專利名稱：艱難梭菌芽孢的抗體及其用途的制作方法
艱難梭菌芽孢的抗體及其用途相關專利申請的交叉引用本申請要求于2008年2月28日提交的美國臨時申請序列號61/032，270的優先 權，將該美國臨時申請以引用的方式并入本文。
背景技術：
艱難梭菌(Clostridium difficile)(即形成厭氧芽孢的革蘭氏陽性菌)是在人 中引起偽膜性腸炎和抗生素相關性腹瀉的主要原因并且是牽涉于醫院引起的醫院內感染 的最廣泛的細菌之一(參見例如Wren，2006，Future Microbiol ； 1(3) :243_245)。根據疾 病控制中心(⑶C)，艱難梭菌在美國每年可造成成百上千例腹瀉病例和至少5，000例死亡。 在1993年至2003年之間，艱難梭菌感染數目翻番，在2000年后增長最大。患有與艱難梭菌相關的疾病的個體在糞便中排出芽孢。艱難梭菌感染常常在住院 患者之間傳播并且該生物體通常存在于醫院工作人員的手上(參見，例如McFarland等人， 1989，N Engl J Med ；320 204-210)。需對感染艱難梭菌的患者進行隔離并采取防范措施 來避免感染蔓延。無癥狀的攜帶者可排出芽孢并且為了隔離目的而需要進行篩選(參見例 如，Kyne 等人，2000，N Engl J Med ；342 :390_397)。艱難梭菌芽孢能耐熱、耐干燥和耐清洗劑，并且可在諸如手推車手柄、床欄桿、便 盆、盥洗室、浴盆、地板、器具、亞麻制品、電話、聽診器、溫度計和遠程控制器之類的環境表 面上存活多達70天。因而，環境表面是易感染源。需要在住院期間對患者的房間進行徹底清潔。顯然需要監控清潔效果以及需要確認患者房間和環境表面沒有艱難梭菌芽孢。目 前，還沒有用于檢測環境樣品和患者樣品中的艱難梭菌芽孢的易用快速方法。雖然目前有 市售的試劑盒(免疫測定法和分子測定法兩種試劑盒)可用于檢測艱難梭菌毒素，但這些 試劑盒不能檢測艱難梭菌芽孢。因而，存在對用于檢測艱難梭菌芽孢的快速易用系統的需要。
發明內容
本發明包括與艱難梭菌芽孢結合的分離的抗體。在一些實施例中，該芽孢是未萌 發的芽孢。在一些實施例中，該芽孢是萌發的芽孢。在一些實施例中，該抗體不與艱難梭菌 營養細胞結合。在一些實施例中，該抗體不與艱難梭菌毒素結合。本發明包括一種分離的抗體，該抗體與艱難梭菌菌株630的具有SEQID NO :1的假 定蛋白CD1021或假定蛋白CD1021的片段結合。在一些實施例中，該分離的抗體與假定蛋 白⑶1021的包含氨基酸殘基505至604的片段結合。在一些實施例中，該分離的抗體與假 定蛋白CD1021的包含氨基酸殘基30至120的片段結合。在一些實施例中，該分離的抗體 與假定蛋白CD1021的包含氨基酸殘基194至293的片段結合。在一些實施例中，該分離的 抗體與假定蛋白⑶1021的包含氨基酸殘基203至217的片段結合。在一些實施例中，該分 離的抗體與假定蛋白⑶1021的包含氨基酸殘基333至347的片段結合。
本發明包括與氨基酸序列SEQ ID NO 2結合的分離的抗體。本發明包括與氨基酸序列SEQ ID NO 9結合的分離的抗體。本發明包括與氨基酸序列SEQ ID NO 10結合的分離的抗體。本發明包括與氨基酸序列EGSSLQYKGDDPESY(SEQ ID NO 3)結合的分離的抗體。本發明包括與氨基酸序列LKNETYKTKYHKYLE(SEQ ID NO 4)結合的分離的抗體。本發明包括一種分離的抗體，該抗體與艱難梭菌菌株630的具有SEQID NO 5的 推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白或推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺 酶蛋白的片段結合。在一些實施例中，該分離的抗體與推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸 酰胺酶蛋白的包含氨基酸殘基294至393的片段結合。在一些實施例中，該分離的抗體與 推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的包含氨基酸殘基582至596的片段結合。 在一些實施例中，該分離的抗體與推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的包含氨 基酸殘基64至78的片段結合。本發明包括與氨基酸序列SEQ ID NO 6結合的分離的抗體。本發明包括與氨基酸序列YKLKDKNGGTTKTVA(SEQ ID NO 7)結合的分離的抗體。本發明包括與氨基酸序列KFKEKPDADSIKLKY(SEQ ID NO 8)結合的分離的抗體。本發明包括單克隆抗體或其抗原結合片段，其中所述單克隆抗體或抗原結合片段 抑制本發明的抗體與其抗原靶標的結合。本發明包括本發明的分離的抗體的抗原結合片段。在一些實施例中，本發明的分離的抗體是多克隆抗體。在一些實施例中，本發明 的分離的抗體是單克隆抗體。在一些實施例中，本發明的分離的抗體不與枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)芽孢或產孢梭菌(Clostridium sporogenes)芽孢結合。在一些實施 例中，本發明的抗體和抗原結合片段帶有標記。本發明包括包含一種或多種本發明的分離的抗體或它們的抗原結合片段的組合 物。本發明包括包含一種或多種本發明的分離的抗體或它們的抗原結合片段的試劑
品.ο本發明包括產生本發明的單克隆抗體的雜交瘤細胞系或轉化的B細胞系。本發明包括分離的多核苷酸序列，該多核苷酸序列包括編碼本發明單克隆抗體的 重鏈、輕鏈、重鏈可變區、輕鏈可變區或一個或多個互補決定區的核酸序列。本發明包括表 達載體，該表達載體包括這種分離的多核苷酸序列。本發明包括宿主細胞，該宿主細胞包括 這種表達載體。本發明包括制備抗艱難梭菌抗體的方法，該方法包括用包含艱難梭菌基因組所編 碼的蛋白質的至少一部分的多肽，對宿主生物體以可有效產生響應所述多肽的抗體的量進 行免疫。在一些實施例中，所述包括由艱難梭菌基因組編碼的蛋白質的至少一部分的多肽 選自 SEQ ID N0:1、SEQ IDN0:2、SEQ ID NO :3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6、 SEQ IDNO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10 以及它們的片段。在一些實施例 中，本方法還包括對抗體制備物進行純化。本發明包括制備抗艱難梭菌抗體的方法，該方法包括使編碼由艱難梭菌基因組編 碼的蛋白質的至少一部分的核酸序列在免疫活性宿主生物體中表達。在一些實施例中，所
7述編碼由艱難梭菌基因組編碼的蛋白質的至少一部分的核酸序列編碼選自SEQ ID NO=U SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ IDN0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO 10以及它們的片段的氨基酸序列。在一些實施例中，本 方法還包括對抗體制備物進行純化。本發明包括組合物，該組合物包括至少兩種分離的抗體或它們的抗原結合片段， 其中每種分離的抗體與艱難梭菌芽孢的獨特抗原表位結合。在所述組合物的一些實施例中，至少一種分離的抗體或其抗原結合片段與艱難梭 菌菌株630的具有SEQ ID NO :1的假定蛋白⑶1021或與假定蛋白⑶1021的多肽片段結 合。在一些實施例中，所述假定蛋白⑶1021的多肽片段選自SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、 SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO 10 以及它們的片段。在所述組合物的一些實施例中，至少一種分離的抗體或其抗原結合片段與艱難梭 菌菌株630的具有SEQ ID NO :5的推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白或推定的 N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的片段結合。在一些實施例中，所述推定的N-乙酰 基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的多肽片段選自SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO 8以及它們的片段。在所述組合物的一些實施例中，第一種分離的抗體或其抗原結合片段與艱難梭菌 菌株630的具有SEQ ID NO :1的假定蛋白⑶1021或假定蛋白⑶1021的多肽片段結合，并 且第二種分離的抗體或其抗原結合片段與艱難梭菌菌株630的具有SEQ ID NO :5的推定的 N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白或推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白 的片段結合。在一些實施例中，所述假定蛋白⑶1021的多肽片段選自SEQ ID NO :2、SEQID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10以及它們的片段。在一些實施例中，所述 推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的多肽片段選自SEQ ID N0:6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8以及它們的片段。本發明包括試劑盒，該試劑盒包括至少兩種分離的抗體或它們的抗原結合片段， 其中每種分離的抗體與艱難梭菌芽孢的獨特抗原表位結合。在所述試劑盒的一些實施例中，至少一種分離的抗體或其抗原結合片段與艱難梭 菌菌株630的具有SEQ ID NO 1的假定蛋白⑶1021或假定蛋白⑶1021的多肽片段結合。 在一些實施例中，所述假定蛋白⑶1021的多肽片段選自SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :9、SEQID NO 10 以及它們的片段。在所述試劑盒的一些實施例中，至少一種分離的抗體或其抗原結合片段與艱難梭 菌菌株630的具有SEQ ID NO :5的推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白或推定的 N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的片段結合。在一些實施例中，所述推定的N-乙酰 基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的多肽片段選自SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO 8以及它們的片段。在所述試劑盒的一些實施例中，第一種分離的抗體或其抗原結合片段與艱難梭菌 菌株630的具有SEQ ID NO :1的假定蛋白⑶1021或假定蛋白⑶1021的多肽片段結合，并 且第二種分離的抗體或其抗原結合片段與艱難梭菌菌株630的具有SEQ ID NO :5的推定的 N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白或推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白 的片段結合。在一些實施例中，所述假定蛋白⑶1021的多肽片段選自SEQ ID NO :2、SEQIDN0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10以及它們的片段。在一些實施例中，所述 推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的多肽片段選自SEQ ID N0:6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8以及它們的片段。本發明包括檢測樣品中艱難梭菌芽孢的存在的方法，該方法包括使所述樣品與一 種或多種本發明的分離的抗體接觸。本發明包括檢測樣品中艱難梭菌芽孢的存在的方法，該方法包括使所述樣品與至 少兩種分離的抗體或它們的抗原結合片段接觸，其中每種分離的抗體與艱難梭菌芽孢的獨 特抗原表位結合。本發明包括檢測樣品中艱難梭菌芽孢的存在的方法，該方法包括使所述樣品與 第一種分離的抗體或其抗原結合片段接觸，其中第一種分離的抗體與艱難梭菌芽孢的第一 抗原表位結合；以及使所述樣品與第二種分離的抗體或其抗原結合片段接觸，其中第二種 分離的抗體與艱難梭菌芽孢的第二抗原表位結合。在本發明方法的一些實施例中，至少一種分離的抗體或其抗原結合片段與艱難梭 菌菌株630的具有SEQ ID NO 1的假定蛋白⑶1021或假定蛋白⑶1021的多肽片段結合。 在一些實施例中，所述假定蛋白⑶1021的多肽片段選自SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :9、SEQID NO 10 以及它們的片段。在本發明方法的一些實施例中，至少一種分離的抗體或其抗原結合片段與艱難梭 菌菌株630的具有SEQ ID NO :5的推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白或推定的 N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的片段結合。在一些實施例中，所述推定的N-乙酰 基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的多肽片段選自SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID NO: 8以及它們的片段。在本發明方法的一些實施例中，第一種分離的抗體或其抗原結合片段與艱難梭菌 菌株630的具有SEQ ID NO :1的假定蛋白⑶1021或假定蛋白⑶1021的多肽片段結合，并 且第二種分離的抗體或其抗原結合片段與艱難梭菌菌株630的具有SEQ ID NO :5的推定的 N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白或推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白 的片段結合。在一些實施例中，所述假定蛋白⑶1021的多肽片段選自SEQ ID N02,SEQID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10以及它們的片段。在一些實施例中，所述 推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的多肽片段選自SEQ ID N0:6、SEQ ID NO 7、SEQ ID N0:8以及它們的片段。除非另外指明，否則“一個”、“一種”、“所述”和“至少一種”可互換使用并且意指
一種或多于一種。
圖1表示如下氨基酸序列之間的同源性來自艱難梭菌菌株630的假定⑶1021 蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO :1，對應GenBank登錄號ΥΡ_001087502)、來自艱難梭 菌QCD_32g58的假定CD1021蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO :11，對應GenBank登錄號 ZP_01804840)、來自艱難梭菌QCD-32g58的假定CD1021蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO 12, 對應GenBank登錄號ZP_01804841)、來自艱難梭菌QCD-32g58的假定CD1021蛋白的氨基 酸序列(SEQ ID NO :21，翻譯自對應GenBank登錄號NZ_AAML04000007的核苷酸461827至462825的區域)、來自艱難梭菌QCD-32g58的假定CD1021蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO 22，翻譯自對應GenBank登錄號NZ_AAML04000007的核苷酸462824至463732的區域)以 及來自艱難梭菌Q⑶_66c26的假定⑶1021蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO :23，翻譯自對應 GenBank登錄號NZ_ABFD01000037的核苷酸15690至17597的區域的互補序列)。利用多 序列比對程序CustalW對這些序列進行比對，該程序可從http://WWW. ebi. ac. uk/Tools/ custalw/公開獲得。所示出的共有序列為SEQ ID NO :38。在這六種假定蛋白中的至少四 種中相同的氨基酸殘基在該共有序列中示出。共有序列中的“X”殘基指示所比對的序列中 的兩個或更多個在各自殘基處顯示出非同一性，或其指示缺少關于三個或更多個比對序列 中各自殘基的序列信息。位于比對序列其中之一的任何給定位置的“ · ”符號指示該氨基 酸位置在相應的GenBank序列中未報道。
具體實施例方式本發明涉及與細菌艱難梭菌的內生孢子結合的抗體。這種芽孢特異性抗體可(例 如)用于檢測環境樣品、生物樣品和食物樣品中的艱難梭菌內生孢子。僅一些屬的細菌(例 如芽孢桿菌屬(Bacillus)和梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium))能夠形成內生孢子。細菌內 生孢子對惡劣的物理和化學條件具有高度耐受性，使得其成為自然界中存在的最耐久的細 胞類型。它們可存活于高熱、干燥、輻射和許多破壞性化學試劑并且為該細菌的非活性形 式，該形式使得其能存活于亞最佳環境條件下。內生孢子可存活十分長的時間然后恢復生 長狀態，即稱為萌發的過程。由于內生孢子可耐受熱、輻射、消毒劑和干燥，它們難以從醫療 和藥物材料除去并且是污染的常見原因。本發明的抗體與細菌艱難梭菌的內生孢子(在本文中也稱為“芽孢”)結合。如 本文所用，術語“抗體”或“多種抗體”可互換使用。本發明的抗體既與艱難梭菌芽孢的活 芽孢結合又與其滅活的芽孢結合。可通過多種方法(包括(但不限于)例如用福爾馬林、 甲醛、戊二醛、化學消毒劑、高壓蒸汽和紫外輻射處理)中的任一種對芽孢進行滅活。本發 明的抗體與萌發和未萌發的艱難梭菌芽孢兩者結合。本發明的抗體與未萌發的艱難梭菌芽 孢結合并且不與萌發的艱難梭菌芽孢結合。本發明的抗體與萌發的艱難梭菌芽孢結合并且 不與未萌發的艱難梭菌芽孢結合。制備未萌發的芽孢和萌發的芽孢的方法是技術人員所 熟知的。簡而言之，通常通過將細菌在諸如胰酶大豆瓊脂之類的培養基上或在胰酶大豆肉 湯中培養直至多數細胞變成芽孢來制備細菌芽孢。通過離心收集芽孢并用諸如PBS之類 的緩沖液洗滌數次。可用醇處理懸浮液以殺死營養細胞并進行洗滌以收集芽孢(參見例 如，Long 禾口 Williams，1958，J Bacteriol 76 :332 禾口 Powers，1968，Appl Microbiol ；16 180-181)。可通過多種方法來引發芽孢萌發。參見(例如)Gould，1970，J Appl Bacteriol ； 33 34-49 ；Foerster 和 Foster，1966，J Bacteriol ；91:1168_1177 ；Moir 和 Smith，1990， Ann Rev Microbiol ；44 :531_553 ；以及美國專利申請系列號 2003/0175318A1。本發明的抗體與艱難梭菌芽孢結合并且不與其他形成內生孢子的細菌的芽 孢結合。本發明的抗體與艱難梭菌芽孢結合并且不與厚壁菌門(Firmicute)的其他 形成內生孢子的細菌的芽孢(例如由梭菌屬或芽孢桿菌屬的多個種中任一者產生 的內生孢子)結合。細菌梭狀芽孢桿菌屬和芽孢桿菌屬的種包括(但不限于)醋 酸梭菌(Clostridium aceticum)、丙酮 丁酉享梭菌(Clostridium acetobutylicum)、肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、酪酸梭菌(Clostridium butyricum)、肉 梭菌(Clostridiumcarnis)、氣月中疽梭菌(Clostridium chauvoei)、反硝化梭 菌(Clostridiumdenitrificans)、發光梭菌(Clostridium fervidus)、蟻酸醋酸 梭菌(Clostridium formicoaceticum)、諾氏梭菌(Clostridium novyi)、巴氏桿 菌(Clostridium pasteurianum)、產氣英月莫梭菌(Clostridiumperfringens)、敗毒 梭菌(Clostridium septicum)、產芽抱梭菌(Clostridium sporogenes)、破傷風梭 菌(Clostridium tetani)、熱乙酸梭菌(Clostridium thermoaceticum)、熱纖梭菌 (Clostridiumthermocellum)、熱角軍糖梭菌(Clostridium thermosacchroIyticum)、酪 丁 酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)、魏氏梭菌(Clostridiumwelchii)、Bacillus 已garadh已erens、^ ^ If S" (Bacillusalcalophilus)、Ι 定㈱ Hfi If 胃(Bacillus amyloliquefaciens)、炭疽芽抱桿菌(Bacillus anthracis)、萎縮芽抱桿菌(Bacillus atrophaeus) λ/^Μ^ΜΙΤ^ (Bacillus azotoformans)、LHfi|f胃(Bacillusbadius)、 菌(Bacillus benzoevorans)、女子炭芽 包桿菌(Bacillus carboniphilus) λ^η 狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、嗜幾丁質芽孢桿菌(Bacillus chitinolyticus)、環狀芽 Ifilf胃(Bacilluscirculans) Λ Bacillus clarkii、&胃氏Ufelf胃(Bacillus clausii)、 凝結芽胞桿菌(Bacillus coagulms)、科氏芽孢桿菌(Bacillus cohnii)、土壤芽孢桿菌 (Bacillus edaphicus)、Bacillus ehimensis、昔求芽胞桿菌(Bacillus fastidiosus)、 堅硬芽胞桿菌(Bacillus firmus)、彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)、Bacillus fumarioli、梭狀桿菌(Bacillusfusiformis)、吉氏芽抱桿菌(Bacillus gibsonii)、圓抱 芽孢桿菌(Bacillus globisporus)、鹽敏芽孢桿菌(Bacillus halmapalus)、Bacillus haloalkaliphilus、月兌 ft I 包 If 胃(Bacillushalodenitrificans)、而 H 包 If 胃 (Bacillus halodurans)、Baci 1 lushalophiIusΛ M 氏芽 包!f (Bacillus horikoshii)、 Bacillus horti、Bacillus infernos、異常芽胞桿菌(Bacillus insolitus)、0譽熱芽 胞桿菌(Bacillus kaustophilus)、左方寵乳酸芽孢桿菌(Bacilluslaevolacticus)、 遲緩芽胞桿菌(Bacillus lentus)、蘚樣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)、海洋 芽胞桿菌(Bacillus marinus)、巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)、甲酉享芽孢桿 菌(Bacillusmethanolicus)、莫海威芽孢桿菌(Bacillus mo javensis)、膠質芽孢桿 菌(Bacillus mucilaginosus)、蕈狀芽胞桿菌(Bacillus mycoides)、長里予芽孢桿菌 (Bacillus naganoensis)、；■芽 包 If 胃(Bacillus niacini)、Bacillus olernius、 蒼白芽胞桿菌(Bacillus pallidus)、巴氏幼蟲芽胞桿菌(Bacillus pasteurii)、 Bacillus pseudalcaliphilus、專性嗜堿芽孢桿菌(Bacillus Pseudofirmus)、假蕈狀 芽孢桿菌(Bacilluspseudomycoides)、嗜冷芽胞桿菌(Bacillus psychrophilus)、冷角軍 糖芽抱桿菌(Bacillus psychrosaccharolyticus)、短小芽胞桿菌(Baci 1 luspumiIus)、 施氏芽胞桿菌(Bacillus schlegelii)、Bacillussilvestris、簡單芽孢桿菌(Bacillus simplex)、Bacillus siralis、史氏芽胞桿菌(Bacillus smithii)、球形芽孢桿菌 (Bacillus sphaericus)、Bacillus sporothermoduransΛ >嗜熱脂肪芽孢桿菌ο、 枯草芽孢桿菌、嗜熱淀粉芽孢桿菌(Baci 1 Ius thermoamylovorans)、熱鏈形芽孢桿 胃(Bacillus thermocatenulatus)、^！；陰肖 $ 包 If 胃(Bacillusthermocloaceae)、^ 反硝化芽孢桿菌(Bacillus thermodenitrificans)、熱葡糖苷酶芽孢桿菌(Bacillusthermoglucosidasius)、喜熱芽抱桿菌(Bacillus thermoleovorans)、Bacillus thermosphaericus、蘇云金芽抱桿菌(Bacillus thuringiensis)、熱泉芽胞桿菌(Bacillus tusciae)、死谷芽抱桿菌(Bacillus vallismortis)、Bacillus vedderi、Bacillusvulcani 禾口韋氏芽抱桿菌(Bacillus weihenstephanensis)。本發明的抗體可結合艱難梭菌芽孢并且不與諸如脫硫腸狀菌屬 (Desulfotomaculum)、芽胞乳桿菌屬(Sporolactobacillus)、短芽孢桿菌屬 (Brevibacillus)、芽胞乂V疊球菌屬(Sporosarcina)禾口熱放線菌屬(Thermoactinomyces) 之類的其他細菌的芽孢結合。在一些實施例中，本發明的抗體與艱難梭菌芽孢結合并且不與枯草芽孢桿菌和產 孢梭菌的芽孢結合。本發明的抗體與艱難梭菌芽孢結合并且不與艱難梭菌營養細胞結合。本發明的 抗體與艱難梭菌芽孢結合并且不與其他形成內生孢子的細菌(包括任何本文所述的那些) 的營養細胞結合。在一些實施例中，本發明的抗體不與艱難梭菌、枯草芽孢桿菌和產孢梭 菌的營養細胞結合。培養各種各樣的梭菌屬和芽孢桿菌屬菌種(包括(但不限于)艱難 梭菌、產孢梭菌和枯草芽孢桿菌)的營養細胞的方法是技術人員所熟知的。參見(例如) Madigan 等人，2003，Brock Biology of Microorganisms，PrenticeHall ；禾口 Cappucino， 2005，Microbiology Laboratory Manual，Benjamin Cummings。病原性艱難梭菌菌株產生多種毒素。得到最好表征的是腸毒素(毒素A)和細胞 毒素(毒素B)，這兩種毒素可造成受感染患者中可見的腹瀉和炎癥(參見例如Gianfrilli 等人，1984,Microbiologica ；7 :375_9)。本發明的抗體與艱難梭菌芽孢結合并且不與艱難 梭菌產生的毒素結合，例如該抗體不與毒素A和/或毒素B結合。制備艱難梭菌毒素A和 毒素B以及測定抗體是否與艱難梭菌毒素A和/或毒素B結合的方法是技術人員所熟知 的。參見(例如)美國專利 No. 4，530，833 ；No. 4，533，630 ；No. 4，863，852 ；No. 4，879，218 ； No. 5，231，003 ；No. 5，610，023 ；No. 5，965，375 ；No. 6，503，722 ；No. 6，939，548 ；禾P No. 7，179，611。細菌內生孢子(包括艱難梭菌內生孢子)包封在由多種多肽的有序組裝形成的多 層蛋白質結構中。內生孢子含有四個保護層核心、皮質、外殼和外壁。芽孢的最外層是外 壁，其為由蛋白質構成的薄的覆蓋層。該外壁內部是芽孢外殼，其由高度交聯的角蛋白和多 層芽孢特異性蛋白質構成。芽孢外殼是多種毒素分子不可滲透的并且還可含有涉及萌發的 酶。皮質處于芽孢外殼之下并且由肽聚糖構成。核心壁處于皮質之下并且包圍原生質或內 生孢子的核心。核心具有標準的細胞結構，例如DNA和核糖體，但在代謝上是不活動的。本發明的一些實施例包括與艱難梭菌的芽孢特異性蛋白質(例如芽孢外壁蛋白、 芽孢外殼蛋白、芽孢皮質蛋白和芽孢內膜蛋白或芽孢核心蛋白)結合。這種抗體與存在于 一種或多種本文所述的厚壁菌門的形成內生孢子的細菌上的芽孢特異性蛋白質結合。在一 些實施例中，該抗體與存在于艱難梭菌中的芽孢特異性蛋白質結合但不與厚壁菌門的其他 形成內生孢子的細菌(例如菌株枯草芽孢桿菌和產孢梭菌)的芽孢特異性蛋白質結合。本發明的一些實施例包括與艱難梭菌的芽孢外殼組裝蛋白結合的抗體。一種這類 芽孢外殼組裝蛋白是CotH蛋白(在本文中也稱為“cotH”)。CotH蛋白是芽孢外殼的結構 組分并且在枯草芽孢桿菌中已得到很好表征。其涉及引導外殼蛋白的組裝并且涉及使外殼蛋白穩定。參見(例如)Naclerio 等人，1996，J Bacteriol ；178 (15) :4375_4380 和 Zilha 等人，1999，J Bacteriol ；181 =2631-2633) 本發明包括與艱難梭菌中的推定CotH蛋白結 合的抗體。已確定了艱難梭菌菌株630的完整基因組序列并且其可從GenBank 序 列數據庫(由美國國立生物技術信息中心(National Center forBiotechnology Information(NCBI))、美國國家醫學圖書館(NationalLibrary of Medicine (NLM))、美國 國立衛生研究院(Nationallnstitutes of Health (NIH))維護)獲得。還可參見Sebaihia 等人，2006，Nat. Genet ;38 (7) :779_786)。菌株630是多重耐藥的并且分離自患有嚴重 偽膜性結腸炎的患者，該疾病于1982年在瑞士的蘇黎世傳播給同一病房的許多其他患者 (Wren, 2006,Future Microbiol ； 1(3) :243_245)。因而，菌株 630 具有有完全毒力的、高度 傳染性的耐藥菌株的遺傳屬性。目前正努力去獲得其他艱難梭菌菌株的基因組序列。桑格研究院(Sanger Institute) (Wellcome Trust Genome Campus，Hinxton, Cambridge，UK)正在對艮難梭菌 菌株R20291的基因組進行測序。艱難梭菌菌株R20291分離自英國的斯托克·曼德維爾 (Stoke Mandevilie,UK)并且與北美超高毒性的BI菌株密切相關(參見ftp站點Sanger. ac.uk/pub/pathogens/cd/C_difficile_Bi_454. dbs)。圣路易斯市(St. Louis，M0)的華盛 頓大學(Washington University)正在對艱難梭菌QCD_32g58的基因組進行測序(參見萬 維網網址 cmr. jcvi. org/cgi-bin/CMR/GenomePage. cgi ？ org = ntcd03)。對艱難梭菌菌株630的所有GenBank 序列進行了全面搜索，確定了假定蛋白 ⑶1021(ΥΡ_001087502)，其顯示具有與枯草芽孢桿菌的芽孢外殼組裝蛋白H(cotH)同源的 保守結構域(氨基酸殘基90至393)。該分析用可得自NCBI和萬維網網址ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/cdd. shtml的保守結構域搜索工具進行。艱難梭菌630的假定蛋白 CD1021 (GenBank 登錄號 YP_001087502)具有氨基酸序列 SEQ ID NO :1。參見 Sebaihia 等 人，2006，Nat. Genet ；38 (7) :779_786 和萬維網網址 ncbi. nlm. nih. gov/entrez/viewer. fcgi ？ db = protein&id = 126698605。本發明的一些實施例包括與艱難梭菌的假定蛋白CD1021及其片段結合的抗體。 本發明的抗體與多種艱難梭菌菌株(包括(但不限于)本文所論述的任何艱難梭菌菌株) 中的假定蛋白CD1021結合。例如，本發明的抗體與如下菌株的假定蛋白CD1021結合艱難 梭菌菌株630、艱難梭菌菌株R20291、艱難梭菌菌株QCD_32q58、艱難梭菌菌株QCD_66c26、 艱難梭菌ATCC 43255、艱難梭菌ATCC 43593、艱難梭菌ATCC 43594、艱難梭菌ATCC 43596、 艱難梭菌ATCC 43597、艱難梭菌ATCC 43598、艱難梭菌ATCC 43603、艱難梭菌ATCC 9689和 /或艱難梭菌ATCC 700792。本發明的抗體包括與艱難梭菌菌株630的具有SEQ ID NO 1 的假定蛋白⑶1021結合的抗體。本發明的一些實施例包括與艱難梭菌的假定蛋白CD1021的多肽片段結合的抗 體。多肽片段可(例如)為約50、約100、約200、約300、約400、約500或約600個氨基酸 長。多肽片段可(例如)為約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40或約45個氨基酸 長。多肽片段可為約8-20、約12-15或約10-20個氨基酸長。本發明的一些實施例包括與艱難梭菌菌株630的假定蛋白⑶1021 (SEQ ID NO 1) 的多肽片段結合的抗體。例如，本發明包括與包括艱難梭菌菌株630的假定蛋白CD1021
13的殘基505-604 (SEQ ID NO :2)的多肽結合的抗體、與包括艱難梭菌菌株630的假定蛋白 ⑶1021的殘基30-120 (SEQID NO 9)的多肽結合的抗體、與包括艱難梭菌菌株630的假定 蛋白CD1021的殘基194-293 (SEQ ID NO 10)的多肽結合的抗體、與包括艱難梭菌菌株630 的假定蛋白⑶1021的殘基203至217 (SEQ ID NO 3)的多肽結合的抗體、與包括艱難梭菌 菌株630的假定蛋白CD1021的殘基333至347 (SEQID NO 4)的多肽結合的抗體。芽孢皮質(厚的肽聚糖層)負責維持芽孢的高度脫水狀態并且有助于芽孢的極端 休眠和耐熱性。細菌芽孢萌發包括一系列的降解事件，這些事件導致芽孢休眠的不可逆喪 失和核心的再水化。芽孢含有涉及萌發的酶。因而，可將與涉及萌發的芽孢特異性蛋白質 結合的抗體用于鑒別萌發芽孢。本發明包括與涉及萌發的芽孢特異性蛋白質結合的抗體。 這種抗體與萌發的芽孢結合但不與未萌發的芽孢結合。這種抗體與未萌發的芽孢結合但不 與萌發的芽孢結合。皮質裂解酶(包括酰胺酶N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶)在萌發中起關鍵 作用，導致皮質的水解(參見例如Moriyama等人，1996，JBacteriol ；181 =2373-2378) 本 發明包括與艱難梭菌酰胺酶結合的抗體，包括與艱難梭菌N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺 酶結合的抗體。對艱難梭菌菌株630的所有GenBank 序列進行了全面的搜索，確定了細胞表 面蛋白(推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶，YP_001087517，在本文中也稱為 “⑶1036”)，其具有保守的結構域CW_binding_2(推定的細胞壁結合重復序列2 ；174至 265、275至368、381至461)和Amidase_3 (N-乙酰基胞壁酰_L_丙氨酸酰胺酶，493至 673)。艱難梭菌630的推定N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶細胞表面蛋白(GenBank 登錄號YP_001087517)具有氨基酸序列SEQ ID NO :5。參見Sebaihia等人，2006，Nat. Genet ；38 (7) :779_786 和萬維網網址 ncbi. nlm. nih. gov/entrez/viewer. fcgi ？ db = protein&icL本發明包括與艱難梭菌的推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶及其片段結 合的抗體。本發明的抗體與多種艱難梭菌菌株(包括(但不限于)任何本文所論述的艱難 梭菌菌株)中的推定N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶結合。例如，本發明的抗體與如 下菌株的推定N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶結合艱難梭菌菌株630、艱難梭菌菌株 R20291、艱難梭菌菌株QCD_32q58、艱難梭菌ATCC 43255、艱難梭菌ATCC 43593、艱難梭菌 ATCC 43594、艱難梭菌ATCC 43596、艱難梭菌ATCC 43597、艱難梭菌ATCC 43598、艱難梭菌 ATCC 9689和/或艱難梭菌ATCC 700792。本發明的抗體包括與艱難梭菌菌株630的具有 SEQ ID NO 5的推定N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶結合的抗體。本發明的一些實施例包括與推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶的多肽片 段結合的抗體。多肽片段可(例如)為約50、約100、約200、約300、約400、約500或約600 個氨基酸長。多肽片段可(例如)為約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40或約45個 氨基酸長。多肽片段可為約8-20、約12-15或約10-20個氨基酸長。本發明包括與艱難梭 菌菌株630的具有SEQ ID NO 5的推定N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶的多肽片段結 合的抗體。例如，本發明包括與包括艱難梭菌菌株630的推定N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸 酰胺酶的殘基294-393 (SEQ ID NO 6)的多肽結合的抗體、與包括艱難梭菌菌株630的推定 N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶的殘基582-596 (SEQ ID NO :7)的多肽結合的抗體、與包括艱難梭菌菌株630的推定N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶的殘基64-78 (SEQ IDNO 8)的多肽結合的抗體。本發明的抗體包括(但不限于)多克隆抗體、親和純化的多克隆抗體、單克 隆抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、抗獨特型抗體、多特異性抗體、單鏈抗體、單鏈 Fvs (scFv)、二硫鍵連接的 Fvs (sdFv)、Fab 片段、F (ab，)片段、F(ab，)2 片段、Fv 片段、雙 體、由Fab表達文庫產生的線性抗體片段、包括VL或VH結構域的片段、細胞內制備的抗體 (即細胞內抗體)以及它們的抗原結合抗體片段。多種靶標抗原中的任一種均可用于產生 本發明的抗體，包括(但不限于)艱難梭菌細胞、芽孢或毒素、蛋白質、肽、碳水化合物以及 它們的組合。蛋白質和肽可以(例如)是天然存在的、通過化學合成或通過重組產生。可 將抗原綴合至載體。另外包括在本發明中的是多種抗體片段，也稱作抗原結合片段，其僅包括完整抗 體的一部分，通常包括完整抗體的抗原結合位點，從而保留了結合抗原的能力。可通過對完 整的或完全的抗體或抗體鏈進行化學或酶處理而獲得片段。還可通過重組手段獲得片段。 抗體片段的例子包括(例如)通過蛋白水解消化和/或還原二硫鍵而產生的Fab、Fab’、Fd、 Fd’、Fv、dAB和F(ab’)2片段以及從Fab表達文庫產生的片段。可通過本領域所熟知的技 術來產生這些抗體片段。本發明的抗體可包括單獨的可變區或可變區與鉸鏈區、CHl結構 域、CH2結構域、CH3結構域和/或Fc結構域的全部或一部分的組合。術語“抗原結合片段” 指免疫球蛋白或抗體的結合抗原或與完整抗體競爭結合抗原的多肽片段。本發明的抗體可以是免疫球蛋白分子的任何型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和 IgY)、任何類(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或亞類。在一些實施例中，免疫 球蛋白是IgG。免疫球蛋白可具有重鏈和輕鏈兩者。一組IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY重 鏈與k或λ形式的輕鏈配對。本發明的抗體可來自任何動物起源，包括鳥類和哺乳動物。在一些實施例中，抗體 是人、鼠、大鼠、驢、綿羊、兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬、大羊駝、駱駝或雞抗體。如本文所用，“人” 抗體包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗體以及包括分離自人免疫球蛋白文庫或分 離自具有一種或多種人免疫球蛋白的轉基因動物的抗體。本發明的抗體可以是多克隆抗體。術語“多克隆抗體”指從不止一種漿細胞克隆 產生的抗體。相比之下，“單克隆抗體”指從單種漿細胞克隆產生的抗體。多克隆抗體的制 備是為人所熟知的。針對靶標抗原的多克隆抗體可通過用免疫原對多種宿主動物進行免疫而獲得。可 使用多種免疫方案中的任一種。宿主動物可以是任何哺乳動物，例如，小鼠、倉鼠、大鼠、兔、 豚鼠、山羊、綿羊、馬、奶牛、水牛、野牛、駱駝或美洲駝。宿主動物可以是禽，例如雞或火雞。 在一些實施例中，抗體制備物不是從血樣獲得，而是從另外的流體源獲得，例如從牛奶、初 乳、蛋白或蛋黃獲得。在一些實施例中，抗體制備物不是通過用靶標抗原免疫宿主動物獲 得，而是從先前暴露于抗原的個體獲得或從匯集的血清獲得，例如從匯集的人血清獲得。將免疫劑與已知在進行免疫的哺乳動物中具有免疫源性的蛋白質綴合可能是有 用的。這種免疫源性蛋白質的例子包括(但不限于)鑰孔嘁血藍蛋白(KLH)、血清白蛋白、牛 甲狀腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制劑。可采用的佐劑的例子包括弗氏完全佐劑和MPL-TDM 佐劑(單磷酰脂質Α，合成的海藻糖白喉菌酸酯(dicorynomycolate))。免疫方案可由本領域技術人員選擇而無需過多的實驗。本發明的一些實施例包括與艱難梭菌芽孢結合的抗血清。如本文所用，抗血清指 來自經免疫的宿主動物的血液，其中凝血蛋白和紅血細胞(RBC)已被移除。抗血清(在本文 中也稱為“抗血清制備物”、“粗抗血清”或“原始抗血清”)仍具有所有類型的免疫球蛋白以 及其他多種血清蛋白。因而，除了可識別靶標抗原的抗體，抗血清還含有針對多種非靶標抗 原的抗體，這些針對多種非靶標抗原的抗體有時候可在免疫測定法中發生非特異性反應。在本發明的一些實施例中，可使抗體富集。這種富集可將非免疫球蛋白從制備物 中除去和/或在該樣品中富集一種或多種類型的免疫球蛋白(例如IgG)。可將多種方法 中的任一種用于獲得這種富集的抗體，包括(但不限于)本文描述的那些。將非免疫球蛋 白血清蛋白質從抗體制備物中除去的方法以及富集IgG級分的方法是本領域所熟知的。例 如，硫酸銨沉淀、蛋白A結合、蛋白G結合或辛酸沉淀可用于富集IgG型抗體。本發明的抗體包括具有增強的靶標抗原親合力的抗體。這種抗體可通過抗原親 和免疫吸附制備。抗原親和免疫吸附可通過多種手段中的任一種來進行。例如，抗原親和 免疫吸附可通過抗原親和柱色譜來進行。柱色譜可通過任何機械手段來進行，例如通過在 采用壓力或不采用壓力的柱操作中進行、在柱操作中從頂部到底部或從底部到頂部進行， 或者可在色譜處理過程中反轉流體在柱中的流動方向。或者，抗原親和免疫吸附可通過除 柱色譜之外的手段進行。例如，親和免疫吸附可利用分批法進行，其中將固相支持物與用于 上樣的液體分離、洗滌、通過任何合適的手段(包括重力、離心或過濾)洗脫。親和免疫吸 附還可通過使樣品與過濾材料接觸來進行，該過濾材料吸附或保留樣品中的某些分子的能 力比吸附或保留其他分子的能力更強。抗原親和柱可通過多種方法中的任一種制備，包括 (但不限于)本文所描述的那些。抗體制備物與抗原親和柱的結合可通過多種免疫吸附方 法(包括(但不限于)本文所描述的那些)中的任一種來進行。抗體制備物與抗原親和柱 的結合可在多種緩沖液或鹽(包括(但不限于)鈉鹽、鉀鹽、銨鹽、鹽酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽、 檸檬酸鹽、Tris緩沖液和/或緩沖容量接近中性的有機緩沖液)中進行。這種緩沖液和鹽 的具體例子包括(例如)Tris、磷酸鈉、磷酸鉀、磷酸銨、氯化鈉、氯化鉀、氯化銨、檸檬酸鈉、 檸檬酸鉀、檸檬酸銨、醋酸鈉、醋酸鉀或醋酸銨。本發明的抗體包括單克隆抗體。單克隆抗體的群組是均質的。制備物中的所有單 克隆抗體可識別靶標分子上的相同表位并且所有單克隆抗體具有相同的親和力。如本文所 用，“親和力，，是單克隆抗體與其抗原表位相互作用的結合強度。如本文所用，“表位”是抗 原為抗體所結合的部分。親和力越高，則抗原和抗體之間的締合就越緊密，并且抗原就更可 能保持在結合位點。本發明的單克隆抗體包括(但不限于)人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、單鏈 Fvs (scFv)、二硫鍵連接的 Fvs (sdFv)、Fab 片段、F (ab，)片段、F(ab，)2 片段、Fv 片段、雙 體、通過Fab表達文庫產生的線性抗體片段、包括VL或VH結構域的片段、細胞內制備的抗 體(即細胞內抗體)以及它們的抗原結合抗體片段。本發明的單克隆抗體可通過動物(包括(但不限于)人、小鼠、大鼠、兔、倉鼠、山 羊、馬、小雞或火雞)產生、通過化學合成或通過重組表達。本發明的單克隆抗體可通過本 領域已知的用于純化免疫球蛋白分子的任一種方法(例如，通過色譜法(如，離子交換色 譜、親和色譜以及分級柱色譜)、離心法、差別溶解法)或通過任何其他用于純化蛋白質的標準技術進行純化。此外，本發明的抗體或其片段可融合至本文所述或本領域已知的異源 多肽序列，以有利于純化。本發明的單克隆抗體可以是任何同種型。本發明的單克隆抗體可以是(例如)鼠 IgM、IgGU IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgD或IgE0本發明的單克隆抗體可以是(例如)人 IgM, IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgD或IgE0在一些實施例中，單克隆抗體可為鼠 IgG2a、IgGl或IgG3。根據本發明，可將給定的重鏈與k或λ形式的輕鏈配對。單克隆抗體可通過本領域技術人員所熟悉的多種技術獲得。例如，使來自用所 需抗原免疫過的動物的脾細胞永生化，通常通過與骨髓瘤細胞融合來永生化(參見(例 如)Kohler 禾口 Milstein，1976，Eur J Immunol ；6 511-519 J.Goding 的"Monoclonal Antibodies Principles andPractice, "Academic Press,第 59-103 頁(1986)；禾口 Harlow 等)κ, Antibodies :A Laboratory Manual,H 726 M (Cold Spring Harbor Pub. (1988))。 可通過本領域所熟知的技術從雜交瘤培養物中分離和純化單克隆抗體。還可使用其他已知 的制備產生單克隆抗體的轉化的B細胞系的方法。本發明的單克隆抗體可通過重組DNA技 術產生，例如通過噬菌體展示或通過組合方法產生。參見(例如)美國專利No. 5，223，409 ； W092/18619 ；WO 91/17271 ；WO 92/20791 ；WO 92/15679 ；WO 93/01288 ；W092/01047 ；WO 92/09690;或WO 90/02809。這些方法可用于產生人單克隆抗體。本發明的抗體包括嵌合抗體。嵌合抗體是其中不同部分源自不同動物物種的抗 體。例如，嵌合抗體可通過將來自具有合適抗原特異性的小鼠抗體分子的基因與來自具 有合適生物特異性的人抗體分子的基因接合在一起而獲得。參見例如Takeda等人，1985， Nature ；314 544-546。在治療上有用的抗體可源自“人源化”單克隆抗體。人源化單克隆抗體可通過這 樣制備將一個或多個來自小鼠(或其他物種)重鏈和輕鏈可變區的CDR轉移進人可變結 構域中，然后用人的殘基取代骨架區中的鼠的對應殘基。源自人源化單克隆抗體的抗體組 分的使用避免了與鼠恒定區的免疫原性相關的潛在問題。用于制備人源化單克隆抗體的技 術可在 Jones 等人，1986，Nature ；321 522 和 Singer 等人，1993，J Immunol 150 2844 中 找到。本發明的人源化單克隆抗體的恒定區可以為來自屬于任何同種型的人免疫球蛋白的 恒定區。其可以(例如)是人IgG的恒定區。源自人免疫球蛋白的恒定區的骨架區沒有具 體限制。完整抗體分子具有兩個重(H)鏈可變區(在本文中簡寫為VH)和兩個輕(L)鏈 可變區(在本文中簡寫為VL)。VH區和VL區可進一步細分為超變區，稱為“互補決定 區”(“CDR”)，散布有較保守的區域，稱為“骨架區”(FR)。已經精確限定了骨架區和CDR的范 圍(參見 Kabat, Ε· A.等人，(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第 5 版，U.S.Department of Health and Human Services, NIHPublication No. 91-3242 和 Chothia，C.等人，J. Mol. Biol. 1987 ； 196 :901_917)。VH 禾口 VL 各由三個 CDR 禾口四個 FR 構成，以如下順序從氨基末端到羧基末端排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本發 明包括具有本發明單克隆抗體的重鏈、輕鏈、重鏈可變區、輕鏈可變區和/或一個或多個互 補決定區的抗體。本發明包括雙特異性或雙功能抗體。雙特異性或雙功能抗體是具有兩個不同的 重鏈/輕鏈對和兩個不同的結合位點的人工雜合抗體。雙特異性抗體可通過多種方法制備，包括融合雜交瘤或連接F(ab’)片段。參見(例如)Songsivilai和Lachmann，1990， Clin Exp Immunol ;79 :315-321 和 Kostelny 等人，1992，J Immunol ;148 :1547_1553。此 外，雙特異性抗體可形成為“雙體” (Holliger等人，1993，PNAS USA 90 =6444-6448)或 "Janusin" (Traunecker 等人，1991，EMBO J ；10 :3655_3659 和 Traunecker 等人，1992，Int J Cancer Suppl ；7 :51_52)。還包括在本發明中的是產生本發明的單克隆抗體的雜交瘤細胞系、轉化的B細胞 系和宿主細胞；這些雜交瘤、轉化的B細胞系和宿主細胞的子代和衍生物；以及等價的或類 似的雜交瘤、轉化的B細胞系和宿主細胞。它們的子代或衍生物產生具有親本品系所產生 的抗體的一種或多種識別特征(例如同種型和抗原特異性)的抗體。本發明還提供了分離的多核苷酸分子，該多核苷酸分子具有編碼本發明的單克隆 抗體的核苷酸序列。本發明還涉及分離的多核苷酸分子，該核苷酸分子具有的核苷酸序列 與編碼本發明單克隆抗體的核苷酸序列具有至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至 少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的序列同一性。本發明還涵蓋了在高嚴 格條件下與編碼本發明抗體的核苷酸序列或其互補序列雜交的多核苷酸。如本文所用，“嚴 格條件”指在如下條件下第一多核苷酸分子與結合過濾材料的第二多核苷酸分子雜交并保 持與之結合的能力在65°C下于0. 5M NaHP04、7%十二烷基硫酸鈉(SDS)和ImM EDTA中 反應，然后在42°C下，在0. 2XSSC/0. 1% SDS中洗滌(參見Ausubel等人(編輯)，Current Protocolsin Molecular Biology,第1 卷，Green Publishing Associates,Inc. ,and John Wiley & Sons，Inc.，NY，第2. 10. 3頁(1989))。還包括在本發明中的是編碼本發明單克隆 抗體的一個或多個CDR區或重鏈和/或輕鏈的多核苷酸。用于對免疫球蛋白可變結構域和 恒定區進行克隆和測序的通用技術是為人所熟知的。參見例如Orlandi等人，1989，PNAS USA ；86 :3833ο本發明還包括重組載體，所述重組載體包括分離的本發明的多核苷酸。該載體可 以是(例如)質粒、病毒顆粒或噬菌體形式。可通過多種方法將合適的DNA序列插入載體 中。通常，通過本領域已知的方法將DNA序列插入至載體中的合適限制性內切核酸酶位點。 這種方法被認為是處于本領域技術人員的能力范圍內。大量的合適載體和啟動子是本領域 技術人員已知的，并且可商購獲得。如下載體是以舉例的方式給出的。細菌載體包括(例 如)pQE70、pQE60、pQE-9、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、 pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、pKK223_3、pKK233_3、pDR540 和 pRIT5。真核載體包括 (例如)pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTl、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG 和 pSVL。然而，可以使用任 何其他質粒或載體。本發明的一些實施例還包括含有上述載體的宿主細胞。宿主細胞可以是高等真核 細胞(例如哺乳動物或昆蟲的細胞)或低等真核細胞(例如酵母細胞)。或者，宿主細胞 可以是原核細胞(例如細菌細胞)或植物細胞。將載體構建體引入宿主細胞可通過任何合 適的技術來實現，例如磷酸鈣轉染、DEAE葡聚糖介導的轉染或電穿孔。(Davis，L.，等人， BasicMethods in Molecular Biology (1986))。本發明的單克隆抗體可在合適啟動子的控制下在哺乳動物細胞、酵母、細菌或其 他細胞中表達。還可以采用無細胞翻譯系統使用源自本發明的DNA構建體的RNA來產 生這類蛋白質。適用于原核和真核宿主的克隆和表達載體由Sambrook等人，MolecularCloning :A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor, NY(1989)進行了描述。還包括在本發明中的是表達來自本發明單克隆抗體的一個或多個超變區的噬菌 體展示文庫和從這種噬菌體展示文庫獲得的克隆。可將噬菌體展示文庫用于產生抗體衍生 的分子。將編碼抗體的抗原結合可變結構域的基因片段融合至編碼噬菌體的外殼蛋白的基 因。將含有這種基因融合物的噬菌體用于感染細菌，所得的噬菌體顆粒具有可表達抗體融 合蛋白的外殼，其中抗原結合結構域展示在噬菌體的外表面上。噬菌體展示文庫可(例如) 用得自New England Biolabs Inc. (Ipswich, MA)的Ph. D. TM-7噬菌體展示肽文庫試劑盒 (產品編號E8100S)或Ph.D. TM-12噬菌體展示肽文庫試劑盒(產品編號E8110S)制備。還 可參見 Smith 和 Petrenko, 1997，Chem Rev ；97 :391_410。可通過本領域所熟知的技術將本發明的抗體直接或間接偶聯至基材或可檢測標 記上。可檢測標記是可(例如)通過光譜(例如紫外光譜、紅外光譜、可見光譜、拉曼光譜、 表面增強拉曼散射(SERS)、質譜)、光化學、生物化學、免疫化學或化學手段檢測的試劑。可 用的可檢測標記包括(但不限于)熒光染料、化學發光化合物、放射性同位素、電子高密度 試劑、酶、有色粒子、生物素或地高辛。可檢測標記通常產生可測量的信號，例如放射性、熒 光、顏色或酶活性。與可檢測試劑綴合的抗體可用于診斷或治療目的。可檢測試劑的例子包 括多種酶、天然存在的芽孢相關的生物分子(例如吡啶二羧酸、吡啶二羧酸鈣)、輔基、熒光 材料、發光材料、生物發光材料、放射性材料、使用多種正電子發射斷層掃描術的正電子發 射材料、非放射性順磁性金屬離子、拉曼標簽和SERS標簽。可使用本領域已知的技術，將所 述可檢測物質直接偶聯或綴合至抗體，或將其通過介質(例如本領域已知的連接基)間接 偶聯或綴合至抗體。參見(例如)美國專利No. 4，741，900，其描述了金屬離子與抗體的綴 合以用于診斷目的。合適的酶的例子包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β “半乳糖苷酶和 乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復合物的例子包括鏈霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白 /生物素；合適的熒光材料的例子包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、若丹明、二氯三嗪 基氨基熒光素、丹磺酰氯和藻紅蛋白；發光材料的例子包括魯米諾；生物發光材料的例子 包括蟲熒光素和水母發光蛋白；以及合適的放射性材料的例子包括碘(1211、1231、1251、1311)、 碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(mln、112ln、113mln、115mln)、锝(99Tc、99mTc)、鉈(201Ti)、鎵(68Ga, 67Ga)、鈀(103Pd)、銷(99Mo)、氣(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177LU、159Gd、149Pm、14°La、175Yb、166H0、9。Y、 47Sc,186Re,188Re,142Pr^105Rh和97Ru。用于將這些部分綴合至抗體的技術是為人所熟知的。本發明的抗體包括通過將任何類型的分子共價連接至抗體而進行修飾或綴合的 抗體衍生物。這種抗體衍生物包括(例如)已通過糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰 胺化、用已知的保護/封閉基團衍生化、蛋白水解裂解或連接至細胞配體或其他蛋白質而 進行修飾的抗體。多種化學修飾中的任一種均可通過已知的技術進行，包括(但不限于) 特異性化學裂解、乙酰化、甲基化和衣霉素的代謝合成。另外，衍生物可含有一種或多種非 典型氨基酸。可通過本文所述的方法或通過本領域已知的任何合適方法測定本發明抗體的免 疫特異性結合。可使用的免疫測定法包括(但不限于)競爭性和非競爭性測定系統，這些 系統使用諸如BIAcore分析、熒光激活細胞分選器(FACS)分析、免疫熒光、免疫細胞化學、 蛋白質印記、放射_免疫測定法、酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、“夾心”免疫測定法、免疫 沉淀測定法、沉淀素反應、凝膠擴散沉淀素反應、免疫擴散測定法、凝集測定法、補體結合測定法、免疫放射測定法、熒光免疫測定法和蛋白A免疫測定法之類的技術。這些測定法是 常規的并且是并領域所熟知的(參見例如Ausubel等人(編輯)，Current Protocols in Molecular Biology,第 1 卷，John Wiley & Sons, Inc.，NY(1994))。還包括在本發明中的是包含一種或多種本文所述抗體的組合物。組合物還可包含 (例如)緩沖劑以將PH保持在可接受的范圍內以及包含防腐劑以延遲微生物生長。組合物 可包括(例如)載體、賦形劑、穩定劑、螯合劑、鹽或抗微生物劑。可接受的載體、賦形劑、穩 定劑、螯合劑、鹽、防腐劑、緩沖劑或抗微生物劑包括(但不限于)緩沖劑，例如磷酸鹽、檸 檬酸鹽和其他有機酸之類；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑，例如疊氮化鈉、 十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯己雙銨；苯扎氯銨、芐索氯銨；苯酚、丁醇或芐醇；烷基對 羥基苯甲酸酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇； 3_戊醇；和間甲酚；多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或非特異性免疫球蛋白；親水性聚 合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴 氨酸；單糖、二糖，以及其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA ；糖 類，例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨醇；成鹽抗衡離子例如鈉；金屬絡合物(例如Zn-蛋 白質絡合物)；和/或非離子型表面活性劑，例如TWEEN、PLURONICS或聚乙二醇(PEG)。如 本文所用，組合物不是多克隆抗血清。本發明還提供包含一種或多種本發明抗體的試劑盒或檢測系統。試劑盒可包括裝 滿一種或多種本發明抗體的容器。另外，試劑盒可包含諸如緩沖液之類的其他試劑，并且還 包含實踐本發明所需的溶液。任選的，這種容器可附帶告示或印刷說明書。試劑盒可包括 包裝材料。如本文所用，短語“包裝材料”指用于覆蓋試劑盒內容物的一種或多種物理結構。 包裝材料通過熟知的方法構造，其可提供無菌、無污染的環境。本發明包括分離的抗體。在用于描述本文所公開的多種抗體時，“分離的”意指已 經被鑒定并且從其天然環境的組分分離和/或回收的抗體。其天然環境的污染組分是通常 會干擾所述多肽的診斷或治療用途的材料，并且可包括酶、激素和其他蛋白質性或非蛋白 質性溶質。本發明的抗體與特定多肽或特定多肽上的表位“特異性結合”或是其“特異性的”。 這種抗體是與特定多肽或特定多肽上的表位結合而不會與任何其他多肽或多肽表位顯著 結合的抗體。本發明的抗體可通過動物產生、通過化學合成或通過重組表達。本發明的抗體可 通過本領域已知的用于純化免疫球蛋白分子的任一種方法，例如，通過色譜法(包括(但不 限于)離子交換色譜、親和色譜以及分級柱色譜)、離心法、差別溶解法或通過任何其他用 于純化蛋白質的標準技術進行純化。此外，可使本發明的抗體或其片段融合至本文所述或 本領域已知的異源多肽序列，以有利于純化或檢測。本發明的抗體可用于多種診斷和治療方法，包括(但不限于)用于檢測艱難梭菌 芽孢以及其多肽片段的方法和用于分離或純化艱難梭菌芽孢或其多肽片段的方法。本發明的抗體可用于多種本領域已知的免疫測定技術中的任一種來確定樣品中 艱難梭菌芽孢的存在與否。如本文所用，免疫測定法是利用抗體與其抗原靶標反應來鑒別 樣品中的被分析物(例如艱難梭菌芽孢)的存在的測試法。該測定法利用抗體與其抗原的 特異性結合。還包括在本發明中的是這種檢測方法。
在免疫測定法中，使樣品與一種或多種抗體接觸，并讓該抗體與它們的樣品中可 能存在的靶標結合。然后，通過檢測結合至其抗原靶標的抗體來確定所述一種或多種抗體 與它們的抗原靶標的結合。這種檢測可(例如)通過比色測定法、熒光測定法、酶促方法或 使用放射性同位素來完成。取決于測定法的形式，可將可檢測標簽結合至抗原或抗體。該 可檢測部分應該能夠(直接或間接)產生可檢測信號。例如，可檢測部分可以是放射性同 位素(例如3h、14C、32P、35S或1251)、熒光或化學發光化合物(例如異硫氰酸熒光素、若丹明或 蟲熒光素)或酶(例如堿性磷酸酶、β -半乳糖苷酶或辣根過氧化物酶)、拉曼標簽或SERS 標簽。可采用本領域已知的用于將抗體或抗原綴合至可檢測部分的任何方法。可將可檢測 部分(在本文中也稱為可檢測標簽)直接或間接綴合至抗體以生成“標記”抗體。標簽可 以是自身可檢測的(如放射性標簽或熒光標簽)，或在酶標簽的情形中，標簽可催化底物化 合物或組合物的化學改變，這種化學改變是可檢測的。本發明的免疫測定法包括(但不限于)競爭性和非競爭性測定系統，這些系統使 用諸如BIAcore分析、熒光激活細胞分選器(FACS)分析、免疫熒光、免疫細胞化學、蛋白質 印記、放射_免疫測定法、酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、“夾心”免疫測定法、免疫沉淀測定 法、沉淀素反應、凝膠擴散沉淀素反應、免疫擴散測定法、凝集測定法、補體結合測定法、免 疫放射測定法、熒光免疫測定法和蛋白A免疫測定法之類的技術。這些測定法是常規的并 且是并領域所熟知的(參見例如Ausubel等人(編輯)，Current Protocols in Molecular Biology，第 1 卷，John Wiley &Sons, Inc.，NY(1994))。本發明的免疫測定法可以是均相或非均相的。非均相免疫測定法需要一將未結合 的抗體或抗原從樣品中除去的步驟，通常利用固相試劑。因為均相測定法不需要該步驟，它 們通常能更快更容易地進行。分離方法包括(例如)沉淀(如，使用二抗)并在包被的管、 包被的珠、包被的孔、磁性粒子或玻璃粒子上移除。本發明的免疫測定法可以是(例如)競爭性結合測定法。在競爭性結合測定法中， 樣品中的抗原與標記抗原競爭與抗體結合。然后測量與抗體位點結合的標記抗原的量。在 該方法中，響應將與未知的抗原濃度成反比例。這是因為響應越大，樣品中越少抗原可用于 與標記抗原競爭。競爭性免疫測定法的例子是放射性免疫測定法(RIA)。本發明的免疫測定法可以是(例如)酶聯免疫吸附測定法(ELISA)。在ELISA中， 未知量的抗原被固定至表面，然后在表面上用特異性抗體沖刷從而其可結合至該抗原。將 該抗體與酶連接，并且在最后的步驟中添加物質，可將酶轉化為某些可檢測的信號并且可 測量樣品中抗原的量。進行ELISA涉及至少一種對特定抗原具有特異性的抗體。使具有未 知量抗原的樣品非特異性地(通過吸附至表面)或特異性地(在“夾心”ELISA中，通過由 對相同抗原具有特異性的另一抗體進行捕獲)固定至固相載體(例如，聚苯乙烯微量滴定 板)。在固定抗原后，加入檢測抗體，與所述抗原形成復合物。可將該檢測抗體共價連接至 酶，或該檢測抗體可自身用通過生物綴合連接至酶的二抗檢測。在各步之間，通常用溫和去 垢劑溶液洗滌所述板，以除去未特異性結合的任何蛋白質或抗體。在最終的洗滌步驟后，通 過添加酶底物對所述板進行顯影以產生可見信號，所述可見信號可指示樣品中抗原的量。 ELISA可利用生色底物、發光底物或熒光生成底物。本發明的免疫測定法可以是夾心測定法。在夾心測定法中，被分析物“夾在”兩種 結合所述靶標被分析物上的不同抗原表位的抗體之間。一種抗體用作捕獲抗體，而第二抗體則用作檢測抗體。可將捕獲抗體包被至固相(例如管或孔)，并且可使檢測抗體帶可檢測 標記。本發明的免疫測定法可以是(例如)免疫色譜橫流測定法(在本文中也稱為橫流 測定法、橫流測試法或免疫色譜試紙條測試法)。橫流測定法使用簡單的裝置來快速檢測 樣品中靶標被分析物的存在(或不存在)。通常將這些檢測法用于醫學診斷，或用于家庭 檢測、即時檢測或用于實驗室用途。橫流測試通常制備成試紙條形式，橫流測試是其中測試 樣品(其可以懸浮于水溶液中)通過朝向吸收墊的毛細或芯吸作用流過多孔基材(例如硝 酸纖維素膜)。將樣品施加于該基材后，其可遇到有色試劑(例如金或膠乳粒子)，該有色 試劑與樣品混合并與樣品中可能存在的被分析物結合。該混合物通過該基材，遇到已經過 預先處理而使能結合被分析物的抗體固定的線或帶。如果被分析物存在于樣品中，則有色 試劑可在檢測線或檢測帶處結合。在可供選擇的實施例中，可將橫流測定法用于檢測存在 于樣品中的特異性抗體。在那些實施例中，有色試劑可以是抗原包被的粒子并且可以用抗 原預先處理檢測線或檢測帶。參見(例如)美國專利申請No. 5，753，517、No. 6，485，982、 No. 6，509, 196、No. 7，189，522 或 No. RE39664、美國專利申請 2006/0275920 或 Jeong 等人， 2003，korean JBiol Sci ；7 :89_92)。還包括在本發明中的是檢測方法，在該檢測方法中將一種或多種本文所述的抗體 用于使樣品中可能存在的艱難梭菌芽孢結合至基材，然后通過多種手段中的任一種檢測和 /或定量芽孢的存在。芽孢的存在可通過(例如)顯微鏡法、培養、酶活性抗體結合(例如， 像在ELISA測定法中一樣)、鈣分子熒光或發光或鑭系元素金屬介導的發光。批啶二羧酸與 鈣離子的1 1復合物在細菌芽孢中以高濃度存在，并且還未在任何其他生活形式中觀察 到。鑭系元素金屬(鋱或銪)會與樣品中的任何細菌芽孢中存在的吡啶二羧酸(DPA)結合 而產生鑭系金屬鹽螯合物(lanthanate chelate)，例如吡啶二羧酸鋱或銪。這種鑭系金屬 鹽螯合物具有截然不同的吸收和發射光譜，可用光致發光測試法檢測該吸收和發射光譜。 還可將鑭系元素金屬介導的發光在本文所述的多種免疫測定方法中的任一種中(例如在 橫流測定法中)用作檢測信號。芽孢萌發后，釋放Ca-DPA，可以通過多種手段檢測鈣。利用 分子熒光或發光來感測的鈣熒光檢測可提供高靈敏性。鈣指示染料可分為兩組第一組是 在存在鈣的情況下增加其熒光的染料，而第二組是在存在鈣的情況下具有的激發和/或發 射波長與在不存在鈣的情況下其具有的激發和/或發射波長不同的染料。鈣指示劑染料鈣 綠-1、鈣綠-2和Fluo-4代表了在存在鈣離子(Ca2+)的情況下增加其熒光而不改變波長的 染料。Fura-2和Indo-I是可按比例計算的Ca2+指示劑，通常認為它們在大多數實驗中可互 換。Fura-2 —旦結合Ca2+，即表現出其吸收峰或激發峰從338nm變為366nm。而Indo-I則在 存在鈣的情況下發射峰從485nm變為405nm。鈣還可以用鈣激活發光蛋白(例如水母發光蛋 白和obelin)來檢測。由于不需要用外部照射激發生物發光的發射，所以所產生的信號基 本上沒有背景。這使得檢測極限處于極其低的水平，使這些發光蛋白成為用于分析應用的 引人注目的標簽。還可將鈣介導的信號傳導在本文所述的多種免疫測定方法中的任一種中 (例如在橫流測定法中)用作檢測信號。這種方法以及本文所述的其他方法也使得能定量 樣品中存在的芽孢。參見(例如)美國專利No. 5，876，960 ；No. 6，498，041 ；No. 6，815，178 ； 和 No. 7，306，942、美國專利系列號 2003/0138876 ；2004/0014154 ；和 2005/0136508 ；以及 Ponce, 2003, NASA Tech Brief ；27 (3)第 i_ii，l_3 頁。
對于本發明的檢測方法，可以使用一種或多種抗體，包括一種或多種本文所述 的與艱難梭菌芽孢結合的抗體。此外，可以使用一種或多種具有已知特異性的額外抗 體，例如可以使用一種或多種與艱難梭菌營養細胞結合的、與不同的細菌物種(例如 C. Clostridium或枯草芽孢桿菌)的營養細胞結合的或與不同細菌物種的芽孢(例如 C. Clostridium或枯草芽孢桿菌的芽孢)結合的抗體。樣品可從各種各樣的來源獲得，包括(但不限于)環境或食物樣品以及醫學或獸 醫學樣品。環境樣品的例子包括(但不限于)水樣品、土壤樣品、植物樣品和空氣樣品。食 物的例子包括(但不限于)肉類、家禽、蛋、魚、海鮮、蔬菜、水果、預加工食品(如湯、調味 汁、糊)、谷物產品(如面粉、谷類食物、面包)、罐裝食物、奶、其他乳制品(如奶酪、酸奶、酸 奶油)、脂肪、油類、甜點、調味品、香料、干面食、飲料、水、動物飼料。醫學或獸醫學樣品包 括(但不限于)臨床樣品、細胞溶解物、全血或其部分(如血清)、其他體液或分泌物(如 唾液、痰、汗液、皮脂、尿液、腦脊液)、糞便、細胞、組織、器官、活組織檢查以及不同類型的拭 子。樣品可以從傳染體獲得。術語“傳染體”通常用于表示能夠攜帶和/或傳播傳染性 有機體的無生命物體或基質。傳染體起到將傳染物例如艱難梭菌在人之間傳播的作用。傳 染體可包括(但不限于)布、拖把頭、毛巾、海綿、抹布、餐具、硬幣、紙幣、手機、衣物(包括 鞋子)、門把手、女性用品、尿布等以及它們的部分或它們的組合。就醫學方面而論，有很多 傳染體的例子；在使用之間沒有進行正確消毒的諸如喉鏡之類的器具、臟的毛巾、餐具和諸 如地板、壁或桌子之類的表面全部可起到傳播疾病的作用。所關注的表面可包括多種表面 的至少一部分，包括(但不限于)壁(包括門)、地板、天花板、排水管、制冷系統、管道(如 風道)、通風孔、馬桶座圈、手柄、門把手、扶手、床欄桿(如醫院中的床欄桿)、工作臺面、桌 面、餐具表面(如盤、器皿等)、工作表面、設備表面、衣服等以及它們的組合。樣品可以是液體、固體或半固體。樣品可以是來自固體表面的拭子。可將樣品直 接用于本發明的檢測方法而無需準備或稀釋。例如，也直接測定液體樣品。可將樣品稀釋 或懸浮于溶液中，溶液可包括(但不限于)緩沖溶液或細菌培養基。可將為固體或半固體 的樣品通過將固體在液體中切碎、混合或浸軟而懸浮于液體中。可對樣品進行進一步濃縮 或富集。本發明的免疫測定法可包括多種合適的對照樣品。例如，可對不含有細菌的芽孢、 細胞或毒素的陰性對照樣品或含有細菌的細胞、芽孢或毒素的陽性對照樣品進行測定。本 發明的免疫測定法可能耗費短至數分鐘的時間來顯影，并且可能需要極少或不需要樣品或 試劑準備。本發明的免疫測定法可以定性或定量的方式進行。定性結果可為樣品提供簡單 的陽性或陰性結果。陽性或陰性之間的截止值通過分析者確定并且可以是統計值。通常將 標準偏差的兩倍或三倍值用于區分陽性和陰性結果。在定量形式中，可將結果內插進標準 曲線中，該標準曲線通常是靶標的系列稀釋度。通過下列實例示出本發明。應當理解，具體的實例、材料、量及方法應根據本發明 的范圍和精神進行廣義地解釋。SM實例1艱難梭菌芽孢的生成
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用艱難梭菌(ATCC No. 700792，美國典型培養物保藏中心，Manassas, VA)對一 管腦心浸出液肉湯(BHI)進行接種，并在厭氧條件下于35-37°C孵育二十四小時。孵育后， 將該肉體培養物的一毫升(mL)等分試樣轉移至最少四個裝有BHI肉湯的管中，然后在厭氧 條件下于35-37°C孵育十二小時。將該肉湯培養物以10，000轉/分鐘(rpm)離心10分鐘 (min)，將細胞沉淀物再懸浮于IOML無水乙醇中室溫下持續1小時以殺死營養細胞。一小 時后，將該懸浮液以10，000RPM離心10分鐘，用無菌Butterfield緩沖液洗滌細胞沉淀物 至少兩次。將沉淀物再懸浮于無菌Butterfield緩沖液中，通過將系列稀釋物涂布于厭氧 血瓊脂上來確定每毫升的芽孢數目。將再懸浮的芽孢用于如下實例中，既在針對滅活芽孢 的多克隆抗體的產生中用作免疫原又在測定抗芽孢抗體的結合特異性的ELISA測定法中 用作抗原靶標。實例2舌·纏·白姊■秘白妒Φ將濃度為約IO6個芽孢/mL的艱難梭菌芽孢用5%福爾馬林處理10分鐘以滅活芽 孢。用無菌Butterfield緩沖液將該滅活的芽孢洗滌兩次，然后再懸浮于無菌Butterfield 緩沖液中。使用標準方法在兔中產生針對該滅活芽孢的多克隆抗體(Antagene，Inc, Mountain View, CA) 0簡而言之，將新西蘭白兔(兩只兔個體)每次免疫用IXlOfVmL當量 的滅活芽孢進行免疫。將免疫原用無菌鹽水稀釋至ImL并與ImL合適佐劑合并。將抗原和 佐劑混合而形成穩定的乳狀液，皮下注射該乳狀液。在第一天用完全弗氏佐劑(CFA)中的 抗原對兔進行免疫，然后在第20、40、60天進行免疫，用完全弗氏佐劑(CFA)中的抗原進行 所有的后續注射。在最后一次免疫十天后，從兔收集血液，讓其在37°C下凝結收縮過夜。將該凝結 的血液冷凍24，輕輕倒出血清并通過以2500rpm離心20分鐘使其澄清。通過ELISA用滅 活芽孢對免疫前血清和免疫血清進行測試。對于ELISA方法，將滅活的艱難梭菌芽孢在包 被緩沖液(0. IM碳酸氫鹽緩沖液，每升無菌蒸餾水1. 59克(g) Na2CO3和2. 93g NaHCO3, pH 9. 6)中稀釋至IO5個芽孢/毫升(mL)。將100微升(μ L)芽孢溶液加至ELISA板(ELISA Enhanced Surface plate,BD Falcon,Franklin Lakes,NJ)的孑L中。向對照孑UJ口人 100 μ L 包被緩沖液。用PARAFILM包裹ELISA板，在4°C下孵育15至16小時。將板倒空，用洗滌 緩沖液(具有0. 05% Tween20的磷酸鹽緩沖鹽水)洗滌三次。用100 μ L封閉緩沖液(PBS 中的BSA或0.05% Tween-20)將板在室溫下伴隨搖動封閉兩小時。將板倒空，用洗滌 緩沖液洗滌三次，用IOOyL封閉緩沖液中的一抗在室溫下伴隨搖動孵育一至兩小時。將板 倒空，用洗滌緩沖液洗滌三次，用100 μ L帶HRP標簽的二抗(山羊抗兔抗體HRP綴合物； 1 10，000稀釋液，？化1~(^，1 0(31^(^(1，IL)在室溫下伴隨搖動孵育一小時。將板倒空，用 洗滌緩沖液洗滌四次。將50 μ L底物溶液(1-step Ultra TMB, Pierce, Rockford，IL)加 至每孔，在室溫下伴隨搖動孵育15至30分鐘。通過添加50 μ L終止溶液(1. 5Μ磷酸)終 ltH色，用 SpectraMax plus 384 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)在 450nm 處i賣取每 個板的吸光度。將吸光度進行比較以確定針對靶標的信號的增強倍數。免疫血清顯示了對 滅活芽孢的良好響應，大約是用免疫前血清所獲得的響應的13至15倍(表1)。表1.對抗滅活的艱難梭菌芽孢所產生的抗血清的表征
權利要求
一種分離的抗體，其與艱難梭菌(Clostridium difficile)芽孢結合。
2.根據權利要求1所述的分離的抗體，其中所述芽孢是未萌發的芽孢。
3.根據權利要求1所述的分離的抗體，其中所述芽孢是萌發的芽孢。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的抗體，其中所述抗體不與艱難梭菌營養細胞結I=I O
5.根據權利要求1至3中任一項所述的分離的抗體，其中所述分離的抗體不與艱難梭菌毒素結合。
6.一種分離的抗體，其與艱難梭菌菌株630的具有SEQ ID NO :1的假定蛋白CD1021或 假定蛋白⑶1021的片段結合。
7.根據權利要求6所述的分離的抗體，其中所述分離的抗體與假定蛋白CD1021的包含 氨基酸殘基505至604的片段結合。
8.一種分離的抗體，其與氨基酸序列SEQ ID N0:2結合。
9.根據權利要求6所述的分離的抗體，其中所述分離的抗體與假定蛋白CD1021的包含 氨基酸殘基30至120的片段結合。
10.一種分離的抗體，其與氨基酸序列SEQ ID N0:9結合。
11.根據權利要求6所述的分離的抗體，其中所述分離的抗體與假定蛋白CD1021的包 含氨基酸殘基194至293的片段結合。
12.—種分離的抗體，其與氨基酸序列SEQ ID N0:10結合。
13.根據權利要求6所述的分離的抗體，其中所述分離的抗體與假定蛋白CD1021的包 含氨基酸殘基203至217的片段結合。
14.根據權利要求6所述的分離的抗體，其中所述分離的抗體與假定蛋白CD1021的包 含氨基酸殘基333至347的片段結合。
15.一種分離的抗體，其與氨基酸序列EGSSLQYKGDDPESY(SEQ ID NO 3)結合。
16.一種分離的抗體，其與氨基酸序列LKNETYKTKYHKYLE(SEQ ID NO 4)結合。
17.一種分離的抗體，其與艱難梭菌菌株630的具有SEQ ID NO :5的推定的N-乙酰基 胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白或所述推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的片 段結合。
18.根據權利要求17所述的分離的抗體，其中所述分離的抗體與所述推定的N-乙酰基 胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的包含氨基酸殘基294至393的片段結合。
19.一種分離的抗體，其與氨基酸序列SEQ ID N0:6結合。
20.根據權利要求17所述的分離的抗體，其中所述分離的抗體與所述推定的N-乙酰基 胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的包含氨基酸殘基582至596的片段結合。
21.根據權利要求17所述的分離的抗體，其中所述分離的抗體與所述推定的N-乙酰基 胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的包含氨基酸殘基64至78的片段結合。
22.—種分離的抗體，其與氨基酸序列YKLKDKNGGTTKTVA(SEQ ID NO 7)結合。
23.一種分離的抗體，其與氨基酸序列KFKEKPDADSIKLKY(SEQ ID NO 8)結合。
24.根據權利要求1至23中任一項所述的分離的抗體，其中所述分離的抗體是多克隆 抗體。
25.根據權利要求1至23中任一項所述的分離的抗體，其中所述分離的抗體是單克隆2抗體。
26.一種單克隆抗體或其抗原結合片段，其中所述單克隆抗體或抗原結合片段抑制根 據權利要求25所述的單克隆抗體與其抗原靶標的結合。
27.根據權利要求1至26中任一項所述的分離的抗體，其中所述分離的抗體不與枯草 芽孢桿菌(Bacillus subtilis)芽孢或產孢梭菌(Clostridium sporogenes)芽孢結合。
28.根據權利要求1至27中任一項所述的分離的抗體的抗原結合片段。
29.根據權利要求1至27中任一項所述的分離的抗體或根據權利要求28所述的抗原 結合片段，其中將所述分離的抗體或抗原結合片段進行了標記。
30.一種組合物，包含一種或多種根據權利要求1至29所述的分離的抗體。
31.一種試劑盒，包含一種或多種根據權利要求1至29所述的分離的抗體。
32.—種雜交瘤細胞系或轉化的B細胞系，其產生根據權利要求25或權利要求26所述 的單克隆抗體。
33.一種分離的多核苷酸序列，包含編碼根據權利要求25或權利要求26所述的單克隆 抗體的重鏈、輕鏈、重鏈可變區、輕鏈可變區或一個或多個互補決定區的核酸序列。
34.一種表達載體，包含根據權利要求33所述的分離的多核苷酸序列。
35.一種宿主細胞，包含根據權利要求34所述的表達載體。
36.一種制備抗艱難梭菌抗體的方法，所述方法包括用包含艱難梭菌基因組所編碼的 蛋白質的至少一部分的多肽，對宿主生物體以可有效產生響應所述多肽的抗體的量進行免疫。
37.根據權利要求36所述的方法，其中所述包含艱難梭菌基因組所編碼的蛋白質的至 少一部分的多Jft選自 SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO: 5,SEQ ID N0:6、SEQ IDNO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO : 10 以及它們的片段。
38.一種制備抗艱難梭菌抗體的方法，所述方法包括使編碼由艱難梭菌基因組編碼的蛋白質的至少一部分的核酸序列在免疫活性宿主生 物體中表達。
39.根據權利要求38所述的方法，所述編碼由艱難梭菌基因組編碼的蛋白質的至少一 部分的核酸序列編碼選自 SEQ ID NO =USEQ IDNO :2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO 10 以及它們的片段的氨基酸序列。
40.根據權利要求36至39中任一項所述的方法，還包括純化所述抗體制備物。
41.一種組合物，包含至少兩種分離的抗體或它們的抗原結合片段，其中每種分離的抗 體與艱難梭菌芽孢的獨特抗原表位結合。
42.根據權利要求41所述的組合物，其中至少一種分離的抗體或其抗原結合片段與艱 難梭菌菌株630的具有SEQ ID NO :1的假定蛋白⑶1021或與假定蛋白⑶1021的多肽片段纟口口。
43.根據權利要求41所述的組合物，其中至少一種分離的抗體或其抗原結合片段與艱 難梭菌菌株630的具有SEQ ID NO 5的推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白或 所述推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的片段結合。
44.根據權利要求41所述的組合物，其中第一種分離的抗體或其抗原結合片段與艱難梭菌菌株630的具有SEQ ID NO :1的假定蛋白⑶1021或假定蛋白⑶1021的多肽片段結 合，并且其中第二種分離的抗體或其抗原結合片段與艱難梭菌菌株630的具有SEQ ID NO 5的推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白或所述推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙 氨酸酰胺酶蛋白的片段結合。
45.根據權利要求42或權利要求43所述的組合物，其中所述假定蛋白CD1021的所述 多月太片段選自 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ IDNO :4、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10 以及 它們的片段。
46.根據權利要求43或權利要求45所述的組合物，其中所述推定的N-乙酰基胞壁 酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的所述多肽片段選自SEQ IDNO 6,SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8以 及它們的片段。
47.一種試劑盒，包含至少兩種分離的抗體或它們的抗原結合片段，其中每種分離的抗 體與艱難梭菌芽孢的獨特抗原表位結合。
48.根據權利要求47所述的試劑盒，其中至少一種分離的抗體或其抗原結合片段與艱 難梭菌菌株630的具有SEQ ID NO :1的假定蛋白⑶1021或假定蛋白⑶1021的多肽片段結口 O
49.根據權利要求47所述的試劑盒，其中至少一種分離的抗體或其抗原結合片段與艱 難梭菌菌株630的具有SEQ ID NO 5的推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白或 所述推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的片段結合。
50.根據權利要求47所述的試劑盒，其中第一種分離的抗體或其抗原結合片段與艱難 梭菌菌株630的具有SEQ ID NO :1的假定蛋白⑶1021或假定蛋白⑶1021的多肽片段結 合，并且其中第二種分離的抗體或其抗原結合片段與艱難梭菌菌株630的具有SEQ ID NO 5的推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白或所述推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙 氨酸酰胺酶蛋白的片段結合。
51.根據權利要求48或權利要求50所述的試劑盒，其中所述假定蛋白CD1021的所述 多月太片段選自 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ IDNO :4、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10 以及 它們的片段。
52.根據權利要求49或權利要求50所述的試劑盒，其中所述推定的N-乙酰基胞壁 酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的所述多肽片段選自SEQ IDNO 6,SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8以 及它們的片段。
53.一種檢測樣品中艱難梭菌芽孢的存在的方法，所述方法包括使所述樣品與根據權 利要求1至29中任一項所述的分離的抗體接觸。
54.一種檢測樣品中艱難梭菌芽孢的存在的方法，所述方法包括使所述樣品與至少兩 種分離的抗體或它們的抗原結合片段接觸，其中每種分離的抗體與所述艱難梭菌芽孢的獨 特抗原表位結合。
55.一種檢測樣品中艱難梭菌芽孢的存在的方法，所述方法包括使所述樣品與第一種分離的抗體或其抗原結合片段接觸，其中所述第一種分離的抗體 與所述艱難梭菌芽孢的第一抗原表位結合；以及使所述樣品與第二種分離的抗體或其抗原結合片段接觸，其中所述第二種分離的抗體 與所述艱難梭菌芽孢的第二抗原表位結合。
56.根據權利要求54或55所述的方法，其中至少一種分離的抗體或其抗原結合片段與 艱難梭菌菌株630的具有SEQ ID NO 1的假定蛋白⑶1021或與假定蛋白⑶1021的多肽片段結合。
57.根據權利要求54或55所述的方法，其中至少一種分離的抗體或其抗原結合片段與 艱難梭菌菌株630的具有SEQ ID NO 5的推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白 或所述推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白的片段結合。
58.根據權利要求54或55所述的方法，其中第一種分離的抗體或其抗原結合片段與艱 難梭菌菌株630的具有SEQ ID NO :1的假定蛋白⑶1021或假定蛋白⑶1021的多肽片段結 合，并且其中第二種分離的抗體或其抗原結合片段與艱難梭菌菌株630的具有SEQ ID NO 5的推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶蛋白或所述推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙 氨酸酰胺酶蛋白的片段結合。
59.根據權利要求56或58所述的方法，其中所述假定蛋白CD1021的所述多肽片段選 自 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQID NO :9、SEQ ID NO 10 以及它們的片 段。
60.根據權利要求57或58所述的方法，其中所述推定的N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸 酰胺酶蛋白的所述多肽片段選自SEQ ID NO :6、SEQ IDNO :7、SEQ ID NO 8以及它們的片段。
全文摘要
本發明提供了與細菌艱難梭菌的內生孢子結合的抗體、制備這種抗體的方法以及使用這種抗體的方法，包括檢測艱難梭菌內生孢子的方法。
文檔編號C07H21/04GK101980723SQ200980111355
公開日2011年2月23日 申請日期2009年2月25日 優先權日2008年2月28日
發明者拉伊·拉賈戈帕爾, 魏愛平 申請人:3M創新有限公司