Stat3信號傳導的調節劑的制作方法

專利名稱：Stat3信號傳導的調節劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及STAT3和SPl間相互作用，且盡管不絕對，但特別涉及鑒定能夠調節 STAT3和SPl間相互作用的化合物的方法。
背景技術：
瘦素(1印tin)，是脂肪組織分泌的激素，通過調節下丘腦神經元活性來調節食物 攝入和能量消耗(1)。通過飽和轉運機制，循環的瘦素穿過血腦屏障進入腦，作用于至少兩 類神經元促進使食欲減退的阿片黑素促皮質激素原(POMC)產生的POMC神經元和下調促 進食欲的神經肽Y(NPY)和刺鼠相關蛋白(AgRP)產生和分泌的NPY/AgRP神經元Q-4)。一 旦它結合且激活長形式的瘦素受體(OBRb)，但不是其他形式的瘦素受體(OBRa、Re、Rd和 Re)，瘦素就通過復合信號傳導途徑發揮它的作用(5，6)。激活的OBRb啟動Jak2_STAT3途 徑，包括STAT3磷酸化和易位至細胞核，STAT3與靶基因啟動子/輔因子復合體結合，和其 最終調節對靶基因啟動子活性，例如POMC轉錄的激活(7)。血漿和腦脊液(CSF)的瘦素水平經常在肥胖個體中更高，如同預期他們的脂肪體 積與瘦人相比更高一樣(8)。然而，由于瘦素信號傳導途徑的損傷，瘦素在這些動物中不能 實現下游的生理學結果，這統稱為瘦素抗性(9)。作為瘦素抗性基礎的分子機制仍然不清 楚。一種可能性是，S0CS3活性的增加抑制了 STAT3磷酸化，隨后阻止了 STAT3易位至細胞 核和作用于它的靶基因，這基于對高脂肪飲食喂養16周后DIO小鼠的分析(10)。最近利用 高脂肪飲食4-5周后DIO小鼠的研究顯示，瘦素刺激的STAT3磷酸化水平與普通飲食(chow diet)的消瘦小鼠的STAT3磷酸化水平是相當的(10，11)。高脂肪喂養4_5周后的小鼠表 現出新陳代謝改變和瘦素水平增加，這表明它們可能處于瘦素抗性的早期(10)。STAT3磷 酸化在瘦素抗性的早期沒有改變但是在瘦素抗性的晚期受到抑制這一事實提示，瘦素抗性 的早期和晚期間進行著不同的分子機制。對于瘦素抗性的早期，由于STAT3磷酸化水平沒 有改變，故損傷肯定位于STAT激活的下游，可能通過轉錄因子。轉錄因子R)X01是含有叉頭框(forWieadbox)的蛋白0超家族的成員，而且是參 與包括通過蛋白-DNA或蛋白-蛋白相互作用的生長和增殖及代謝調節的多方面作用的中 心信號分子(14，15)。FoxOl蛋白在人類中為655個氨基酸而在小鼠中為個652個氨基酸 (GenBank 登錄號 Q12778 (人類)和 AJ252157 (小鼠))。POMC是瘦素所誘導的關鍵神經肽(16)。POMC表達在瘦素信號傳導缺陷小鼠模型， 如ob/ob和db/db小鼠中減少(17)。POMC表達在瘦素抗性DIO小鼠中也減少(18)。早先 的研究已經表明，瘦素刺激的POMC表達經由STAT3介導(19)。發明概述本發明人已發現磷酸-STAT3通過需要POMC基因啟動子中SPl結合位點的機制， 響應瘦素，激活POMC啟動子活性。本發明人還發現R)x01(SEQ ID NO 2)與STAT3結合而 且阻止STAT3與SP1/P0MC啟動子復合體相互作用，因此抑制STAT3介導的瘦素作用。本發 明人已確定 ^οχΟΙ和STAT3間這種相互作用需要R)x01蛋白的44個氨基酸區域。因此，本發明人已首次證明瘦素作用能夠在STAT3激活并易位至細胞核的下游步驟受到抑制，并且提供瘦素抗性的潛在機制，其中i^oxOl水平的增加拮抗STAT3介導的瘦素 信號傳導。本發明還提供了 SEQ ID NO 1的肽，其包含STAT3的R)x01結合位點。包含與SEQ ID NO :1有至少60%序列同一性的肽的化合物和能夠模擬R)x01對SPl和STAT3間相互作 用的干擾作用的化合物也是本發明的一部分。包含與SEQ ID NO :1有至少60%序列同一性的肽的化合物能夠用于抑制STAT3和 SPl間相互作用，而且因此抑制參與食欲抑制的基因的表達。相反，能結合與SEQ ID NO 1有至少60%序列同一性的肽的化合物能夠用于通過 干擾R)x01和STAT3間相互作用釋放STAT3/SP1/啟動子復合體形成的R)x01介導的抑制。 此類化合物能夠用于阻斷 ^οχΟΙ對需要STAT3和SPl間相互作用的基因表達的抑制作用 ("STAT3 SPl可調型基因”)。通過維持STAT3 SPl可調型基因(例如編碼POMC的基因) 的表達，能夠抑制食欲。因此，通過鑒定對R)x01和STAT3間相互作用所必需的氨基酸序列，本發明人已提 供了用于鑒定能夠刺激和抑制需要治療的患者的食欲的化合物的方法。這些化合物和包含 這些化合物的藥物制劑的治療用途是本發明的一部分。本發明提供了用于鑒定能夠調節STAT3和SPl間相互作用的化合物的方法、測定 和篩選。在一些情況下，通過所述方法、測定和篩選所鑒定的化合物通過抑制STAT3和SPl 的相互作用來調節相互作用。其他情況下，受試化合物可通過增強STAT3和SPl的相互作 用來調節相互作用。在本發明的方法中，在受試化合物存在的情況下，使STAT3多肽和SPl多肽接觸并 檢測STAT3和SPl間的相互作用。在一些情況下，受試化合物是包含SEQ ID NO :1或包含 與SEQ ID NO :1有至少60%序列同一性的肽的肽。可選地，受試化合物是SEQ ID N0:1的 肽的模擬物。在其他情況下，受試化合物能夠結合與SEQ ID NO :1有至少60%序列同一性 的肽。在受試化合物能夠結合包含SEQ ID NO :1或與其有序列同一性的肽的情況下，在 FoxOl存在的情況下，評估STAT3和SPl間的相互作用。在某些方法中，通過檢測STAT3 SPl可調型基因的表達鑒定能夠調節STAT3和SPl 間的相互作用的化合物。此類方法可涉及檢測報告基因的表達，該報告基因可操作地連接 于STAT3 SPl可調型基因的啟動子。在本發明的第一方面，提供了用于鑒定STAT3和SPl的相互作用的調節劑的方法， 所述的方法包括(a)提供 STAT3 多肽；(b)提供 SPl 多肽；(c)提供 R)X01 多肽；(d)在R)x01多肽和受試化合物存在的情況下，使STAT3和SPl多肽接觸；以及(d)檢測STAT3和SPl的結合；其中受試化合物能夠結合包含SEQ ID NO :1的肽的多肽或與SEQ ID N0:1有至少 60%序列同一性的肽。在第二方面，提供了用于鑒定STAT3和SPl的相互作用的調節劑的方法，所述的方法包括(a)提供 STAT3 多肽；(b)提供SPl多肽(c)在受試化合物存在的情況下，使STAT3和SPl多肽接觸；以及(d)檢測STAT3和SPl的結合；其中受試化合物包含肽或其模擬物，所述肽與SEQ ID NO 1的肽有至少60%的序 列同一性。在第三方面，本發明提供了鑒定能夠抑制食欲的化合物的方法，該方法包括篩選 能結合包含SEQ ID NO :1的肽或結合與SEQ ID NO :1有至少60%序列同一性的肽的受試 化合物。在本發明的一些方面，STAT3和SPl的結合為復合體形成。本發明的某些方法可涉及測試受試化合物是否介導STAT3 SPl介導的基因表達的步驟。在第四方面，本發明提供了本發明的方法所鑒定的食欲抑制劑。在第五方面，本發明提供了包含本發明的方法所鑒定的食欲抑制劑的藥物。在第六方面，本發明提供了鑒定STAT3和SPl間相互作用的調節劑的方法，所述的 方法包括以下步驟(a)提供包含STAT3多肽、SPl多肽、FoxOl多肽和可操作地連接于報告基因的 STAT3應答啟動子的細胞；(b)提供能夠結合SEQ ID NO=I的肽的受試化合物；以及(c)檢測報告基因的表達。本發明的方法可包括以下步驟(d)比較步驟(C)中的報告基因的表達和在受試化合物不存在的情況下的表達。在第七方面，本發明的方法包括添加瘦素的步驟。在第八方面，本發明提供了與SEQ ID NO :1有至少60%、至少75%或至少90%序 列同一性的多肽。本發明的多肽可包含3-100個氨基酸或3-44個氨基酸。在第九方面，本發明提供了 SEQ ID NO 1的多肽的模擬物，該模擬多肽能夠破壞 STAT3和SPl間的相互作用。在第十方面，本發明提供了用于制造抑制或刺激食欲的藥物的多肽或模擬物。篩選方法本發明的方法可在體外或體內進行。當該方法在體外進行時，該方法可包括高通 量篩選測定。該方法所使用的受試化合物可從合成的組合肽文庫獲得或可為合成肽或肽模擬 分子。在本發明的方法中，STAT3和SPl可從哺乳動物提取物獲得，從細菌、酵母或包括 細胞系和昆蟲細胞系在內的更高級哺乳動物真核細胞重組產生，或使用商購可獲得的合成 儀重新合成。在一方法中，STAT3和SPl為重組的。優選地，STAT3和SPl分子是人STAT3 和SPl分子。STAT3 (signal transducer and activator of transcription,信號轉導禾口轉錄激活因子)是52個氨基酸的轉錄因子，其響應細胞因子和生長因子而磷酸化(GenBank標 識符(GenBank ID) :AAK17196 (人類)；AAK17195 (小鼠))。一旦磷酸化，STAT3 二聚體化并 易位至細胞核，在此處它充當轉錄因子。STAT3對包括瘦素和IL5在內的許多細胞因子、激 素和其他的生長因子作出應答。本發明的方法利用STAT3多肽。本發明方法所用的STAT3 多肽包括與SEQ ID NO :5有至少60%序列同一性的多肽，或包含SEQ ID NO :5多肽片段的 多肽，或與SEQ ID NO :5片段有至少60%序列同一性的多肽。SPKspecificity protein，特異性蛋白)是約785個氨基酸的轉錄因子，且包含 鋅指DNA結合結構域(GenBank標示符AAC08527 (小鼠)；AAH432M (人類))。諸如POMC 基因的某些基因的啟動子含有SPl結合位點。本發明的方法所用的SPl多肽包括與SEQ ID NO 7有至少60%序列同一性的多肽，及包含SEQ ID NO 7多肽的片段的多肽，或其與SEQ ID NO 7的片段有至少60%的序列同一性。本發明方法的SPl多肽具有SPl DNA結合活 性。優選地，在本發明方法中，STAT3多肽能夠與SPl結合，且SPl多肽能夠與STAT3結 合。優選地，STAT3多肽能夠與結合于諸如POMC啟動子的啟動子(SPl/啟動子復合體)的 SPl多肽結合。本發明提供了鑒定能夠調節STAT3和SPl相互作用的化合物的方法。調節相互作 用指化合物能夠減弱或增強STAT3和SPl的結合。在本發明的方法中，提供了 STAT3和SPl多肽，且添加受試化合物。在受試化合物 存在的情況下檢測STAT3和SPl多肽的結合。在一些情況下，檢測結合包括檢測結合的缺 少。利用本發明方法，能夠鑒定調節STAT3和SPl多肽相互作用和結合的受試化合物。在所述的方法中，可以通過免疫學技術，包括免疫印跡、免疫沉淀和酶聯免疫吸附 測定(ELISA)來測定結合。在本發明的某些測定中，提供了包含(例如表達)STAT3和SPl多肽的細胞(如 HEK293細胞)。在某些方法中，細胞還包含(例如表達)FoxOl多肽。將受試化合物添加至 細胞，通過檢測可操作地連接于STAT3 SPl可調型啟動子的報告基因，如P0MC，評估STAT3 和SPl的相互作用。在一些實例中，報告基因是熒光素酶。在一些實例中，可操作地連接于 STAT3 SPl可調型啟動子的報告基因被穩定地或短暫地整合到細胞基因組中。在其他方法 中，可操作地連接于STAT3 SPl可調型啟動子的報告基因位于于載體中。在本發明的某些方法中，提供了包含STAT3和/或SPl基因的載體。在一些方法 中，提供了包含i^oxOl基因的載體。載體可為可操作地連接有基因的表達載體。在某些方 法中，將載體提供在細胞中。在其他的方法中，將STAT3和/或SPl和/或R)x01基因穩定 地整合到細胞基因組中。在本說明書中，術語“可操作地連接”可包括這種情況以使核苷酸序列的表達處 于調節序列的影響或控制下的方式，共價連接所選擇的核苷酸序列和調節核苷酸序列(例 如啟動子)。從而，如果調節序列能夠實現形成部分或全部所選擇的核苷酸序列的核苷酸序 列的轉錄，則調節序列可操作地連接于所選擇的核苷酸序列。如果合適，由此隨后可將產生 的轉錄物翻譯成期望的蛋白或多肽。在諸如高通量篩選的體外篩選中表現出活性的受試化合物可隨后利用細胞在篩 選測試，例如在暴露于候選調節劑的哺乳動物細胞中，并測試它們調節STAT3 SPl可調型基因表達的能力。受試化合物受試化合物可以許多方式中的一種調節或干擾STAT3和SPl的相互作用。在一方 法中，化合物可通過結合一種分子直接調節相互作用，從而掩蔽相互作用位點。受試化合物 優選包含與靶分子相互作用的肽或模擬該肽結構的有機化合物(模擬物)。在一些情況下，受試化合物包含與SEQ ID NO :1有至少60%序列同一性的肽。在 一些實例中，所述肽與SEQ ID NO :1有超過65%、超過70%、超過75%、超過80%、超過 85%、超過90%或超過95%的序列同一性。在一些情況下，受試化合物是SEQ ID NO :1肽 的片段。在其他情況下，受試化合物能夠結合包含與SEQ ID NO :1有至少60%序列同一性 的肽的多肽。能夠通過本領域中已知的方法，包括免疫共沉淀或酵母雙雜交篩選，鑒定能夠 結合多肽的受試化合物。此類受試化合物也能夠結合 ^οχΟΙ或結合與R)x01有至少60%同 源性的多肽。任選地，本發明的受試化合物不是STAT3或SPl多肽或與STAT3或SPl多肽有高 度序列同一性的肽。通過測量其調節STAT3 SPl可調型基因表達的能力可測定受試化合物的調節作 用。此類測定可包括(a)將候選物質給予受試細胞，優選哺乳動物細胞；和(b)測定受試化 合物對STAT3 SPl可調型基因表達的作用。結合親和力結合親和力是兩個組分相互作用程度的度量。利用Cheng和ft~USOff方程式 (Cheng, Y. , Prusoff,W. H. (1973) Biochem. Pharmacol. 22, 3099-3108)自 IC5tl 計算親和結合 力(Ki)，Ki = IC50+ {1+ ([放射性配體]/Kd)}其中，通過對與X軸的log[所用蛋白的摩爾濃度]相比的X軸的特異性結合％作 圖來測定IC5tl(取代50%結合配體的抑制劑的濃度)值，且Kd為放射性配體與受體的結合 親和力。本發明所提供的某些調節劑對SEQ ID N0:1肽具有高&。優選地，此類調節劑對 包含SEQ ID NO 1的多肽具有的Kj比那些包含SEQ ID NO 1的多肽對STAT3具有的Kj更 高。此類調節劑可用于治療瘦素抗性和肥胖。化合物通過相互作用的干擾涉及無論是部分地還是全部地，分子中斷、破壞或阻 止STAT3和SPl的正常相互作用的能力，而且可通過一種或多種正常相互作用的分子的 活性水平的改變或通過測定正常相互作用的分子結合的存在、缺乏或部分存在或缺乏來測 量。調節描述化合物改變相互作用的物質或分子間相互作用的結果的能力。因此，可 通過活性水平，例如結合相互作用的伴侶分子的能力的變化(增加或減少)來檢測調節。調 節化合物對有關活性或結合可具有增強作用或抑制作用。活性
給定物質或分子的活性可通過測定活性來測量，例如通過光子計數能夠測量熒光 素酶活性。活性可以是給定物質，例如包含SEQ ID NO :1的調節肽與另一分子的相互作用 或結合的功能。多肽本發明的多肽包括與SEQ ID NO :1有至少60%同一性且包含R)x01的STAT3結合 位點的多肽。本發明的多肽可包含少于44個氨基酸(例如25、沈、27、觀、29、30、31、32、33、 34、35、36、37、38、39、40、41、42或43個氨基酸)，但是保持結合STAT3的能力，且與SEQ ID NO 1多肽保持至少60%的序列同一性。合適的多肽的長度可高達250個氨基酸但是優選 長度為200個氨基酸或更少，或更優選下列長度之一 3-15、15-30、30-50、50-75、75-100、 100-125、125-150、150-175、175-200 或 200-225 個氨基酸。在本說明書中，調節多肽可以為具有氨基酸序列的任何肽、多肽或蛋白，該氨基酸 序列與SEQ ID NO :1或能夠與STAT3結合的這一序列的片段有指定程度的序列同一性。指 定程度的序列同一性可以為至少60%至100%的序列同一性。更優選地，指定程度的序列 同一性可以是至少 65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 同一性中的一個。序列同一件在某些方面，本發明涉及這樣的化合物，該化合物為分離的肽/多肽，其包含與給 定的序列有至少60%序列同一性的氨基酸序列。序列同一性百分比(％ )被定義為，在比對序列并且如果需要引入空位以實現最 大序列同一性，且不將任何保守取代作為序列同一性的一部分后，候選序列中與給定序列 (以SEQ ID No.表示)中殘基相同的氨基酸殘基的百分比。優選在各自序列的全長范圍內 計算序列同一性。如果比對的序列的長度不同，那么較短的比較序列的序列同一性可以在較長的給 定序列的全長范圍內測定，或者如果比較序列比給定的序列長，那么比較序列的序列同一 性可以在較短的給定序列的全長范圍內來測定。例如，如果給定的序列包含100個氨基酸而候選序列包含10個氨基酸的情況下， 那么候選序列與給定的序列的全長只能有最大10%的同一性。在下列的實例中對此作了進 一步說明。(A)給定的序列XXXXXXXXXXXXXXX (15個氨基酸)比較序列:ΧΧΧΧΧΥΥΥΥΥΥΥ(12個氨基酸)給定的序列可以為，例如編碼R)x01結合位點的序列(例如SEQ ID NO 1)。%序列同一性=比對后相同匹配的氨基酸殘基的數量除以較長的給定的序列中 氨基酸殘基的總數量，即(5/1 X 100 = 33.3%。如果比較序列長于給定的序列，那么可以在給定的序列的全長范圍內來測定序列 同一性。例如(B)給定的序列XXXXXXXXXX (10個氨基酸)比較序列XXXXXYYYYYYZZYZZZZZZ (20 個氨基酸)
再次，給定序列可以為，例如編碼FoxOl結合位點的序列(例如SEQ ID NO 1)。%序列同一性=比對后相同的氨基酸數量除以給定的序列中氨基酸殘基的總數 量，即(5/10) XlOO = 50%。用于測定氨基酸序列同一性百分比目的的比對能夠以本領域技術人員已知的 各種方式實現，例如，利用公眾可獲得的計算機軟件，如ClustalW 1. 82. T-coffee或 Megalign(DNASTAR)軟件。當使用此類軟件時，優選使用例如空位罰分(gap penalty)或延 伸罰分(extension penalty)的默認參數。ClustalW 1. 82的默認參數為蛋白空位開放 罰分(Protein Gap Open Penalty) = 10. 0,蛋白空位延伸罰分(Protein Gap Extension Penalty) = 0. 2，蛋白矩陣=Gonnet，蛋白 /DNA ENDGAP = _1，蛋白 /DNA GAPDIST = 4。核酸序列的同一性可以以相似的方式進行測定，該方式包括比對序列，并且如果 有必要，引入空位，以實現最大序列同一性，且在各自序列全長范圍內計算序列同一性。如 果比對的序列的長度不同，序列同一性可如上文所述和如實例(A)和(B)所示進行測定。肽衍牛物本發明的肽包括SEQ ID NO 1所編碼的R)x01結合肽的片段和衍生物。同樣，盡 管本發明方法中所用的組分可以包含全長的蛋白序列，但這并不總是必需的。作為可選擇 方案，可以使用全長多肽的同源物、突變體、衍生物或片段。衍生物包括給定的全長蛋白序列的變體，而且包括與該全長蛋白有實質氨基酸序 列同一性的天然存在的等位基因變體和合成的變體。蛋白片段的長度可高達5、10、15、20、25、30、35或40個氨基酸殘基。最小的片段 長度可為 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 或 30 個氨基酸或 3-30 間
的氨基酸的數量。突變體與相應的野生型多肽相比，可包含至少一個添加、取代、倒位和/或缺失。 突變體可表現出改變的活性或特性，例如結合。突變可發生在SEQ ID No 1中，而且含有此類片段的組分可滿足調節突變體活性 以完全或部分地恢復野生型多肽活性的目的。衍生物也可以包含天然變異或多態性，其可存在于個體間或家族成員間。所有此 類衍生物都包括在本發明的范圍內。僅作為實例，可在此類多態性中發現的保守取代可存 在于以下組內的氨基酸之間(i)丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸(ii)谷氨酸和天冬氨酸；(iii)精氨酸和亮氨酸；(iv)天冬酰胺和谷酰胺；(ν)異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸；(vi)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。衍生物也可以是融合蛋白的形式，其中通過標準克隆技術使蛋白、片段、同源物或 突變體與另一多肽融合，該多肽可包含DNA結合結構域、轉錄激活結構域或適用于親和純 化的配體(例如谷胱甘肽-S-轉移酶或六個連續的組氨酸殘基)。FoxOl的衍生物包括包含與SEQ ID NO 1有實質序列同一性的序列部分且能夠結 合STAT3的片段。
樽擬物已知的藥學上有活性的化合物的模擬物的設計，是基于“先導”化合物研發藥物的 已知方法。如果活性化合物合成困難或昂貴或當它不適用于特定的給藥方法，例如一些肽 可能是口服組合物的不適宜的活性劑，因為它們傾向于被消化道中的蛋白酶迅速降解，該 設計可能是令人期待的。模擬設計、合成和測試通常用于避免針對靶特性的大量分子的隨 機篩選。自具有給定的靶特性的化合物設計模擬物，通常采用幾個步驟。首先，確定在決定 靶特性中關鍵和/或重要的化合物的特定部分。在肽的情況下，通過系統地改變肽中的氨 基酸殘基，例如通過依次取代每個殘基能夠完成這一步驟。這些構成化合物的活性區域的 部分或殘基稱為它的“藥效團”。—旦發現藥效團，就可以根據它的物理性質，例如立體化學、結合、大小和/或電 荷，利用來自于一系列資源的數據，例如光譜學技術、X射線衍射數據和核磁共振(NMR)，對 其結構進行模擬。計算分析、相似性作圖(它模擬藥效團的電荷和/或體積，而不是原子間 的結合)和其他的技術都能夠用于這一模擬過程。在這一方法的一個變體中，模擬配體的三維結構和它的結合伴侶。這在配體和/ 或結合伴侶改變結合構象的情況下尤其有用，從而允許該模型在模擬物設計中考慮到這一
點ο然后選擇模板分子，模擬藥效團的化學基團可以移植于所述模板分子之上。能夠 便利地選擇模板分子和移植到其上的化學基團，以便于模擬物易于合成，很可能是藥學上 可接受的，而且在體內不會降解，同時保留先導化合物的生物學活性。然后篩選通過這一方 法發現的一種或多種模擬物，以觀察它們是否具有靶特性，或它們將這一特性顯示到什么 程度。然后可進行進一步的最優化或修飾，以得到一種或多種用于體內或臨床測試的最終 模擬物。關于本發明，已根據所述的方法鑒定了肽或肽模擬物，該方法還可包括修飾肽結 構的步驟，隨后任選地重復接觸和測定步驟。如果需要，肽或肽模擬物的這一修飾過程可重 復多次，直到鑒定出對結合親和力具有理想的效應或效應水平的肽。所采用的修飾步驟可包括截短肽或肽模擬物的長度(這可涉及合成長度較短的 肽或肽模擬物)，取代一個或多個氨基酸殘基或化學基團，和/或化學性修飾肽或肽模擬物 以增加穩定性、抗降解性、跨細胞膜轉運和/或對從機體清除的抗性。治療應用本發明的化合物或通過本發明的方法鑒定的化合物可用于刺激或抑制需要治療 的動物的食欲。優選地，經歷治療的動物為需要此類治療的人類患者。更具體而言，所述化 合物可用于刺激或抑制食欲。STAT3和SPl間相互作用的增強劑可用于治療肥胖和瘦素抗性，且通過增強STAT3 與SPl/啟動子復合體的相互作用，并因此增強瘦素可調型基因如POMC的表達，而用于食欲 抑制。STAT3 SPl相互作用的抑制劑可用于刺激食欲。抑制劑可用于治療厭食癥和其他 進食病癥。STAT3 SPl相互作用的抑制劑損害STAT3結合SPl/啟動子復合體的能力，并因 此阻止STAT3促進響應瘦素的基因，例如POMC的表達。
本發明的化合物可配制為臨床用途的藥物組合物用，而且可包含藥學上可接受的 載體、稀釋劑或佐劑。所述組合物針對可包括注射在內的局部、胃腸外、靜脈內、肌肉內、鞘 內、眼內、皮下、口服、吸入或透皮給藥途徑而配制。可注射的制劑可包含在無菌或等滲介質 中的所選擇的化合物。配制藥學上有用的組合物和藥物根據本發明的方法，也提供了藥學上有用的組合物的生產，該生產基于如此鑒定 的物質或受試化合物。除了本文所述方法的步驟外，此類生產方法還包括一個或多個選自 以下的步驟(a)鑒定和/或表征所選擇的物質或受試化合物的結構；(b)獲得所述物質或化合物；(c)使所選擇的物質或化合物與藥學上可接受的載體、佐劑或稀釋劑混合。例如，本發明的另一方面涉及配制或生產用于治療瘦素抗性和肥胖的藥物組合物 的方法，根據本文所述的一種或多種方法，該方法包括鑒定促進或抑制STAT3和SPl相互作 用的化合物或物質，還包括一個或多個以下步驟(i)鑒定所述化合物或物質；和/或(ii)通過使所選擇的物質或其前體藥物與藥學上可接受的載體、佐劑或稀釋劑混 合來制備藥物組合物。通過此類方法配制的某些藥物組合物可包含所選擇的物質的前體藥物，其中所述 前體藥物在人體內或動物體內可轉化成期望的活性劑。在其他情況下，所述活性劑可存在 于如此生產的藥物組合物中，且可以以生理學上可接受的鹽的形式存在。附圖簡要說明現將參考附圖闡明本發明原理的實施方案和實驗，其中

圖1.基于細胞系統中POMC啟動子活性的STAT3介導的痩素調節。(A)圖(上方圖板)繪示在重組HEK293細胞中穩定表達的瘦素受體構建體。管 狀物(solenoid)代表質膜(PM)。OBRa和OBRb共享相同的細胞外序列，包括瘦素結合位點 (靠近PM的陰影區)。“Y”表示涉及瘦素信號傳導的酪氨酸殘基，而且只存在于OBRb中。這 兩種構建體在它們的C末端是Myc標記的(黑色區域)。下方圖板顯示瘦素受體在293細 胞系中的表達。通過使用瘦素偶聯的CNBR-激活的瓊脂糖凝膠珠(kpharose beads)濃縮 來源于^3-0BRa、293-0BRb和對照的裂解產物并通過使用Myc抗體檢查它們的表達。(B)125 碘-瘦素與對照、293-( 1^或四3-( 此細胞混合，同時添加過量未標記的瘦素(白色柱)或 不添加過量未標記的瘦素(灰色柱)。洗滌細胞并計算放射性。結果為平均值士SEM，而且 代表三個獨立的實驗。*P < 0. 01。(C)用 pXJ40-Flag-mSTAT3 轉染 ^3_0BRa 和 ^3_0BRb。 瘦素或模擬處理30分鐘后，裂解細胞并進行8% SDSPAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝 膠電泳)。磷酸-STAT3和泛-STAT3抗體這兩種抗體用于蛋白檢測。注意只在瘦素處理的 293-OBRb細胞中檢測到磷酸-STAT3信號，而泛-STAT3信號在所有的樣品中都是明顯的。 (D)用 pXJ40-Flag-mSTAT3、pGL3-P0MC 和 pCMV-Renilla 轉染 ^3_0BRa 或 ^3_0BRb。瘦素 處理20小時后，收獲細胞且將其裂解，并測量裂解產物的螢火蟲熒光素酶活性且將其標準 化為海腎熒光素酶活性。結果為平均值士SEM，而且代表三個獨立的實驗。Y <0.01。圖2. FoxOl抑制痩素誘導的POMC啟動子活性。
(A)用相同數量的pXJ40-Flag-mSTAT3和pGL3_P0MC，加上數量遞增的 pcDNA3-Flag-mFox01 轉染 ^3_0BRb 細胞，如 POMC 和 STAT3 的實心長條(solid bar)和 FoxOl的實心階梯(solid staircase)所指示的。代替pGL3_P0MC轉染啟動子較少的pGL3 基礎(promoter-less pGL3-basic)作為陰性對照(泳道1和2)。瘦素處理20小時后，收 獲細胞利用抗磷酸-STAT3、泛-STAT3或R)x01的抗體進行免疫印跡。將微管蛋白包括在 內，用于指示所有樣品間的同等加載。注意 ^οχΟΙ的表達隨著轉染的pCDNA3-Flag-mFOX01 的量遞增成比例地增加。⑶將如在㈧中同樣處理的細胞在被動裂解緩沖液中裂解，而且 測量它們的螢火蟲熒光素酶活性且將其標準化為海腎熒光素酶活性。該測定以一式三份， 重復3次。結果代表每一此類測定的平均值士SEM。圖3.高水平的FoxOl不干擾STAT3磷酸化或STAT3易位至細胞核。(A)用相同數量的pXJ40-Flag_mSTAT3和pGL3_P0MC，加上數量遞增的 pcDNA3-Flag-mFox01轉染^3_0BRb細胞，如POMC和STAT3的實心長條和FoxOl的實心階 梯所指示的。瘦素處理后30分鐘，在低滲緩沖液中裂解細胞，并隨后進行離心和高鹽處理 以分離細胞核部分和細胞質部分，如實驗方法中所述。基于Bradford測量，加載等量的細 胞核蛋白，并通過微管蛋白信號證明(下方圖板)。免疫印跡顯示用抗磷酸-STAT3的抗體 (上方圖板)或抗R)x01的抗體(中間的圖板)探測的核蛋白。(B)用pXJ40-Flag-mSTAT3 單獨轉染 ^3-0BRb 細胞(a, c)或用 pXJ40_Flag-mSTAT3 和 pcDNA-Myc-mFox01 —起轉染 ^3-0BRb細胞(b，d)。瘦素(c，d)或模擬物(a，b)處理后，將細胞固定、滲透化并用抗 STAT3(綠色)和R)x01(紅色)的抗體探測。在沒有瘦素處理的情況下，STAT3信號大部分 是細胞質的，但是在瘦素處理的樣品中STAT3信號集中于細胞核。圖4.介導POMC轉錄活性痩素調節的POMC啟動子中的必需DNA元件(-646至 +65)。(A)野生型(WT)POMC啟動子和缺失突變體的圖。所有突變體的細節描述在圖8 中。(B)用 pXJ40-Flag-mSTAT3、pGL3-P0MC 和 pCMV-Renilla 轉染 ^3-0BRb 細胞。瘦素處 理后20小時，在被動裂解緩沖液中裂解細胞。測量螢火蟲熒光素酶活性且將其標準化為海 腎熒光素酶活性。結果表示為平均值士SEM，而且代表三份至少三個獨立實驗。S 5. SPl結合位點的突變？肖除PQMC啟云力子活件的痺素i周節。(A)pGL3-P0MC構建體的圖顯示介導POMC轉錄活性的瘦素調節的必需DNA元件 (-138至-88)的序列。如實驗方法中所述，合成含有推斷的SPl結合位點(探針1)或點突變 (探針2)的EMSA探針。基礎突變用紅色高亮顯示。(B)利用表達Flag-mSTAT3&^3-0BRb 的細胞核提取物，進行探針1或探針2的EMSA。核蛋白結合探針1 (箭頭，泳道1和2)，但 未結合探針2(泳道3和4)。蛋白結合被SPl抗體特異性抑制(泳道5和6)。加載來自于 兩個獨立的實驗的樣品，以舉例說明重復性。(C)WT POMC啟動子和SPl結合位點突變體的 圖。突變體的細節描述在圖8中。基礎突變用紅色高亮顯示。(D)用pXJ40-Flag-mSTAT3 和pCMV-Renilla，加上pGL3_P0MC、突變體12或13轉染^3_0BRb細胞。瘦素處理后20小 時，在被動裂解緩沖液中裂解細胞。測量螢火蟲熒光素酶活性，并將其標準化為海腎熒光素 酶活性。結果表示為平均值士SEM，而且代表三份至少三個獨立實驗。圖6. FoxOl通過結合STAT3抑制STAT3-SP1復合體形成。(A)用pXJ40-Flag-mSTAT3轉染^3_0BRb細胞。瘦素或載體處理后，在裂解緩沖液中裂解細胞，用SPl抗體或對照IgG孵育細胞裂解產物。免疫共沉淀(co-IP)樣品 中所使用的5%的細胞裂解產物作為進料(input)加載。(B，C)用pXJ40-Flag-mSTAT3 和pCDNA3-MyC-mFoX01轉染^3-0BRb細胞。瘦素處理后，在裂解緩沖液中裂解細胞。用 Iyg的抗Flag (B)、抗Myc (C)或對照IgG孵育細胞裂解產物。利用或者抗Myc(B)或者抗 Flag(C)的抗體的免疫印跡(IB)顯示STAT3-Fox01相互作用。⑶如實心長條(STAT3)和階 梯O7OxOl)所指示的用相同數量的pXJ40-Flag-mSTAT3和遞增數量的pcDNA3-Myc_mFox01 轉染^3-0BRb細胞。瘦素處理后30分鐘，自這些細胞中分離核蛋白并利用Flag抗體進行 IP (免疫沉淀)。抗-Myc的免疫印跡或抗-SPl的IB顯示隨著R)x01數量的遞增SPl數量 減少。S 7.痺素調節POMC啟動子活件和1；誦i寸FoxOl抑制的潛在機制。(A) 一旦瘦素與OBIib結合，STAT3就磷酸化。激活的STAT3易位至細胞核并通過 它與SPl-POMC啟動子復合體的相互作用激活POMC啟動子活性。(B)隨著R)x01表達數量 的增加，FoxOl在細胞核中結合磷酸化的STAT3，而且阻止STAT3與SPl-POMC啟動子復合體 相互作用，因此抑制STAT3介導的POMC啟動子的瘦素激活。圖8. DNA構津體本研究中所用的DNA構建體，包括基于PGL3-P0MC的截短和突變構建體。圖9.引物圖8中所描述的DNA構建體產生過程中所用的引物。圖10.產牛以便鑒定FoxOl上的STAT3結合位點的FoxOl構津體FoxOl是652個氨基酸的蛋白。制備一系列C末端缺失的構建體并通過免疫共沉 淀測試它們與STAT3的相互作用(+或-指示免疫共沉淀中構建體是否與STAT3結合)。 FoxOl(1"167)和其他更長的R)x01突變體能結合STAT3，但不能與STAT3結合。這 表明123-167間的區域對STAT3相互作用是重要的。FoxOl(1-123)-(168-652)是缺失構建體，其不 含有在以前的C末端缺失構建體中所鑒定的區域。作為對照，我們還產生了不含有168-241 間區域的 ^οχΟΙ突變體，FOX01(1_167)_(242_652)。使用以上兩種缺失構建體的Co-IP實驗證實了 C末端缺失結果，即對應于氨基酸124-167的區域對于STAT3相互作用是必需的。圖11.序列本申請所述的多肽的序列。發明的詳細描述本發明一個或多個實施方案的細節通過實施例在下文所附描述中進行了闡明，包 括發明人為實施本發明所考慮的本發明的最佳模式的具體細節。對本領域中技術人員所顯 而易見的是，本發明可不受這些具體細節的限制而實施。
實施例實驗方法DNA構建體P0MC啟動子-熒光素酶構建體(pGL3_P0MC)由Domenico Accili博士 (Columbia University，USA (美國哥倫比亞大學))惠贈，pcDNA3_Flag-mFox01 由 Fukamizu 博士(日本)惠贈，pN3-SPl FL-complete由Suske博士(德國)惠贈。早先已經描述了 pXJ40-flag-STAT3 (20)。表1和2描述了本研究所用的所有其他DNA構建體和引物，包括基于pGL3-P0MC的截短和突變構建體。細胞培養和熒光素酶測定早先已描述了超表達0BRaO93-0BRa)或 OBRb (293-OBRb)的Flp4nHEK293穩定細胞系Ql)。在37 °C下在具有5 % CO2的培養 箱中，將細胞培養于含有10%的胎牛血清(FBS)的達爾伯克氏基本必需培養基(DMEM， Invitrogen)中。平板接種1天后，利用Fugene 6 (Roche)，用相關的DNA構建體轉染細胞。 16小時后，在用重組瘦素(Invitrogen)或媒介(vehicle)將它們處理20小時之前，將轉 染細胞血清饑餓5小時。然后用PBS洗滌細胞并且在包括在雙熒光素酶報告基因檢測系統 (Promega)中的200μ 1的IX被動性裂解緩沖液中裂解。在酶標儀(aluminometer，分子 裝置)上測量細胞提取物的熒光素酶活性。使螢火蟲熒光素酶活性針對海腎熒光素酶活性 標準化。293穩定細胞系中OBRa和OBIib的檢測收獲^3_0BRa和細胞并用裂解 緩沖液裂解，且用瘦素偶聯的CNBR激活的瓊脂糖凝膠珠(Sigma)孵育過夜。用裂解緩沖液 重復洗滌后，將帶有沉降蛋白的珠進行SDS-PAGE。通過使用Myc抗體檢查瘦素受體表達。瘦素與穩定的HEK293細胞結合如早先所述，在6孔板中進行Ql)該所述結合。 簡單地說，將^3-0BRa或^3-0BRb細胞培養到約90%融合，并用PBS洗滌。4°C下，在補 充有1% (w/v)牛血清蛋白(BSA)的PBS(組分(fraction) V, Sigma)的Iml終末體積中， 將細胞僅與約60000cpm的鼠重組125I-瘦素(Perkin-Elmer)或與帶有過量未標記的瘦素 的125I-瘦素Qyg/孔)一起孵育。孵育結束時，通過兩遍PBS洗滌移除未結合的125I-瘦 素。然后添加Iml的IN NaOH，并利用Wizard 1470自動γ計數器(Wizard 1470Automatic Gamma Counter, Perkin-Elmer)測量裂解產物中的放射性。自293細胞制備細胞核提取物將瘦素或媒介處理后的細胞洗滌兩次并收集于冷 PBS中。將細胞懸浮液以1300rpm離心5分鐘。由此得到的粒狀沉淀用低滲緩沖液QOmM HEPES pH 7. 9、10mM KClUmM EDTAUmM Na3V04、10%丙三醇、0. 2% NP_40、20mM NaFUmM DTT和IX完全蛋白酶抑制劑(Roche))重懸浮，并且在4°C下搖動10分鐘。然后將混合物 以13000rpm的速度離心30秒，并添加高鹽緩沖液(沒有NP-40的低滲緩沖液中含20%丙 三醇、420mM NaClUmM Na3V04、lmM DTT和1 X完全蛋白酶抑制劑)，以重懸浮粒狀沉淀。搖 動40分鐘后，在4°C下以13000rpm離心混合物。收集上清液作為細胞核提取物。Co-IP 1) 對于STAT3-SP1相互作用，用pXJ40-Flag-mSTAT3轉染^3_0BR細胞，隨后用瘦素處理。自 細胞制備細胞核提取物并與SPl抗體一起孵育，以進行免疫沉淀(IP)。利用磷酸-STAT3抗 體(Cell Signaling)進行免疫沉淀的免疫印跡。每一免疫共沉淀(coIP)樣品中所用的5% 的細胞裂解產物作為進料加載。2)對于STAT3-Fox01相互作用，將用pXJ40-Flag-mSTAT3 和pcDNA3-Myc-mFox01的表達載體轉染的^3_0BRb細胞進行血清饑餓，并用瘦素(50nM) 處理 30 分鐘，然后在裂解緩沖液 QOmM Tris-Cl pH7. 5、150mM NaClU % Triton-X-100, IOmM NaFUm MEDTAUmM Na3V04、lmM PMSF，補充有蛋白酶抑制劑)中裂解。分另丨」用1 μ g Flag(Sigma)、Myc (Santa Cruz Biotechnology)抗體或對照 IgG 與約 500 μ g 的細胞裂解 產物一起孵育2小時，隨后用蛋白A+G瓊脂糖凝膠珠(Sigma)進行1小時IP。將免疫沉淀 物在裂解緩沖液中洗滌4次，并進行SDS-PAGE和用抗Flagor Myc抗體進行免疫印跡。每 一 coIP樣品中所用的5%的細胞裂解產物作為進料加載。3)對于R)x01對STAT3-SP1相 互作用的作用，將pXJ40-Flag-mSTAT3和數量遞增的pcDNA3-Myc_mFox01轉染于^3_0BRb細胞中。瘦素處理后收集細胞用于細胞核分級。通過Flag抗體的IP和Myc (針對STAT3) 及SPl抗體的IB檢查細胞核提取物中的STAT3與SPl的結合。免疫印跡在含有ImM PMSF的IX細胞裂解緩沖液(Cell Signaling)中裂解 細胞。在冰上將裂解產物孵育20分鐘，同時溫和搖動，并在4°C下以20000Xg離心10 分鐘。通過SDS-PAGE和利用以下抗體的免疫印跡分析等量的樣品抗磷酸-STAT3抗 體(Cell Signaling Technology)；抗泛-STAT3、FoxOU SPl 和 Myc 抗體(Santa Cruz Biotechnology)；抗 Flag 抗體(Sigma)禾口抗 Myc 抗體(polyclonal, Upstate)。EMSA 使 兩對寡核苷酸即野生型(GAG GCC CGC CGC CCC CCT 禾口 GAA GGGGGG CGG CGG GC)禾口 SPl 結 合位點突變序列(GAG GCT TGT TGC CCC CCT禾口 GAA GGG GAA CAA CGG GC)退火，且通過 klenowexo- (NEB)將約IOOng探針用50 μ Ci的32Ρ dCTP標記。標記后，通過使用G-50柱純 化探針，并用 LS6500 多功能閃爍計數器(LS6500 Multi-Purpose Scintillation Counter, Beckmam Coulter)測量放射性。室溫下，將5 μ g核蛋白與20000cpm的探針在總體積為 12μ 1 的 DNA-蛋白上樣緩沖液(50mM NaClUOmM TrisCl pH 7. 5、0· 5mM EDTAUmM MgCl2, 4% Ficoll、0. 5mM DTT和1 X完全蛋白酶抑制劑)中一起孵育15分鐘。在0. 5XTBE中 通過4% PAGE凝膠溶解混合物，并在80°C下通過使用凝膠干燥儀(Bio-rad)干燥凝膠2小 時。在_80°C下將X射線膠片(Kodak)暴光48小時，然后顯影。免疫細胞化學將^3_0BRb細胞接種在聚賴氨酸包被的蓋玻片上1天后，用相關 的質粒轉染它們。瘦素或模擬物處理后，用PBS洗滌細胞，將其在含有4%多聚甲醛的PBS 中固定10分鐘，在含有0. 5% triton X-100的PBS中滲透10分鐘，并在室溫下，在ICC緩 沖液(PBS中含3% BSA、3%羊血清和0. 15% triton X-100)中封閉1小時。然后通過使 用STAT3和R)X01抗體和熒光共軛二抗(Invitrogen)探測細胞。將蓋玻片安裝在載玻片 上并密封，以通過共聚焦顯微術進行觀察。統計分析將數據表示為平均值士SEM。利用針對獨立數據的雙尾斯氏t檢驗 (two-tailed Student' s t-test)進行數據的比較。顯著性界限設置為ρ < 0. 05。實施例1 經由STAT3激活的POMC啟動子活性的痩素調節為理解STAT3信號傳導是如何在其激活的下游受到抑制的，建立基于細胞的系 統，以研究STAT3如何介導基因表達的瘦素調節。基于細胞的系統包括OBRb的穩定表達和 螢火蟲熒光素酶在POMC啟動子下的短暫表達。之所以選擇POMC啟動子來研究STAT3介導的瘦素調節，是因為1. POMC是受瘦素 和STAT3調節的關鍵的使食欲減退的神經肽(19)。2.在瘦素抗性的DIO小鼠中，POMC表 達降低(18)。基于細胞的系統的建立瘦素主要通過其借助于結合并激活長形式而不是其他形式的瘦素受體OBRb的中 心作用，調節體內能量平衡(5，6)。建立穩定表達OBRb的HEK293細胞系，作為研究POMC啟 動子活性的瘦素調節的體外系統。用超表達OBRa的HEK293細胞Q93-0BRa)作為陰性對 照。在這些細胞系中，只有帶有C末端Myc標記的單拷貝基因構建體可整合于基因組中，以 確保各自受體的表達水平一致。因為穩定細胞系中受體的表達水平不足以用于通過蛋白印跡(Western blotting)從細胞裂解產物中直接檢測，所以通過使用瘦素偶聯的珠濃縮蛋白。只有在各自的穩定細胞系而不是對照中才能夠檢測到OBRa或OBRb (圖1A，下方圖板)。為進一步證實 OBRa或OBRb的表達和驗證它們在這些細胞系細胞表面上的正確定位和定向，在過量的未 標記的瘦素存在或不存在的情況下，將該細胞與125I-標記的瘦素一起孵育。125I-標記的瘦 素能夠以相似的程度結合^3-0BRa和^3-0BRb這兩者(圖1B)。在對照細胞中或在過量 未標記的瘦素存在的情況下檢測不到125I-標記的瘦素的放射性，其指示瘦素結合(圖1B)。將包含熒光素酶基因由POMC啟動子驅動的質粒通過短暫地轉染引入到^3_0BRb 和^3-0BRa對照中以測試^3-0BRb細胞是否能夠用作體外研究啟動子活性的瘦素調節的 系統。我們使用含有POMC基因的-646至+65的POMC啟動子，因為完全的啟動子活性僅需 要轉錄起始位點上游的480bp DNA片段(13，22)。瘦素處理僅在^3_0BRb細胞中誘導STAT3磷酸化(圖1C)。同樣，瘦素刺激的熒 光素酶活性僅在^3-0BRb細胞中觀察到，在^3-0BRa細胞中觀察不到(圖1D)，這與早先 只有OBRb能夠進行瘦素信號轉導的發現是一致的(6)。總之，293-OBRb是合適的用于研究 通過STAT3-介導的瘦素信號傳導調節POMC啟動子活性的系統。實施例2 =FoxOl抑制STAT3-介導的POMC活件在瘦素抗性的早期，磷酸-STAT3的水平在高脂肪飲食的小鼠中與在正常飲食的 小鼠中是相當的，這表明瘦素信號傳導的損傷位于STAT3激活的下游(10)。為模擬瘦素抗 性的早期，其中STAT3磷酸化未減少，用可導致最高水平的瘦素誘導的POMC啟動子激活的 數量的STAT3轉染^3-0BRb細胞(數據示出)。在恒定的STAT3水平的背景上引入數量遞增的R)x01 cDNA(圖2A)，以測試R)x01 是否能夠干擾瘦素誘導的POMC啟動子活性。FoxOl表達水平與用于轉染的cDNA數量的遞 增成比例的增加(圖2A)。盡管瘦素誘導的STAT3磷酸化不受R)x01表達遞增的影響，但 是POMC啟動子活性的瘦素調節，如熒光素酶活性所指示，在高表達水平的R)X01下被消除 (圖2B)。當引入數量遞增的類似大小的對照蛋白時，POMC啟動子活性的瘦素調節不受影 響(數據未示)。這些數據證明，高水平的 ^οχΟΙ能夠干擾瘦素信號傳導，且表明R)x01在 STAT3激活的下游步驟發揮作用。實施例3 =FoxOl抑制STAT3在細胞核中的作用。為進一步描述遞增的R)x01在哪一個步驟影響瘦素信號傳導，我們測試了瘦素激 活后R)x01是否抑制STAT3易位至細胞核。用在恒定的STAT3水平的背景上數量遞增的 FoxOl轉染^3-0BRb細胞，并通過分級分離細胞核和細胞質成分。正如預期的，FoxOl蛋白 水平在細胞核部分中隨著i^oxOl cDNA數量的遞增而增加(圖3A，第二圖版)；而同時不管 FoxOl表達水平是多少，磷酸化的STAT3在細胞核中保持在同一水平上(圖3A，第一圖版)。 為使R)X01對瘦素誘導的STAT3激活和易位至細胞核的作用直接形象化，我們進行免疫細 胞化學，且在只表達STAT3的或表達STAT3加上FoxOl的^3_0BRb細胞上進行共聚焦顯微 術。在沒有瘦素刺激的情況下，STAT3信號大部分是細胞質的(圖:3B，圖板a和b)，但是在 瘦素處理的樣品中STAT3信號集中在細胞核中(圖3B，圖板c和d)。細胞核中STAT3信號 所指示的STAT3易位至細胞核的程度，在具有R)X01的細胞和無R)x01的細胞間是不能辨 別的(圖3B，圖版c和d)。這些數據表明，FoxOl既不影響瘦素誘導的STAT3磷酸化，也不 影響隨后的STAT3易位至細胞核，而且表明R)x01介導的抑制POMC啟動子活性的瘦素調節 發生在STAT3易位至細胞核的下游，即高水平的R)x01阻止在細胞核中STAT3激活POMC啟動子。^MM 4 用干痺素i秀導的POMC啟動子活t牛的必需DNA片段為理解R)X01如何抑制STAT3介導的POMC啟動子激活，研究STAT3和POMC啟動 子間相互作用的模式。在pGL3-P0MC(WT，圖4A)背景上制備一系列在POMC啟動子區具有缺 失的突變體(突變體#1-11，圖4A)，以確定STAT3介導的POMC啟動子活性的瘦素激活所必 需的序列。將突變構建體，連同PGL3-P0MC—起，分別引入到^3-0BRb細胞，并測定瘦素處 理或瘦素未處理的各種POMC啟動子構建體的熒光素酶活性。無-138和-88 (#2，6和8)間 DNA片段的缺失突變體導致POMC啟動子活性的瘦素調節的損失，而所有含有這一片段的突 變體仍維持瘦素調節，突變體其包括只含有這一 DNA片段的突變體#11 (-138至-88)，所述 片段直接與POMC啟動子TATA盒上游融合(圖4B)，這表明對瘦素增強POMC啟動子活性關 鍵的DNA結合元件位于自轉錄起始位點上游的-138和-88bp間。t施例5 :SP1結合元件是POMC啟動子活t牛所必需的為鑒定負責正常瘦素應答的POMC啟動子的DNA片段，研究了 POMC啟動子的結構。序列分析顯示-138和-88間的DNA元件含有SPl的共有序列結合序列(consensus binding sequence)(圖5A)，即存在于大多數細胞類型中的組成性轉錄因子03)。為證實 推斷的SPl結合位點是否與SPl相互作用，合成對應于原始序列的探針1和含有推斷的SPl 結合位點中的突變的探針2 (圖5A)，并對來自^3-0BRb細胞的細胞核提取物進行EMSA。核 蛋白特異性地與探針1但不結合探針2，而且與探針1的結合可被SPl抗體(圖5B)抑制， 而不被STAT3或R)x01抗體特異性抑制(數據未示)。這些數據表明結合的核蛋白是SP1， 且SPl和探針1形成特定復合體。為檢查SPl結合位點在POMC啟動子活性中的潛在功能， 生成突變體#12和#13，其在SPl結合位點和相鄰序列內含有點突變(突變體#12)或只在 SPl結合位點內含有點突變(突變體#13)(圖5C)。對這些^3-0BRb細胞中的突變體的功 能性分析顯示，這兩種突變體的啟動子活性及它們通過瘦素的調節被消除(圖5D)，這表明 瘦素介導的POMC啟動子的轉錄激活依賴SP1。實施例6 痩素介導的POMC啟動子活性需要STAT3和SPl的肓接相互作用。STAT3結合共有序列在-138和-88間DNA元件中的缺少表明，POMC啟動子活性的 STAT3調節通過除了直接的STAT3-DNA相互作用之外的方式，即STAT3通過中間蛋白發揮介 導瘦素作用的功能。因為瘦素誘導的POMC啟動子激活依賴于SP1，我們假設STAT3通過它 與SPl的相互作用調節POMC啟動子。利用SPl抗體的Co-IP導致在來自瘦素處理的樣品 而不是在對照的^3-0BRb細胞中產生豐富的磷酸-STAT3信號，而對照抗體未降低來自瘦 素處理的細胞或對照細胞中的磷酸STAT3(圖6A)。這些數據表明SPAl能夠特異性結合磷 酸STAT3，還表明STAT3可通過SPl作用，介導POMC啟動子活性的瘦素調節。討論早先的研究將兩個推斷的STAT3結合位點(-361至-353，和-76至-68)和一個 R)x01結合位點(-375至-370)與POMC表達連系在一起(13，22)。然而，在本研究中，這 些STAT3結合位點(突變體1，4和9，圖4)或R)x01結合位點(突變體4，圖4)的缺失對 POMC啟動子活性的瘦素調節影響很小。而且，SPl，而不是STAT3或R)x01，能夠與瘦素調節 所必需的51bpDNA片段形成復合體，這表明磷酸化的STAT3通過需要SPl-POMC啟動子復合 體而不是直接的STAT3-P0MC啟動子相互作用的機制增強POMC啟動子活性。SPl是組成性轉錄因子，而且據報道可作為STAT3調節基因表達的中間體發揮作用(30-32)，例如STAT3 通過SPl-DNA復合體相互作用介導IL-6誘導的VEGF啟動子活性(30)。連同本研究一起， 這些研究提示了在激素/細胞因子信號傳導中已確立的直接的STAT3-DNA相互作用的可選 機制，即STAT3可通過其與SPl-DNA復合體的相互作用調節基因表達(圖7A)。實施例7 =FoxOl抑制STAT3-SP1相互作用。通過R)X01抑制STAT3介導的POMC啟動子活性的瘦素調節，發生在STAT3易位至 細胞核的下游步驟(圖3)，而且瘦素作用需要STAT3和SPl的直接相互作用。測試R)x01 是否能夠干擾STAT3-SP1復合體的形成并從而阻止STAT3作用于POMC啟動子。為測試R)x01是否能夠結合STAT3，在來自細胞的樣品中進行co_IP。 FoxOl在抗Flag標記的STAT3抗體(抗-Flag)而不是對照抗體處理的樣品中特異性免疫 共沉淀(圖6B)。相反，STAT3在用抗Myc標記的R)X01抗體(抗-Myc)而不是對照抗體處 理的樣品中降低(圖6C)。從而，該雙向co-IP實驗證實了 Fox01-STAT3的結合。通過對用數量遞增的R)x01 cDNA轉染的^3_0BRb細胞進行co-IP，測試數量遞增 的R)X01是否能夠減少甚至消除與STAT3結合的SPl。STAT3抗體降低SPl的能力受R)x01 抑制，而且在高R)X01表達水平上檢測不到STAT3-SP1的結合(圖6D)。總之，這些數據證 明 ^οχΟΙ能夠通過與STAT3的結合阻止STAT3-SP1復合體的形成。^MM 8 :STAT3相互作用所必需的關鍵FoxOl序歹U的鑒定FoxOl是652個氨基酸的蛋白。為鑒定STAT3相互作用所必需的R)x01序列，制備 一系列C末端缺失構建體并通過免疫共沉淀測試它們與STAT3的相互作用FoX01a_167)和 其他更長的 ^οχΟΙ突變體能夠結合STAT3，而卻不能結合STAT3，這表明氨基酸 殘基123-167間的區域對STAT3相互作用是重要的。制備缺失構建體R)X01 (1-123)-(168-652)，該構建體不含有在之前的C末端缺失 構建體中所鑒定的區域。作為對照，制備不含有168-M1間區域的FoxOl突變體，即 FoX01 (1-167)-(242-㈣)。利用上述兩種缺失突變體的co-IP實驗證實了 C末端缺失結果，即 124-167氨基酸間的區域是STAT3相互作用所必需的，因為^5x01肽不能結合 STAT3，但是 Fox01(H67)H652)卻能結合 STAT3。討論總之，這些數據證明1)磷酸STAT3通過需要POMC啟動子中的SPl結合位點的機 制，響應瘦素信號傳導，激活POMC啟動子；2)瘦素作用能夠被R)x01在STAT3磷酸化和易 位至細胞核的下游步驟上抑制；3)FoxOl結合STAT3且阻止STAT3與SPl-POMC啟動子復合 體相互作用，并因此抑制STAT3介導的瘦素作用；4)與STAT3結合的R)x01需要1M-167 區域內的殘基。這些數據提供了瘦素抗性的潛在機制，其中，增加的FoxOl通過干擾STAT3 SPl靶基因啟動子復合體的形成而拮抗STAT3介導的瘦素信號傳導。根據這些數據，本發明人提出R)x01如何抑制POMC啟動子的瘦素調節的潛在機制 的模型隨著R)x01表達數量的遞增，FoxOl結合細胞核內的磷酸化的STAT3(經由1M-167 區域中的氨基酸殘基)，并阻止STAT3與SPl-POMC啟動子復合體相互作用，并因此抑制 STAT3介導的POMC啟動子的瘦素激活(圖7B)。參考文獻1. 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權利要求
1.用于鑒定STAT3和SPl相互作用的調節劑的方法，所述的方法包括(a)提供STAT3多肽；(b)提供SPl多肽；(c)提供FoxOl多肽；(d)在所述R)x01多肽和受試化合物存在的情況下，使STAT3和SPl多肽接觸；以及 (d)檢測STAT3和SPl的結合；其中所述受試化合物能夠結合多肽，該多肽包含SEQ ID NO :1的肽或包含與SEQ ID NO 1有至少60%的序列同一性的肽。
2.用于鑒定STAT3和SPl相互作用的調節劑的方法，所述的方法包括(a)提供STAT3多肽；(b)提供SPl多肽；(c)在受試化合物存在的情況下，使STAT3和SPl多肽接觸；以及(d)檢測STAT3和SPl的結合；其中所述受試化合物包含肽或其模擬物，所述肽與SEQ ID NO :1的肽有至少60%的序 列同一性。
3.鑒定能夠抑制食欲的化合物的方法，所述的方法包括篩選能結合包含SEQID NO 1 的肽或結合與SEQ ID NO :1有至少60%序列同一性的肽的受試化合物。
4.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述STAT3和SPl的結合為復合體形成。
5.如任何上述權利要求所述的方法，還包括(e)測試所述受試化合物是否介導STAT3SPl介導的基因表達。
6.通過權利要求1-3中任一項所述的方法所鑒定的食欲抑制劑或增強劑。
7.包含權利要求6所述的食欲抑制劑或增強劑的藥物。
8.鑒定STAT3和SPl間相互作用的調節劑的方法，包括(a)提供包含STAT3多肽、SPl多肽、FoxOl多肽和可操作地連接于報告基因的STAT3 應答啟動子的細胞；(b)提供能夠結合SEQID NO 1的肽的受試化合物；以及(c)檢測所述報告基因的表達。
9.如權利要求8所述的方法，還包括以下步驟(d)比較步驟(c)中的所述報告基因的表達和在所述受試化合物不存在的情況下的表達。
10.如權利要求8或9所述的方法，其中所述報告基因為熒光素酶。
11.如權利要求8-10中任一項所述的方法，還包括添加瘦素的步驟。
12.如權利要求8-11中任一項所述的方法，其中所述細胞超表達瘦素受體。
13.如權利要求8-12中任一項所述的方法，其中所述細胞為HEK293細胞。
14.與SEQID NO :1有至少60%序列同一性的多肽。
15.如權利要求14所述的多肽，其與SEQID NO 1有至少75%的序列同一性。
16.如權利要求15所述的多肽，其與SEQID NO :1有至少90%的序列同一性。
17.如權利要求14-16中任一項所述的多肽，其包含3-100個氨基酸。
18.如權利要求14-16中任一項所述的多肽，其包含3-44個氨基酸。
19.所述的SEQID NO 1的多肽模擬物，其能夠破壞STAT3和SPl間的相互作用。
20.權利要求14-18中任一項所述的多肽或權利要求19所述的模擬物，在制造抑制或 刺激食欲的藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及用于鑒定調節STAT3和SP1間相互作用的化合物的方法。提供了能夠與STAT3結合且干擾STAT3和SP1的相互作用的肽。本發明提供了用于鑒定能夠與肽結合從而釋放干擾STAT3和SP1間相互作用的化合物的方法，及用于鑒定STAT3和SP1相互作用的抑制劑和增強劑的方法。本發明方法所鑒定的化合物在抑制或刺激患者食欲方面是有用的，從而用于治療瘦素抗性、肥胖癥和厭食癥。
文檔編號C07K14/47GK102066945SQ200980123434
公開日2011年5月18日 申請日期2009年6月1日 優先權日2008年6月19日
發明者楊國慶, 韓衛平 申請人:科技研究局