專利名稱：新型禽星狀病毒的制作方法
新型禽星狀病毒本發明涉及獸醫病毒學和免疫學的領域。具體地，本發明涉及新型禽星狀病毒；抗 該新型病毒的抗體或其片段；該新型禽星狀病毒的抗原性制劑、蛋白質和DNA分子；該新型 病毒或者其抗原性制劑、蛋白質或DNA的疫苗；用于制造此類疫苗的方法以及診斷試劑盒。星狀病毒是小的圓形無包膜病毒，其具有有義單鏈RNA基因組。大多數星狀病 毒與引起一些類別的腸炎、產生腹瀉、嘔吐、吸收障礙(malabsorbtion)、全身不適和生長 遲緩(growth retardation)相關。感染在不太易于恢復活力的人或動物例如年幼、年老 或免疫減弱的個體中可以是致命的。參見Matsui和Greenberg(在Fieldsvirology， 第 3 版，1996，ed. :B. Fields 等人，ISBN :781702534，第洸章中)和Moser 和 Schultz-Cherry(2005, Viral Immunology,第 18 卷，p.4-10)。此外，星狀病毒誘導的病狀的嚴重性可因星狀病毒種類之間或株系本身之間的毒 性差異而變化。這已使得人們相信一些星狀病毒充當二級病原體(secondary pathogen), 它們本身只引起亞臨床疾病，而完全臨床癥狀只有當存在來自另一種病原體的另外的病因 時才得以體現。籍以獲得抗星狀病毒感染的免疫力的機制還不完全清楚；病毒中和抗體確實似乎 在防御和免疫記憶中起作用，但可能不是抗星狀病毒感染的免疫反應的唯一效應物。這由 M. KocU2005，Virallmmunology，第 18 卷，p. 11-16)進行了綜述。已在世界范圍內檢測到星狀病毒，并且從眾多種動物分離了星狀病毒。而在感染 某一靶動物的星狀病毒種類當中，已描述了幾個血清型。在分類學上將星狀病毒科分成兩 個主要的屬，即哺乳動物星狀病毒——哺乳動物星狀病毒屬(Mamastrovirus)和禽星狀病
毒(avianAstroviruse)-禽星狀病毒屬(Avastrovirus)。現在禽星狀病毒屬包括正式
承認的種類禽腎炎病毒(Avian nephritis virus) 1和2(ANV1，2)(來自雞)和火雞星狀 病毒(turkey Astrovirus) 1 禾口 2(TastVl,2)。已從鴨、雞、駝鳥和火雞分離了幾種另外的禽星狀病毒。例如，雞星狀 病毒 2 (CAstV2)己由 Baxendale 禾口 Mebatsion(2004，Avianpathology,第 33 卷， p. 364-370 ；和于國際專利公開案W02004/027053中)進行了描述，Todd等人描述了 CAstV3 (W02007/077464)，其與CAstV2關系密切。此類星狀病毒仍未被正式分類，如由Koci 和 Schulz-CherrH2002，Avian Pathology 第 31 卷，p. 213-227)所綜述的。星狀病毒在環境中非常穩定，例如，它們可抗常用的脂溶劑(lipid-solvent)和 去垢劑，具有寬廣的PH耐受性，并且具有相當的熱穩定性。這一性質符合它們的高傳染性 和容易的傳播(通過糞口途徑)，解釋了可在全世界這么多的人和動物中發現星狀病毒或 抗它們的抗體的原因。當需要更新以適合新的實驗數據時，此類小RNA病毒的分類和命名一直經歷頻繁 的改變。例如鴨星狀病毒(DAstV)以前被分類為細小核糖核酸病毒(Picorna virus)，并 且最初被稱為II型鴨肝炎病毒，因為其引起肝炎。類似地，ANVl以前被描述為細小核糖核 酸病毒，特別地腸病毒(enterovirus)，但被重新分類至星狀病毒(Imada等人，2000，J. of Virology，第74卷，p. 8487-8493)。ANVl也被稱為雞星狀病毒1 (CAstVl)，其引起腎炎。
一旦獲得關于它們的病毒基因組的序列和組織的新信息，則需要重新分類此類病 毒。特別地對于星狀病毒科，已顯示物理、電子顯微鏡和生物化學表征通常不足以將星狀病 毒科與其他所謂的“小圓病毒”或“腸病毒樣病毒”例如細小RNA病毒科(Picornaviridae)、 嵌杯病毒科(Caliciviridae)或肝炎病毒科(戊型肝炎樣病毒)或甚至與引起的疾病 癥狀與星狀病毒非常相似的包膜RNA病毒(enveloped RNAviruse)例如呼腸孤病毒 (Reoviruse)、輪狀病毒(Rotaviruse)或冠狀病毒相區別。這是因為這些表征的結果隨使 用的方法和條件變化而變化。因此這些表征的一致性不足以至不能正確確定。在另一個方面，與免疫學表征組合的分子生物學表征例如基因分型的全面性 和重現性足以將微生物分配至恰當的分類群(VanRegenmortel等人，2000，在Virus Taxonomy, 7th report of theICTV, Academic press, New York 中)。因此理想地,這樣的 確定基于核苷酸測序、聚合酶鏈式反應(PCR)測定和血清分型測定。星狀病毒科的RNA基因組大小大致為大約71Λ，該病毒科典型的基因組組織參見 Jiang 等人(1993，PNAS-USA，vol. 90，p. 10539-10543)和 Koci 等人(2000，J. of Virology, 第74卷，p.6173-6177)。根據目前的理解，基因組從5'至3'整合了 3個明確可辨認的開 放閱讀框架(ORF)ORF la:大小為大約31Λ，編碼具有絲氨酸蛋白酶基序的非結構蛋白。ORF Ib 大小為大約1. 5kb,與ORF Ia部分重疊，其編碼非結構的RNA依賴性RNA
聚合酶。ORF 2 通過大約21Λ的亞基因組RNA編碼結構性病毒蛋白。表達的多蛋白在病毒 裝配之前可能被切割成更小的部分，并且包含a. ο.衣殼或外殼蛋白。在這3個ORF中，當在可公開獲得的星狀病毒核苷酸序列之間進行比較時，ORF Ib 具有最保守的核苷酸序列，ORF 2是序列變異性最大的0RF。從1987年至目前，在荷蘭、德國和阿拉伯聯合酋長國的家禽養殖業中觀察到一些 特珠疾病問題雞和火雞遭受腹瀉、飼料轉化和生長的降低以及遭受關節和腿肌腱的腫脹 和疼痛的問題。在不同年齡的肉禽、種禽和產蛋型禽中和在不同的無明顯相互毗連的農場 中均發現了此類問題。在禽類中在它們的第一周齡直至數月齡中觀察到跛行。動物表現出腫脹的后踝 (踝)關節和小腿的肌腱移位(兩者過度充盈澄清的輕微粘稠的液體)和關節炎的癥狀。 在這些禽類中觀察到飼料轉化率和生長率的減少，最可能地是由運動問題造成的。在最壞 的情況下，這些禽類不再能夠運動，從而不能獲得飼料或飲水，從而導致死亡。這些腿部畸 形在更重的肉用型禽類中最突出，然而持續的經濟損失在所有類型的禽類中是相當大的。主要在更幼小的禽類中但也在產蛋齡的禽類中觀察到的腹瀉具有甚至更大的影 響。癥狀從消化不良變化至明顯的腸炎，并且導致飼料轉化的降低；生長抑制或甚至體重減 輕；產蛋量下降(“減蛋(egg-drop)”)；質量差的蛋的數目增加；和死亡。在一些農場中，在數年中觀察到這些問題，導致持續的較差產量數據而無明確的 病因。在死后檢查時，在幾個情況下發現除了腸或腿關節外的身體部分也受到影響，例 如由砂囊糜爛或肝腫脹所展示的。為了檢測這些癥狀的病因，對管理和飲食方面進行調查，但這些方面可與在這些情況下觀察到的問題不相關。此外還研究了可能是造成感染，特別地由呼腸孤病毒引起的 感染的原因的病原體，因為眾所周知該病毒引起吸收障礙和關節問題。然而，盡管使用許多 種測定，但在許多情況下未能檢測到呼腸孤病毒。還常規地或特別地檢查了已知引起相似問題的幾種其他病原體，例如細菌: 沙門氏菌(Salmonella)、支原體(Mycoplasma)、嗜血桿菌(Haemophilus)和巴斯德菌 (Pasteurella)；和病毒腺病毒、傳染性支氣管炎病毒Qnfectious Bronchitis virus, IBV)、新城疫病毒(NDV)、傳染性腔上囊病病毒(Infectious Bursal Diseasevirus，IBDV)、 減蛋綜合癥(Egg Drop Syndrome, EDS)和禽流感病毒(AIV)。直至今日，還沒有致病因子可與觀察到的腿和腸的問題(無論嚴重度)、動物福利 的問題以及所造成的這些家禽養殖業的不利經濟性能相關聯。因此需要鑒定與觀察到的疾病癥狀關聯的試劑以及提供疫苗和診斷劑，以提供對 該疾病的預防和致病因子的鑒定。令人驚訝地，已在患有腸和運動疾病的雞和火雞中發現一種新型病毒。該病毒可 從不同年齡、種類和來源的患病禽類分離到(從關節和肌腱以及從各種內臟器官分離)。所 分離的病毒反過來在感染健康測試動物后誘導相似的疾病癥狀，并且可從患病的測試動物 中再分離到，從而滿足了柯赫氏法則。可將該新型病毒用于開發檢測和抵抗該病毒和其在家禽中引起的疾病問題(特 別地關節和肌腱以及胃腸道的疾病)的診斷測定和疫苗。已用許多方法分析了新型病毒，令人驚訝地該病毒被鑒定為星狀病毒。由于其在 雞和火雞中流行，暫時將其定性為禽星狀病毒。除許多其他特征外，從兩個使用氯仿的連續提取的結果還發現本文中描述的新型 病毒是無包膜的(抽提之后，所抽提的病毒樣品仍然能夠在SPF雞胚蛋中引起特定的致病 作用)。可用于進一步分析的核酸只可在RNA提取和RT-PCR后獲得、而不能在DNA分離和 常規PCR后獲得這一事實，揭示了該新型病毒中存在RNA基因組這一特點。令人驚訝地，發現最接近(然而可區別的)的親緣病毒為ANVl型病毒，因此本文 中描述的新型禽星狀病毒代表了暫時分類為ANV3病毒的新型禽腎炎病毒組。然而，本發明者已令人驚訝地發現了一些特征，它們可以區分本文中描述的新型 禽星狀病毒與ANVl和其他(星狀_)病毒，并且將新型禽星狀病毒的不同分離株獨特地鑒 定為屬于其自己的新的獨立的組。主要的鑒定特征涉及可通過核苷酸序列分析和通過PCR測定鑒定的特定核苷酸 序列的存在。還觀察到當感染胚胎時誘導的不同的病理學癥狀。使用VN-或IFT-測定通過血 清分型可檢測到特定的免疫差異。所有這些將在下面通過實驗結果和數據來進行描述。本發明涉及具有開放閱讀框架(ORF) Ia基因組區域的分離的新型禽星狀病毒，其 特征在于所述禽星狀病毒的ORF la，當與禽腎炎病毒1的ORF Ia相比較時，包含12個核苷 酸的插入物，所述插入物位于相應于SEQ ID NO 1的第M85和M86號核苷酸之間。優選的“禽類”生物是家禽；更優選的禽類生物選自雞、火雞、鴨和鵝。最優選是雞。術語“星狀病毒”顯示了本發明新型病毒組與目前已描述和/或分類為屬于星狀病毒科分類學科的病毒的關系。然而，本領域技術人員將認識到這樣的分類學分類可隨時 間而改變，因為新的知識可導致重新分類至新的或其他分類群。然而，由于這不改變本發明 病毒的特征而只改變其分類，因此這樣的重新分類的生物仍然在本發明的范圍內。特別地，本發明包括從本發明禽星狀病毒亞分類至亞種、株系、基因型、血清型、變 體或亞型等的所有病毒。因此，對于本發明，“星狀病毒”是具有分類為星狀病毒的病毒的表征特性的病毒。 此類表征特征涉及例如分子、生物化學和生物學特征；例如涉及具有包含可辨認為la、lb 和2的ORF的有義單鏈RNA基因組；為大約觀-30歷的無包膜病毒粒；和引起腸炎。術語“基因組區域”指本發明新型禽星狀病毒的遺傳材料的一部分。這樣的區域 將由核酸組成；在本發明新型禽星狀病毒的情況下，核酸是RNA。如所有其他星狀病毒科一樣，本發明新型禽星狀病毒的基因組包括可辨認為和相 應于ORF la、Ib和2的區域。然而，令人驚訝地發現該新型禽星狀病毒在其ORF Ia基因組區域具有一些不存 在于ANVl或任何其他類型的(禽)星狀病毒ORF Ia中的核苷酸。這些核苷酸以12個核 苷酸的線性連續區段的形式存在，并且當與ANVl的ORF Ia序列相比較時，代表了至該區域 內的插入物。該12個核苷酸的“插入物”存在于本文中描述的新型禽星狀病毒的組群的所 有檢測過的分離株的ORF Ia中。通過參照對于ANVl參照株的基因組序列所描述的編號(所述編號由Imada等人 (2000，J. of Virology，第74卷，p. 8487-8493)描述)來標示所述12個核苷酸的插入物在 本文中描述的新型禽星狀病毒分離株的ORFla中存在的位置。該ANVl株的基因組序列的 cDNA序列也可在登錄號AB033998下從稱為GenBank的美國國立衛生研究院的互聯網核苷 酸數據庫獲得，并且在本文中表示為SEQ ID NO :1。對于本發明新型禽星狀病毒的所有分離株，該ORF中的12核苷酸插入物位于相應 于SEQ ID NO 1的第M85和M86號核苷酸的核苷酸之間。目前不知道本發明新型禽星狀病毒的ORF Ia中的該12核苷酸插入物(其不存在 于ANVl的ORF Ia中)是否或如何影響該新型禽星狀病毒的行為。不受任何理論束縛，本 發明者假設，由于此插入物以12個核苷酸的形式存在，從而存在4個三聯體，仍然使ORFl 的翻譯閱讀框保持完整，這一事實使得將編碼的4個額外氨基酸整合在從ORF Ia表達的非 結構蛋白中。這極可能影響病毒的病理-生物學行為，例如其毒性和其引起腸以及腿、關節 和肌腱的疾病的能力。然而，這12個核苷酸存在于本文中描述的新型禽星狀病毒的ORFIa基因組區域但不存在于ANVl或其他(禽)星狀病毒的ORF Ia中這一事實提供 了該新型病毒組群的陽性遺傳標記。如在本領域中所熟知的，遺傳標記是生物體遺傳材料的特征，其位于某一基因組 位置上，可用于進行某種區分或產生某種關聯，并且可通過技術方法來檢測。當一個特征存 在于待鑒定的組群中(如本發明中的情形)時，其是該組群的“陽性”遺傳標記。表征本發明新型禽星狀病毒的該12核苷酸插入物的核苷酸序列對于本文中描述 的新型禽星狀病毒的所有分離株而言不是完全相同的，然而大小和位置是相同的。該12核 苷酸插入物的核苷酸序列的共有序列為
5' -TCYG⑶MARYYT-3‘，在本文中表示為 SEQ ID NO :2。因此，在一個優選實施方案中，本發明的特征在于該12核苷酸插入物具有如SEQ ID NO 2中所示的核酸序列。本領域技術人員將知道，SEQ ID NO :2的序列是所謂的‘變性的’引物序列，表明其 中有一些位置(此處為Y、D、M和R)處可以存在多個核苷酸中的一個。用于標示變性堿基 的常用代碼是IUPAC代碼(Biochem. J.，1985，第229卷，p. 281-286中公開的)，其中R = G 或A;Y = T 或 C;M = A 或C;K = G 或T;S = G或 C;W = A 或T;H = A、C或 T;B = G、T 或 C ;V = G、C 或 A ;D = G、A 或 T ；禾口 N = G、A、T 或 C。對于本文中描述的新型禽星狀病毒，該可檢測的遺傳標記的存在允許通過檢測例 如通過DNA測序或PCR進行檢測來鑒定該新型病毒和其新型組群。DNA測序是一項熟知的技術；例如用于高速自動化測序的標準方案和設備是可廣 泛獲得的。最常見地此類方案利用基于PCR的“循環-測序”，然后進行高分辨力電泳。為了進行RNA病毒例如星狀病毒科病毒的核酸測序，待檢查的核酸需要以拷貝 DNA(cDNA)的形式存在，因為RNA測序仍然是不可行的。對于cDNA的制備，有許多標準方案 和商業試劑盒可供利用。此類方案使用逆轉錄酶。通常使用引物起始拷貝過程。用于RT反應的合適引物的一個實例是在本文中表示為SEQ ID NO 3的DNA寡核 苷酸，其為5' -TCG WTS CTA CYC-3'。本發明者將該引物稱為引物17。該引物雜交至許多禽星狀病毒的基因組的遠端3'區，該區域始于相應于SEQ ID NO 1第6731號核苷酸的核苷酸并且反向延伸。在
圖1中，展示了來自選定數目的本發明禽星狀病毒分離株的ORFla部分的cDNA 序列的多重比對。將這些cDNA序列與SEQ ID NO :1中所示的ANVl參照病毒基因組的相應 部分進行比對。如在加框區域中清楚可見的，所有分離株具有不存在于ANVl ORF Ia中的 一個12核苷酸區域。本發明禽星狀病毒分離株的ORF la cDNA序列的序列編號SEQID NO 列于表1中。類似地，圖2顯示了通過圖1中所列cDNA序列的計算機翻譯制備的推定氨基酸序 列的多重比對。如加框的區域中可見的，由本發明禽星狀病毒的ORF Ia編碼的蛋白質包含 不存在于由ANVl的ORF Ia編碼的蛋白質中的4個氨基酸。本發明禽星狀病毒分離株的翻 譯ORF Ia序列的序列編號SEQ ID NO列于表1中。關于本發明禽星狀病毒的分離株在一段時間內從遭受上述腿和/或腸疾病的雞 和火雞收集大量野外分離株(field isolate)。分析了這些分離株當中的許多株，得到了本 文中描述的新型禽星狀病毒組群這一發明。然而，在本文中只提供所有經分析的分離株中 選出的一些分離株，以在該組群中發生的天然變異的背景中定義該新型禽星狀病毒。表1提供了本文所述的本發明禽星狀病毒分離株的描述。此外，表1還列出了來 自所選分離株的ORF IaUb和2的cDNA和推定蛋白質序列的序列編號SEQ ID NO。表1 所選的本發明禽星狀病毒分離株的特征；以及已測序的cDNA區域(“nt”) 和推定的編碼蛋白質(“aa”)的SEQ ID NO。
權利要求
1.具有開放閱讀框架(ORF)Ia基因組區域的禽星狀病毒，其特征在于所述禽星狀病毒 的ORF la,當與禽腎炎病毒1的ORF Ia相比較時，包含12個核苷酸的插入物，所述插入物 位于相應于SEQ ID NO 1的第M85和M86號核苷酸的核苷酸之間。
2.權利要求1的禽星狀病毒，其特征在于所述12個核苷酸的插入物具有SEQID NO 2中所示的核酸序列。
3.權利要求1至2的禽星狀病毒，其特征在于所述禽星狀病毒的ORFIa包含與SEQ ID NO 4具有至少88%的核苷酸序列同一性的區域。
4.權利要求1至3的禽星狀病毒，其特征在于可在使用SEQID NO 30和31中所示的 一組引物的PCR測定中從所述禽星狀病毒的ORF Ia產生大約260個核苷酸的PCR產物。
5.權利要求1至4的禽星狀病毒，其為以編號CNCM1-3895保藏在法國巴黎的巴斯德 研究所國家微生物菌種保藏中心(CNCM)的病毒。
6.在病毒中和測定中可中和權利要求1至5的禽星狀病毒的抗體或其片段。
7.從權利要求1至5的禽星狀病毒可獲得的抗原性制劑。
8.包含與SEQID NO 4具有至少88%核苷酸序列同一性的區域的DNA分子。
9.包含與SEQID NO :5具有至少93%氨基酸序列同一性的區域的蛋白質。
10.一種疫苗，其包含權利要求1至5的禽星狀病毒、權利要求6的抗體或其片段、權利 要求7的抗原性制劑、權利要求8的DNA分子或權利要求9的蛋白質和藥學上可接受的載 體。
11.權利要求10的疫苗，其包含至少一種從對家禽有致病性的微生物可獲得的另外的 抗原。
12.用于家禽的疫苗的化合物或組合物，其中所述化合物或組合物是權利要求1至5的 禽星狀病毒、權利要求6的抗體或其片段、權利要求7的抗原性制劑、權利要求8的DNA分 子或權利要求9的蛋白質。
13.化合物或組合物用于制造家禽的疫苗的用途，其中所述化合物或組合物是權利要 求1至5的禽星狀病毒、權利要求6的抗體或其片段、權利要求7的抗原性制劑、權利要求 8的DNA分子或權利要求9的蛋白質。
14.用于制造家禽的疫苗的方法，其中將化合物或組合物與適當的藥物載體混合，所述 化合物或組合物是權利要求1至5的禽星狀病毒、權利要求6的抗體或其片段、權利要求7 的抗原性制劑、權利要求8的DNA分子或權利要求9的蛋白質。
15.一種診斷試劑盒，其包含權利要求1至5的禽星狀病毒、權利要求6的抗體或其片 段、權利要求7的抗原性制劑、權利要求8的DNA分子或權利要求9的蛋白質。
全文摘要
本發明涉及獸醫病毒學和免疫學的領域。具體地，本發明涉及新型禽星狀病毒；抗該新型病毒的抗體或其片段；該新型禽星狀病毒的抗原性制劑、蛋白質和DNA分子；該新型病毒或者其抗原性制劑、蛋白質或DNA的疫苗；用于制造此類疫苗的方法以及診斷試劑盒。
文檔編號C07K14/08GK102066407SQ200980113697
公開日2011年5月18日 申請日期2009年4月27日 優先權日2008年4月28日
發明者C·C·斯徹厄, I·萬斯特根, 德 拉 M·梵, 威特 S·德 申請人:英特威國際有限公司