α-促黑素細胞激素的肽類似物的制作方法

專利名稱：α-促黑素細胞激素的肽類似物的制作方法
技術領域：
本發明涉及肽類似物。具體地說，本發明涉及對黑皮質素1受體(MClR)具有選擇 性的天然α-促黑素細胞激素(α-MSH)的肽類似物，其藥物制劑以及這些類似物在治療醫 學和獸醫學疾病中的應用。
背景技術：
神經肽是廣泛分布于機體中的生物學活性小肽，具有從神經遞質到生長因子的功 能。許多證據表明神經肽具有抗炎性能。在許多神經肽中，黑皮質素肽(黑皮質素)能結 合并刺激黑皮質素(MC)受體。黑皮質素的一個例子包括α-促黑素細胞激素(α-MSH)，主 要知道它能調節外周色素沉著，但也知道它有抗炎和免疫調節性能。已在幾種器官中檢測 到α -MSH神經肽，由神經元、垂體、腸、皮膚和免疫細胞產生。注射α -MSH誘導半抗原特異性耐受的接觸過敏模型和抑制細菌內毒素_介導的 炎癥業已證明α-MSH具有這種免疫調節性能。在許多動物疾病模型，例如炎性腸病、關節 炎和實驗性心臟移植中α-MSH也顯示具有治療活性。大腦炎癥、腎臟損傷和肝炎的其它 動物模型證明了該神經肽有抗炎作用。α -MSH能抑制促炎細胞因子，例如TNF-α、IL_6和 IL-I的產生，并抑制趨化因子而減少巨噬細胞和嗜中性白細胞遷移至炎性部位。一氧化氮 (NO)是各種形式炎癥的共同介質。也顯示α-MSH能抑制受內毒素刺激的巨噬細胞和嗜中 性白細胞合成NO。除了對細胞因子產生的作用外，α-MSH能下調單核細胞和樹突狀細胞的 I類MHC、⑶86和⑶40表達而影響抗原呈遞和協同刺激。還知道α -MSH能增加單核細胞 中的白介素IO(IL-IO)形成，據信IL-10是免疫抑制作用的重要組分。雖然α -MSH免疫調節作用的分子機制尚未完全知曉，但α -MSH作用的潛在機制 是它能抑制細胞中核因子_ κ B的激活。抑制NF- κ B抑制了巨噬細胞產生促炎細胞因子和 合成一氧化氮。α -MSH通過結合屬于含7個跨膜結構域的G-蛋白偶聯受體組的特異性受 體而起作用。這些受體包括巨噬細胞的黑皮質素1和黑皮質素3受體(MCR-1和MCR-3)， α -MSH通過與之結合抑制NF- κ B。α -MSH的許多免疫調節作用也通過累積cAMP而介導。 α -MSH與黑皮質素受體結合提高了 cAMP水平，從而可抑制I κ B降解，因而抑制NF- κ B轉 位和一氧化氮產生。與α -MSH結合并受其刺激的MCl受體參與各種抗炎和免疫調節應答。已鑒定到 五類黑皮質素受體，MC1-MC5。已發現MC-I受體存在于黑素細胞、黑色素瘤細胞、巨噬細胞、 嗜中性白細胞、神經膠質瘤細胞、星形細胞、單核細胞、內皮細胞上，存在于腦、睪丸和卵巢 的某些區域中。本領域對刺激MC-I受體并產生有效抗炎和免疫調節應答的化合物和方法 一直有興趣。發明概述本文提供能選擇性結合黑皮質素1受體(MClR)的基本純的化合物或其藥學上可 接受的鹽，所述化合物包含具有序列His Xaa1 Arg Trp (SEQ ID NO :1)或D-Trp D-Arg Xaa2 D-His (SEQ ID NO 2)的核心四肽；其中 Xaa1 是 D-Cha, D-Phe 或 Cha, Xaa2 是 D-Cha, D-Phe或Phe。在一些實施方式中，其C-末端序列是D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser (SEQ ID NO 3)。本文還提供能選擇性結合黑皮質素1受體(MCRl)的基本純的化合物或其藥學上 可接受的鹽，所述化合物包含具有以下序列的多肽X&&2X&&5X&&7 X&&g X&&g X&&1QXss^ X&&13，其中X aa1 是 D-Val、D-Ala 或 D-Lys ；Xaa2 是 D_Prο、D-A1 a 或 D_Ly s ；Xaa3 是 D-Lys> D-Orn> D_Nle、D-Ala 或 D-Lys ；Xaa4 是 Gly 或 D-Ala ；Xaa5 是 D_Trp、Trp, D_3_ 苯并噻吩基-Ala、D_5_ 羥基-Trp, D_5_ 甲氧基-Trp, D-Phe 或 D-Ala ；XaadD-ArgJ-His 或 D-Ala;Xaa7 是 D-Cha、D-Phe、Phe、D_4-氟 _Phg、D_3-吡啶基-Ala、D-Thi、D-Trp、D_4_ 硝 基-Phe 或 D-Ala ；Xaa8 ^ D-His> His> D~Arg> Phe ^ D-Ala ；Xaa9 是 D_Glu、D-Asp, D-瓜氨酸、D-Ser 或 D-Ala ；Xaa10 是 D-Met、D-丁石智氛酸(buthionine)、D-Ile 或 D-Ala ；Xaa11 是 D-Ser> D-Ile 或 D-Ala ；
Xaa12 ^ D-Tyr > D-Ser D-Ala ；Xaa13 是 D-Ser 或 D-Ala ；其中除非當Xaai_3均是D-Ala時，不多于一個的Xaa1,是D-Ala和不多于一個的 Xaa1 ο 是L-氨基酸。在還有另一方面，本文提供包含具有以下序列多肽的基本純的化合物或其藥學上 可接受的鹽D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg Phe D-His D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser(SEQ ID NO 4)；D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg D-Cha D-His D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser(SEQ ID NO 5)；Ser Tyr Ser Met Glu His Cha Arg Trp Gly Lys Pro Val (SEQ ID NO 6)；或D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg D-Phe D-His D-Glu D-Met D-Ser D-Tyr D-Ser(SEQ ID NO :7)。在一些實施方式中，本文提供的多肽經PEG化。在一些實施方式中，本文提供的化合物可偶聯于生物學活性部分。 在一些實施方式中，本文提供的化合物選擇性結合MC1R。在一些實施方式中，所述 化合物表現出以下特性的至少一種能選擇性激活MC1R，在體外血漿中穩定和耐受蛋白酶 降解。在一方面，本文提供包含本文提供的任何一種基本純的化合物和藥學上可接受的 賦形劑的藥物組合物。在另一方面，本文提供治療有需要的對象的自身免疫疾病或病癥的方法，包括給予所述對象包含藥學上可接受的賦形劑和治療有效量的本文提供的化合物的藥物組合物。 在一些實施方式中，所述自身免疫疾病或病癥選自多發性硬化癥、I型糖尿病、再生障礙 性貧血、格雷夫斯病、腹部疾病、克羅恩病、紅斑狼瘡、關節炎、骨關節炎、自身免疫葡萄膜炎 和重癥肌無力。在還有另一方面，本文提供治療有需要的對象的炎癥的方法，包括給予所述對象 包含藥學上可接受的賦形劑和治療有效量的本文提供的化合物的藥物組合物。在一些實 施方式中，所述炎癥與選自下組的疾病相關炎性腸病、類風濕性關節炎、過敏、動脈粥樣硬 化、銀屑病、胃炎和缺血性心臟病。 在一方面，本文提供降低或抑制有需要的對象的移植物排異的方法，包括給予所 述對象包含藥學上可接受的賦形劑和治療有效量的本文提供的化合物的藥物組合物。在另一方面，本文提供治療有需要的對象的黑色素瘤的方法，包括給予所述對象 包含藥學上可接受的賦形劑和治療有效量的本文提供的化合物的藥物。在還有另一方面，本文提供治療有需要的對象的黑色素瘤的方法，包括給予所述 對象包含藥學上可接受的賦形劑和治療有效量偶聯物的藥物，所述偶聯物包含與抗腫瘤負 載物偶聯的本文提供的化合物。該抗腫瘤負載物可以是放射性核素、輻照致敏劑、光敏劑、 化療劑或毒素。在還有一方面，本文提供裝有本文提供化合物的藥物組合物和任選的使用說明書 的試劑盒。附圖簡述

圖1顯示天然α-MSH減輕了葡萄膜炎。圖IA顯示每日用天然a-MSH(100微克 /小鼠)靜脈內注射治療BIO. RIII小鼠的數據，臨床評分為2-3。與未治療對照相比葡萄 膜炎顯著減輕(p<0.01)。圖IB顯示每日腹膜內注射天然α-MSHdOO微克/小鼠)或腹 膜內注射地塞米松(0. 2mg/kg或2. Omg/kg)治療BIO. RIII小鼠的數據，臨床評分為1_2(η =5)。治療開始后，視網膜炎癥減輕(ρ < 0. 05)。星號表示與對照相比有顯著差異。圖2說明RI α -MSH和天然α -MSH緩解了晚期葡萄膜炎。在BIO. RIII小鼠中誘 導EAU，小鼠于第12天達到疾病晚期(評分為3)，靜脈內注射每日給予100微克/小鼠天 然α -MSH、RI α -MSH或PBS。圖2A顯示用天然α -MSH或逆(retro) -RI α -MSH治療小鼠 的數據，與PBS對照小鼠相比，顯示葡萄膜炎眼評分降低。圖2Β顯示EAU誘導后第16天， 各組中小鼠各眼的最高評分(η = 8)。星號表示各組之間有顯著差異(ρ < 0. 05)。圖3顯示用α -MSH或RI α -MSH治療的小鼠的視網膜圖像和各眼評分。在Β10. RIII小鼠中誘導EAU，小鼠于第13天達到疾病晚期，此時開始每日用100微克/小鼠天然 α -MSH、RI α -MSH或PBS靜脈內注射治療。顯示了治療13天后提供各組眼評分中值的視 網膜眼底檢查(Fimdoscopic)圖像(η = 11)。PBS治療小鼠的眼評分為3，顯示在眼睛的數 個象限中有炎性病損和鄰近視神經有血管炎(圖3Α)。α -MSH和RI α -MSH治療小鼠的眼 評分為1，顯示葡萄膜炎消退，僅在視神經周圍有炎癥(圖3Β和3C)。視網膜代表各組的眼 評分中值。治療后第13天各組小鼠的各眼評分示于圖中。星號表示各組之間有顯著差異
(P < 0. 01)。圖4顯示RI α -MSH和天然α -MSH治療EAU小鼠的組織病理學。給雌性Β10. RI11 小鼠注射IRBP+CFA誘導EAU。當小鼠達到眼評分為3時，每日靜脈內注射100微克/小鼠的逆-倒位(retro-inverso) α -MSH、天然 α -MSH 或 PBS 治療小鼠。RI α -MSH 或 α -MSH 治療組小鼠的炎性應答緩解(P < 0. 05)。照片顯示治療開始后10天眼睛的蘇木精和曙紅 染色，代表了 PBS (圖4Α)、α -MSH(圖4Β)和RI α -MSH (圖4C)治療組小鼠的眼評分中值。 放大100Χ。 圖5顯示與混雜肽對照相比，每日腹膜內給予逆_倒位α -MSH對葡萄膜炎的影 響。誘生疾病后第11天開始每日腹膜內注射100微克RI α-MSH或對照混雜D氨基酸肽治 療BIO. RIII小鼠。數據顯示RI α -MSH(η = 4)和對照混雜肽(η = 5)治療組小鼠的臨床 平均眼評分。小鼠總共治療13天。數據代表兩次實驗。星號表示各組之間有顯著差異(P < 0. 04)。圖6. RI α -MSH治療視網膜炎癥的效果。當臨床評分為4時，每日腹膜內注射 RI α -MSH(3、10或100微克/小鼠)治療B10RIII小鼠。每日注射對照混雜肽100微克/ 小鼠。該圖描繪了隨時間推移的臨床評分。用100或10微克/小鼠開始治療后觀察到視 網膜炎癥減輕。用較低劑量的RI α -MSH(3微克/小鼠)或PBS或對照混雜肽(η = 4)治 療的小鼠，觀察到有限的有益臨床應答。星號表示各組之間有顯著差異(P <0.05)。圖7顯示RI α -MSH對鼠黑色素瘤細胞產生cAMP的影響。用0. 01ng/ml-1000ng/ ml濃度的天然α -MSH、逆-倒位α -MSH或對照混雜肽處理B16-F1黑色素瘤細胞后檢測細 胞中的cAMP。圖7A顯示天然α -MSH和RI α -MSH顯著提高了 cAMP水平。檢測cAMP所用 的對照包括100 μ M濃度的毛喉素。圖7Β顯示丙氨酸掃描數據。檢驗lyg/ml RIa-MSH 的丙氨酸取代肽是否能提高鼠B16-F1黑色素瘤細胞系的cAMP水平。數據代表兩次實驗。 序列表見表1。星號表示各組之間有顯著差異(P < 0. 01)。圖8顯示MOG誘導的EAE的疾病進程。注射M0G35-55肽(200微克/小鼠)和 CFA乳液誘導C57BL/6小鼠產生EAE。在第0天和第2天注射百日咳毒素。第10天開始每 日腹膜內注射100微克/小鼠a-MSH、RI a-MSH或PBS進行治療。圖8A顯示每日記錄的 臨床疾病評分。圖8B顯示誘導疾病后第20天各組的各疾病評分。圖9顯示RI a -MSH導致EAE疾病平均評分降低。注射M0G35-55肽(200微克/ 小鼠)和CFA誘導C57BL/6小鼠產生EAE。在第0天和第2天注射百日咳毒素。第10天開 始每日腹膜內注射100微克或30微克/小鼠的a -MSH或RI a -MSH、2mg/kg的地塞米松或 PBS進行治療。每日記錄臨床疾病評分。圖10顯示用RI a -MSH治療小鼠的脊髓組織學。注射M0G35-55肽(200微克/小 鼠)和CFA乳液誘導C57BL/6小鼠產生EAE。在第0天和第2天注射百日咳毒素。第10 天開始每日腹膜內注射100微克/小鼠的RI a -MSH進行治療。收集疾病誘導后第24天的 脊髓。各組顯示兩只代表性小鼠的PBS治療(圖IOa和10c)和RI a -MSH治療(圖IOb和 IOd)。箭頭顯示炎癥細胞浸潤部位。圖11顯示EAE疾病階段中，MOG肽免疫小鼠脾臟中的TNFa和IL-IOmRNA含 量。在第0天用200 μ g MOG肽免疫小鼠，第10-15天每日用PBS、a-MSH(100 μ g)或 RIa-MSH(IOOyg)治療。治療開始后第1 (圖Ila和lib)、第4 (圖Ilc和lid)和第7天 (圖lie和Ilf)收集脾臟，用定量PCR分析TNF α和IL-IOmRNA表達。數據顯示各治療組 4只小鼠的平均值。根據肌動蛋白標準化RNA水平。圖12顯示對MOG 35-55肽的回憶應答。在第0天用200 μ g MOG肽免疫小鼠。第2-8天小鼠腹膜內注射PBS、IOOyga-MSH或IOOyg RI a-MSH(η = 5)。第9天收集脾臟 (圖12a)和淋巴結(圖12b)細胞，用25 μ g/ml MOG35-55肽或OVA肽體外刺激。培養第三 天用[3H]胸苷脈沖細胞。數據顯示為平均值士SD。24小時后，收集用MOG肽刺激的脾臟 細胞培養上清液，用流式細胞術分析細胞因子TNF-α和IFNy (圖12c)及MCP-1 (圖12d) 的水平。數據顯示為平均值士SD。原初小鼠未用MOG肽免疫。圖13顯示RI α -MSH治療后，MOG免疫小鼠的血清和脾臟中的細胞因子概況。在 第0天用200 μ g MOG 35-55肽免疫小鼠。第2-8天給小鼠腹膜內注射PBS、100 μ g α -MSH 或IOOyg RI α-MSH(η = 5)。第9天收集脾臟和血清。圖13a和13b顯示實時PCR定量 測定的脾臟TNF-α和IL-10分別的mRNA水平。數據顯示各治療組4只小鼠的平均值。根 據β-肌動蛋白標準化RNA水平。用流式細胞術分析血清的細胞因子水平。圖13c顯示 TNF-α、MCP-U IL_6的血清水平，圖13d顯示IL-10和IL-12的血清水平。原初小鼠未用 MOG肽免疫。數據顯示為平均值士SD。圖14顯示α -MSH和RI α -MSH對巨噬細胞標記的影響。在第1_7天，用MOG肽體 內免疫小鼠，每日用α-MSH或RI α-MSHdOO微克/小鼠)治療。用流式細胞術分析脾臟 巨噬細胞的CD14、CD40和CD86表達水平。根據CDllb+(圖14a)或F4/80+(圖14b)巨噬細 胞群門控(分離)細胞。數據顯示為門控(分離的)巨噬細胞群的平均陽性百分比(η = 5)。圖15顯示LPS-誘導了腹腔巨噬細胞(圖15a)和脾臟(圖15b)中mMClRmRNA水 平增加。給C57BL/6小鼠(η = 4)腹膜內注射LPS(1微克/小鼠)。在0. 5小時、1小時和 24小時收集腹腔巨噬細胞和脾臟。用實時PCR定量測定mMClR mRNA水平。根據18s標準 化RNA水平。圖16顯示MSH對體內LPS炎癥模型的作用。給C57BL/6小鼠腹膜內注射1微克 LPS。30分鐘后，腹膜內注射地塞米松(2mg/kg)和α -MSH(圖16a-16c)或RI α -MSH類似 物891(圖16d-16f)治療小鼠。LPS攻擊后2小時收集血清。通過流式細胞術，采用細胞計 數珠試驗分析TNF- α (圖16a 和16d)、MCP-I (圖16b和16e)和IL-10 (圖16c和16f)水 平。數據顯示各細胞因子檢測值和各組的平均值(η = 6)。圖17顯示RI-α-MSH和α-MSH在血漿和血清中的穩定性。圖17Α顯示37°C， RI-α -MSH和α -MSH在血漿和PBS中的穩定性。圖17Β顯示單次靜脈內注射后，RI-α -MSH 和α-MSH肽的血清半衰期。圖18顯示MSH(圖18Α)和RI-MSH(圖18Β)與黑皮質素受體1、3、4和5的結合研
允結果。圖19顯示核心四肽HfRW和逆-倒位MSH的翻轉。圖20顯示RI-MHS不同位置的非天然氨基酸殘基取代。圖21顯示RI-MHS與其變體的代表性競爭結合MClR的試驗。圖22顯示RI α-MSH類似物對Β16 Fl鼠黑色素瘤細胞cAMP水平的影響。圖22A 類似物890,891和892 ；圖22B 類似物893,894和895 ；圖22C 類似物880,886和878 ；和 圖22D 類似物872,878和869。發明詳述^X
本發明方法的α-MSH和MClR蛋白及核酸不限于其具體來源或物種。因此，可以 是分離的或重組(產生)的蛋白質和核酸。α -促黑素細胞激素(α -MSH)是包含序列Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val (SEQ ID NO 8) (SYSMEHFRffGKPV)的多肽。近年來檢驗到 α-MSH 具有抗 炎和免疫調節性能。α-MSH源自阿黑皮素原(POMC)的胞內蛋白水解切割。已在幾種器官 中檢測到α-MSH神經肽，系由神經元、垂體、腸、皮膚和免疫細胞所產生。已
“偶聯物”包括粘附、連接、偶聯、形成復合體或以其它方式彼此結合的兩個或更多 個成員。這些成員可通過共價鍵、離子鍵、靜電作用、氫鍵、范德華力或物理方式彼此連接。“生物學活性”分子包括能引發或調節生理學應答的分子或化合物。在一方面，生 物學活性化合物能刺激黑皮質素受體，優選MCl-受體。“調節”表示上調或下調一種或多種蛋白質和蛋白質亞單位的活性，例如其表達、 水平或活性高于或低于不存在該調節劑時觀察到的活性。例如，術語“調節”可表示“抑制” 或“刺激”。“C-末端序列”包括通常(但不一定)指羧基末端的氨基酸鏈。書寫肽序列的習 慣是將C-末端置于右側，從N-末端向C-末端書寫序列。C-末端序列可包含1-100個氨基 酸，優選2-15個氨基酸。甚至更優選3-10個氨基酸。C-末端可以羧基為末端，或者可用 本領熟知的方法修飾該末端而包含功能成員(例如，靶向基團、保留信號、脂質和錨定(基 團))。本發明提供“基本純的化合物”。本文用術語“基本純的化合物，，描述基本上不含 與其天然結合的其它蛋白質、脂質、碳水化合物、核酸和其它生物學材料的分子，例如多肽 (如結合MClR的多肽或其片段)。例如，基本純的分子，如多肽可以是至少60干重％的感 興趣分子。可采用常規方法，例如聚丙烯酰胺凝膠電泳(如，SDS-PAGE)、柱層析(如，高效 液相層析(HPLC))和氨基末端的氨基酸序列分析來測定多肽的純度。在一個實施方式中，短語“選擇性結合”表示當存在兩種或多種受體(例如，黑皮 質素受體MC1、MC2、MC3、MC4、MC5受體)的混合物時，本發明制備或所用的化合物或多肽優 先結合一類受體勝過另一類受體。“氨基酸”或“氨基酸序列”包括寡肽、肽、多肽或蛋白質序列，或它們的任何片段、 部分或亞單位，及其天然或合成的分子。術語“多肽”和“蛋白質”包括通過肽鍵或修飾的 肽鍵(即肽等構物)彼此連接的氨基酸，包括除20種基因編碼的氨基酸外的修飾氨基酸。 術語“多肽”還包括肽和多肽片段、基序等。氨基酸的大寫單字母縮寫指其天然L-異構體。 氨基酸的小寫單字母縮寫表示其D-異構體。術語“多肽”、“肽”和“蛋白質”可互換使用，指任何長度的氨基酸聚合物。肽和多 肽可完全由合成的、非天然氨基酸類似物構成，或是部分天然肽的氨基酸和部分非天然氨 基酸的類似物構成的嵌合分子。在一方面，多肽用于本發明的組合物、細胞體系或方法中 (例如，含有表達至少一種本發明酶的質粒的宿主細胞)。此外，多肽指由共價連接于另一 功能基團(例如，增溶基團、靶向基團、PEG、非氨基酸基團或其它治療劑)的氨基酸聚合物 構成的化合物。可用以下括號內的名稱簡寫氨基酸脯氨酸(Pro)、纈氨酸(Val)、賴氨酸(Lys)、鳥氨酸(Orn)、正亮氨酸(Nle)、甘氨酸(Gly)、色氨酸(Trp)、丙氨酸(Ala)、苯丙氨酸 (Phe)、精氨酸(Arg)、組氨酸(His)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、絲氨酸(Ser)、甲硫 氨酸(Met)、異亮氨酸(lie)、酪氨酸(Tyr)、環己基丙氨酸(Cha)、4_氟-D-苯基甘氨酸 (4-氟-D-Phg)、2_ 噻吩基-D-丙氨酸(D-Thi)。本文所用的“治療”指給予哺乳動物能引發個體產生預防性、治愈性或其它有益作 用的制劑。治療也可導致減弱或緩解對象的疾病或疾病癥狀。除非另有表述，本文所用的單數形式“一個”、“一種”和“該”包括復數形式。例如， “一種”靶細胞包括一個或多個靶細胞。本發明的多肽組合物可含有非天然結構組分的任何組合。各個肽殘基可通過 肽鍵、其它化學鍵或偶聯劑，例如戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯、雙功能馬來酰亞胺、N， N’ - 二環己基碳二亞胺(DCC)或N，N’ - 二異丙基碳二亞胺(DIC)相連接。能替代傳統酰 胺鍵(“肽鍵”)連接的連接基團包括，例如酮基亞甲基(如_C( = 0)-CH2-替代-C(= 0) -NH-)、氨基亞甲基(CH2-NH)、亞乙基、烯烴(CH = CH)、醚(CH2-O)、硫醚(CH2-S)、四唑、噻 唑、逆酰胺(retroamide)、硫代酰胺或酯(參見，例如Spatola(1983)刊于Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and ProteinsC 氨基酸、肽和蛋白質的化學禾口 生物活性)，第 7 卷，第 267-357 頁，"Peptide Backbone Modifications” (肽骨架修飾) MD (Marcel Dekker)公司，紐約，通過引用納入本文)。可通過天然加工，例如翻譯后加工(如磷酸化、酰化等)，或通過化學修飾技術，修 飾用于實施本發明方法的多肽，而得到修飾的多肽。修飾可發生在多肽中的任何地方，包 括肽骨架、氨基酸側鏈和氨基或羧基末端。應該知道，給定多肽的數個位點中可存在程度 相同或不同的同一類修飾。給定多肽也可含有多種類型的修飾。修飾包括乙酰化、酰化、 ADP-核糖基化、酰胺化、共價連接于核黃素、共價連接于血紅素分子、共價連接于核苷酸或 核苷酸衍生物、共價連接于脂質或脂質衍生物、共價連接于磷脂酰肌醇、交聯環化、形成二 硫鍵、脫甲基化、形成共價交聯、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸鹽、甲酰化、Y "羧化、糖基化、 GPI錨定形成、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、PEG化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊 烯化、硒化、硫酸化和轉運-NA介導的蛋白質添加氨基酸，例如精氨酸化。參見，例如通過 弓I用納入本文的 Creighton, Τ· Ε· , Proteins—Structure and Molecular Properties (蛋 白質"結構和分子特性)第2版.，WFC公司(W. H. Freeman and Company)，紐約(1993)； Posttranslational Covalent Modification ofProteins ( ^ SM Wllif jp^^ff tfP ), B. C. Johnson 編.，學術出版社(Academic Press)，紐約，第 1-12 頁(1983)。化合物的其它實施方式 在一些實施方式中，本發明提供能選擇性結合黑皮質素1受體(MCRl)的基本純的 化合物或其藥學上可接受的鹽，所述化合物包括具有以下序列的多肽X&&2X&&5X&&7 X&&g X&&g X&&1QXss^ X&&13，其中Xaa1 是 D_Val、D-Ala 或 D-Lys ；Xaa2 M D-Pro > D-Ala D-Lys ；Xaa3 是 D-Lys> D-Orn> D_Nle、D-Ala 或 D-Lys ；Xaa4 是 Gly 或 D-Ala ；Xaa5 是 D_Trp、Trp, D_3_ 苯并噻吩基-Ala、D_5_ 羥基-Trp、D_5_ 甲氧基-Trp、D-Phe 或 D-Ala ；XaadD-ArgJ-His 或 D-Ala;Xaa7 是 D-Cha、D-Phe、Phe、D_4-氟 _Phg、D_3-吡啶基-Ala、D-Thi、D-Trp、D_4_ 硝 基-Phe 或 D-Ala ；Xaa8 ^ D_His、His、D-Arg> Phe D-Ala ；Xaa9 是 D_Glu、D-Asp, D-瓜氨酸、D-Ser 或 D-Ala ；Xaaltl 是 D-Met、D-丁硫氨酸、D-Ile 或 D-Ala ；Xaa11 是 D-Ser> D-Ile 或 D-Ala ；Xaa12 ^ D-Tyr > D-Ser D-Ala ；Xaa1^D-Ser 或 D-Ala0在一些實施方式中，本文提供能選擇性結合MClR的肽類似物或其藥學上可接受 ^ JIW^T"ji^lJ W^li -.Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11
Xaa12 Xaa13,其中 Xaa1 是 D-Val ；Xaa2 是 D-Pro ；Xaa3 是 D-Lys>D-Orn 或 D-Nle ；Xaa4 是 Gly ； Xaa5 是 D-Trp、Trp、D_3_ 苯并噻吩基-Ala、D_5_ 羥基-Trp、D_5_ 甲氧基-Trp 或 D-Phe ； Xaa6 是 D-Arg 或 D-His ；Xaa7 是 D-Cha、D-Phe、Phe、D_4-氟-Phg、D_3-吡啶基-Ala,D-Thi, D-Trp 或 D-4-硝基-Phe ；Xaa8 是 D-His, His、D-Arg, Phe 或 D-Ala ；Xaa9 是 D-Glu, D-Asp, D-瓜氨酸或 D-Ser ；Xaa10 是 D_Met、D_ 丁硫氨酸或 D-Ile ；Xaa11 是 D-Ser 或 D-Ile ；Xaa12 是 D-Tyr或D-Ser ；Xaa13是D-Ser ；其中不多于一個的Xaai_13是L-氨基酸。在其它實施方式中，本文提供的肽類似物或其藥學上可接受的鹽包含具有以下序 列白勺多月太！Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13，其中 Xaa1 是 D-Val ；Xaa2 是 D-Pro ；Xaa3 是 D-Lys>D-Orn 或 D-Nle ；Xaa4 是 Gly ；Xaa5 是 D-Trp 或 Trp ；Xaa6 是 D-Arg ；Xaa7 是 D-Cha、D-Phe、Phe 或 D-Thi ；Xaa8 是 D-His 或 His ；Xaa9 是 D-Glu 或 D-Ser ；Xaa10 是 D_Met、D- 丁硫氨酸或 D-Ile ；Xaa11 是 D-Ser 或 D-Ile ；Xaa12 是 D-Tyr 或 D-Ser ；Xaa13是D-Ser ；其中不多于一個的Xaai_13是L-氨基酸。本文提供的化合物包括α -促黑素細胞激素(α _MSH)的肽類似物。在一個替代實施方式中，所述肽類似物由D-氨基酸構成。在其它實施方式中，所 述肽包含D氨基酸、L氨基酸或D和L氨基酸的混合物。在其它實施方式中，所述肽由至少 40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或100 %的D氨基酸構成。本發明的化合物也可摻入以下 非限制性例子的非標準氨基酸D-鳥氨酸、D-正亮氨酸、3-苯并噻吩基-D-丙氨酸、5-羥 基-D-Trp、5-甲氧基-D-Trp、4-氟-D-苯基甘氨酸(4-氟-D-Phg)、3_吡啶基-D-丙氨酸、 2-噻吩基-D-丙氨酸(D-Thi)、D_環己基丙氨酸(D-Cha)、4_硝基-D-Phe、D-瓜氨酸、α -甲 基-D-Met和D- 丁硫氨酸。在一些實施方式中，所述核心四肽由氨基酸序列His Phe Arg Trp或Trp Arg Phe His構成，優選D-氨基酸構型。在另一實施方式中，所述核心四肽由氨基酸序列His D-Cha Arg Trp或Trp Arg D-Cha His構成，優選D-氨基酸構型。在一些實施方式中，所述核心四 肽由4個D-氨基酸構成。在其它實施方式中，所述核心四肽含有至少一個非標準氨基酸。本文提供的化合物 可以是天然或重組的化合物。可用本領域已知的常規化學技 術制備本發明的化合物。出版的文獻解釋了固相合成方法，例如Solid Phase Peptide Synthesis :A Practical Approach (固相肽合成實用方法)(Ε. Atherton 等，1989)。也可用本領域已知的常規分子生物學技術制備本發明的化合物。除非另有表述，本申請的術語定義和技術說明見于多種熟知的參考文獻中，例如=Sambrook, J等.,Molecular Cloning A Laboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港出版社)(1989) ；Goeddel，D編· ,Gene Expression Technology,Methods in Enzymology (基因表汰技術,酶學方法)，185, Academic Press (學術出版社)，圣迭戈，加利 福尼亞州(1991) ；"Guide to Protein Purification (蛋白質純化指南)”Deutshcer，M. P 編.,Methods in Enzymology (酶學方法)，Academic Press (學術出版社)，圣迭戈，加利福 尼亞州(1989) ；Innis 等·，PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications (PCR 方案方法和應用指導)，學術出版社，圣迭戈，加利福尼亞州(1990) ；Freshney, R. I.， Culture of Animal Cells :A Manual of Basic Technique (動物細胞培養基礎技術 手冊)，第二版，Alan Liss, Inc (AL 公司)·紐約，紐約州(1987) ；Murray, Ε. J 編.，Gene Transfer and Expression Protocols (基因轉移和表汰方案)，第 109-128 頁，The Humana Press Inc.(休瑪娜出版公司)，克利夫頓，新澤西州和Lewin，B.，Genes VI(基因VI)，牛 津大學出版社，紐約(1997)。所有引述的參考文獻通過引用全部納入本文。在一些實施方式中，本文提供的肽類似物能選擇性結合或活化黑皮質素1受體 (MClR)。可采用任何合適的試驗來檢測MClR的結合或活化。例如，可采用體外誘導cAMP來 評估MClR活化。體外評估可表明體內活化。本發明的其它實施方式包括MCl-受體的任何選 擇性多肽。可用合適的篩選試驗鑒定選擇性MCl-受體化合物。實施例4公開了 MC-I受體 結合試驗的非限制性例子。在一些實施方式中，優選的MCl-受體包括智人(homo sapiens) 的黑皮質素1受體(GenBank登錄號NP_002377)。本發明的其它實施方式涉及調節cAMP、一氧化氮(NO)、TNF-α、TNF-α mRNA、 IL-IOmRNA, IL-10、IFN y , IL_6、IL-12和/或MCP-I水平的化合物。在一些實施方式中， 所述化合物能提高cAMP水平。在其它實施方式中，所述化合物涉及降低或抑制一氧化氮 (NO) ,TNF-α、TNF-a mRNA、IL-10mRNA、IL-10、IFNy、IL-6、IL-12 和 / 或 MCP-I 的水平。可 通過篩選試驗測定調節上述水平的化合物的身份。可用本領域已知的可接受試驗檢測上述 水平。實施例中公開了顯示能理想地調節這些水平的化合物的鑒定試驗的非限制性例子。在一些實施方式中，本發明化合物可通過其它作用機制調節免疫應答和炎癥，而 不限于本文公開的機制。在一些實施方式中，本文提供血漿穩定性和對蛋白酶降解耐受性改善的肽。可用 任何合適的方法評估血漿穩定性和對蛋白酶降解的耐受性。實施例19公開了一個非限制 性例子。體外評估可表明體內的性能、改善的耐受性和較長的半衰期。本文提供可在體內、離體或體外實施的方法。PEG化的肽在一些實施方式中，修飾所述肽延長其半衰期。在一些實施方式中，PEG化所述 肽。在一些實施方式中，PEG化的肽指共價連接或偶聯于一條或多條聚乙二醇(PEG)聚 合物鏈的肽。PEG聚合物鏈可包括經修飾、功能化或衍生的PEG鏈。在另一實施方式中， PEG聚合物鏈可含有至少一個或多個分支點。在一些優選的實施方式中，PEG聚合物鏈和 相應的PEG化肽為水溶性，可在溶液中高度流動，無毒性和無免疫原性，不難從體內清除， 其體內分布可改變。在一些優選的實施方式中，通過(改變)PEG鏈類型來調節PEG化肽的藥代動力學性質。制備PEG化肽的策略和方法可采用本領域已知的方法(G. Pasuta和 F. M. Veronese(2007) "Polymer-drug conjugation, recent achievements and general strategies (聚合物-藥物偶聯，最近的成果和通用策略)"Progress in Polymer Science 32(8-9) :933-961，通過引用納入本文)。本領域已知制備第一和第二代PEG化蛋白質的方法。PEG化的非限制性例子包括第一步適當功能化PEG聚合物的一個或兩個末端(對 于線形PEG)。用相同的反應活性分子活化各末端的PEG稱為“同質雙功能化”，而如果提供 不同的官能團，稱該PEG衍生物為“異質雙功能化”或“異質功能化”。制備PEG聚合物的化 學活性或活化衍生物而使PEG連接于所需分子。根據要偶聯于PEG的分子中可利用的反應 活性基團的類型選擇PEG衍生化的合適官能團。反應活性氨基酸的非限制性例子包括賴氨 酸、半胱氨酸、組氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸。也可利用N-末 端氨基和C-末端羧酸。用于偶聯的其它異質雙功能PEG:這些異質雙功能PEG在兩種實體需要親水性、屈 曲性和生物相容性間隔臂的連接中非常有用。異質雙功能PEG的優選末端基團是馬來酰亞 胺、乙烯基砜、吡啶基二硫化物、胺、羧酸和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯基團。在本發明的一些實施方式中，PEG化肽的分子量范圍為0. 2kDa-100kDao在本發明 的一些優選實施方式中，PEG化肽的分子量范圍為0.2kDa-40kDa。在本發明的一些優選實 施方式中，PEG化肽的分子量范圍為0.2kDa-15kDa。在其它實施方式中，可商品化購得的 PEG的優選平均分子量(以Da計；通過尺寸排阻層析測定)可選自< lk、2k、3. 5k、5k、10k、 20k、30k、40k和以上，但根據所需的藥代動力學可以是任何分子量。例如，可采用較低分子 量的異質雙功能PEG作為接頭和采用較低分子量的PEG來提高肽的溶解性。PEG還可以是 多臂、分叉或分支PEG。在一些實施方式中，將所述肽偶聯于靶向分子或起著靶向分子的作用，其中所述 靶向分子優選結合于所需受體。在本發明的一些優選實施方式中，將所述肽偶聯于細胞 毒制劑。術語“細胞毒制劑”指能抑制或阻止細胞的表達活性、細胞的功能和/或導致細 胞破壞的物質。該術語應包括放射性同位素化療劑，和毒素，例如細菌、真菌、植物或動 物來源的小分子毒素或酶活性毒素，包括它們的片段和/或變體。細胞毒制劑的非限制 性例子包括美登素、多拉司他汀及其類似物，包括塔斯托定(tasidotin)和奧利斯它汀 (auristatin)0在本發明的其它實施方式中，細胞毒制劑的非限制性例子包括但不限于 美登素類(maytansinoids)、釔、鉍、蓖麻毒蛋白、蓖麻毒蛋白A-鏈、皂草素、阿霉素、柔紅霉 素、紫杉醇、溴化乙錠、絲裂霉素、依托泊苷、鬼白噻吩甙(tenoposide)、長春新堿、長春堿、 秋水仙素、二羥基炭疽桿菌素二酮、放線菌素、白喉毒素亞單位A、截短的假單胞菌外毒素 (PE)A, PE40、相思豆毒蛋白、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α -八疊球菌素、白樹毒 素、米托潔林、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素、麻瘋樹逆境蛋白(curicin)、巴豆毒蛋白、刺 孢霉素、石堿草(sapaonaria officinalis)抑制劑、糖皮質激素和其它化療劑、以及放射性 同位素，例如 At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32 和 Lu 的放射性同位素。還可將 抗體偶聯于能將前藥轉化為其活性形式的抗癌前藥活化酶。可用本領域目前已知的任何方法將肽直接或間接連接于細胞毒性或靶向制劑。在 本發明的一些優選實施方式中，經一個或多個接頭使所述肽連接于細胞毒制劑或靶向試劑而形成偶聯物，只要包含的接頭不會實質性阻礙該肽或所偶聯制劑的功能、結合、毒性或攝 入。接頭的非限制性例子包括離子鍵和共價鍵及任何其它足夠穩定的結合鍵，從而使 該偶聯物所靶向的細胞可內化所述靶向制劑。根據所需特性選擇接頭分子。接頭選擇要 考慮的包括減輕或降低偶聯元件相靠近所導致的空間位阻，偶聯物的其它性能，例如特異 性、毒性、溶解性的變化，偶聯物的血清穩定性和/或胞內利用度和/或提高連接鍵的可屈 曲性。接頭可以是任何類型的連接鍵，例子描述參見通過引用全文納入本文的美國專利號 7，166，702 和 5，194，425。適合于化學連接的偶聯物的接頭和連接鍵包括但不限于游離的反應活性基 團，例如胺基與硫醇基之間的二硫鍵、硫醚鍵、位阻二硫鍵和共價鍵。可采用異質雙功能 試劑產生這些鍵，在一個或兩個多肽上產生反應活性硫醇基，然后使一個多肽的硫醇基 與另一個多肽的反應活性馬來酰亞胺基或反應活性硫醇基或胺基反應。其它接頭包括 可在更具酸性的細胞內腔室中被切割的酸可切割接頭，例如雙馬來酰亞胺乙氧基丙烷 (bismaleimidoethoxy propane)，酸不穩定轉鐵蛋白偶聯物與己二酸二酰胼接頭；暴露于 紫外光或可見光時可被切割的交聯接頭和例如各種結構域，如人IgGl的恒定區CH1、CH2和 CH3(參見通過引用納入本文的 Batra 等.，(1993)Mol. Immunol. 30 :379_386)。可共價偶聯接頭而將化學接頭和肽接頭插入所述肽和靶向制劑或細胞毒制劑中。 可用下述異質雙功能試劑來實現此類共價偶聯。異質雙功能交聯試劑本領域技術人員已知用于在氨基與硫醇基之間形成共價鍵和將硫醇基引入蛋 白質中的許多異質雙功能交聯劑(參見，例如描述此類試劑的制備和應用并提供此類試 劑的商品化來源的PIERCE CATALOG(皮爾斯公司目錄)，Immuno Technology Catalog & Handbook(免疫技術目錄和手冊)，1992-1993 ；也參見 Cumber 等·，(1992)Bioconjugate Chem. 3' :397_401 ；Thorpe 等.，(1987)Cancer Res. 47 :5924_5931 ；Gordon 等.，(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 308-312 ；Walden 等·， (1986) J. Mol. Cell Immunol. 2 191-197 ；Carlsson 等·， (1978)Biochem. J. 173 723~737 ；Mahan 等·， (1987)Anal. Biochem. 162 163-170 ；Wawryznaczak 等· , (1992)Br. J. Cancer 66 :361_366 ；Fattom等·, (1992) Infection & Immun. 60 584-589)。引述的所有參考文獻通過引用全文納入本文。 可利用這些試劑在靶向劑、趨化因子與要靶向(輸送)的物質之間形成共價鍵。這些試 劑包括但不限于N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP;二硫鍵接頭)； 6-[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基]己酸磺基琥珀酰亞胺酯(磺基-LC-SPDP)；琥珀酰亞 胺基氧基羰基-α-甲基芐基硫代硫酸酯(SMBT，阻礙二硫鍵接頭)；6-[3-(2_吡啶基二硫 代)丙酰胺基]己酸琥珀酰亞胺酯(LC-SPDP) ；4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-1-羧 酸磺基琥珀酰亞胺酯(磺基-SMCC) ；3-(2_吡啶基二硫代)丁酸琥珀酰亞胺酯(SPDBHi 阻二硫鍵接頭)；2-(7_疊氮基-4-甲基香豆素-3-乙酰胺)乙基-1，3-二硫代丙酸磺基 琥珀酰亞胺酯(SAED) ；7-疊氮基-4-甲基香豆素-3-乙酸磺基琥珀酰亞胺酯(SAMCA)； 6-[α-甲基-α_(2-吡啶基二硫代)甲苯酰胺基]己酸琥珀酰亞胺酯(磺基-LC-SMPT)； 1，4_ 二-[3' -(2'-吡啶基二硫代)丙酰胺基]丁烷(DPDPB) ;4_琥珀酰亞胺基氧基羰 基-α-甲基-α-(2-吡啶基硫代)甲苯(SMPT，位阻焦硫酸酯接頭)；6 [ α -甲基-α - (2_ 口比啶基二硫代)甲苯酰胺基]己酸磺基琥珀酰亞胺酯(磺基-LC-SMPT)；間-馬來酰亞胺基苯 甲酰基-N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)；間-馬來酰亞胺苯甲酰基-N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯 (磺基-MBS) ；N-琥珀酰亞胺(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB;硫醚接頭)；(4-碘代 乙酰基)氨基苯甲酸磺基琥珀酰亞胺酯(磺基-SIAB)；琥珀酰亞胺基_4-(對-馬來酰亞 胺基苯基)丁酸酯(SMPB)；磺基琥珀酰亞胺基_4-(對-馬來酰亞胺基苯基)丁酸酯(磺 基-SMPB)；疊氮基苯甲酰基酰胼(ABH)。其它異質雙功能可切割交聯接頭包括N-琥珀酰亞胺基(4-碘代乙酰基)_氨 基苯甲酸酯；(4-碘代乙酰基)-氨基苯甲酸磺基琥珀酰亞胺酯；4-琥珀酰亞胺基-氧 基羰基-α -(2-吡啶基二硫代)_甲苯；磺基琥珀酰亞胺基_6-[ α -甲基-α -(吡啶基 二硫醇)_甲苯酰胺基]己酸酯；N-琥珀酰亞胺基-3-(_2-吡啶基二硫代)_丙酸酯； 6 [3 (- (-2-吡啶基二硫代)-丙酰胺基]己酸琥珀酰亞胺酯；6 [3 (- (-2-吡啶基二硫代)-丙 酰胺基]己酸磺基琥珀酰亞胺酯；3-(2_吡啶基二硫代)-丙酰胼、埃爾曼試劑、二氯三嗪酸 (dichlorotriazinic acid)、S-(2-硫代吡啶基)-L-半胱氨酸。其它示范性雙功能連接化 合物公開于美國專利號 5，349，066,5, 618，528,4, 569，789,4, 952，394 和 5，137，877，它們 均通過引用全文納入本文。酸可切割、光可切割和熱敏感的接頭也可采用酸可切割、光可切割和熱敏感的接頭，特別是在需要切割要靶向(輸送) 的物質使之更易于接觸反應的情況時。酸可切割的接頭包括但不限于雙馬來酰亞胺基乙 氧基丙烷接頭；和己二酸二酰胼接頭(參見，例如通過引用納入本文的Fattom等.，(1992) Infection & Immim. 60 :584_589)，和含有轉鐵蛋白充足部分能進入胞內轉鐵蛋白循環途 徑的酸不穩定轉鐵蛋白偶聯物(參見，例如通過引用納入本文的WelhSner等.，(1991) J. Biol. Chem. 266 :4309_4314)。光可切割的接頭是暴光時可被切割的接頭(參見，例如Goldmacher等.，(1992) Bioconj. Chem. 3 104-107，這些接頭通過引用納入本文)，從而在暴光后可釋放要靶向(輸 送)的的物質。已知有暴光時可被切割的光可切割接頭(參見，例如Hazum等.，(1981)刊 于P印t.，Proc. Eur. Pept. Symp.，第 16 屆，Brunfeldt，K(編)，第 105-110 頁，其描述了采用 硝基芐基作為半胱氨酸的光可切割保護基團；Yen等.，(1989)Makromol. Chem. 190 =69-82, 其描述了水溶性光可切割共聚物，包括羥丙基甲基丙烯酰胺共聚物、甘氨酸共聚物、熒光素 共聚物和甲基羅丹明共聚物；GoIdmacher等.，(1992) Bioconj. Chem. 3 104-107，其描述 了暴露于近紫外光(350nm)時可發生光解降解的交聯接頭和試劑；和Senter等.，(1985) Photochem. Photobiol. 42 :231_237，其描述了可產生光可切割連接鍵的硝基芐氧基羰基氯 交聯劑)，從而在暴光后可釋放要靶向(輸送)的的物質。引述的所有參考文獻通過引用 全文納入本文。此類接頭在采用光纖暴光治療皮膚病或眼病中特別有用。給予所述偶聯物 后，使眼睛或皮膚或其它身體部分暴光，導致釋放偶聯物中要靶向(輸送)的物質。此類光 可切割的接頭可與需要除去靶向試劑使之從動物體內快速清除的診斷方案聯用。用于化學偶聯的其它接頭其它接頭包括三苯甲基接頭，特別是衍生的三苯甲基可產生在不同酸度或堿度下 釋放治療劑的一類偶聯物。因此，若能預先選擇使治療劑釋放的PH范圍所賦予的靈活性， 就能夠根據需要遞送的治療劑在組織之間(分配)的已知生理學差異來選擇接頭(參見，例如通過引用納入本文的美國專利號5，612，474)。例如，腫瘤組織的酸度看來低于正常組織。肽接頭接頭分子可以是肽。偶聯物中可采用肽接頭。這種肽接頭通常含有約2個-60個 氨基酸殘基，例如約5-40個，或約10-30個氨基酸殘基。長度的選擇取決于例如所包含接 頭的用途等因素。接頭分子可以是可屈曲的間隔臂氨基酸序列，例如單鏈抗體研究中已知的那 些序列。此類已知的接頭分子的例子包括但不限于GGGGS，(GGGGS) η、GKSSGSGSESKS、 GSTSGSGKSSEGKG, GSTSGSGKSSEGSGSTKG, GSTSGSGKSSEGKG, GSTSGSGKPGSGEGSTKG, EGKS SGSGSESKEF、SRSSG、SGSSC0也可采用具有以下序列的白喉毒素胰蛋白酶敏感性接頭 AMGRSGGGCAGNRVGSSLSCGGLNLQAM。其它接頭分子的描述參見，例如Huston 等.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85 5879-5883,1988 ；Whitlow, M^., Protein Engin. 6 989-995,1993 ；Newton 等.， Biochemistry 35 545-553,1996 ；A.J. Cumber 等.，Bioconj. Chem. 3 397-401,1992； Ladurner 等.，J. Mol. Biol. 273 :330_337，1997 ；和美國專利號 4，894，443，所有出版物通過 引用納入本文。其它接頭包括但不限于酶底物，例如組織蛋白酶B底物、組織蛋白酶D底物、胰蛋 白酶底物、凝血酶底物、枯草桿菌蛋白酶底物、因子Xa底物、和腸激酶底物；能提高溶解性、 可屈曲性和/或胞內可切割性的接頭包括例如(glymSer)n和(sermgly) η等接頭，(參見， 例如通過引用納入本文的PCT公布號WO 96/06641，其提供了偶聯物所用的示例性接頭)。 在一些實施方式中，可包含幾種接頭以利用各接頭的所需特性。制備偶聯物可用化學偶聯、重組DNA技術或重組表達與化學偶聯相結合，來制備含連接靶向 物質的偶聯物。可以任何取向連接本發明肽與細胞毒制劑或靶向制劑，偶聯物中可存在一 種以上的靶向制劑和/或要靶向(輸送)的物質。在本發明的一些優選實施方式中，通過親水性和生物相容性間隔臂聚合物，包括 烷基短鏈、聚唾液酸或透明質酸、多肽或PEG將細胞毒制劑連接于所述肽。在本發明的一些 優選實施方式中，細胞毒制劑通過可切割接頭，例如二硫鍵或含有可被溶酶體蛋白酶(如 組織蛋白酶)切割序列的肽偶聯。在本發明的一些優選實施方式中，這種間隔臂連接于所 述肽的N-或C-末端。MM制備這些制劑或組合物的方法包括使本發明化合物與運載體和任選的一種或多 種輔助成分相結合的步驟。一般通過使本發明的化合物均勻緊密地結合液體運載體，或精 細分級的固體運載體，或二者，然后如果需要的話使產物成形來制備這種制劑。可按照本領域已知的制備藥物的任何方法制備藥物制劑。此類制劑可含有甜味 劑、調味劑、著色劑和防腐劑。可將制劑與適合制造的藥學上可接受的無毒賦形劑混合。此 類“賦形劑”通常指無毒性不會以有害方式與該組合物中其它組分相互作用的基本上惰性 的物質。藥學上可接受的賦形劑包括但不限于液體，例如水、緩沖鹽水、聚乙二醇、透明質 酸、甘油和乙醇。其中包括藥學上可接受的鹽，例如無機酸鹽，如三氟乙酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等；和有機酸鹽，例如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等。以適合遞送的藥物或藥物組合物形式給予所述治療劑。制劑可包含一種或多種稀 釋齊 、乳化齊 、防腐齊 、緩沖齊 、賦形劑等，可提供例如凍干粉末、噴霧齊 、乳膏、洗液、凝膠、 貼劑、植入物等劑型。可用本領域熟知的藥學上可接受的運載體將口服給予的藥物制劑配 制成相應的合適劑型。此類運載體能將藥物配制成適合患者吞服的單位劑型，例如片劑、丸 劑、粉末、錠劑(dragee)、膠囊、液體、糖錠(lozenge)、凝膠、糖漿、糊劑、混懸液等。加入合 適的添加化合物后(如果需要的話)，可將口服應用的藥物制品配制成固體賦形劑，任選研 磨所得的混合物和加工顆粒混合物，從而獲得片劑或錠劑的芯。合適的固體賦形劑有碳水 化合物或蛋白質填充劑，包括，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨醇；玉米、小麥、大 米、馬鈴薯或其它植物的淀粉；纖維素，例如甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素或羧甲基纖維 素鈉；和樹膠，包括阿拉伯膠和黃蓍膠；和蛋白質，例如明膠和膠原。可加入崩解劑或增溶 劑，例如交聯聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、海藻酸或其鹽，例如海藻酸鈉。水性懸浮液可含有活性藥物(例如，本發明的嵌合多肽或肽模擬物)和與之混 合的適合制備水性懸浮液的賦形劑。此類賦形劑包括懸浮劑，例如羧甲基纖維素鈉、甲基 纖維素、羥丙基甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍膠和阿拉伯膠，和分散劑或 潤濕劑，例如天然磷脂(如卵磷脂)、環氧乙烷與脂肪酸的縮合產物(例如，聚氧乙烯硬 脂酸酯)、環氧乙烷與長鏈脂肪醇(例如，十七烷乙烯氧基十六醇Ofeptadecaethylene oxycetanol))的縮合產物、環氧乙烷與脂肪酸和己糖醇衍生偏酯的縮合產物(例如，聚氧 乙烯失水山梨糖醇單油酸酯)、或環氧乙烷與脂肪酸和己糖醇衍生偏酯的縮合產物(例如， 聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯)。水性懸浮液還可包含一種或多種防腐劑，例如對羥基苯 甲酸乙酯或正丙酯；一種或多種著色劑；一種或多種調味劑和一種或多種甜味劑，例如蔗 糖、阿斯巴甜或糖精。可調節制劑的克分子滲透壓濃度。可采用基于油的藥物給予本發明的疏水性活性制劑。可通過將活性制劑(例 如，本發明的嵌合組合物)懸浮在植物油，例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰油，或礦物油， 例如液體石蠟；或這些油的混合物中，配制基于油的懸浮液。參見，例如通過引用納入本 文的美國專利號5，716，928描述了采用精油或精油組分提高口服給予的疏水性藥學化合 物的生物利用度和降低個體間和個體內差異(也參見通過引用納入本文的美國專利號 5，858，401)。這種油性懸浮液可含有增稠劑，例如蜂蠟、硬石蠟或鯨蠟醇。可加入甜味劑以 提供可口的口服制品，例如甘油、山梨醇或蔗糖。可加入抗氧化劑，例如抗壞血酸使這些制 劑防腐。可注射油性載體的例子參見通過引用納入本文的Minto (1997) J. Pharmacol. Exp. Ther. 281 :93_102。本發明的藥物制劑也可以是水包油乳液形式。油相可以是上述植物油或 礦物油，或這些油的混合物。合適的乳化劑包括天然樹膠，例如阿拉伯膠和黃蓍膠，天然磷 脂，例如大豆卵磷脂，衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如失水山梨糖醇單油酸酯， 和這些偏酯與環氧乙烷的縮合產物，例如聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯。這種乳液也可 包含甜味劑和調味劑，例如配制糖漿和酏劑。此類制劑還可含濕潤劑、防腐劑或著色劑。也考慮包含治療劑的組合物或藥物可以含有藥學上可接受的運載體，將其用作 肽、蛋白質、多核苷酸等物質的穩定劑。可起作肽的穩定劑作用的合適運載體的例子包括 但不限于藥物級的葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、葡聚糖等。其 它合適的運載體包括但不限于淀粉、纖維素、磷酸鈉或鈣、檸檬酸、酒石酸、甘氨酸、高分子量聚乙二醇(PEG)和它們的組合。還可采用荷電脂質和/或洗滌劑。合適的荷電脂質包 括但不限于磷脂酰膽堿(卵磷脂)等。洗滌劑通常是非離子型、陰離子型、陽離子型或 兩性型表面活性劑。合適的表面活性劑的例子包括，例如Tergitol⑧和Triton 表面活 性劑(康涅狄格州丹伯里的聯合碳化物化學和塑料公司(Union Carbide Chemicals and Plastics, Danbury, CT))；聚氧乙烯山梨聚糖，例如TWEEN 表面活性劑(特拉華州威爾明 頓的 ACI 公司(Atlas Chemical Industries, Wilmington, DE))；聚氧乙烯醚，例如 Bri j ； 藥學上可接受的脂肪酸酯，例如硫酸月桂酯及其鹽(SDS)等材料。藥學上可接受的賦形 劑、運載體、穩定劑和其它輔助物質的詳細討論可參見通過引用納入本文的Remington’ s Pharmaceutical Sciences (雷明頓藥物科學)(Mack Pub. Co.(馬克出版公司)，新澤西州， 1991)。適合胃腸外給予的本發明藥物組合物組合包含一種或多種本發明化合物與一種 或多種藥學上可接受的無菌等滲水性或非水性溶液、分散液、懸浮液或乳液，或可在使用前 重建成無菌可注射液或分散液的無菌粉末，它們可含有糖、醇、抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑、 賦予該制劑與接受者血液等滲的溶質、或懸浮劑或增稠劑。可用于本發明藥物組合物中的合適水性和非水性運載體的例子包括水、乙醇、多 元醇(例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和它們的合適混合液；植物油，例如橄欖油；和可 注射的有機酯，例如油酸乙酯。例如，以分散液為例，可采用包衣物質，例如卵磷脂來維持所 需粒徑和采用表面活性劑來維持合適的流動性。這些組合物也可含有輔佐劑，例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。可通過包含 各種抗細菌和抗真菌制劑，例如對羥基苯甲酸酯(paraben)、氯代丁醇、苯酚、抗壞血酸等， 來確保防止微生物對本發明化合物的作用。該組合物中還需要包含等滲劑，例如糖、氯化 鈉、磷酸緩沖鹽水等。此外，可通過包含能延遲吸收的制劑，例如單硬脂酸鋁和明膠來延緩 注射藥物的吸收。在一些情況中，為延長藥物的作用，需要減緩皮下或肌肉內注射藥物的吸收。可采 用水溶性差的晶體或無定形材料的液體懸浮液實現此目的。藥物的吸收速度取決于其溶解 速度，進而取決于晶體大小和晶形。或者，可將藥物溶解或懸浮于油性載體中實現胃腸外給 予藥物的延遲吸收。在本發明方法中，也可將所述藥物化合物作為微球遞送以減緩體內釋放。例如， 可通過皮內注射給予微球使藥物緩慢地皮下釋放；參見Rao (1995) J. Biomater Sci. Polym. Ed. 7 623-645 ；生物可降解和可注射的凝膠制劑，參見，例如Gao (1995)Pharm. Res. 12 857-863 (1995)；或口服給予的微球，參見，例如 Eyles (1997) J. Pharm. Pharmacol. 49 669-674。引述的所有參考文獻通過引用全文納入本文。通過在生物可降解聚合物，例如聚丙交酯-聚乙交酯中形成微囊基質來制備本發 明化合物的可注射貯存劑型。可根據藥物與聚合物的比例和所用具體聚合物的性質來控制 藥物釋放的速度。其它生物可降解的聚合物的例子包括聚(原酸酯)和聚(酐)。也可將 藥物包裹在與機體組織相容的脂質體或微乳劑中來制備可注射的貯存制劑。可給予所述多肽本身或與另一種治療性化合物聯合給予。具體地說，可與治療哺 乳動物黑色素瘤、炎癥或自身免疫疾病的治療性化合物一起給予所述多肽。可將所述多肽 和其它治療性化合物配制在同一或不同組合物中。可與其它治療性化合物同時、依次或分別給予所述多肽。鍾可改變本發明藥物組合物中活性成分的實際劑量水平，以獲得具體患者、組合物 和給藥方式所需的治療反應而對患者無毒的有效活性成分用量。當將本發明化合物作為藥 物給予人和動物時，可將它們本身給予或作為藥物組合物給予，所述藥物組合物含有，例如 與藥學上可接受的運載體相組合的0. 1-99%、更優選10-30%活性成分。選擇的劑量水平取決于各種因素，包括所用的本發明特定化合物的活性，給藥途 徑、給藥時間、所用特定化合物的分泌和代謝速度、吸收速度和程度、治療持續時間、與所用 特定化合物聯用的其它藥物、化合物和/或材料、所治療患者的年齡、性別、體重、全身健康 狀況、和既往醫療史等醫學領域熟知的因素。具備本領域普通技術的醫師或獸醫不難確定所需藥物組合物的有效量和開出處 方。例如，醫師或獸醫在藥物組合物中采用本發明化合物的開始劑量可低于實現所需治療 效果的水平，再逐漸增加劑量直至實現所需效果。本發明化合物的合適日劑量通常是產生治療效果最低有效劑量的化合物用量。此 類有效劑量通常取決于上述各種因素。用于所示作用時，用于患者本發明化合物的口服、靜 脈內、腦室內和皮下劑量的非限制性范圍通常為約lmg-5mg/公斤體重/小時。在其它實施 方式中，該劑量的非限制性范圍為約5mg-2. 5mg/公斤體重/小時。在進一步的實施方式中， 該劑量的非限制性范圍為約5mg-lmg/公斤體重/小時。如果需要，可將所述活性化合物的有效日劑量分成2、3、4、5、6或更多份亞劑量， 任選以單位劑型在全天經過合適的時間間隔給予。在一個實施方式中，所述化合物以每日 一次劑量給予。在進一步的實施方式中，連續給予所述化合物，例如通過靜脈內或其它途 徑。在其它實施方式中，給予所述化合物的頻率低于每日一次，例如每周一次或更少。雖然可以單獨給予本發明化合物，但優選將該化合物作為藥物制劑(組合物)給 予。接受這種治療的對象是有需要的任何動物，包括靈長類，特別是人，和其它哺乳動 物，例如家兔、馬、牛，如奶牛、豬、山羊和綿羊；和通常的禽類及寵物。可將本發明化合物給予或與藥學上可接受的運載體混合給予，也可與抗微生物制 劑，例如青霉素、頭孢菌素類、氨基糖苷類和糖肽類一起給予。因此，聯合治療包括依次、同 時和分別給予所述活性化合物，使后續給藥時前次給予的化合物的療效尚未完全消失。給予所述化合物的可能途徑可通過任何合適的給藥途徑將這些化合物給予人和其它動物進行治療。本文所用 的術語給藥“途徑”包括但不限于皮下注射、靜脈內注射、眼內注射、真皮內注射、肌肉內注 射、腹膜內注射、氣管內給藥、脂肪內給藥(intraadiposal administration)、關節內給藥、 鞘內給藥、硬膜外給藥、吸入、鼻內給藥、口服給藥、舌下給藥、口腔含化給藥、直腸給藥、陰 道給藥、腦池內給藥、透皮給藥和局部給藥、或經局部遞送給藥(例如通過導管或支架)。也 可給予緩釋劑型或共同給予所述化合物。在本發明方法中，還可通過鼻內、眼內、眼周和陰道內途徑給予所述藥學化合 物，包括栓劑、吹入劑、粉末和氣溶膠制劑(例如類固醇吸入劑，參見通過引用納入本文 的 Rohatagi (1995)J. Clin. Pharmacol. 35 :1187-1193 ；Tjwa(1995)Ann. Allergy Asthma
20Immunol. 75 :107-111)。可通過混合藥物與合適的無刺激賦形劑來制備栓劑，所述賦形劑在 平常溫度下是固體，但在體溫下是液體，因此會在體內融化而釋放藥物。此類材料是可可脂
和聚乙二醇。在本發明的方法中，可配制成涂布棒、溶液、懸浮液、乳液、凝膠、乳膏、軟膏、糊劑、 凝膠劑、粉末和氣溶膠，通過局部途徑經皮遞送所述藥學化合物。在本發明的方法中，可胃腸外給予所述藥學化合物，例如靜脈內(IV)給藥或體腔 (例如，滑液空間)或器官內腔中給藥。這些制劑可包含溶解于藥學上可接受的運載體中的 活性藥物溶液。可采用的可接受載體和溶劑是水和林格液，一種等滲氯化鈉(溶液)。此 外，可采用無菌的不揮發油作為溶劑或懸浮介質。為此目的，可采用任何溫和的不揮發油， 包括合成單甘油酯或甘油二酯。本文所述的本發明方法可單獨使用或與其它方法聯用以治療自身免疫疾病或本 文所述的其它疾病。聯合方案所采用的具體聯合治療(療法或過程)要考慮所需療法和/或過程是否 與要實現的所需治療效果相容。還應知道，所用療法對同一疾病能否實現所需效果(例如， 本發明化合物可與用于治療同一疾病的另一種藥物同時給予)，或者它們可實現不同效果 (例如，控制任何不良作用)。通常給予以治療或預防特定疾病或病癥的本文所用的其它治 療劑稱為“適合于所治療疾病或病癥的”治療劑。可同時、依次或分別給予所述治療劑的各個組分來實現本文定義的本發明聯合治療。治療應用為預防或治療目的可給予本文所述的多核苷酸或調節性化合物(下文稱為“治療 劑”)。當預防性提供時，在出現任何癥狀前提供所述治療劑。所述治療劑的預防性給藥的 作用是防止或減輕任何癥狀。當治療性提供時，在發生疾病或病癥癥狀時(或其后不久) 提供治療劑。治療性給予所述治療劑的作用是減輕實際癥狀的任何惡化。所治療的個體可以是任何哺乳動物。一方面，所述哺乳動物是人。另一方面，此人 患有自身免疫疾病或病癥。在其它方面，所述自身免疫疾病或病癥與以下疾病相關或選自 以下疾病多發性硬化癥、I型糖尿病、再生障礙性貧血、格雷夫斯病、腹部疾病、克羅恩病、 紅斑狼瘡、關節炎、骨關節炎、自身免疫葡萄膜炎和重癥肌無力。在其它方面，此人患有炎性疾病或病癥。在另一方面，所述炎性疾病或病癥與以下 疾病相關或選自以下疾病炎性腸病、類風濕性關節炎、過敏、動脈粥樣硬化、銀屑病、胃炎 和缺血性心臟病。在另一方面，所述炎癥與腦死亡相關，優選腦組織中內源性循環α-MSH 或Ci-MSH的水平降低。在還有另一方面，用所述治療劑治療患有α-MSH或MCl-受體介導 病癥或疾病的對象。在另一方面，本發明涉及治療患有黑色素瘤的對象。在一方面，本發明減輕或緩解 對象中的黑色素瘤。在還有另一方面，在黑色素瘤檢測或成像試驗中采用本發明化合物。裝有所述化合物的藥盒本發明還提供實施本發明治療方案的藥盒。此類藥盒單獨或聯合裝有治療有效量 的藥學上可接受形式的肽和藥學上可接受形式的其它藥物，該肽具有MClR調節劑的特定 活性。優選的藥物劑型包括肽與無菌鹽水、葡萄糖溶液、緩沖液或其它藥學上可接受的無菌液體的組合。或者，可凍干或干燥所述組合物。在此例中，藥盒也可裝有藥學上可接受的溶 液(優選無菌)以形成注射溶液。在另一實施方式中，藥盒還可裝有針頭或注射器，優選包 裝成無菌形式以供注射所述組合物。在其它實施方式中，所述藥盒還裝有將該組合物給予 對象的用法說明材料。說明材料可以是書寫的插頁、音頻記錄、視頻記錄或指導給予對象該 組合物的任何其它手段。在一個實施方式中，所述藥盒裝有(i)含有肽的第一容器，所述肽 具有MClR-特異性調節活性；和(ii)用法說明材料。治療方法的其它實施方式在一些實施方式中，本發明向有需要的對象提供能減輕或抑制其移植物排異的方 法，包括給予所述對象包含藥學上可接受的賦形劑和有效量的至少一種本文提供的肽化合 物的藥物組合物。在一些實施方式中，本發明提供減輕或抑制移植的組織、細胞或器官引發 對象產生免疫應答的方法。移植組織的非限制性例子是實驗性心臟移植中的同種異體移植 物和胰島細胞。&棚牛自躺繩#騎(EAE)痛刪牛產生了 α-MSH的新型D-氨基酸肽類似物并在實驗性自身免疫葡萄膜炎(EAU)和 實驗性自身免疫腦脊髓炎(EAE)模型以及脂多糖(LPQ替代性炎癥疾病模型中評估其免疫 調節作用。在EAU模型和MOG誘導的EAE小鼠模型中，用RI α-MSH類似物治療降低了臨 床疾病評分和疾病發生率。此外，治療小鼠中，MOG免疫小鼠的脾臟和淋巴結中TNF-α和 IL-IOmRNA表達水平降低。在LPS誘導的全身炎癥模型中，α-MSH和類似物治療降低了血 清細胞因子水平。這些數據表明這些新型α-MSH類似物具有用于治療炎癥和自身免疫疾 病的潛能。材料和方法肽.α -MSH(SYSMEHFRffGKPV)購自賓夕法尼亞州金戈夫普魯西亞的巴卡姆公司 (Bachem, King of Prussia, PA) 。 D- U^W. RI α -MSH MU^ (vpkgwrfhemsys)、RI α -MSH 的丙氨酸取代肽、(硬脂酰基)HfRW(820)、(Ph(CH2)3CO)HfRff (819)和RI α-MSH類似物 891 [vpkGwr(D-Cha)hsiiss]由健贊公司(Genzyme Corporation)用標準固相方法合成，通 過反相HPLC純化。混雜的D氨基酸對照肽(ksrsmgvfpeyh)由健贊公司合成。無關的D氨 基酸對照肽(plyWdiWdles)由健贊公司合成。動物.5-6周齡雌性BIO. RIII_H2r小鼠購自緬因州巴港的杰克遜實驗室(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)。6-8周齡雌性或雄性C57BL/6小鼠購自緬因州巴港的杰克遜實驗室。動物研究的 所有方案得到健贊股份有限公司的公共動物照料和使用委員會(Institutional Animal Care and use Committee) (IACUC)批準。EAU誘導.在兩個部位(肩胛骨之間和骨盆區)給雌性B10. RIII分別皮下注射 總共200μ g馬薩諸塞州費奇伯格新英格蘭肽公司(New England Peptide ；Fitchburg, ΜΑ)的光感受器間結合蛋白肽(interphotoreceptor binding protein peptide) (IRBP) 161-180，該肽用含結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis) H37Ra (密歇根州 底特律迪菲科公司(Difco，Detroit, MI))的ang/ml完全弗氏佐劑(CFA ；密蘇里州圣路易 斯西格瑪公司(Sigma, St. Louis, MO))配制。眼評分.用1或2滴托吡卡胺(波多黎各胡瑪考的阿爾康公司(Alcon ；Humacao,Puerto Rico))和暗室中靜置約5分鐘擴張小鼠眼睛的(瞳孔)。用手捉住小鼠， 用帶78號屈光鏡的間接眼底鏡觀察雙眼視網膜。采用0-5之間的漸進評分系統給眼睛的 炎癥評分。評分O 正常視網膜。評分1 鄰近視神經有血管炎癥。評分2 :< 5個炎性病損 局限于眼睛的一個象限。評分3:在眼睛的一個以上象限中有>5個炎性病損。評分4:炎 性病損匯合。評分5:視網膜剝脫。收集小鼠的完整眼睛置于PBS中。將眼睛包埋在OCT介 質中冷凍固定。通過乳頭-視神經平面切割成5-μπι的切片，用蘇木精和曙紅染色。與黑皮質素受體的結合研究.檢測了 α -MSH、RI α -MSH和混雜肽與黑皮質素受 體:1、3、4和5的結合概況。采用競爭性結合試驗與(Nle4, D-Phe7) α -MSH(巴卡姆公司) 進行結合研究。由法國巴黎的克萊普實驗室(Cer印laboratories)用編碼樣品進行結合分 析。所述肽結合后，還用HEK293細胞系膜制品進行與125I-NDP-MSH競爭結合黑皮質 素受體1、3、4和5的研究。25°C，將與125I-(Nle4, D-Phe7) - α-MSH混合的諸肽在V-底96 孔板的結合緩沖液(25mM HEPES pH7,1. 5mM CaCl2, ImM MgSO4, IOOmM NaCl,0. 2% BSA)中 與含I-IOfmol受體的HEK293轉染細胞系(馬薩諸塞州波士頓的帕金埃爾默公司(Perkin Elmer,Boston MA))的膜制品混合 1 小時。用 3μΜ 的(Nle4,D-Phe7)-NDP-MSH(巴卡姆公 司)作為陽性對照。使混合液通過96-孔GFC過濾器(馬薩諸塞州比爾里卡米利波爾公司 (Millipore, Billerica, MA))過濾，用不含BSA的結合緩沖液洗滌3次，干燥并計數。cAMP檢測.將弗吉尼亞州馬納薩斯美國模式培養物保藏所(American Type Culture Collection,Manassas, VA)的B 16-F1 (黑色素瘤細胞系)細胞以切104/孔接種平 底96孔板，用補加了 2mM谷氨酰胺、抗生素(100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素)和10%熱 滅活胎牛血清(紐約州格蘭德島市英杰公司(Invitrogen，Grand Island, NY))的DMEM(馬 里蘭州沃克斯維爾市坎布萊克斯公司(Cambrex，WalkerSVille，MD))培養過夜。然后用天 然 a-MSH(0. 01-1000ng/ml)、逆-倒位 a -MSH(0. 01-1000ng/ml)或混雜 D 氨基酸對照肽 (0. 01-1000ng/ml)處理細胞30分鐘。裂解細胞，用新澤西州皮斯卡塔韋AB公司(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)的酶免疫測定試劑盒檢測胞內cAMP水平。用密蘇里州圣路 易斯西格瑪公司的100 μ M毛喉素作為陽性對照。EAE誘導和評分.用含0. 6mg結核分枝桿菌(密歇根州底特律迪菲科公司)的完 全弗氏佐劑(CFA ；密蘇里州圣路易斯西格瑪公司)乳化的M0G35-55肽Q00微克/小鼠； 馬薩諸塞州費奇伯格新英格蘭肽公司)免疫雌性C57BL/6小鼠。每只小鼠皮下二點注射遞 送0. 2ml體積的乳液。腹膜內給藥途徑采用400納克/動物劑量的PBS配制的百日咳博德 特菌(Bordetella pertussis)毒素(PTX ；西格瑪公司)，在第0天和第3天給予。每日監 測小鼠的EAE麻痹癥狀。采用0-5之間的漸進評分系統給小鼠的臨床癥狀評分。評分0 無疾病；評分1 尾巴松弛；評分2 后肢虛弱；評分3 后肢癱瘓；評分4 前肢虛弱/部分癱 瘓；評分5 死亡。收集脊髓和腦包埋在石蠟中以供蘇木精和曙紅染色。增殖試驗.在96孔板中以切105個細胞/孔培養C57BL/6小鼠脾細胞和淋巴結 細胞。取M0G35-55或OVA 257-264肽以25 μ g/ml的濃度加入各孔。收集MOG肽刺激后48 小時的上清液。培養3天后，用IyCi/孔的[3H]胸苷脈沖細胞8小時。通過cpm檢測胸 苷摻入。細胞因子RNA分析-RT-QPCR.用加利福尼亞州卡爾斯巴德英杰公司(Invitrogen，Carlsbad, CA)的TRIzo 1提取組織的總RNA。采用STOR綠(熒光)摻入和加利福尼亞州福 斯特城應用生物系統公司(Applied Biosystems,Foster City, CA)的試劑，在ABI 7900儀 上逆轉錄IygS RNA，用定量PCR檢測。對于靶細胞因子檢測，在每次PCR中運作cDNA標準 品并按小鼠β -肌動蛋白標準化所得信使(RNA)的濃度。用于獲得這些數據的引物如下小 TNF α JE[b] -ggcaggtctactttggagtcattgc-acattcgaggctccagtgaattcgg(1)。1
們采用的小鼠 IL-IO 正向tgctatgctgcctgctctta 和反向tcatttccgataaggcttgg(2)。小 鼠 β -肌動蛋白的序列是正向 gtgggccgctctaggcaccaa禾Π反向 ctctttgatgtcacgcacgattt c (3)。CBA分析.利用加利福尼亞州圣何塞BD生物科學公司(BDBiosciences，San Jose, CA)制造的細胞計數珠試驗試劑盒(CBA)對小鼠血清或細胞上清液作炎性細胞因子概況的 流式細胞術分析。按照生產商的方案加工樣品。mMClR RNA分析-RT-QPCR.用加利福尼亞州卡爾斯巴德英杰公司的TRIzol提取 組織的總RNA。用Taqman試劑盒和加利福尼亞州福斯特城應用生物系統公司的試劑，在 ABI 7900儀上逆轉錄Iyg總RNA，用定量PCR檢測。對于mMClR檢測，在每次PCR中運作 cDNA標準品，按真核18S內源性對照(VIC/MGB探針，應用生物系統公司部分#4319413E)標 準化所得信使(RNA)的濃度。mMClR的引物如下正向CTCTGCCTCGTCACTTTCTTTCTA和反向 AACATGTGGGCATACAGAATCG及探針CCATGCTGGCACTCA。這些引物的設計采用了加利福尼亞州 福斯特城應用生物系統公司的引物表達3. 0軟件。LPS模型.用LPS(1微克/小鼠)腹膜內注射攻擊雄性C57BL/6小鼠。30分鐘后， 用地塞米松(ang/kg ；西格瑪公司)、RI- α -MSH類似物891或RI- α -MSH治療小鼠。LPS攻 擊后2小時，給小鼠放血獲取血清。用細胞計數珠試驗試劑盒(BD生物科學公司)作流式 細胞術分析細胞因子。統計學分析.結果表示為平均值士SD。各實驗重復至少兩次。為分析結果，采用 單向ANOVA和Tukey多重比較檢驗。提供以下實施例是為了說明而非限制本發明。實施例1^mn ^^^mmm^ (EAU) 型中的免疫抑擊時舌個牛自身免疫葡萄膜炎是一種可導致疼痛和視力喪失的眼睛炎性疾病。類固醇和免疫 抑制藥物是目前葡萄膜炎的唯一治療劑，常具有嚴重的眼睛和全身毒性。因此，需要安全的 替代治療劑。EAU是一種影響美國兩百三十萬人葡萄膜炎的動物模型。用光感受器間類視黃 醇結合蛋白(IRBP)或其肽片段或視網膜S-抗原(S-Ag)加佐劑免疫接種可誘導易感嚙 齒類動物品系產生該疾病。該疾病涉及眼睛視網膜中炎性細胞浸潤和光感受器損壞，可 自然恢復且無自發性復發。在同系嚙齒動物受者中可過繼性轉移致葡萄膜炎性T細胞 (uveitogenic T cell)，提示葡萄膜炎是器官特異性T細胞介導的自身免疫疾病，如同許多 其它類似的自身免疫疾病，例如多發性硬化癥、1型糖尿病和類風濕性關節炎。眼睛的微環境是免疫赦免部位，其中維持免疫抑制的機制適當地阻止了局部發生 炎癥。眼組織中神經元表達的幾種神經肽有助于維持眼睛的免疫赦免。這些神經肽之一是 α -MSH，它在眼睛微環境中以30pg/ml的生理濃度持續表達。
在大鼠內毒素-誘導的葡萄膜炎期間全身性給予天然α -MSH，以劑量依賴性方式 抑制了眼房水中的浸潤細胞數和IL-6、TNF-a、MCP_1、MIP_2及一氧化氮水平。在小鼠EAU 模型中，當視網膜炎癥達到高峰時給予a-MSH抑制了該病的嚴重程度。a-MSH可通過T細 胞上的黑皮質素5受體(MCR-5)誘導T調節細胞而抑制EAU。評估了天然a -MSH在小鼠后色素層葡萄膜炎模型中的治療效果。給BIO. RIII小 鼠注射IRBP 161-180和CFA誘導葡萄膜炎。免疫后約10天疾病發作。第13天眼評分達到 2-3，連續7天靜脈內注射給予小鼠QOO微克/小鼠)天然a-MSH，或不治療。由于預防性 治療系靶向疾病引發階段而非效應階段的活動性炎癥，故當觀察到活動性視網膜炎癥時開 始治療。此外，該治療方案著重于臨床應用。與未治療的小鼠相比，用a-MSH治療的小鼠 在7天治療期間顯示臨床平均眼評分降低(圖la)。與未治療組小鼠第15天達到最高眼平 均評分3. 67士0. 52相比，α -MSH治療小鼠第13天顯示的最高眼平均評分為2. 83士0. 39。實施例2
_9] 在BIO. RIII牛自身免,瘡葡萄臘炎1草型Φ比較天然α-MSH與地,H米松葡萄膜炎目前的治療方式包括皮質激素和免疫抑制劑。將天然α-MSH的效果 與已知的皮質激素治療劑地塞米松相比。注射11 161-180和0 4誘導810.1 111小鼠 發生葡萄膜炎。疾病發作即小鼠的眼臨床評分達到1時，每日腹膜內注射給予小鼠天然 α -MSH(100微克/小鼠)、0· 2mg/kg地塞米松或2. Omg/kg地塞米松。每日治療小鼠21天。 與PBS對照小鼠相比，在治療期間用天然α -MSH治療的小鼠顯示臨床平均眼評分顯著降低 (圖1Β)。數據顯示每日腹膜內注射給予天然α -MSH抑制葡萄膜炎的程度高于0. 2mg/kg 或2. Omg/kg劑量的地塞米松治療。實施例3新型逆-倒位α -MSH類似物可特異性結合MCR-I合成了天然α -MSH的新型、穩定的D-氨基酸肽類似物(RI α -MSH)并在體外和實 驗性自身免疫葡萄膜炎(EAU)模型中評估了其免疫調節性能。結合研究表明與天然a-MSH 不同，RI a -MSH能特異性結合抗-炎性a -MSH受體(MCR-I)，但不結合其它a -MSH受體 (MCR-3、4 或 5)。分析了 RI a-MSH類似物與黑皮質素受體(MCR)的結合。采用包括MCR 1、3、4和 5在內的一組MCR進行競爭性結合試驗。如前所述，所述肽的結合與125I-NDP-MSH競爭。天 然a-MSH能結合MCR 1、3、4和5。然而，與天然a-MSH不同，發現RI a-MSH只結合調節炎 性應答的MCR-I (表1)。混雜D氨基酸對照肽不結合任何黑皮質素受體。開發的能特異性 結合MCR-I而不結合MCR-3和MCR-4的a -MSH類似物，可降低天然a -MSH通過結合這些 受體可能產生的副作用。表 權利要求
1.一種基本純的化合物或其藥學上可接受的鹽，所述化合物能選擇性結合黑皮質素1 受體(MClR)，所述化合物包含的核心四肽具有以下序列His Xaa1 Arg Trp (SEQ ID NO 1) 或 D-Trp D-Arg Xaa2 D-His(SEQ ID NO 2)； 其中) 是 D-Cha、D-Phe 或 Cha，禾口 Xaa2 ^ D-Cha> D-Phe Phe0
2.如權利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物包含的C-末端多肽具有以下 序列D-kr D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser (SEQ ID NO :3)。
3.—種基本純的化合物或其藥學上可接受的鹽，所述化合物選擇性結合黑皮質素1受 體(MClR)，所述化合物包含具有以下序列的多肽XBB^ XΒ3-2 X&&3 Xao^ XBB^ X&3-5 XBB^ XBBg XBBg XBB^q XBB^ XBB^ X3-3-^3'其中 Xagi1 是 D-Val、D-Ala 或 D-Lys ；Xaa2 是 D-Pro、D-Ala 或 D-Lys ；Xaa3 是 D-Lys> D-Orn> D_Nle、D-Ala 或 D-Lys ；Xaa4 是 Gly 或 D-Ala ；Xaa5 是 D-Trp, Trp, D-3-苯并噻吩基-Ala、D_5_ 羥基-Trp, D_5_ 甲氧基-Trp, D-Phe 或 D-Ala ；Xaa6 是 D-Arg> D-His 或 D-Ala ；Xaa7 是 D-Cha、D-Phe, Phe、D_4_ 氟-Phg、D-3-吡啶基-Ala、D-Thi、D-Trp、D_4_ 硝 基-Phe 或 D-Ala ；Xaa8 是 D-His、His、D-Arg> Phe 或 D-Ala ；Xaa9 是 D-Glu、D-Asp, D-瓜氨酸、D-Ser 或 D-Ala ；Xaa10 是 D-Met、D- 丁硫氨酸、D-Ile 或 D-Ala ；Xaa11 是 D-Ser、D-Ile 或 D-Ala ；Xaa12 是 D-Tyr > D-Ser 或 D-Ala ；Xaa13 是 D-Ser 或 D-Ala ；其中除非當Xaa1j均是D-Ala時，不多于一個的)(叫_13是D-Ala和不多于一個的)(叫_13 是L-氨基酸。
4.如權利要求3所述的化合物或其藥學上可接受的鹽，其特征在于，所述化合物包含 具有以下序列的多肽XBB^ XΒ3-2 X&&3 Xao^ XBB^ X&3-5 XBB^ XBBg XBBg XBB^q XBB^ XBB^ X3-3-^3' 其中 Xagi1 是 D-Val ； Xaa2 ^ D-Pro ；Xaa3 是 D-Lys、D-Orn 或 D-Nle ； Xaa4 ^ Gly ；Xaa5 是 D-Trp、Trp、D-3-苯并噻吩基-Ala、D_5-羥基-Trp、D_5_ 甲氧基-Trp 或 D-Phe ； Xaa6 是 D-Arg 或 D-His ；Xaa7 是 D-Cha、D-Phe, Phe、D_4_ 氟-Phg、D-3-吡啶基-Ala, D-Thi、D-Trp 或 D_4_ 硝 基-Phe ；Xaa8 是 D-His、His、D-Arg> Phe 或 D-Ala ； Xaa9 是 D-Glu、D-Asp、D-瓜氨酸或 Dler ； Xaa10 是 D-Met、D- 丁硫氨酸或 D-Ile ； Xaa11 是 D-Ser 或 D-Ile ； Xaa12 是 D-Tyr 或 Dler ；禾口 Xaa13 是 D-Ser ；其中不多于一個的^Caa1,是L-氨基酸。
5.如權利要求3所述的化合物或其藥學上可接受的鹽，其特征在于，所述化合物包含 具有以下序列的多肽XBB^ XΒ3-2 X&&3 Xao^ XBB^ X&3-5 XBB^ XBBg XBBg XBB^q XBB^ XBB^ X3-3-^3' 其中 Xagi1 是 D-Val ； Xaa2 ^ D-Pro ；Xaa3 是 D-Lys、D-Orn 或 D-Nle ； Xaa4 是 Gly ；Xaa5 是 D-Trp 或 Trp ； Xaa6 是 D-Arg ；Xaa7 是 D-Cha、D-Phe, Phe 或 D-Thi ；Xaa8 是 D-His 或 His ；Xaa9 是 D-Glu 或 D-Ser ；Xaa10 是 D-Met、D- 丁硫氨酸或 D-Ile ；Xaa11 是 D-Ser 或 D-Ile ；Xaa12 是 D-Tyr 或 Dler ；禾口Xaa13 是 D-Ser ；其中不多于一個的^Caa1,是L-氨基酸。
6.一種基本純的化合物或其藥學上可接受的鹽，所述化合物包含具有以下序列的多肽D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg Phe D-His D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser(SEQ ID NO 4)；D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg D-Cha D-His D-Ser D-Ile D-Ile D-Ser D-Ser(SEQ ID NO 5)；Ser Tyr Ser Met Glu His Cha Arg Trp Gly Lys Pro Val(SEQ ID NO :6)；或 D-Val D-Pro D-Lys Gly D-Trp D-Arg D-Phe D-His D-Glu D-Met D-Ser D-Tyr D-Ser(SEQ ID NO :7)。
7.如權利要求1、3、4、5或6所述的化合物，其特征在于，所述多肽經PEG化。
8.如權利要求6所述的化合物，其特征在于，所述化合物能選擇性結合MC1R。
9.如權利要求1、3、4、5或6所述的化合物，其特征在于，所述化合物顯示出至少一種以 下特性選擇性激活MClR的能力； 在體外血漿中的穩定性；或 對蛋白酶降解的耐受性。
10.一種藥物組合物，其包含權利要求1、3、4、5或6所述的化合物和藥學上可接受的賦 形劑。
11.如權利要求1、3、4、5或6所述的化合物，其特征在于，所述化合物偶聯于生物學活 性部分。
12.—種治療有需要的對象中自身免疫疾病或病癥的方法，包括給予所述對象包含藥 學上可接受的賦形劑和治療有效量的權利要求1、3、4、5或6所述化合物的藥物組合物。
13.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述自身免疫疾病或病癥選自多發性硬 化癥、I型糖尿病、再生障礙性貧血、格雷夫斯病、腹部疾病、克羅恩病、紅斑狼瘡、關節炎、骨 關節炎、自身免疫葡萄膜炎和重癥肌無力。
14.一種治療有需要的對象中炎癥的方法，包括給予所述對象包含藥學上可接受的賦 形劑和治療有效量的權利要求1、3、4、5或6所述化合物的藥物組合物。
15.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述炎癥與選自下組的疾病相關炎性腸 病、類風濕性關節炎、過敏、動脈粥樣硬化、銀屑病、胃炎和缺血性心臟病。
16.一種降低或抑制有需要對象中移植物排異的方法，包括給予所述對象包含藥學上 可接受的賦形劑和治療有效量的權利要求1、3、4、5或6所述化合物的藥物組合物。
17.一種治療有需要的對象中黑色素瘤的方法，包括給予所述對象包含藥學上可接受 的賦形劑和治療有效量的權利要求1、3、4、5或6所述化合物的藥物組合物。
18.一種治療有需要的對象中黑色素瘤的方法，包括給予所述對象包含藥學上可接受 的賦形劑和治療有效量的偶聯物的藥物組合物，所述偶聯物包含偶聯于抗腫瘤負載物的權 利要求1、3、4、5或6所述化合物。
19.如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述抗腫瘤負載物是放射性核素、輻射致 敏劑、光敏劑、化療劑或毒素。
20.一種試劑盒，其裝有權利要求10所述的藥物組合物和任選的使用說明書。
全文摘要
本文提供對黑皮質素1受體(MC1R)具有選擇性的天然α-促黑素細胞激素(α-MSH)的穩定的肽類似物。本文還提供這種α-MSH肽類似物的藥物制劑以及用這些類似物治療涉及MC1R的醫學和獸醫學疾病的方法。
文檔編號C07K14/68GK102143970SQ200980120892
公開日2011年8月3日 申請日期2009年3月20日 優先權日2008年5月27日
發明者A·E·埃德林, C·Q·潘, J·E·斯蒂法諾, J·L·德祖里斯, M·A·佩里科內, T·E·威登 申請人:健贊股份有限公司