專利名稱：經修飾的因子ix多肽及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及經修飾的因子IX多肽，諸如具有一個或多個引入的糖基化位點的因 子IX多肽。經修飾的因子IX多肽可以展現出升高的體外或體內穩定性諸如較長的血漿半 衰期。本發明還涉及生成經修飾的因子IX多肽的方法，和使用經修飾的因子IX多肽例如 來治療罹患血友病B的患者的方法。
背景技術：
血友病B影響著34，500名男性中的一名，并且是由編碼因子IX(FIX)的基因的 多種遺傳缺陷引起的，所述遺傳缺陷導致血液中低的或檢測不到的FIX蛋白(Kurachi等， Hematol. Oncol. Clin. North Am. 6 991-997,1992 ；Lillicrap, Haemophilia 4:350—357， 1998)。不足水平的FIX導致有缺陷的凝固和源自不受控制的出血的癥狀。通過靜脈內輸注 血漿衍生的或重組的FIX蛋白以停止已經啟動的出血或阻止出血發生(預防)來有效地治 療血友病 B (Dargaud 等，Expert Opin. Biol. Ther. 7 651-663 ；Giangrande, Expert Opin. Pharmacother. 6 1517-1524，2005)。有效的預防要求維持約1 %正常水平的最低谷水平的 FIX (Giangrande, Expert Opin. Pharmacother. 6 :1517_1524，2005)。由于約 18 至 24 小時 的天然FIX(血漿衍生的或重組的)半衰期，FIX水平在推注后3至4天內下降至正常水 平的小于1%，這使平均每三天重復注射成為必要以實現有效的預防(Giangrande，Expert Opin. Pharmacother. 6 1517-1524, 2005)。此類頻繁的靜脈內注射對于患者而言是成問題 的，而且是實現有效預防的一項障礙(Petrini，Haemophilia 13 Suppl 2 16-22，2007)，尤 其在兒童中。具有較長半衰期的FIX蛋白會實現較小頻率的施用，并且如此是有顯著醫學 益處的。發明概述本申請提供了 FIX多肽(也稱為經修飾的FIX多肽、FIX突變蛋白、或FIX變體)， 其包含已經通過弓I入一個或多個糖基化位點來修飾的氨基酸序列。在一些實施方案中，所 述一個或多個糖基化位點可以是N-連接的糖基化位點。在一些實施方案中，所述多肽具有 凝固活性。在一些實施方案中，所述經修飾的多肽可以包含至少一處取代，諸如但不限于 R338A和V86A。在一些實施方案中，所述經修飾的多肽可以包含R338A和V86A取代兩者。本申請還提供了包含已經通過引入一個或多個糖基化位點進行過修飾的氨基酸 序列的FIX多肽。所述FIX多肽可以進一步包含附接于一個或多個引入的糖基化位點的碳 水化合物鏈。在一些實施方案中，所述碳水化合物鏈可以是N-連接的碳水化合物鏈。在一 些實施方案中，所述碳水化合物鏈可以具有哺乳動物碳水化合物鏈結構。在一些實施方案 中，所述碳水化合物鏈可以具有人碳水化合物鏈結構。在一些實施方案中，相對于缺乏引 入的糖基化位點的多肽，在一個或多個引入的糖基化位點附著碳水化合物鏈可以將多肽的
7血清半衰期增加例如至少30%。在一些實施方案中，相對于缺乏引入的糖基化位點的分泌 性多肽的量，在一個或多個引入的糖基化位點附著碳水化合物鏈未將分泌性多肽的量降低 例如超過50%。在一些實施方案中，相對于缺乏引入的糖基化位點處的碳水化合物鏈的多 肽與FVIII、FXI、或FX的相互作用，在一個或多個引入的糖基化位點附著碳水化合物鏈未 將多肽與因子VIII (FVIII)、因子XI (FIX)、或因子X(FX)中至少一種的相互作用抑制超過 50%。在一些實施方案中，經修飾的多肽可以具有例如每mg多肽至少100個單位的比活。可以經由一個或多個氨基酸取代來引入一個或多個糖基化位點。取代可以在表面 暴露的殘基處和/或限于不引入已知與血友病B有關的突變的取代。例示性的實施方案包 括包含一個或多個取代的FIX多肽，所述取代諸如但不限于(a)G4T ；E33N ；E36T ；E36N ；R37N ；F75N ；F77T ；E83T ；D85N ；V86A ；K91T ；A103T ； V107T ；K122N ；K122T ；S138N ；A146N ；T148N ；F150T ；P151N ；T159N ；A161T ；A161N ；T169N ； Q170N ；T172N ；D177N ；D177E ；F178T ；K201N ；K201T ；K214T ；V223N ；G226N ；Y226T ；K228N ； K228T ；E239N ；E242N ；I251T ；A262T ；E294N ；R338A ；R338N ；K341N ；F353N ；H354V ；H354I ； E355T ；V370N ；T371V ；T371I ；E372T ；E374N ；M391N ；K392V ；G393T ；E410N ；K413N ；L414I ；(b) YlN 禾口 S3T ；S3N 禾口 K5T ；G4N 禾口 L6T ；K5N 和 E7T ；L6N 禾口 E8T ；E7N 禾口 F9T ；F9N 禾口 QllT ；VlON禾口 G12T ；QllN禾口 N13T ；G12N禾口 L14T ；N13(N13T)禾口 E15T ；L14N禾口 R16T ；E15N禾口 E17T ；M19N 禾口 E21T ；E20N 禾口 K22T ；S24N 禾口 E26T ；F25N 禾口 E27T ；E26N 禾口 A28T ；E27N 禾口 R29T ； A28N 和 E30T ；R29N 和 V31T ；E30N 和 F32T ；V31N 和 E33T ；F32N 和 N34T ；T35N 和 R37T ；T38N 禾口 E40T ；T39N 禾口 F41T ；E40N 禾口 W42T ；F41N 禾口 K43T ；W42N 禾口 Q44T ；K43N 禾口 Y45T ； Q44N 禾口 V46T ；Y45N 和 D47T ；V46N 和 G48T ；E52N 和 N54T ；S53N 和 P55T ；G59N 和 S61T ；K63N 和 D65T ； I66N 和 S68T ；S68N 和 E70T ；G76N 和 E78T ；E78N 和 K80T ；E83N 和 D85T ；L84N 和 V86T ； I90N 和 N92T ；K100N 和 S102T ；S102N 和 D104T ；A103N 和 N105T ；D104N 和 K106T ；K106N 和 V108T ； R116N 和 A118T ；E119N 和 Q121T ；Q121N 禾口 S123T ；A127N 和 P129T ；V135N 和 V137T ；S136N 和 S138T ；V137N 和 Q139T ；Q139N 和 S141T ；T140N 和 K142T ；S141N 和 L143T ；E147N 和 V149T ； T148N 和 F150T ；V149N 和 P151T ；P151N 和 V153T ；D152N 和 D154T ；V153N 和 Y155T ；D154N 和 V156T ；Y155N 和 N157T ；V156N 和 S158T ；S158N 和 E160T ；T159N 和 A161T ；E160N 和 E162T ； E162N 和 1164T ；T163N 和 L165T ； 1164N 和 D166T ；L165N 和 N167T ；D166N 和 1168T ； 1168N 和 Q170T ；T169N 和 S171T ；S171N 和 Q173T ；T172N 和 S174T ；Q173N 和 F175T ；S174N 和 N176T ； G184N 和 D186T ；E185N 和 A187T ；D186N 和 K188T ；A187N 和 P189T ；P189N 和 Q191T ；G200N 和 V202T ；K201N 和 D203T ；V202N 和 A204T ；E224N 和 G226T ；T225N 和 V227T ；G226N 和 K228T ； V227N 和 I229T ；H236N 和 I238T ； I238N 和 E240T ；E240N 和 E242T ；T241N 和 H243T ；H243N 和 E245T ；K247N 和 N249T ；V250N 和 R252T ；I251N 和 I253T ； I253N 和 P255T ；A261N 和 I263T ； A262N 和 N264T ；D276N 和 P278T ；V280N 和 N282T ；F302N 和 S304T ；S304N 和 Y306T ；R312N 和 F314T ；V313N 禾Π Η315Τ ；F314N 禾Π Κ316Τ ；Η315Ν 禾Π G317T ；Κ316Ν 禾Π R318T ；G317N 禾Π S319T ； S319N 和 L321T ；Α320Ν 和 V322T ；R327N 和 Ρ329Τ ；Ρ329Ν 和 V331T ；D332N 和 Α334Τ ；L337N 和 S339T ；S339N 和 Κ341Τ ；Τ340Ν 和 F342T ；Τ343Ν 和 Υ345Τ ；G352N 和 Η354Τ ；F353N 和 Ε355Τ ； Η354Ν 和 G356T ；Ε355Ν 和 G357T ；G356N 和 R358T ；G357N 和 D359T ；Ε372Ν 和 Ε374Τ ；W385N 禾口 Ε387Τ ；G386N 和 Ε388Τ ；Α390Ν 和 Κ392Τ ；(c)D85N、K122T、和 I251T ；D85N、K122T、和 E242N ；E125N、P126A、和 A127T ；P126N、V128T、和 P129A ；T148N、F150T、和 P151A ；F150N、P151A、和 D152T ；P151N、V153T、和 A161N ； P151N、V153T、和 T172N ；V153N、Y155T、和 E294N ；T172N、G226N、和 K228T ；F353N、H354V、 和 E355T ；F353N、H354I、和 E355T ；V370N、T371V、和 E372T ；V370N、T371I、和 E372T ；M391N、 K392V、和 G393T ；D85N、P151N、V153T、和 K228N ；D85N、P151N、V153T、和 E242N ；K122T、 P151N、V153T、和 K228N ；K122T、P151N、V153T、和 E242N ；K122T、P151N、V153T、和 I251T ； T148N、F150T、G226N、和 K228T ；P151N、V153T、T172N、和 R338A ；P151N、V153T、D177E、和 F178T ；P151N、V153T、G226N、和 K228T ；T172N、G226N、K228T、和 R338A ；D85N、K122T、P151N、 V153T、和 E242N ；D85N、P151N、V153T、G226N、和 K228T ；K122T、P151N、V153T、G226N、和 K228T ；S138N、P151N、V153T、G226N、和 K228T ；T148N、F150T、G226N、K228T、和 R338A ；P151N、 V153T、T172N、G226N、和 K228T ；P151N、V153T、D177E、F178T、和 R338A ；P151N、V153T、G226N、 K228T、和 R338A ；和 P151N、V153T、T172N、G226N、K228T、和 R338A ；和其任意組合。可以將一個或多個糖基化位點引入FIX的催化域或激活肽中。例示性的實施方案 包括包含一個或多個取代的FIX多肽，所述取代諸如但不限于R37N ；D85N ；K122T ；S138N ； A146N；A161N ；Q170N ；T172N ；D177N ；F 178T；K201N ；K228N ；E239N ；E242N ；I251T ；A262T ； E294N ；E374N ；和E410N。其它實施方案可以包括包含一個或多個取代的下列FIX多肽，所 述取代諸如:G59N 和 S61T ；K63N 和 D65T ；G76N 和 E78T ；S102N 和 D104T ；A103N 和 N105T ； D104N 和 K106T ；E119N 和 Q121T ；Q121N 和 S123T ；S136N 和 S138T ；Q139N 和 S141T ；T140N 和 K142T ；T148N 和 F150T ；V149N 和 P151T ；P151N 和 V153T ；D152N 和 D154T ；V153N 和 Y155T ； D154N 和 V156T ；V156N 和 S158T ；S158N 和 E160T ；E160N 和 E162T ；E162N 和 I164T ；T163N 和 L165T ； I164N 和 D166T ；D166N 和 I168T ； I168N 和 Q170T ；S171N 和 Q173T ；T172N 和 S174T ； Q173N 和 F175T ；S174N 和 N176T ；K201N 和 D203T ；V202N 和 A204T ；E224N 和 G226T ；T225N 禾口 V227T ；G226N 和 K228T ；T241N 和 H243T ； I251N 和 I253T ； I253N 和 P255T ；A262N 和 N264T ； V280N 和 N282T ；T343N 和 Y345T ；和 E372N 和 E374T ；F150N、P151A、和 D152T。在一些實施 方案中，所述經修飾的多肽可以進一步包含至少一處取代，諸如例如R338A和V86A。在一些 實施方案中，所述經修飾的多肽可以進一步包含R338A和V86A取代兩者。可以通過將0-連接的糖基化位點轉變為N-連接的糖基化位點來引入一個或多個 糖基化位點。例示性的實施方案包括取代，諸如但不限于T169N ；T172N ；T148N和F150T ；和 T159N和A161T。在一些實施方案中，所述取代可以是T172N ；T148N和F150T ；和T159N和 A161T0在一些實施方案中，所述經修飾的多肽可以進一步包含至少一處取代，諸如但不限 于R338A和V86A。在一些實施方案中，所述經修飾的多肽可以進一步包含R338A和V86A取 代兩者。可以通過在氨基酸殘基160-164之間插入1_12個氨基酸殘基來引入一個或多 個糖基化位點。可以在氨基酸殘基160-161之間、氨基酸殘基161-162之間、氨基酸殘基 162-163之間、或氨基酸殘基163-164之間引入糖基化位點。在一些實施方案中，可以在氨 基酸殘基160-161之間、氨基酸殘基161-162之間、氨基酸殘基162-163之間、或氨基酸殘 基163-164之間引入SEQ ID NO :2。在其它實施方案中，可以通過將1_12個氨基酸殘基添 加至FIX多肽的C端來引入糖基化位點。在一些實施方案中，可以將SEQ ID N0:4、5、6、或 7引入FIX多肽的C端。在一些實施方案中，所述多肽可以進一步包含氨基酸取代D177E和 F178T。在一些實施方案中，所述多肽可以進一步包含氨基酸取代P151N和V153T。在一些實施方案中，所述多肽可以進一步包含氨基酸取代T172N。在一些實施方案中，所述多肽可 以進一步包含氨基酸取代P151N、V153T、和T172N。在一些實施方案中，所述多肽可以進一 步包含氨基酸取代T148N和F150T。在一些實施方案中，所述多肽可以進一步包含氨基酸取 代G226N和K2^T。在一些實施方案中，所述經修飾的多肽可以進一步包含至少一處取代， 諸如R338A和V86A。在一些實施方案中，所述經修飾的多肽可以進一步包含R338A和V86A 取代兩者。在例示性的實施方案中，提供了包含一個或多個取代的經修飾的FIX多肽，所述 取代諸如:D85N ；K122T ；S138N ；T172N ；K201N ；K228N ；E239N ；E242N ；I251T ；A262T ；E294N ； G59N 禾口 S61T ；G76N 禾口 E78T ；S102N 禾口 D104T ；A103N 禾口 N105T ；D104N 禾口 K106T ；E119N 和 Q121T ；Q121N 和 S123T ；S136N 和 S138T ；Q139N 和 S141T ；T140N 和 K142T ；T148N 和 F150T ； V149N 和 P151T ；P151N 和 V153T ；D152N 和 D154T ；S158N 和 E160T ；E162N 和 I164T ；T163N 和 L165T ；T172N 和 S174T ；Q173N 和 F175T ；K201N 和 D203T ；T225N 和 V227T ；G226N 和 K228T ； I253N 和 P255T ；A262N 和 N264T ；V280N 和 N282T ；E372N 和 E374T ；F150N、P151A、和 D152T ； A161 和 E162 之間的 SEQ ID NO :2 插入；和 G2^N、K228T、和 A161 和 E162 之間的 SEQ ID N0:2插入。在一些實施方案中，所述經修飾的多肽可以進一步包含至少一處取代，諸如例 如R338A和V86A。在一些實施方案中，所述經修飾的多肽可以進一步包含R338A和V86A取 代兩者。本申請還提供了包含R338A取代和V86A取代的FIX多肽。在一些實施方案中，所 述多肽可以具有每mg多肽至少700個單位的比活。本申請還提供了藥物制劑，其包含經修飾的FIX多肽和藥學可接受載體。本申請還提供了用于治療血友病B的方法，包括對有所需要的受試者施用治療有 效量的本文中所描述的藥物制劑。本申請還提供了編碼經修飾的多肽的DNA序列，以及用所述DNA序列轉染的真核 宿主細胞。本申請還提供了用于生成經修飾的FIX多肽的方法，包括⑴通過引入一個或多 個糖基化位點來修飾所述多肽的氨基酸序列；(ii)以容許在所述一個或多個糖基化位點 糖基化的方式表達所述多肽；并(iii)純化所述多肽。附圖簡述
圖1描繪了來自8種物種的激活肽內的FIX序列的多序列比對。圖2描繪了對來自用FIX的糖基化位點突變蛋白轉染的HKBll細胞的培養基的 Western印跡分析。使用抗FIX-HRP抗體來檢測FIX蛋白。圖3描繪了 HKBll細胞中FIX糖基化位點突變蛋白的表達和活性的表。通過ELISA 來測定表達，并通過aPTT測定法來測定活性。比活計算為每mg FIX蛋白的國際單位。將 數值轉變為相同轉染實驗中運行的FIX-R338A的百分比。(無)遷移率沒有變化，(+)遷 移率降低，其中+數目指明了程度，(_)遷移率升高。圖4描繪了 HKBll細胞中FIX糖基化位點突變蛋白的表達水平、凝固活性、和比 活。數值表示為FIX-R338A突變蛋白的百分比。圖3中描繪了構建體。圖5描繪了對來自用FIX的G2^N、K228T糖基化位點突變蛋白轉染的HKBll細胞 的培養基的Western印跡分析。使用抗FIX-HRP抗體來檢測FIX蛋白。
發明詳述本申請提供了包含一個或多個0-或N-連接的糖基化位點的FIX多肽。可以使用 治療性蛋白質的糖基化升高來實現1)降低的免疫原性；2)較小頻率的蛋白質施用；3)升 高的蛋白質穩定性，諸如增加的血清半衰期；和4)不利副作用諸如炎癥的降低。本申請提供了具有一個或多個別的糖基化位點的人FIX變體。經修飾的FIX多 肽還可以具有延長的血漿半衰期，其在血友病B患者中會提供例如針對出血的保護時間延 長。經修飾的FIX多肽會以比目前可用的野生型FIX蛋白療法可能的注射更少的FXI注射 使血友病B患者能夠實現針對出血的保護。本申請提供了許多例示性FIX變體，其中在催化域和激活肽兩者中創建功能性糖 基化位點。此外，本申請表明這些變體可以在哺乳動物細胞中表達，具有指明糖基化升高 的表觀分子量增加，而且在凝固測定法中維持50% -100%的活性。最后，這些修飾位點可 以與增強FIX比活的改變(包括但不限于R338A取代和/或V86A取代)組合(Chang等， J. Biol. Chem. 273 12089-12094，1998 和 Chang 等，J. Biol. Chem. 277 :25393_25399，2002)。 與R338A和V86A取代之一或兩者的組合補償源自糖基化位點添加的任何活性降低，使得經 修飾的多肽的比活可以類似于或高于野生型FIX的。一旦表達，野生型FIX是一條約55，000道爾頓的單鏈糖蛋白。可以認為它在結構 上具有四種域富含Gla或Y-羧基谷氨酸的域；EGF樣區；激活肽；和含有活性位點的催 化域(Thomson, Blood 67:565-572,1986)。FIX在肝中以461個氨基酸的單鏈多肽合成， 并且在通過高爾基和內質網過程中經歷廣泛的翻譯后修飾(Nemerson等，CRC Crit. Rev. Biochem. 9 :45_85，1980 ；Stenflo 等，Annu. Rev. Biochem. 46 157-172，1977)。除去信號 序列和前肽兩者，導致415個氨基酸(SEQ ID NO 1)的成熟蛋白(Choo等，Nature 299 178-180,1982 ；Kurachi 等，Proc Natl Acad Sci USA 79 :6461_6464，1982)。有效的 γ-羧 基化對于FIX的凝固活性是至關重要的，并且在人中，在N端Gla域內生成12個Gla殘 基，雖然對Gla36和Gla40的Y-羧基化是功能不需要的(DiScipio等，Biochemistryl8 899-904，1979 ；Gillis等，Protein Sci. 6 :185_196，1997)。另外，FIX含有兩個N-連接的糖 基化位點(N157.N167)、六個0-連接的糖基化位點(S53、S61、T159、T169、T172、T179)、和各 用于Ser磷酸化(S158)、酪氨酸硫酸化(Y155)和β -羥基化(D64)的一個位點(McMullen 等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 115 :8_14,1983)。激活的因子VII (FVII)通過與由于對血管壁的損傷而暴露的組織因子(TF)形成 復合物來啟動正常的止血過程。隨后，復合物激活FIX;活性形式稱為FIXa。通過由因子 XIa(FXIa)或組織因子(TF)/因子VIIa復合物在兩個位點處進行的蛋白水解切割來除去 FIX的激活肽以生成催化活性分子，即因子IXa(FIXa)。FIXa和因子VlIIa(FVIIIa)將FX 轉化成因子Xa(FXa)，其繼而將凝血酶原轉化成凝血酶。然后，凝血酶將血纖蛋白原轉化成 血纖蛋白，導致血纖蛋白凝塊的形成。因為野生型FIX具有許多翻譯后修飾(已經提示了其中一些在體內藥動學概況 (profile)中起作用)，可以在不影響這些其它修飾的位置處引入異位糖基化位點。一旦生 成，FIX應當保持酶促活性，并與FVIII、FXI、和FX相互作用以有效治療血友病B。引入的 糖基化位點不應干擾這些相互作用和功能。本申請部分提供了對FIX的修飾，其可能在最 小的功能干擾的情況中導致糖基化位點數目增加，并且如此具有提高FIX的生物利用度的
11效用。最后，這些修飾位點可以與增強FIX比活的改變(包括但不限于R338A突變和/或 V86A突變)聯合。增強FIX比活的改變可以補償凝固活性的潛在損失，而且還通過在較低 的蛋白質水平賦予功效來潛在地延長經修飾分子的功效。經修飾的FIX多肽本申請提供了包含一個或多個引入的糖基化位點的FIX多肽，即經修飾的FIX多 肽。如本文中所使用的，“因子IX”指人血漿FIX糖蛋白，其是固有凝固途徑的成員，而且對 于血液凝固是至關重要的。要理解的是，此定義包括天然以及重組形式的人血漿FIX糖蛋 白。除非另有規定或指明，如本文中所使用的，FIX指其在凝固中的正常作用中的任何功能 性人FIX蛋白分子，包括任何其片段、類似物、變體、和衍生物。術語“片段”、“衍生物”、“類 似物”、“突變蛋白質”、和“變體”在提及本申請的多肽時指保留基本上相同生物學功能或活 性的多肽片段、衍生物、類似物、突變蛋白質、和變體。FIX多肽的非限制性例子包括FIX、FIfe、和具有FIX活性的截短型式的FIX。任何 維持至少某種程度的FIX活性的上述FIX多肽的生物學活性片段、刪除變體、取代變體、或 添加變體也可以充當FIX多肽。在一些實施方案中，FIX多肽可以包含與SEQ ID N0:1至 少約70、80、90、或95%相同的氨基酸序列。在一些實施方案中，經修飾的FIX多肽是生物 學活性的。可以通過例如本文中所描述的凝固測定法來測定生物學活性。經修飾的FIX多肽還可以含有保守的氨基酸取代。保守取代在本領域中公認為用 一種氨基酸替換另一種具有相似特性的氨基酸，并且包括例如丙氨酸變化為絲氨酸；精氨 酸變化為賴氨酸；天冬酰胺變化為谷氨酰胺或組氨酸；天冬氨酸變化為谷氨酸；半胱氨酸 變化為絲氨酸；谷氨酰胺變化為天冬酰胺；谷氨酸變化為天冬氨酸；甘氨酸變化為脯氨酸； 組氨酸變化為天冬酰胺或谷氨酰胺；異亮氨酸變化為亮氨酸或纈氨酸；亮氨酸變化為纈氨 酸或異亮氨酸；賴氨酸變化為精氨酸；甲硫氨酸變化為亮氨酸或異亮氨酸；苯丙氨酸變化 為酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；絲氨酸變化為蘇氨酸；蘇氨酸變化為絲氨酸；色氨酸變化為 酪氨酸；酪氨酸變化為色氨酸或苯丙氨酸；和纈氨酸變化為異亮氨酸或亮氨酸。在一些實 施方案中，在引入一個或多個糖基化位點外，SEQID NO 1的FIX多肽還包含1_30、1_20、或 1-10處保守的氨基酸取代。特定氨基酸的單字母縮寫、其相應的氨基酸、和三字母縮寫如下A，丙氨酸 (Ala) ；C，半胱氨酸(Cys) ；D，天冬氨酸(Asp) ；E，谷氨酸(Glu) ；F，苯丙氨酸(Phe) ；G，甘氨 酸(Gly) ；H，組氨酸(His) ；I，異亮氨酸(Ile) ；K，賴氨酸(Lys) ；L，亮氨酸(Leu) ；M,甲硫氨 酸(Met) ；N，天冬酰胺(Asn) ；P，脯氨酸(Pro) ；Q，谷氨酰胺(Gln) ；R，精氨酸(Arg) ；S，絲氨 酸(Ser) ；T，蘇氨酸(Thr) ；V，纈氨酸(Val) ；W，色氨酸(Trp) ；Y，酪氨酸(Tyr)；和正亮氨酸 (Nle)。多肽的糖基化通常是N-連接的或0-連接的。N-連接的指將碳水化合物模塊附接 于天冬酰胺殘基的側鏈。三肽序列Asn-X-Ser和Asn-X-Thr (其中X是除脯氨酸外的任何氨 基酸)是用于將碳水化合物模塊酶促附接于Asn側鏈的識別序列。如此，多肽中這些三肽 序列之任一的存在創建潛在的N-連接的糖基化位點。可用于本發明的例示性N-連接的糖 基化位點也可以如下表示=X1-Asn-X2-X3-X4 ；其中&任選地是Asp、Val、Glu、Gly、或Ile ；X2 是除Pro外的任何氨基酸；X3是Ser或Thr ；而&任選地是Val、Glu、Gly、Gin、或lie。在 一些實施方案中，&任選地是Asp ；)(2是^^成是！!^ ;而)(4是Gin。在一些實施方案中，X1是Asp ；X2是Ile ；X3是Thr ；而&是Gin。通過改變氨基酸序列使得引入一種或多種上 文所描述的三肽序列來實現N-連接的糖基化位點向FIX多肽的添加。0-連接的糖基化指將糖類N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖之一附接于羥基氨基 酸，最通常至絲氨酸或蘇氨酸，雖然附接于5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸也是有可能的。可以 通過改變氨基酸序列使得引入一個或多個Ser或Thr殘基來實現0-連接的糖基化位點向 FIX多肽的添加。可以例如通過刪除一個或多個氨基酸殘基、用另一種氨基酸替換一個或多個內源 FIX氨基酸殘基、或者添加一個或多個氨基酸殘基來引入糖基化位點。氨基酸殘基的添加可 以在兩個現有的氨基酸殘基之間或者在天然FIX分子的N-或C-端末端。所使用的氨基酸取代的術語如下。第一個字母代表在人FIX的位置上天然存在的 氨基酸殘基。后面的數字代表成熟人FIX氨基酸序列(SEQ ID NO 1)中的位置。第二個字 母代表取代(替換/取代)天然氨基酸的不同氨基酸。舉例而言，R338A表示SEQ ID NO 1的第338位Arg殘基已經用Ala殘基替換。關于包含人FIX多肽的額外的5’氨基酸序列 (46 個氨基酸)的 SEQ ID NO 26, SEQID NO 1 的第 338 位對應于 SEQ ID NO 26 的第 384 位。本文中所使用的FIX殘基數目系統指成熟人FIX蛋白的，其中殘基1代表除去信 號序列和前肽兩者后的成熟FIX多肽的第一個氨基酸。天然的或野生型FIX是全長成熟人 FIX分子，如SEQ ID NO 1中所顯示的。在一些實施方案中，在FIX中在不會消除蛋白質功能或其在細胞中表達的位置處 工程化改造糖基化位點。為了設計包含一個或多個引入的糖基化位點的FIX多肽，可以應 用數項標準。在一些實施方案中，引入的糖基化位點是表面暴露的。可以基于溶劑可接近表 面積來測定表面暴露，如Autin等(J. Thromb. Haemost. 3 =2044-56,2005)中所測定的。在 一些實施方案中，引入的糖基化位點沒有引入已知與血友病B有關的突變。已知的突變可 以參見環球網于 kcl. ac. uk/ip/petergreen/haemBdatabase. html 禾口表 1。表 1
殘基號突變殘基號突變殘基號突變
1權利要求
1.一種因子IX多肽，其包含已經通過引入一個或多個氨基酸取代或插入來修飾的氨 基酸序列。
2.依照權利要求1的多肽，其中所述氨基酸序列已經通過引入一個或多個糖基化位點 而修飾。
3.依照權利要求2的多肽，其中所述一個或多個糖基化位點選自N-連接的糖基化位 點和0-連接的糖基化位點。
4.依照權利要求2和3的多肽，其進一步包含附接于所述一個或多個引入的糖基化位 點的碳水化合物鏈。
5.依照權利要求1至4中任一項的多肽，其中所述一個或多個氨基酸取代選自G4T； E33N ；E36T ；E36N ；R37N ；F75N ；F77T ；E83T ；D85N ；V86A ；K91T ；A103T ；V107T ；K122N ；K122T ； S138N ；A146N ；T148N ；F150T ；P151N ；T159N ；A161T ；A161N ；T169N ；Q170N ；T172N ；D177N ； D177E ；F178T ；K201N ；K201T ；K214T ；V223N ；G226N ；Y226T ；K228N ；K228T ；E239N ；E242N ； I251T ；A262T ；E294N ；R338A ；R338N ；K341N ；F353N ；H354V ；H354I ；E355T ；V370N ；T371V ； T371I ；E372T ；E374N ；M391N ；K392V ；G393T ；E410N ；K413N ；L414I ；YlN 和 S3T ；S3N 和 K5T ； G4N 和 L6T ；K5N 和 E7T ；L6N 和 E8T ；E7N 和 F9T ；F9N 和 QllT ；VlON 和 G12T ；QllN 和 N13T ； G12N 和 L14T ；N13 (N13T)和 E15T ；L14N 和 R16T ；E15N 和 E17T ；M19N 和 E21T ；E20N 和 K22T ； S24N 和 E26T ；F25N 和 E27T ；E26N和 A28T ；E27N 和 R29T ；A28N 和 E30T ；R29N 和 V31T ；E30N 和 F32T ；V31N 和 E33T ；F32N 和 N34T ；T35N 和 R37T ；T38N 和 E40T ；T39N 和 F41T ；E40N 和 W42T ； F41N 和 K43T ；W42N 和 Q44T ；K43N 和 Y45T ；Q44N 和 V46T ；Y45N 和 D47T ；V46N 和 G48T ；E52N 和 N54T ；S53N 和 P55T ；G59N 和 S61T ；K63N 和 D65T ； I66N 和 S68T ；S68N 和 E70T ；G76N 和 E78T ； E78N 和 K80T ；E83N 和 D85T ；L84N 和 V86T ；I90N 和 N92T ；K100N 和 S102T ；S102N 和 D104T ； A103N 和 N105T ；D104N 和 K106T ；K106N 和 V108T ；R116N 和 A118T ；E119N 和 Q121T ；Q121N和 S123T ；A127N 和 P129T ；V135N 和 V137T ；S136N 和 S138T ；V137N 和 Q139T ；Q139N 和 S141T ； T140N 和 K142T ； S141N 和 L143T ；E147N 和 V149T ；T148N 和 F150T ； V149N 和 P151T ；P151N 和 V153T ；D152N 和 D154T ；V153N 和 Y155T ；D154N 和 V156T ；Y155N 和 N157T ；V156N 和 S158T ； S158N 和 E160T ；T159N 和 A161T ；E160N 和 E162T ；E162N 和 I164T ；T163N 和 L165T ； I164N 和 D166T ；L165N 和 N167T ；D166N 和 I168T ； I168N 和 Q170T ；T169N 和 S171T ；S171N 和 Q173T ； T172N 和 S174T ；Q173N 和 F175T ；S174N 和 N176T ；G184N 和 D186T ；E185N 和 A187T ；D186N 和 K188T ；A187N 和 P189T ；P189N 和 Q191T ；G200N 和 V202T ；K201N 和 D203T ；V202N 和 A204T ； E224N 和 G226T ；T225N 和 V227T ；G226N 和 K228T ；V227N 和 I229T ；H236N 和 I238T ； I238N 和 E240T ；E240N 和 E242T ；T241N 和 H243T ；H243N 和 E245T ；K247N 和 N249T ；V250N 和 R252T ； I251N 和 I253T ；I253N 和 P255T ；A261N 和 I263T ；A262N 和 N264T ；D276N 和 P278T ；V280N 和 N282T ；F302N 和 S304T ； S304N 和 Y306T ；R312N 和 F314T ；V313N 和 H315T ；F314N 和 K316T ； H315N 和 G317T ；K316N 和 R318T ；G317N 和 S319T ；S319N 和 L321T ；A320N 和 V322T ；R327N 和 P329T ；P329N 和 V331T ；D332N 和 A334T ；L337N 和 S339T ；S339N 和 K341T ；T340N 和 F342T ； T343N 和 Y345T ；G352N 和 H354T ；F353N 和 E355T ；H354N 和 G356T ；E355N 和 G357T ；G356N 和 R358T ；G357N 和 D359T ；E372N 和 E374T ；W385N 和 E387T ；G386N 和 E388T ；A390N 和 K392T ； D85N、K122T、和 I251T ；D85N、K122T、和 E242N ；E125N、P126A、和 A127T ；P126N、V128T、和 P129A ；T148N、F150T、和 P151A ；F150N、P151A、和 D152T ；P151N、V153T、和 A161N ；P151N、V153T、和 T172N ；V153N、Y155T、和 E294N ；T172N、G226N、和 K228T ；F353N、H354V、和 E355T ； F353N、H354I、和 E355T ；V370N、T371V、和 E372T ；V370N、T371I、和 E372T ；M391N、K392V、和 G393T ；D85N、P151N、V153T、和 K228N ；D85N、P151N、V153T、和 E242N ；K122T、P151N、V153T、和 K228N ；K122T、P151N、V153T、和E242N ；K122T、P151N、V153T、和I251T ；T148N、F150T、G226N、 和 K228T ；P151N、V153T、T172N、和 R338A ；P151N、V153T、D177E、和 F178T ；P151N、V153T、 G226N、和 K228T ；T172N、G226N、K228T、和 R338A ；D85N、K122T、P151N、V153T、和 E242N ； D85N、P151N、V153T、G226N、和 K228T ；K122T、P151N、V153T、G226N、和 K228T ；S138N、P151N、 V153T、G226N、和 K228T ；T148N、F150T、G226N、K228T、和 R338A ；P151N、V153T、T172N、G226N、 和 K228T ；P151N、V153T、D177E、F178T、和 R338A ；P151N、V153T、G226N、K228T、和 R338A ；和 P151N、V153T、T172N、G226N, K228T、和 R338A ；和其任意組合。
6.依照權利要求1至4中任一項的多肽，其中所述一個或多個氨基酸取代選自R37N; D85N ；K122T ；S138N ；A146N ；A161N ；Q170N ；T172N ；D177N ；F178T ；K201N ；K228N ；E239N ； E242N ；I251T ；A262T ；E294N ；E374N ；E410N ；G59N 禾口 S61T ；K63N 禾口 D65T ；G76N 禾口 E78T ； S102N 和 D104T ；A103N 和 N105T ；D104N 和 K106T ；E119N 和 Q121T ；Q121N 和 S123T ；S136N 和 S138T ；Q139N 和 S141T ；T140N 和 K142T ；T148N 和 F150T ；V149N 和 P151T ；P151N 和 V153T ； D152N 和 D154T ；V153N 和 Y155T ；D154N 和 V156T ；V156N 和 S158T ；S158N 和 E160T ；E160N 和 E162T ；E162N 和 I164T ；T163N 和 L165T ； I164N 和 D166T ；D166N 和 I168T ； I168N 和 Q170T ； S171N 和 Q173T ；T172N 和 S174T ；Q173N 和 F175T ；S174N 和 N176T ；K201N 和 D203T ；V202N 和 A204T ；E224N 和 G226T ；T225N 和 V227T ；G226N 和 K228T ；T241N 和 H243T ； I251N 和 I253T ； I253N 和 P255T ；A262N 和 N264T ；V280N 和 N282T ；T343N 和 Y345T ；E372N 和 E374T ；D85N、 K122T、和 E242N ；D85N、K122T、和 I251T ；F150N、P151A、和 D152T ；T172N、G226N、和 K228T ； D85N、P151N、V153T、和 K228N ；D85N、P151N、V153T、和 E242N ；K122T、P151N、V153T、和 K228N ； K122T、P151N、V153T、和 E242N ；K122T、P151N、V153T、和 I251T ；P151 (P151N, P151T,或 P151A)、V153T、G226N、和 K228T ；D85N、K122T、P151N、V153T、和 E242N ；D85N、P151N、V153T、 G226N、和 K228T ；S138N、P151N、V153T、G226N、和 K228T ；P151N、V153T、T172N、G226N、和 K228T。
7.依照權利要求1至4中任一項的多肽，其中所述一個或多個氨基酸取代選自D85N; K122T ；S138N ；T172N ；K201N ；K228N ；E239N ；E242N ；I251T ；A262T ；E294N ；G59N 禾口 S61T ； G76N 和 E78T ；S102N 和 D104T ；A103N 和 N105T ；D104N 和 K106T ；E119N 和 Q121T ；Q121N 和 S123T ；S136N 和 S138T ；Q139N 和 S141T ；T140N 和 K142T ；T148N 和 F150T ；V149N 和 P151T ； P151N 和 V153T ；D152N 和 D154T ；S158N 和 E160T ；E162N 和 I164T ；T163N 和 L165T ；T172N 和 S174T ；Q173N 和 F175T ；K201N 和 D203T ；T225N 和 V227T ；G226N 和 K228T ； I253N 和 P255T ； A262N 和 N264T ；V280N 和 N282T ；E372N 和 E374T ；和 D85N、K122T、和 E242N ；D85N、K122T、 和 I251T ；F150N、P151A、和 D152T ；T172N、G226N、和 K228T ；D85N、P151N、V153T、和 K228N ； D85N、P151N、V153T、和 E242N ；K122T、P151N、V153T、和 K228N ；K122T、P151N、V153T、和 E242N ；K122T、P151N、V153T、和 I251T ；P151 ((P151N, P151T，或 P151A))、V153T、G226N、和 K228T ；D85N、K122T、P151N、V153T、和 E242N ；D85N、P151N、V153T、G226N、和 K228T ；S138N、 P151N、V153T、G226N、和 K228T ；P151N、V153T、T172N、G226N、和 K228T。
8.一種因子IX多肽，其包含氨基酸序列ynsgkleefvqgnlerecmeekcsfeearevfenterttefwkqyvd⑶qcesnpclnggsckddinsyecwcpfgfegkncelx85x86tcnikngrceqfcknsax104nkvvcsctegyrlaenx121kscepavpfpcgrvsvx138qtsk Ltraex148Vx150X151X152X153Dyvnsx159Ez1X161Z2Ez3Tz4Ildnix169Qsx172Qx174Fnx177X178TrvvggedakpgQF PffQVVLNGKVDAFCGGS I VNEKffIVTAAHCVETX226VX228I T WAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKynhdialleldeplvlnsyvtpiciadkeytniflkfgsgyvsgwgrvfhkgrsalvlqylrvplvdratclx338stKFTIYNNMFCAGX353X354X355GGRDSCQ ⑶ SGGPHX37qX371X372 VEGTsFLTGnsWGEECAXs31X392X393KYGIYTKV SRYVNWIKEKTX413X414T (SEQ ID NO :3)； 其中I選自D和Ε; 其中X86選自Α、Ε、P、S、和V ； 其中)(1Q4選自D、NjPT; 其中X121選自N、QjPT; 其中A38選自N、S、*T; 其中X148和)(15。選自(i)X148是T而父15(1是？；(ii) 48是N而X15(1是T;和(iii) 48是N而X150是S ； 其中X151選自A、P、和T ；其中X 151 和)(153選自 (i)X151是P而父說是乂； (Ii)X15I ^ NM X153 ^ T (iii)X151 是 N而1說是3; 其中z1. z2, z3、和&獨立地選自(i)0至12個氨基酸殘基和(ii)SEQID NO 2 ； 其中選自D、N、*T; 其中X159和)(161選自 (土))^9是丁而X161 是A;(ii) 是N而X161是T;和(iii))(棚是N而 X161 是S; 其中X169選自T和N; 其中X172選自T和N; 其中X174選自S和T ； 其中X177和)(178選自 (iU177是D而父”8是？； (土土))(177是￡而父哪是！1 ；和 (土^))(177是已或D而父”8是3 ； 其中)(226和選自(iU2a;是6而)(鄉是K; (ii) a;是N而 是T ；和(iii) a;是N而 是S ； 其中X338選自R禾口 A;其中X 353、 X354、禾口 1 自 (i)X 353 ^ F，X354 ^ H，X355 是Ε; ( )Χ 353 ^ N，X354 ^ V，乂355 是Τ;(i ii) X3ra 是 N，X354 是 LX355 是 Τ;和(iv)X353 是 N，X354 是 H、V、或 I，X355 是 S ； 其中X37t^X371、和X372選自(i)X370 ^ V, X371是τ、χ372是Ε;GiU370 是 N，X371 是 V，X372 是 T ； (iiDX37 是 N，X371 ^ I, X372 ^ T (iv) X370 是 N，X371 是 Τ、V、或 I，X372 是 S ； 其中^31J392、和A93選自(i)X391 ^ M, X392 ^ K, X393 ^ G ；(ii)X391^ N, X392 ^ K, X393 ^ T ；(iii)XjN，X3i32是 V，X393 是 T ；和(iv)X391 是 N，X392 是 V 或 K，X393 是 S ； 其中)(413和)(414選自(iU413是K而)(414是L;(ii) 13是N而 14是L;和(iii) 13是N而 14是I；和其中與具有SEQ ID NO :1的FIX多肽相比，所述FIX多肽包含至少一個引入的糖基化 位點。
9.依照權利要求6或7的多肽，其進一步包含選自R338A和V86A的氨基酸取代。
10.依照權利要求1-9中任一項的多肽，其中所述氨基酸序列已經如下修飾過，即在人 因子IX的氨基酸殘基160-164間引入1-10個氨基酸殘基，導致引入一個或多個糖基化位點ο
11.依照權利要求10的多肽，其中所述氨基酸殘基插入氨基酸殘基160-161之間、氨基 酸殘基161-162之間、氨基酸殘基162-163之間、或氨基酸殘基163-164之間。
12.依照權利要求11的多肽，其中包含氨基酸序列SEQID NO :2的多肽在氨基酸殘基 160-161之間、氨基酸殘基161-162之間、氨基酸殘基162-163之間、或氨基酸殘基163-164 之間引入。
13.依照權利要求11或12的多肽，其進一步包含選自如下的氨基酸取代V86A； R338A ；V86A 和 R338A ；T148N 和 F150T ；D177E 和 F178T ；P151N 和 V153T ；P151N、V153T、和 T172N ；G226N 和 K228T。
14.依照權利要求1-7中任一項的多肽，其中所述氨基酸序列已經如下修飾過，即在因 子IX多肽的C端引入1-10個氨基酸殘基，導致引入一個或多個糖基化位點。
15.依照權利要求14的多肽，其中在因子IX多肽的C端引入包含選自SEQIDNO :4、 SEQ ID NO 5, SEQ ID NO :6、和SEQ ID NO 7的氨基酸序列的多肽。
16.一種因子IX多肽，其包含R338A取代和V86A取代。
17.依照權利要求1至15中任一項的多肽，其中相對于缺乏所述引入的糖基化位點的 多肽，在一個或多個所述引入的糖基化位點附接碳水化合物鏈將所述多肽的血清半衰期增 加至少30%。
18.依照權利要求1至17中任一項的多肽，其中所述多肽具有每mg多肽至少100個單 位的比活。
19.一種藥物制劑，其包含權利要求1-18中任一項的因子IX多肽和藥學可接受載體。
20.一種治療血友病B的方法，包括對有所需要的受試者施用治療有效量的權利要求 19的藥物制劑。
21.編碼權利要求1-18中任一項的多肽的DNA序列。
22.—種真核宿主細胞，其以容許所述宿主細胞表達因子IX多肽的方式用依照權利要 求20的DNA序列轉染。
23.一種用于生成因子IX多肽的方法，包括(i)通過引入一個或多個糖基化位點來修 飾所述多肽的氨基酸序列；(ii)以容許在所述一個或多個糖基化位點糖基化的方式表達 所述多肽；并(iii)純化所述多肽。
全文摘要
本發明涉及經修飾的因子IX多肽，諸如具有一個或多個引入的糖基化位點的因子IX多肽。經修飾的因子IX多肽可以展現出升高的體外或體內穩定性諸如較長的血漿半衰期。本發明還涉及生成經修飾的因子IX多肽的方法，和使用經修飾的因子IX多肽例如來治療罹患血友病B的患者的方法。
文檔編號C07K14/745GK102083856SQ200980122784
公開日2011年6月1日 申請日期2009年4月16日 優先權日2008年4月16日
發明者烏爾里克·豪普茨, 尤維·格里贊, 科尼利亞·柯克納, 約翰·E·墨菲, 艾倫·布魯克斯, 蔣曉喬, 錢德拉·帕特爾, 馬里安·塞托 申請人:拜耳先靈醫藥股份公司, 拜耳醫藥保健有限公司