, S·C·杰弗瑞, S·C·阿利 申請人:西雅圖基因公司