專利名稱：免疫結合劑的溶解性優化的制作方法
免疫結合劑的溶解性優化相關申請本申請要求于2008年6月25日提交的、名稱為“SolubilityOptimization of Immunobinders” 的 US 61/075，692 的優先權。
背景技術：
已證明抗體在癌癥、自身免疫疾病和其他病癥的治療中是非常有效和成功的治療 劑。盡管一般已在臨床上使用全長抗體，但存在使用抗體片段可以提供的許多優點，例如增 加組織穿透力、與增加其他效應子功能的能力結合的Fc效應子功能的不存在、和由較短的 全身體內半衰期導致的較少全身性副作用的可能性。抗體片段的藥代動力學性質表明，它 們可能特別良好地適合于局部治療方法。此外，抗體片段在特定表達系統中可以比全長抗 體更容易產生。一個類型的抗體片段是單鏈抗體(scFv)，其由經由接頭序列綴合的輕鏈可變結構 域與重鏈可變結構域(Vh)組成。因此，scFv缺乏所有抗體恒定區結構域，并且先前的 可變/恒定結構域界面的氨基酸殘基(界面殘基)變成溶劑暴露的。scFv可以通過已建立 的重組改造技術由全長抗體(例如IgG分子)制備。然而，全長抗體轉變成scFv通常導致 蛋白質的弱穩定性和溶解性、低產量和高聚集趨勢，這增加免疫原性危險。因此，已嘗試改善scFv的性質例如溶解性。例如，Nieba, L.等人(Prot. Eng. (1997) 10 =435-444)選擇已知為界面殘基的3個氨基酸殘基且使其突變。他們觀察到突變 的scFv在細菌中周質表達增加，以及熱誘導聚集速率減小，盡管熱力學穩定性和溶解性未 顯著改變。此外，在他們的公開物中，他們明確地陳述，他們未觀察到改造的scFv的天然蛋 白質狀態的任何溶解性的提高，如通過PEG沉淀法所測定的。其中對scFv內的特定氨基酸 殘基進行定點誘變的其他研究也已得到報告(參見例如，Tan，P. H.等人(1988)Biophys. J. 75:1473-1482 ；Worn，Α.和 Pluckthun, Α. (1998)Biochem. 37 :13120-13127 ；Worn，Α.和 Pluckthun，A. (1999) Biochem. 38 :8739-8750)。在這些各種研究中，選擇用于誘變的氨基酸 殘基基于其在scFv結構內的已知位置(例如，來自分子建模研究)進行選擇。在另一種方法中，將來自表達極弱的scFv的互補決定區(OTR)移植到已證實具有 有利性質的 scFv 的構架區內(Jung, S.和 Pluckthun, Α. (1997)Prot. Eng. 10 :959-966)。 所得到的scFv顯示改善的可溶性表達和熱力學穩定性。改造scFv以改善溶解性和其他功能性質中的進展在例如Worn，A.和Pluckthun， A. O001)J.Mol. Biol. 305 :989-1010中綜述。然而，仍需要允許合理設計免疫結合劑 (immunobinder)，特別是具有優良溶解性的scFv的新方法。此外，仍需要改造scFv和其他 類型的抗體從而賦予改善的溶解性一尤其是天然蛋白質的溶解性的方法。發明概述本發明提供了在可變重鏈區VH中包含溶解性增強基序的免疫結合劑以及改造免 疫結合劑例如scFv抗體以賦予改善的溶解性的方法。在特定的實施方案中，本發明的方法 包括用賦予改善的溶解性的優選氨基酸殘基置換免疫結合劑的重鏈可變區和/或輕鏈可 變區的序列內的對于溶解性潛在有問題的氨基酸。例如，在某些優選實施方案中，用親水性殘基置換疏水性殘基。優選地，提供的免疫結合劑，在本發明的改造方法中使用的或由本發明的改造方 法產生的免疫結合劑是scFv，但其他免疫結合劑例如全長免疫球蛋白、Fab片段、單結構域 抗體(例如Dab)和納米抗體(Nanobody)也可以根據所述方法進行改造。本發明還包括 根據改造方法制備的免疫結合劑，以及包含所述免疫結合劑和藥學上可接受的載體的組合 物。在一個方面，本發明提供了免疫結合劑，所述免疫結合劑在重鏈氨基酸位置12、 103和144 (AHo編號)中包含下列溶解性增強基序之一(a)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸⑶；(b)重鏈氨基酸位置103處的絲氨酸⑶；和(c)重鏈氨基酸位置144處的蘇氨酸⑴；或(al)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸⑶；(bl)重鏈氨基酸位置103處的蘇氨酸⑴；和(cl)重鏈氨基酸位置144處的絲氨酸⑶；或(a2)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸⑶；(b2)重鏈氨基酸位置103處的蘇氨酸⑴；和(c2)重鏈氨基酸位置144處的蘇氨酸(T)；或(a3)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸(S)；(b3)重鏈氨基酸位置103處的絲氨酸⑶；和(c3)重鏈氨基酸位置144處的絲氨酸⑶。在另一個方面，本發明提供了改造免疫結合劑的方法，免疫結合劑包含(i)重鏈 可變區或其片段，其中重鏈可變區包含Vh構架殘基和/或(ii)輕鏈可變區或其片段，其中 輕鏈可變區包含\構架殘基，所述方法包括A)選擇Vh構架殘基、\構架殘基或Vh和\構架殘基中的至少兩個氨基酸位置以 用于突變；和B)突變選擇用于突變的所述至少兩個氨基酸位置，其中，如果選擇用于突變的所述至少兩個氨基酸位置在Vh構架殘基中，那么置換 在選自12、103和144(根據AHo編號約定)的一個或多個重鏈氨基酸位置上，和/或其中，如果選擇用于突變的一個或多個氨基酸位置在\構架殘基中，那么置換在 選自15、52和147(根據AHo編號約定；在使用Kabat編號的情況下，氨基酸位置15、44和 106)的輕鏈氨基酸位置上。在下文中進一步詳細描述選擇用于突變的所述至少兩個氨基酸位置以及在選擇 的位置處插入的氨基酸殘基。下文中所示的氨基酸位置編號使用AHo編號系統；使用Kabat 編號系統的相應位置在本文中進一步描述，并且AHo和Kabat編號系統的轉換表在下文的 發明詳述中闡述。使用標準單字母縮寫代碼闡述氨基酸殘基。令人驚訝地發現，在指定的位置上指定的突變的存在增加了免疫結合劑的總體溶 解性而不對蛋白質的其他功能性質產生負面影響。例如，在scFv的VH中3個增強溶解性 的突變V12S、L144S和V103T組合的情況下，發現所述置換占整個scFv的溶解性的約60%。 這與現有技術中陳述的增加免疫結合劑的表達產量的嘗試不同。例如，US 6，815，540描述通過減少鏈內結構域間界面區域中的疏水性對免疫結合劑進行改進。為了所述目的，鑒定 了重鏈可變構架中的16個位置，所述位置可單獨地用選自10個氨基酸的一個或多個氨基 酸置換。發現產生的突變體的表達產量增加。此外，相同的研究組于1999年，即所提及的 美國專利的優先權日期后3年，發表了論文(參見Jung，S.，Honegger, A.和Pluckthun， Α. (1997)Prot. Eng. 10 :959-966)，該論文陳述，已在幾個研究中報導用更加親水的殘基置 換疏水性表面殘基提高了產量。根據該作者，產量的增加歸因于正確折疊與錯誤折疊材料 的聚集之間的改善的動力學分配，同時天然蛋白質的溶解性不受影響，其熱力學穩定性也 未受到顯著影響。因此，對于本領域技術人員來說很顯然的是，PlUckthim等人所提及的溶 解性參數只涉及可溶性表達而非天然蛋白質的總體溶解性。附圖概述當考慮本文的下列詳細描述時，本發明將得到更好的理解，并且除上文所述的那 些外的目的將變得顯然。此類描述參考附圖，其中
圖1描述了野生型ESBA105 (E105)和其溶解性變體的PEG沉淀溶解性曲線。圖2描述了野生型ESBA105(E105)及其溶解性變體的熱變性曲線圖，如在廣泛溫 度范圍Q5-96°C )下的熱攻擊后測量的。圖3描述了 SDS-PAGE凝膠，其顯示了在熱脅迫條件下溫育2周后各種ESBA105溶 解性突變體的降解行為。圖4描述了 EP43max和其優化的變體的熱變性曲線，如通過FIlR分析測定的。圖5描述了 578min-max和578min_max_DHP的熱穩定性，如通過FT-IR測量的。圖6a和6b說明了通過硫酸銨沉淀測量的578min_max和578min_max_DHP的溶解性。發明詳述本發明涉及用于增加免疫結合劑的溶解性的方法。更具體地，本發明公開了通過 在免疫結合劑中引入改善免疫結合劑的溶解性的氨基酸置換來優化免疫結合劑的方法。本 發明還涉及根據本發明的方法產生的經改造的免疫結合劑例如scFv。為了可更容易地理解本發明，首先定義某些術語。除非另外指出，本文中使用的所 有技術和科學術語具有與本發明所屬領域內的技術人員通常理解的意義相同的意義。雖然 與本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本發明的實踐或試驗中，但下 面描述了適當的方法和材料。本文中提及的所有公開物、專利申請、專利和其他參考資料以 它們的全文通過引用合并入本文。在矛盾的情況下，以本說明書(包括定義)為準。此外， 材料、方法和實施例只是舉例說明性的而非限定性的。本文中使用的術語“抗體”是免疫球蛋白的同義詞。根據本發明的抗體可以是 完整的免疫球蛋白或其片段，其包括免疫球蛋白的至少一個可變結構域，例如單個可變結 構域，Fv (Skerra A.和 Pluckthun，Α. (1988) Science 240 :1038-41)、scFv (Bird, R. Ε.等 人(1988) Science 242 :423-26 ；Huston, J. S.等人(1988 ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 5879-83), Fab, (Fab' ) 2、或本領域技術人員熟知的其他片段。本文中使用的術語“抗體構架(antibody framework) ”或“構架”是指可變結構 域VL或VH的一部分，其用作該可變結構域的抗原結合環的支架(Kabat，E.A.等人，(1991) Sequences of proteins ofimmunological interest. NIH Publication 91—3242)。
本文中使用的“抗體⑶R”或“⑶R”是指抗體的互補決定區，其如Kabat Ε. A.等人， (1991)Sequences of proteins of immunologicalinterest. NIH Publication 91-3242) 定義的由抗原結合環組成。抗體Fv片段的兩個可變結構域中的每一個包含例如3個CDR。術語“單鏈抗體”或“scFv”意指包含通過接頭連接的抗體重鏈可變區(Vh)和 抗體輕鏈可變區的分子。此類scFv分子可具有一般結構=NH2-V^接頭-Vh-COOH或 NH2-Vh-接頭-Vl-C00H。如本文中所使用的，“同一性”是指兩個多肽、分子之間或兩個核酸之間匹配的序 列。當兩個進行比較的序列中的位置都被相同的堿基或氨基酸單體亞單元占據(例如，如 果兩個DNA分子的每一個中的位置都被腺嘌呤占據，或兩個多肽的每一個中的位置都被賴 氨酸占據)時，各個分子在該位置上是同一的。兩個序列之間的“百分數同一性”是由這兩 個序列共有的匹配位置的數目除以進行比較的位置的數目再乘以100的函數。例如，如果 兩個序列的10個位置中有6個匹配，那么這兩個序列具有60%的同一性。例如，DNA序列 CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(總共6個位置中有3個位置匹配)。通常，在將兩個 序列比對以產生最大同一性時進行比較。這樣的比對可通過使用，例如，通過計算機程序例 如Align程序(DNAstar, Inc.)方便地進行的Needleman等(I97O)J. Mol. Biol. 48 :443-453 的方法來提供。“相似的”序列是當比對時共有相同和相似氨基酸殘基的序列，其中相似的殘基是 進行比對的參照序列中的相應氨基酸殘基的保守置換。在這點上，參照序列中的殘基的“保 守置換”是用在物理或功能上與相應的參照殘基相似(例如具有相似大小、形狀、電荷、化 學性質，包括形成共價鍵或氫鍵的能力等)的殘基進行的置換。因此，“經保守置換修飾的” 序列是與參照序列或野生型序列相異在于存在一個或多個保守置換的序列。兩個序列之間 的“百分數相似性”是包含由兩個序列共有的匹配殘基或保守置換的位置的數目除以進行 比較的位置的數目再乘以因子100的函數。例如，如果兩個序列的10個位置中有6個匹配 以及10個位置中有2個包含保守置換，那么這兩個序列具有80%的正相似性。本文中使用的“氨基酸共有序列”是指可使用至少兩個，優選更多的進行比對的氨 基酸序列的矩陣產生的氨基酸序列(允許在比對中出現缺口)，其使得可能確定各位置上 出現頻率最高的氨基酸殘基。共有序列是包含在各位置上出現頻率最高的氨基酸的序列。 如果兩個或更多個氨基酸等同地出現在單個位置上，那么共有序列包括兩個或所有此類氨 基酸。可在不同水平上分析蛋白質的氨基酸序列。例如，可在單個殘基水平、多個殘基水 平、具有缺口的多個殘基水平等上展示保守性或變異性。殘基可展示相同殘基的保守性或 可在種類水平上保守。氨基酸種類的實例包括具有下列的氨基酸種類極性的但不帶電荷 的側鏈或R基團(絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)；帶正電荷的R基團(賴氨酸、精 氨酸和組氨酸)；帶負電荷的R基團(谷氨酸和天冬氨酸)；疏水R基團(丙氨酸、異亮氨 酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸和酪氨酸)；以及特殊氨基酸種類(半胱氨 酸、甘氨酸和脯氨酸)。其他種類對于本領域技術人員來說是已知的并且可使用結構測定法 或其他數據來定義以估量可置換性。在該意義上，可置換的氨基酸可以指可在該位置上進 行置換并且保持功能保守性的任何氨基酸。然而，將認識到，相同種類的氨基酸在它們的生物物理性質上可具有一定程度的不同。例如，將認識到，某些疏水性R基團(例如，丙氨酸、絲氨酸或蘇氨酸)比其他疏水 性R基團(例如，纈氨酸或亮氨酸)更加親水(即，具有更高的親水性或更低的疏水性)。 相對親水性或疏水性可使用本領域公知的方法(參見，例如，Rose等人，Science, 229 834-838(1985)和 Cornette 等人，J Mol. Biol, 195 :659-685(1987))來測定。如本文中所使用的，當一個氨基酸序列(例如，第一 ￥11或八序列)與一個或多個 另外的氨基酸序列(例如，數據庫中的一個或多個VH或VL序列)比對時，可將一個序列 (例如，第一 Vh或\序列)中的氨基酸位置與一個或多個另外的氨基酸序列中的“相應位 置”相比較。如本文中所使用的，“相應位置”表示當對序列進行最優比對時，即當序列進行 比對以獲得最高百分數同一性或百分數相似性時進行比較的序列中的等同位置。如本文中所使用的，術語“抗體數據庫”是指兩個或更多個抗體氨基酸序列(“多 個”序列)的集合，通常是指數十個、數百個或甚至數千個抗體氨基酸序列的集合。抗體數 據庫可存儲例如抗體Vh區、抗體\區或兩者的集合的氨基酸序列，或可存儲由Vh和\區域 組成的scFv序列的集合。優選，可將數據庫存儲在可檢索的、固定的介質中，例如計算機上 可檢索的計算機程序中。在一個實施方案中，抗體數據庫是包含或由種系抗體序列組成的 數據庫。在另一個實施方案中，抗體數據庫是包含或由成熟(即，表達的)抗體序列組成的 數據庫(例如，成熟抗體序列的Kabat數據庫，例如KBD數據庫)。在另一個實施方案中，抗 體數據庫包含或由功能性選擇的序列(例如，根據QC測定選擇的序列)組成。術語“免疫結合劑”是指分子，所述分子包含抗體的全部或部分抗原結合位置，例 如重鏈和/或輕鏈可變結構域的全部或一部分，這樣免疫結合劑能夠特異性識別靶抗原。 免疫結合劑的非限定性實例包括全長免疫球蛋白分子和scFv，以及抗體片段，包括但不限 于(i)Fab片段，由\、VH、Cl和ChI結構域組成的單價片段；(ii)F(ab' )2片段，包含通 過鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段，(iii)Fab'片段，其基本上是具有 鉸鏈區的一部分的 Fab (參見，FUNDAMENTALIMMUNOLOGY(Paul 編輯，3. sup. rd ed. 1993)； (iv)由Vh和ChI結構域組成的Fd片段；(ν)包含抗體的單臂的\和Vh結構域的Fv片 段；(vi)單結構域抗體例如Dab片段(Ward等人，(1989)Nature 341 :544-546)，其由Vh 或 Vl 結構域組成，Camelid(參見 Hamers-Casterman，等人，Nature 363 :446-448(1993) 和 Dumoulin 等人，Protein Sciencell :500-515(2002))或 Shark 抗體(例如，shark Ig-NARs Nanobodie S )；和(Vii)納米抗體(Nanobody)，包含單個可變結構域和兩個 恒定結構域的重鏈可變區。如本文中所使用的，術語“功能性質”是例如為了提高多肽的生產性質或治療功 效，其提高(例如相對于常規多肽)對于本領域技術人員來說是期望的和/或有利的多肽 (例如，免疫結合劑)的性質。在一個實施方案中，功能性質是穩定性(例如，熱穩定性)。 在另一個實施方案中，功能性質是溶解性(例如，在細胞條件下)。在另一個實施方案中，功 能性質是聚集行為。在另一個實施方案中，功能性質是蛋白質表達(例如，在原核細胞中)。 在另一個實施方案中，功能性質是在相應的純化方法中內含體溶解后的重折疊效率。在某 些實施方案中，抗原結合親和力不是期望提高的功能性質。在另一個實施方案中，功能性質 的提高或改善不牽涉抗原結合親和力的顯著改變。術語“溶解性”，如本文中所使用的，是指天然蛋白質，即單體、非聚集的和 功能性免疫結合劑的溶解性。“增加的溶解性”意指天然蛋白質的溶解性的提高，其優選通過下列方法中的至少一個方法測定PEG沉淀法、硫酸銨沉淀法、重折疊得率 或本領域技術人員已知的任何其他測定溶解性的方法。PEG沉淀法是如Atha等人 在〃 Mechanism ofPrecipitation of Proteins by Polyethylene Glycols" , JBC,256 12108-12117(1981)中描述的方法。可以例如如下進行硫酸銨沉淀法制備20mg/ml蛋白 質溶液的10 μ 1等分，向每一個所述等分中加入10 μ 1不同飽和度(例如35% ,33^^31%、 ^^^25^^20^^0 15%)的(NH4)2SO4溶液，然后渦旋5秒并在室溫下溫育30分鐘。在以 6000rpm于4°C離心30分鐘后，測定上清液中的蛋白質濃度。在該方法中，不同蛋白質的比 較物(comparator)是V50值，其是50%的蛋白質沉淀時所處的(NH4) 2S04飽和度的百分數。 根據上清液中測定的可溶性蛋白質對應用的(NH4)2SO4飽和度的百分數的曲線測定V50。重 折疊得率相應于在相應制造/純化方法中從溶解的內含體獲得的正確折疊的蛋白質的百 分數。本文中使用的術語溶解性不是指可溶性表達。具有提高的溶解性的免疫結合劑在第一方面，提供免疫結合劑，其在重鏈氨基酸位置12、103和144 (AHo編號)中 包含下列溶解性增強基序之一(a)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸(S)；(b)重鏈氨基酸位置103處的絲氨酸⑶；和(c)重鏈氨基酸位置144處的蘇氨酸⑴；或(al)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸(S)；(bl)重鏈氨基酸位置103處的蘇氨酸(T)；和(cl)重鏈氨基酸位置144處的絲氨酸⑶；或(a2)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸(S)；(b2)重鏈氨基酸位置103處的蘇氨酸⑴；和(c2)重鏈氨基酸位置144處的蘇氨酸⑴；或(a3)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸(S)；(b3)重鏈氨基酸位置103處的絲氨酸⑶；和(c3)重鏈氨基酸位置144處的絲氨酸⑶；或令人驚訝地發現，在指定位置上指定的氨基酸的存在增加了完整免疫結合劑的總 體溶解性。例如，在scFv的VH中3個溶解性增強突變V12S、L144S和V103T組合的情況下， 發現所述置換占完整scFv的溶解性的大約60%。因為疏水斑塊在所有免疫結合劑的可變 結構域中是保守的，因此一個或多個指定位置上的置換可用于提高任何免疫結合劑的溶解 性。免疫結合劑優選是scFv抗體、全長免疫球蛋白、Fab片段、Dab或納米抗體。在優選實施方案中，免疫結合劑還包含選自下列的一個或多個氨基酸(a)輕鏈 氨基酸位置31處的天冬氨酸(D)、(b)輕鏈氨基酸位置83處的谷氨酸(E)、(c)重鏈氨基 酸位置43處的精氨酸(R)、(d)重鏈氨基酸位置67處的亮氨酸(L)和(e)重鏈氨基酸位置 78處的丙氨酸(A)。一個或多個指定的氨基酸在相應位置上的存在賦予免疫結合劑增強的 穩定性。本文中指定的氨基酸可存在于天然發生的免疫結合劑或其衍生物中，或免疫結合 劑可被改造而摻入一個或多個上述氨基酸。
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在優選實施方案中，本文中公開的免疫結合劑特異性結合人TNF α或人VEGF。具有提高的溶解性的免疫結合劑的改造如實施例中詳細描述的，本文中描述的基于序列的方法已成功用于鑒定賦予提高 的溶解性的特定氨基酸殘基置換。實施例列出了在免疫結合劑(例如，scFv)的VH區內和 任選地VL區中在確定的氨基酸位置處的示例性和優選氨基酸置換。示例性置換包括氨基 酸位置處有問題的氨基酸殘基(例如，暴露于溶劑的疏水性殘基)的置換(更親水并且在 數據庫(例如，成熟抗體(KDB)數據庫)中以更高的頻率發生)。特別優選的置換是比有問 題的殘基更親水的最頻繁發生的殘基。在其他實施方案中，更加親水的氨基酸選自丙氨酸 (A)、絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)。因此，本發明提供了其中將一個或多個特定氨基酸置換引入免疫結合劑例如scFv 抗體內的改造方法。此種置換可以使用標準分子生物學方法例如定點誘變、PCR介導的誘 變等來進行。如實施例中所示，下列氨基酸位置已被鑒定為有問題的氨基酸(即，所謂的“疏水 斑塊”)以用于在指定的Vh或\序列中進行改造Vh 氨基酸位置 2、4、5、12、103 和 144 ；和Vl 氨基酸位置15,52和147。使用的編號是AHo編號系統；將AHo編號轉換成Kabat系統編號的轉換表示于表 1禾口 2中。令人驚訝地發現，VH位置12、103、144(根據AHo編號系統)中的兩個或更多個位 置處的置換影響整個免疫結合劑的總體溶解性。因為疏水斑塊在所有免疫結合劑的可變結 構域中是保守的，因此至少兩個在指定的位置處的置換可用于提高任何免疫結合劑的溶解 性。在一個實施方案中，本發明提供了改造免疫結合劑例如scFv抗體的方法，其中在 一個或多個上述鑒定的氨基酸位置處產生至少兩個氨基酸置換，從而產生免疫結合劑的變 異(即，突變)形式。因此，在另一個方面，本發明提供了改造免疫結合劑的方法，所述方法包括A)在Vh區、八區或Vh和\區內選擇至少兩個氨基酸位置用于突變；和B)突變選擇用于突變的至少兩個氨基酸位置，其中如果選擇用于突變的所述至少兩個氨基酸位置位于中，那么置換是選自 12、103和144(根據AHo編號約定；在使用Kabat編號的情況下，氨基酸位置11、89和108) 的至少兩個重鏈氨基酸位置，和/或其中如果選擇用于突變的一個或多個氨基酸位置在&區中，那么置換在選自15、 52和147(根據AHo編號約定；在使用Kabat編號的情況下，氨基酸位置15、44和106)的 輕鏈氨基酸位置處。在某些實施方案中，氨基酸位置被疏水性氨基酸(例如，亮氨酸(L)或纈氨酸(V)) 占據。在一個實施方案中，重鏈氨基酸位置12處的氨基酸是纈氨酸(V)。在另一個實施方 案中，重鏈氨基酸位置103處的氨基酸是纈氨酸(V)。在另一個實施方案中，重鏈氨基酸位 置144處的氨基酸是亮氨酸(L)。在另一個實施方案中，輕鏈氨基酸位置15處的氨基酸是 纈氨酸(V)。在另一個實施方案中，輕鏈氨基酸位置52處的氨基酸是苯丙氨酸(F)。在另一個實施方案中，輕鏈氨基酸位置147處的氨基酸是纈氨酸(V)。優選，突變是用更親水的氨基酸置換選擇的氨基酸位置處的氨基酸。在其他實施 方案中，更親水的氨基酸選自絲氨酸( 或蘇氨酸(T)。在某些實施方案中，所述方法包括a)在免疫結合劑中選擇至少兩個氨基酸位置 用于突變；和b)突變選擇用于突變的至少兩個氨基酸位置，其中突變包括選自下列的至少 兩個置換(i)重鏈氨基酸位置12 (使用AHo編號)(在使用Kabat編號的情況下，位置11) 處的絲氨酸⑶；(ii)重鏈氨基酸位置103 (使用AHo編號)(在使用Kabat編號的情況下，位置89) 處的絲氨酸⑶或蘇氨酸⑴；和(iii)重鏈氨基酸位置144(使用AHo編號)(在使用Kabat編號的情況下，位置 108)處的絲氨酸(S)或蘇氨酸(T)。在非常優選的實施方案中，重鏈氨基酸位置12、103和144中的至少一個是蘇氨酸 ⑴。在其他實施方案中，突變包括在輕鏈氨基酸位置15 (使用AHo或Kabat編號)處 使用蘇氨酸(T)的置換和/或在輕鏈氨基酸位置147 (使用AHo編號)(在使用Kabat編號 約定的情況下，位置106)處使用丙氨酸(A)的置換。在其他實施方案中，突變導致溶解性增加至少2倍(例如，溶解性增加2倍、2. 5 倍、3倍、3. 5倍、4倍或更多倍)。在另一個實施方案中，免疫結合劑的熱穩定性、重折疊、表達產量、聚集和/或結 合活性未受到突變的不利影響。在某些實施方案中，突變還包括一個或多個選自下列的在氨基酸位置(AHo編號 約定)處的穩定性突變(a)輕鏈氨基酸位置31處的天冬氨酸(D) ； (b)輕鏈氨基酸位置83 處的谷氨酸(E) ； (c)重鏈氨基酸位置43處的精氨酸(I ) ； (d)重鏈氨基酸位置67處的亮氨 酸(L)；和(e)重鏈氨基酸位置78處的丙氨酸(A)。已證明此類突變對免疫結合劑的穩定 性具有影響。在另一個方面，本發明提供了根據本發明的方法制備的免疫結合劑。在某些示例性實施方案中，根據本發明的方法改造的免疫結合劑是本領域公認的 免疫結合劑(其結合具有治療重要性的靶抗原)或包含來源于具有治療重要性的免疫結 合劑的可變區(VL和/或VH區)或一個或多個CDR(例如，CDRLU CDRL2、CDRL3、CDRHU CDRH2和/或CDRH3)的免疫結合劑。例如，目前由FDA或其他管理機構批準的免疫結合劑 可以根據本發明的方法進行改造。更具體而言，這些示例性免疫結合劑包括但不限于，抗 CD3 抗體例如莫羅單抗(Orthoclone 0KT3 Johnson&Johnson, Brunswick, NJ;參見 Arakawa 等人 J. Biochem，(1996) 120 :657-662 ；Kung 和 Goldstein 等人，Science (1979)， 206 =347-349)、抗 CDll 抗體例如依法珠單抗(Raptiva , Genentech, South San Francisco, CA)、抗 CD20 抗體例如利妥昔單抗(Ri tUXan /Mabthera , Genentech， South San Francisco，CA)、托西莫單抗(Bexxar ,GlaxoSmithKline,London)或替伊莫 單抗(Zeval in , Biogen I dec, Cambridge ΜΑ)(參見美國專利 5，736，137 ；6, 455, 043 ； 和 6，682，734)、抗0)25(11^21^)抗體例如達克珠單抗(Zenapax , Roche，Basel，Switzerland)或巴利昔單抗(Simulect , Novartis, Basel, Switzerland)、抗 CD33 抗體例如吉妥珠單抗(Mylotarg ，Wyeth，Madison, NJ-參見美國專利5，714，350和 6，350, 861)、抗 CD52 抗體例如阿侖珠單抗(Campath , Millennium Pharmacueticals, Cambridge, ΜΑ)、抗 GpIIb/glla 抗體例如阿昔單抗(ReoPro ，Centocor，Horsham, PA)、 抗TNF α抗體例如英利昔單抗(Remi cade ,Centocor，Horsham, PA)或阿達木單抗 (Humi ra , Abbott, AbbottPark，IL-參見美國專利 6，258，562)、抗 IgE 抗體例如奧馬 珠單抗(Xolair , Genentech，South San Francisco，CA)、抗 RSV 抗體例如帕利珠單抗 (Synag iS ，Medimmune，Gaithersburg, MD-參見美國專利 5,824，307)、抗 EpCAM 抗體 例如依決洛單抗(Panorex ,Centocor)、抗EGFR抗體例如西妥昔單抗(Erbitux , ImcloneSystems, New York, NY)或中白木單抗(VeCt ibix , Amgen, ThousandOaks, CA)、 抗HER2/neu抗體例如曲妥珠單抗(Hercept in , Genentech)、抗α 4整聯蛋白抗體例 如那他珠單抗(Tysabri ,Biogenidec)、抗C5抗體例如依庫珠單抗(Soliris , AlexionPharmaceuticals, Chesire, CT)和抗 VEGF 抗體例如貝伐珠單抗(Avast in , Genentech-參見美國專利 6,884,879)或雷珠單抗(Lucent i S , Genentech)。在某些示例性實施方案中，根據本發明的方法改造的免疫結合劑是上述本領域公 認的免疫結合劑。在優選實施方案中，免疫結合劑是scFv抗體。在其他實施方案中，免疫 結合劑是例如全長免疫球蛋白、Dab、納米抗體或Fab片段。盡管描述了前述內容，但在多種實施方案中，某些免疫結合劑被排除用于本發明 的改造方法和/或被排除成為通過改造方法產生的免疫結合劑組合物。例如，在多種實施 方案中，存在附帶條件，即免疫結合劑不是PCT公開號WO 2006/131013和WO 2008/006235 中公開的任何scFv抗體或其變體，例如，PCT公開號WO 2006/131013和W02008/006235中 公開的ESBA105或其變體，所述專利各自的內容明確地通過引用合并入本文。優選，本文中公開的、用于本文中公開的方法的或通過本文中公開的方法產生的 免疫結合劑分別是scFv抗體，但也包括其他免疫結合劑，例如全長免疫球蛋白、Fab片段或 本文中描述的任何其他類型的免疫結合劑(例如Dab或納米抗體)。在優選實施方案中，本文中公開的、用于本文中公開的方法的或通過本文中公開 的方法產生的免疫結合劑分別特異性結合人TNF α或人VEGF。本發明還包括包含本文中公開的免疫結合劑和藥學上可接受的載體的組合物。scFv組合物和制劑本發明的另一個方面涉及按照本發明的方法制備的scFv組合物。因此，本發明提 供了經改造的scFv組合物，其中與原始的目的scFv相比，已將一個或多個溶解性增強突變 導入氨基酸序列，其中突變已被導入疏水氨基酸殘基的位置。在一個實施方案中，scFv已 進行了改造，從而包含一個突變的氨基酸位置(例如，一個構架位置)。在其他實施方案中， scFv已進行了改造，從而包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10個突變的氨基酸位置(例如， 構架位置)。在某些實施方案中，突變還包括于2008年6月25日提交的、名稱為“Methods of Modifying Antibodies, and Modified Antibodieswith Improved Functional Properties”的 PCT 申請 PCT/CH2008/000285 或 2008 年 3 月 12 日提交的、名稱為“MethodsofModifying Antibodies, and Modified Antibodies with ImprovedFunctional !Properties”的美國臨時申請號系列號61/069，056(兩者通過引用合并入本文)中所述的 一個或多個穩定性突變。例如，免疫結合劑還可包含選自下列的在氨基酸位置(AHo編號約 定)處的置換(a)輕鏈氨基酸位置31處的天冬氨酸(D) ； (b)輕鏈氨基酸位置83處的谷氨 酸(E) ； (c)重鏈氨基酸位置43處的精氨酸(R) ； (d)重鏈氨基酸位置67處的亮氨酸(L)； 和(e)重鏈氨基酸位置78處的丙氨酸(A)。一個或多個在指定位置處的突變對整個免疫結 合劑的總體溶解性具有影響。在其他實施方案中，突變還包括下列穩定性突變(AHo編號約 定)(a)輕鏈氨基酸位置31處的天冬氨酸⑶；(b)輕鏈氨基酸位置83處的谷氨酸(E)； (c)重鏈氨基酸位置43處的精氨酸(R) ； (d)重鏈氨基酸位置67處的亮氨酸(L)；和(e)重 鏈氨基酸位置78處的丙氨酸(A)。本發明的另一個方面涉及本發明的SCFv組合物的藥物制劑。此類制劑通常包含 scFv組合物和藥學上可接受的載體。如本文中所使用的，“藥學上可接受的載體”包括生理 上相容的任何和所有溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。優 選，載體適合于例如靜脈內、肌內、皮下、胃腸外、脊柱、表皮施用(例如，通過注射或輸注)、 或局部施用(例如，至眼或皮膚)。取決于施用途徑，可將scFv包被在材料中以保護化合物 免受酸的作用和可使化合物失活的其他天然條件的損害。本發明的藥物化合物可包括一種或多種藥學上可接受的鹽。“藥學上可接受的鹽” 是指保持親本化合物期望的生物學活性并且不提供任何不想要的毒理學效應的鹽(參見 例如，Berge，S. Μ.等人(1977) J. Pharm. Sci. 66 :1-19)。此類鹽的實例包括酸加成鹽和堿加 成鹽。酸加成鹽包括從無毒無機酸例如鹽酸、硝酸、磷酸(phosphoric)、硫酸(sulfuric)、 氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸(phosphorous)等衍生的鹽，以及從無毒有機酸例如脂肪族一羧酸 和二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳香族酸、脂肪族和芳香族磺酸等衍生的鹽。堿 加成鹽包括從堿土金屬例如鈉、鉀、鎂、鈣等衍生的鹽，以及從無毒有機胺例如N，N' - 二芐 基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等衍生的鹽。本發明的藥物組合物還可包含藥學上可接受的抗氧化劑。藥學上可接受的抗氧 化劑的實例包括(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸 鈉(sodium metabisulfite)、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑例如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁 羥基茴香醚(BHA)、丁羥甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α -生育酚等；和(3)金屬螯合 劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。可用于本發明的藥物組合物的適當的水性和非水性載體的實例包括水、乙醇、多 元醇(例如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇等)和其適當的混合物，植物油例如橄欖油，和可注射 的有機酯例如油酸乙酯。可以例如通過使用包衣材料例如卵磷脂、在分散體的情況下通過 維持需要的顆粒大小和通過使用表面活性劑維持恰當的流動性。此類組合物還可包含佐劑例如防腐劑、濕潤劑、乳化劑和分散劑。可通過滅菌方法 (同上)和通過包含各種抗菌劑和抗真菌劑例如對羥基苯甲酸酯(paraben)、氯丁醇、苯酚、 山梨酸等來確保防止微生物的存在。也可期望將等滲劑例如糖、氯化鈉等包含入組合物。 此外，可通過包含延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鋁和明膠來獲得可注射藥物形式的延長吸 收。藥學上可接受的載體包括無菌水溶液或分散體以及用于臨時制備無菌注射液或
13分散體的無菌粉劑。此類介質和試劑用于藥物活性物質的用途在本領域內是已知的。除非 任何常規介質或試劑與活性化合物不相容，否則預期其在本發明的藥物組合物中的用途。 還可將補充的活性化合物摻入組合物。治療性組合物通常必須是無菌的并且在生產和貯存的條件下是穩定的。可將組合 物配制為溶液、微乳劑、脂質體或適合高藥物濃度的其他有序結構。載體可以是包含例如 水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇和液體聚乙二醇等)和其適當的混合物的溶劑或分 散介質。可以例如通過使用包衣例如卵磷脂、在分散體的情況下通過維持需要的顆粒大小 和通過使用表面活性劑來維持恰當的流動性。在許多情況下，優選在組合物中包含等滲劑， 例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨糖醇或氯化鈉。可通過在組合物中包含延遲吸收的試劑例 如單硬脂酸鹽和明膠來獲得可注射組合物的延長的吸收。無菌注射液可通過將活性化合物以需要的量與上面例舉的成分的一種或組合一 起摻入適當的溶劑中，然后進行滅菌微過濾(如果需要的話)來制備。通常，通過將活性化 合物摻入包含基本分散介質和需要的來自上面列舉的成分的其他成分的無菌媒介物來制 備分散體。在用于制備無菌注射液的無菌粉劑的情況下，制備的優選方法是從之前無菌過 濾的溶液產生包含活性成分和任何額外的期望的成分的粉劑的真空干燥和冷凍干燥(凍 干法(Iyophilization)) ο可與載體材料組合從而產生單個劑型的活性成分的量將隨正在治療的受試者以 及施用的特定模式的變化而變化。可與載體材料組合從而產生單個劑型的活性成分的量 通常是產生治療效果的組合物的量。一般地，除百分之百外，該量將在大約0. 01 %至大約 99 %的活性成分，優選大約0. 1 %至大約70 %，最優選大約1 %至大約30 %的活性成分的范 圍內(與藥學上可接受的載體組合)。調整給藥方案以提供最佳的期望的應答(例如，治療應答)。例如，可施用單個大 丸劑，可在一段時間內施用幾份分開的劑量或可根據治療狀況的緊急性的需要，按比例減 少或增加劑量。特別有利地以單位劑型(dosage unit form)配制胃腸外組合物以便施用和 保持劑量均一。本文中使用的單位劑型是指適合用作用于待治療的受試者的單份劑量的物 理上分開的單位；各單位包含經計算與需要的藥物載體一起產生期望的治療效果的預先確 定量的活性化合物。本發明的單位劑型的規格(specification)受制于和直接取決于(a) 活性化合物的獨特特征和要獲得的具體治療效果，和(b)配制用于治療個體的敏感性的此 類活性化合物的領域中固有的限制。抗體位置編號系統提供了用于鑒定抗體重鏈和輕鏈可變區中的氨基酸殘基位置的兩個不同編號系 統的換算表。Kabat編號系統進一步描述于Kabat等人(Kakit，E. Α.，等人(1991) kquences of Proteins of Immunologicallnterest,第5版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)。AHo 編號系統進一步描述于 Honegger，A.和 Pluck thun, Α. (2001) J. Mol. Biol. 309 :657-670)。重鏈可變區編號表1 重鏈可變結構域中殘基位置的換算表
權利要求
1.一種免疫結合劑，其包含重鏈氨基酸位置12、103和144 (AHo編號)中的下列溶解性 增強基序之一(a)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸(S)；(b)重鏈氨基酸位置103處的絲氨酸(S)；和(c)重鏈氨基酸位置144處的蘇氨酸(T)；或 (al)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸(S)； (bl)重鏈氨基酸位置103的蘇氨酸(T)；和 (cl)重鏈氨基酸位置144處的絲氨酸(S)；或 (a2)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸(S)； (b2)重鏈氨基酸位置103處的蘇氨酸(T)；和 (c2)重鏈氨基酸位置144處的蘇氨酸(T)；或 (a3)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸(S)； (b3)重鏈氨基酸位置103處的絲氨酸(S)；和 (c3)重鏈氨基酸位置144處的絲氨酸(S)。
2.權利要求1的免疫結合劑，其還包含(a)輕鏈氨基酸位置31處的天冬氨酸(D)；(b)輕鏈氨基酸位置83處的谷氨酸(E)；(c)重鏈氨基酸位置43處的精氨酸(R)；(d)重鏈氨基酸位置67處的亮氨酸(L)；和/或(e)重鏈氨基酸位置78處的丙氨酸(A)。
3.增強免疫結合劑的溶解性的方法，所述免疫結合劑包含重鏈可變(Vh)區或其片段， 所述方法包括A)在Vh區中選擇至少兩個氨基酸位置用于突變；和B)突變選擇用于突變的所述至少兩個氨基酸位置，其中所述至少兩個氨基酸位置選自由12、103和144(根據AHo編號約定)組成的重鏈 氨基酸位置，并且突變包括用親水性氨基酸置換所選擇的氨基酸位置處的氨基酸。
4.權利要求3的方法，其中所述親水性氨基酸是(a)重鏈氨基酸位置12處的絲氨酸⑶；(b)重鏈氨基酸位置103處的絲氨酸( 或蘇氨酸(T)；和/或(c)重鏈氨基酸位置144處的絲氨酸( 或蘇氨酸(T)。
5.權利要求3或4的方法，其中選擇用于突變的氨基酸位置處的氨基酸是疏水性氨基酸。
6.權利要求5的方法，其中所述疏水性氨基酸是亮氨酸(L)或纈氨酸(V)。
7.權利要求3至6的任一項的方法，其中(a)重鏈氨基酸位置12處的選擇用于突變的氨基酸是纈氨酸(V)；(b)重鏈氨基酸位置103處的選擇用于突變的氨基酸是纈氨酸(V)；和(c)重鏈氨基酸位置144處的選擇用于突變的氨基酸是亮氨酸(L)。
8.權利要求3至7的任一項的方法，其中免疫結合劑的熱穩定性、重折疊、表達產量、聚 集和/或結合活性未受到突變的不利影響。
9.權利要求3至8的任一項的方法，其中所述突變導致溶解性增加至少2倍。
10.權利要求3至9的任一項的方法，其中所述突變還包括在選自下列的氨基酸位置 (AHo編號約定)處引入一個或多個突變的步驟(a)輕鏈氨基酸位置31處的天冬氨酸(D)；(b)輕鏈氨基酸位置83處的谷氨酸(E)；(c)重鏈氨基酸位置43處的精氨酸(R)；(d)重鏈氨基酸位置67處的亮氨酸(L)；和(e)重鏈氨基酸位置78處的丙氨酸(A)。
11.根據權利要求3至10的任一項的方法制備的免疫結合劑。
12.權利要求1、2或11的任一項的免疫結合劑，其為scFv抗體、全長免疫球蛋白、Fab 片段、Dab或納米抗體。
13.權利要求1、2、11或12的任一項的免疫結合劑，其中所述免疫結合劑特異性結合人 TNFa 或人 VEGF。
14.包含權利要求1、2、11、12或14的任一項的免疫結合劑和藥學上可接受的載體的組 合物。
全文摘要
本發明提供了使用基于序列的分析和合理的策略來提高免疫結合劑，特別是單鏈抗體(scFv)的溶解性的方法。本發明提供了改造免疫結合劑，特別是scFv的方法，其中用通過分析選擇的穩定scFv序列的數據庫而鑒定的親水性殘基進行一個或多個置換。本發明還提供了根據本發明的改造方法制備的具有優化的溶解性的免疫結合劑。
文檔編號C07K16/22GK102076715SQ200980123815
公開日2011年5月25日 申請日期2009年6月25日 優先權日2008年6月25日
發明者D·厄里什, L·波拉斯 申請人:艾斯巴技術,愛爾康生物醫藥研究裝置有限責任公司