包含結合her2結構域ii的抗體及其酸性變體的組合物的制作方法

專利名稱：包含結合her2結構域ii的抗體及其酸性變體的組合物的制作方法
技術領域：
本發明關注包含結合HER2結構域II的主要種類HER2抗體及其酸性變體的組合 物。本發明還涉及包含所述組合物的藥物配制劑及所述組合物的治療用途。
背景技術：
HER2 抗體受體酪氨酸激酶的HER家族是細胞生長、分化和存活的重要介質。該受體家族 包括四個獨特的成員表皮生長因子受體(EGFR、ErbBl或HER1)、HER2 (ErbB2或pl85neu)、 HER3(ErbB3)和 HER4(ErbB4 或 tyro2)。由erbBl基因編碼的EGFR已被認為是人類惡性腫瘤的病因。具體而言，在乳 癌、膀胱癌、肺癌、頭癌、頸癌和胃癌以及成膠質細胞瘤中已經觀察到EGFR表達的升高。 EGFR受體表達的升高常常與EGFR配體，轉化生長因子α (TGF-α )的產量增加有關，這 樣的腫瘤細胞通過自分泌刺激途徑導致受體活化。Baselga and Mendelsohn, Pharmac. Ther. 64 :127-154(1994)。針對EGFR或其配體TGF-α或EGF的單克隆抗體已經作為治療 此類惡性腫瘤的治療劑進行了評估。參見例如Baselga and Mendelsohn，見上文；Masui et al. , Cancer Research 44:1002—1007(1984);及 Wu et al. , J. Clin. Invest. 95 1897-1905(1995)。HER家族的第二個成員pl85neu最初被鑒定成轉化基因的產物，來自經化學處理 的大鼠的成神經細胞瘤。neu原癌基因的活化形式產生自所編碼蛋白質跨膜區中的點突 變(纈氨酸變成谷氨酸)。在乳癌和卵巢癌中觀察到neu的人同系物的擴增，而且這與預 后不良有關(Slamon et al, Science 235 :177_182 (1987) ；Slamon et al. , Science 244 707-712(1989)；及美國專利4，968，603)。迄今為止，對于人類腫瘤尚無neu原癌基因中 與之類似的點突變的報道。在其它癌瘤中也已觀察到HER2的過表達(頻繁但不均一，原 因在于基因擴增)，包括胃、子宮內膜、唾液腺、肺、腎、結腸、甲狀腺、胰和膀胱的癌瘤。參 見 King et al.，Science 229 974(1985) ；Yokota et al.，Lancet 1 :765_767(1986)； Fukushige et al. , Mol.Cell Biol. 6 :955_958(1986) ；Guerin et al. , Oncogene Res. 3 21-31 (1988) ；Cohen et al. , Oncogene 4 81~88 (1989) ；Yonemura et al. , Cancer Res.51 1034 (1991) ；Borst et al. , Gynecol. Oncol. 38 364(1990) ；Weinere et al., Cancer Res. 50 :421_425(1990) ；Kern et al. ,Cancer Res. 50 5184(1990) ；Park et al.， Cancer Res. 49 6605(1989) ；Zhau et al.，Mol. Carcinog. 3 254-257(1990) ；Aasland et al. ,Br. J. Cancer 57:358-363(1988) ；Williams et al. ,Pathobiology 59 :46_52(1991)； 及 McCann et al. , Cancer 65 88-92(1990)等。HER2 可在前列腺癌中過表達(Gu et al.， Cancer Lett. 99 185—9(1996) ；Ross et al. , Hum. Pathol. 28 827-33(1997) ；Ross etal·，Cancer 79:2162-70(1997)；及 Sadasivan et al. , J. Urol. 150 126-31 (1993)) 已經描述了針對大鼠pl85neu和人HER2蛋白質產物的抗體。Drebin及其同 事制備了針對大鼠neu基因產物，pl85neu的抗體。參見例如Drebin et al. , Cell41 695-706(1985) ；Myers et al.，Meth. Enzym. 198 :277_290(1991)；及 W094/22478。Drebin et al.，Oncogene 2 :273_277 (1988)報道了與pl85neu的兩個獨特區域有反應性的抗體混 合物對植入裸鼠的neu轉化NIH-3T3細胞產生協同的抗腫瘤作用。還可參見1998年10月 20日發布的美國專利5，824，311。Hudziak et al. , Mol. Cell. Biol. 9(3) :1165_1172 (1989)描述了一組 HER2 抗體 的生成，并利用人乳房腫瘤細胞系SK-BR-3鑒定。通過72小時后單層細胞的結晶紫染色測 定了暴露于抗體后SK-BR-3細胞的相對細胞增殖。利用此測定法，用稱作4D5的抗體獲得 了最大抑制，它抑制細胞增殖達56%。該組其它抗體在此測定法中以較低程度降低細胞增 殖。還發現抗體4D5使過表達HER2的乳房腫瘤細胞系對TNF- α的細胞毒性作用變得敏感。 還可參見1997年10月14日發布的美國專利5，677，171。Hudziak等人的文章中討論的抗 體還在以下文獻中進行了鑒定Fendly et al.，Cancer Research 50 1550-1558 (1990)； Kotts et al., In Vitro 26(3) :59A(1990) ；Sarup et al. , Growth Regulation 1 72-82(1991) ；Shepard et al. , J. Clin. Immunol. 11(3) 117-127 (1991) ；Kumar etal., Mol.Cell. Biol. 11(2) :979_986(1991) ；Lewis et al. , Cancer Immunol. Immunother. 37 255-263(1993) ；Pietras et al. , Oncogene 9 1829-1838 (1994) ；Vitetta et al., Cancer Research 54 5301-5309(1994) ；Sliwkowski et al. , J. Biol.Chem. 269(20) 14661-14665(1994) ；Scott et al. , J.Biol. Chem. 266 14300-5(1991) ；D ‘ souza et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. 91 :7202_7206(1994) ；Lewis et al. , Cancer Research 56 1457-1465(1996)；及 Schaefer et al.，Oncogene 15:1385-1394(1997)。鼠 HER2 抗體 4D5 的重組人源化型式(huMAb4D5_8、rhuMAb HER2、Trastuzumab
或HERCEPTIN ;美國專利5，821，337)在臨床上對患有HER2過表達的轉移性乳
癌并已接受廣泛的早期抗癌療法的患者起作用(Baselga et al. , J. Clin. Oncol. 14 737-744(1996))。Trastuzumab在1998年9月25日得到了食品和藥品管理局的銷售許可， 可用于治療所患腫瘤過表達HER2蛋白質的轉移性乳癌患者。以下文獻中描述了具有各種特性的其它HER2抗體Tagliabue et al. , Int. J.Cancer 47 933-937(1991) ；McKenzie et al., Oncogene 4 543-548(1989) ；Maier et al. , Cancer Res. 51 :5361_5369(1991) ；Bacus et al. , Molecular Carcinogenesis 3 350-362(1990) ；Stancovski et al.，PNAS(USA)88 :8691_8695 (1991) ；Bacus et al.， Cancer Research 52:2580-2589(1992) ；Xu et al.，Int. J. Cancer 53:401-408(1993)； W094/00136 ；Kasprzyk et al. ,Cancer Research 52 :2771_2776(1992) ；Hancock et al.， Cancer Res. 51 :4575_4580(1991) ；Shawver et al. , Cancer Res. 54 1367-1373 (1994)； Arteaga et al. , Cancer Res. 54 :3758_3765(1994) ；Harwerth et al. , J.Biol. Chem. 267 15160-15167 (1992)；美國專利 5，783，186 ；及 Klapper et al.，Oncogene 14 2099-2109(1997)。同源性篩選使得HER受體家族的兩個其它成員得以鑒定HER3(美國專利 5，183，884 和 5，480，968 以及 Kraus et al. , PNrAS (USA) 86 :9193_9197 (1989))和 HER4(歐洲專利申請 599，274 ；Plowman et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 1746-1750 (1993)； 及Plowman et al.，Nature 366:473-475(1993))。這兩種受體均在至少有些乳癌細胞系
中顯示表達升高。通常發現HER受體在細胞中有多種組合，而且認為它的二聚化增加了對各種 HER 配體的細胞應答的多樣性(Earp etal. , Breast Cancer Research and Treatment 35 :115-132(1995))。EGFR受到6種不同配體的結合表皮生長因子(EGF)、轉化生 長因子α (TGF-α)、雙調蛋白、肝素結合表皮生長因子(HB-EGF)、betacellulin和 epiregulin(Groenen et al. , Growth Factors 11:235—257(1994))。由單一基因的可 變剪接產生的一個調蛋白蛋白質家族是HER3和HER4的配體。調蛋白家族包括α、β 和 Y 調蛋白(Holmes et al.，Science 256 1205-1210 (1992)；美國專利 5，641，869 ；及 Schaefer et al.，Oncogene 15:1385-1394(1997)) ；neu 分化因子(NDF)；神經膠質生長 因子(GGF)；乙酰膽堿受體誘導活性(ARIA)；及感覺和運動神經元衍生因子(SMDF)。有關 綜述參見 Groenen et al. , Growth Factors 11:235-257(1994) ；Lemke，G，Molec. & Cell. Neurosci. 7 247-262 (1996)；及 Lee et al.，Pharm. Rev. 47 :51_85 (1995)。最近還鑒定了 另外三種HER配體神經調節蛋白-2 (NRG-2)，據報道它結合HER3或HER4 (Chang et al.， Nature 387:509-512(1997)；及 Carraway et al. , Nature 387:512-516(1997))；神經調 節蛋白-3，它結合 HER4 (Zhang et al.，PNAS (USA) 94 (18) :9562_7 (1997))；和神經調節蛋 白-4，它結合HER4(Harari et al. ,Oncogene 18 :2681_89 (1999))。HB_EGF、betacellulin 和印iregulin也結合HER4。盡管EGF和TGF α不結合HER2，但是EGF刺激EGFR和HER2形成異二聚體，它活化 EGFR并導致異二聚體中HER2的轉磷酸作用。二聚化作用和/或轉磷酸作用看來活化HER2 酪氨酸激酶。參見Earp et al.，見上文。同樣，當HER3與HER2共表達時，形成有活性的信號 復合物，而針對HER2的抗體能破壞此復合物(Sliwkowski et al. , J. Biol. Chem. 269(20) 14661-14665(1994))。此外，在與HER2共表達時，HER3對調蛋白(HRG)的親和力提高到 了較高的親和力狀態。關于HER2-HER3蛋白質復合物還可參見Levi et al.，Journal of Neuroscience 15 1329-1340(1995) ；Morrissey et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 1431-1435(1995)；及 Lewis et al.，Cancer Res. 56 1457-1465(1996)。HER4，與 HER3 類 似，與 HER2 形成有活性的信號復合物(Carraway and Cantley，Cell 78:5-8(1994))。為了靶向HER信號途徑，將rhuMAb 2C4 (Pertuzumab)開發成抑制HER2與其它HER 受體二聚化的人源化抗體，從而抑制配體驅動的磷酸化作用和活化作用，及RAS和AKT途徑 的下游激活。在Pertuzumab作為治療實體瘤的單一藥劑的I期試驗中，用Pertuzumab治 療患有晚期卵巢癌的3名受試者。一人具有持久的部分響應，而另一名受試者疾病穩定了 15 周。Agus et al. Proc AmSoc Clin Oncol 22 :192，Abstract 771 (2003)。抗體變體組合物美國專利6，339，142描述了包含抗HER2抗體及其一種或多種酸性變體的混合物 的HER2抗體組合物，其中所述酸性變體的量少于約25%。Trastuzumab是例示性的HER2 抗體。Reid等人在充分表征的生物技術藥物會議(Well Characterized Biotech Pharmaceuticals Conference) (2003 年 1 月)上呈現的海 艮"Effects of Cell CultureProcess Changes on Humanized Antibody Characteristics，，描述了一禾中未命名的人源化 IgGl抗體組合物，它由于其重鏈上VHS信號肽、N-末端谷氨酰胺和焦谷氨酸的組合而具有 N-末端異質性。Harris 等人在 IBC 抗體生成會議(IBC Antibody Production Conference) (2002 ^ 2 B) 故白勺 舌“The Ideal Chromatographic Antibody Characterization Method”報告了人源化抗IgE抗體E25的重鏈上的VHS延伸。Rouse 等人在 WCBP (2004 年 1 月 6-9 日)上所做的演講“‘Top Down'Glycoprotein Characterization by High Resolution Mass Spectrometry and Its Application to Biopharmaceutical Development”描述了一種單克隆抗體組合物，它由于其輕鏈上的lHS 或-2HS信號肽殘基而具有N-末端異質性。Jill Porter 在 IBC 會議(2OOO 年 9 月)上呈現的海報“Strategic Use of Comparability Studies and Assays for Well Characterized Biologicals，，i寸ife 了 ZENAPAX 的晚期洗脫形式，它在其重鏈上具有三個額外的氨基酸殘基。US2006/0018899記載了一種包含主要種類Pertuzumab抗體及Pertuzumab抗體的 氨基末端前導延伸變體以及其它變體形式的組合物。發明_既述依照第一個方面，本發明關注一種包含結合HER2結構域II的主要種類HER2抗體 及其酸性變體的組合物，其中所述酸性變體包括糖化變體(glycated variant)、二硫化物 還原變體(disulfide reduced variant)、或不可還原變體(non-reducible variant) 優 選的是，所述酸性變體包括糖化變體、脫酰胺變體(deamidated variant)、二硫化物還原變 體、唾液酰化變體(sialylated variant)、和不可還原變體。期望的是，所述酸性變體的量 少于約25%。在另一個方面，本發明提供一種包含主要種類HER2抗體及該主要種類抗體的酸 性變體的組合物，其中所述主要種類HER2抗體包含SEQ ID No. 3和4中的可變輕鏈和可變 重鏈，且其中所述酸性變體包括糖化變體、脫酰胺變體、二硫化物還原變體、唾液酰化變體、 和不可還原變體。本發明還關注在藥學可接受載體中包含所述組合物的藥物配制劑。另外，本發明涉及一種治療患者中HER2陽性癌癥的方法，包括以有效治療所述癌 癥的量對所述患者施用所述藥物配制劑。就此類方法而言，如本文實施例中所證明的，優選 的是，所述主要種類抗體和酸性變體具有本質上相同的藥動學。在另一個方面，本發明關注一種制備藥物組合物的方法，包括(1)制備包含結 合HER2結構域II的主要種類HER2抗體及其酸性變體的組合物，所述酸性變體包括糖化 變體、二硫化物還原變體、或不可還原變體，并(2)評估所述組合物中的所述酸性變體，并 確定其量少于約25%。在一個實施方案中，通過選自下組的方法來評估所述酸性變體離 子交換層析(其中所述組合物用唾液酸酶處理)；有十二烷基硫酸鈉的還原性毛細管電泳 (CE-SDS)；非還原性CE-SDS ；硼酸鹽層析；和肽作圖。附圖簡述

圖1提供了 HER2蛋白質結構的示意圖，及其胞外域的結構域I_IV的氨基酸序列 (分別是 SEQ ID No. 19-22)。
圖2A和2B描繪了鼠源單克隆抗體2C4的輕鏈可變區久)(圖2A)和重鏈可變區 (Vh)(圖2B)(分別是SEQ ID No. 1和2)；人源化2C4型式574的Vl和Vh結構域(分別是 SEQ ID No. 3和4)，及人八和Vh共有框架(hum κ 1，輕鏈κ亞組I ；hum III，重鏈亞組III) (分別是SEQ ID No. 5和6)的氨基酸序列對比。星號標示人源化2C4型式574和鼠源單 克隆抗體2C4之間或人源化2C4型式574和人框架之間的差異。互補決定區(OTR)在括號 中。圖 3A 和 3B 顯示了 Pertuzumab 輕鏈(SEQ ID No. 15)和重鏈(SEQ ID No. 16)的 氨基酸序列。⑶R以粗體顯示。碳水化合物模塊(moiety)附著于重鏈的Asn299。圖 4A 和 4B 顯示了 Pertuzumab 輕鏈(SEQ ID No. 17)和重鏈(SEQ ID No. 18)的 氨基酸序列，各自包含完整的氨基末端信號肽序列。圖5以圖描述了 2C4在HER2的異二聚體結合位點處的結合，由此阻止與活化的 EGFR或HER3的異二聚化。圖6描繪了 HER2/HER3與MAPK和Akt途徑的偶聯。圖 7 比較了 Trastuzumab 禾口 Pertuzumab 的活性。圖 8A 禾口 8B 顯示了 Trastuzumab 輕鏈(SEQ ID No. 13)和重鏈(SEQ ID No. 14)的
氨基酸序列。圖 9A 和 9B 描繪 了變體 Pertuzumab 輕鏈序列(SEQ ID No. 23)和變體 Pertuzumab 重鏈序列(SEQ ID No. 24)。圖10顯示了陽離子交換MP(主峰)和AV(酸性變體)的分離、細胞培養、回收、和 PK(藥動學)評估和分析測試的實驗設計。新鮮的培養基=標準培養基；用過的培養基= 細胞培養12天后的標準培養基，通過離心來除去細胞。不控制溶解氧、pH、和其它參數。圖11顯示了來自實施例1的典型DIONEX PR0PACJ陽離子交換(CEX)層析圖。圖12顯示了對Pertuzumab起始材料和CEX級分的分析。AV =酸性變體；MP =主 峰；而BV =堿性變體。圖13揭示了摻入細胞培養物并溫育12天的主峰(MP)的CEX。圖14描述了主峰溫育條件。圖15概述了用于表征酸性變體的方法。圖16顯示了實施例1中PK研究中的Pertuzumab濃度對時間的關系。圖17提供了來自實施例1中PK研究的曲線下面積(AUC)和幾何均值比。優選實施方案的詳述I.定義術語“主要種類抗體”在本文中指組合物中這樣的抗體氨基酸序列結構，它是該組 合物中在數量上占絕大多數的抗體分子。優選的是，主要種類抗體是HER2抗體，諸如結合 HER2結構域II的抗體、比Trastuzumab更有效地抑制HER 二聚化的抗體、和/或結合HER2 的異二聚體結合位點的抗體。本文中主要種類抗體的優選實施方案是包含SEQ ID No. 3和 4中的輕鏈和重鏈可變區氨基酸序列的抗體，且最優選包含SEQ ID No. 15和16中的輕鏈和 重鏈氨基酸序列(Pertuzumab)。“氨基酸序列變體”抗體在本文中指具有與主要種類抗體不同的氨基酸序列的抗 體。通常，氨基酸序列變體將與主要種類抗體具有至少約70%的同源性，而且優選的是，它們將是與主要種類抗體至少約80%，且更優選至少約90%同源。氨基酸序列變體在主要 種類抗體氨基酸序列內部或鄰近的某些位置具有替代、刪除和/或添加。本文中氨基酸序 列變體的例子包括酸性變體(如脫酰胺抗體變體)、堿性變體、在其一條或兩條輕鏈上具有 氨基末端前導延伸(如VHS-)的抗體、在其一條或兩條重鏈上具有C-末端賴氨酸殘基的抗 體、具有一個或多個氧化后甲硫氨酸殘基的抗體等，且包括重鏈和/或輕鏈氨基酸序列變 異的組合。“酸性變體”指比主要種類抗體更加酸性的主要種類抗體的變體。相對于主要種類 抗體，酸性變體已經獲得了負電荷或損失了正電荷。此類酸性變體可以使用依照電荷將蛋 白質分開的分離方法(諸如離子交換層析)來解析。在通過陽離子交換層析分離時，主要 種類抗體的酸性變體比主峰先洗脫。“二硫化物還原變體”有一個或多個形成二硫鍵的半胱氨酸被化學還原成游離硫 醇形式。這種變體可以通過疏水相互作用層析或通過分篩方法(諸如有十二烷基硫酸鈉的 毛細管電泳(CE-SDS))來監測，例如如實施例1中所描述的。在本文中，“不可還原變體”指不能通過還原劑(諸如二硫蘇糖醇)處理被化學還 原成重鏈和輕鏈的主要種類抗體變體。此類變體可以通過用還原劑處理組合物并使用評估 蛋白質大小的方法(諸如有十二烷基硫酸鈉的毛細管電泳(CE-SDS))評估所得組合物來評 估，例如使用下文實施例1中描述的技術。“糖基化變體(glycosylation variant) ”抗體在本文中指有一個或多個碳水化合 物模塊附著于它的抗體，所述碳水化合物與附著于主要種類抗體的一個或多個碳水化合物 模塊不同。本文中糖基化變體的例子包括有Gl或G2寡糖結構代替GO寡糖結構附著于其 Fc區的抗體、有一個或多個碳水化合物模塊附著于其一條或兩條輕鏈的抗體、沒有碳水化 合物模塊附著于其一條或兩條重鏈的抗體、唾液酸化的抗體等，以及這些糖基化改變的組
I=I ο若抗體具有Fc區，則本文中諸如圖14所示的寡糖結構可附著于抗體的一條或兩 條重鏈，如位于殘基299。對于Pertuzumab，GO是最主要的寡糖結構，而在Pertuzumab組 合物中發現其它寡糖結構，諸如GO-F、G-l、Man5、Man6、Gl-I、Gl (1-6)、Gl (1-3)和G2的量 較少。除非另有說明，“G1寡糖結構”在本文中包括Gl (1-6)和Gl (1_3)結構。為本文目的，“唾液酰化變體”指如下的主要種類抗體變體，其包含附著至其一條 或兩條重鏈的一個或多個唾液酰化碳水化合物模塊。唾液酰化變體可以通過在有或沒有唾 液酸酶處理的情況中評估組合物(例如通過離子交換層析)來鑒定，例如如實施例中所描 述的。“糖化變體”指共價附著有糖(諸如葡萄糖)的抗體。這種添加可以通過葡萄糖與 蛋白質上的賴氨酸殘基起反應(例如在細胞培養基)來發生。糖化變體可以通過對還原的 抗體的質譜術分析(評估重鏈或輕鏈質量的增加)來鑒定。糖化變體還可以通過硼酸鹽層 析來定量，如下文實施例1中所解釋的。糖化變體與糖基化變體不同。“脫酰胺”抗體指其中一個或多個天冬酰胺殘基衍生成例如天冬氨酸、琥珀酰亞胺 或異天冬氨酸的抗體。脫酰胺抗體的一個例子是Pertuzumab變體，其中Pertuzumab的一 條或兩條重鏈上的Asn-386和/或Asn-391是脫酰胺的。
“氨基末端前導延伸變體”在本文中指在主要種類抗體的任何一條或多條重鏈或 輕鏈的氨基末端處有一個或多個氨基酸殘基的氨基末端前導序列的主要種類抗體。例示性 的氨基末端前導延伸包含三個氨基酸殘基、VHS或由其組成，它們存在于抗體變體的一條或 所有兩條輕鏈上。“同源性”定義為在必要時對比序列和引入缺口以獲取最大百分比同一性后，氨基 酸序列變體中相同殘基的百分比。用于對比的方法和計算機程序在本領域是眾所周知的。 一種這樣的計算機程序是“Align 2”，由Genentech, Inc.創作，已經在1991年12月10日 與用戶文檔(user documentation) 一起提交給美國版權局(Washington，DC 20559)。為了本文的目的，“陽離子交換分析”指根據電荷差異利用陽離子交換劑將包含兩 種或多種化合物的組合物分開的任何方法。陽離子交換劑通常包含共價結合的，帶負電荷 的基團。優選的是，本文中的陽離子交換劑是弱陽離子交換劑和/或包含羧酸鹽/酯官能 團，諸如Dionex出售的PROPAC WCX-10 陽離子交換柱。"HER受體”是屬于HER受體家族的受體蛋白質酪氨酸激酶，包括EGFR、HER2、HER3 和HER4受體及未來將鑒定的此家族其它成員。HER受體通常將包含胞外結構域，它可結合 HER配體；親脂性跨膜結構域；保守的胞內酪氨酸激酶結構域；和含有幾個可被磷酸化的酪 氨酸殘基的羧基末端信號結構域。優選的是，HER受體是天然序列人HER受體。HER2的胞外域包含4個結構域結構域I (大約第1_195位氨基酸殘基)、結構 域II (大約第196-319位氨基酸殘基)、結構域III (大約第320-488位氨基酸殘基)和 結構域IV (大約第489-630位氨基酸殘基)(殘基編號不包括信號肽)。參見Garrett et al.，Mol. Cell. 11 :495_505(2003) ；Cho et al.，Nature 421 :756_760(2003) ；Franklin et al. , Cancer Cell 5:317-328(2004)；或 Plowman et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. 90 1746-1750(1993)。還可參見本文圖1。術語“ErbBl”、“HERl”、“表皮生長因子受體”和“EGFR”在本文中可互換使用，指例 如 Carpenter et al.，Ann. Rev. Biochem. 56 :881_914 (1987)中公開的 EGFR，包括其天然存 在的突變體形式(如Humphrey et al. , PNAS (USA) 87 =4207-4211 (1990)中的刪除突變體 EGFR)。erbBl指編碼EGFR蛋白質產物的基因。表述“ErbB2”和“HER2”在本文中可互換使用，指例如Semba et al.，PNAS (USA) 82 6497-6501(1985)和 Yamamoto et al. , Nature 319:230-234(1986)中描述的人 HER2 蛋 白(Genebank編號X03363)。術語“erbB2”指編碼人ErbB2的基因，而“neu”指編碼大鼠 Pl85neu的基因。優選的HER2是天然序列人HER2。“ErbB3” 禾口 “HER3” 指例如美國專利 5，183，884 和 5，480，968 及 Kraus et al.， PNAS (USA) 86 :9193_9197 (1989)中公開的受體多肽。術語“ErbB4”和“HER4”在本文中指例如歐洲專利申請599，274 ；Plowman et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 1746-1750(1993)；及 Plowman et al. , Nature 366 473-475(1993)中公開的受體多肽，包括其同種型(isoform)，例如1999年4月22日出版 的W099/19488中所公開的。“HER配體”指結合和/或活化HER受體的多肽。本文中特別感興趣的HER配 體是天然序列人HER配體，諸如表皮生長因子(EGF) (Savage et al.，J. Biol. Chem. 247 7612-7621 (1972))；轉化生長因子 α (TGF- α ) (Marquardt et al.，Science 223 1079-1082 (1984))；雙調蛋白，又稱為施旺細胞瘤(schwannoma)或角質形成細胞自 分泌生長因子(Shoyab et al.，Science 243 1074-1076(1989) ；Kimura et al.， Nature 348:257-260(1990);及 Cook et al. , Mol. Cell. Biol. 11 2547-2557 (1991))； betacellulin(Shing et al. , Science 259 1604-1607(1993)； 及 Sasada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 190 1173(1993))；肝素結合表皮生長因子(HB-EGF) (Higashiyama et al. , Science 251:936-939 (1991)) ；epiregulin(Toyoda et al. , J. Biol. Chem. 270 7495-7500 (1995) ； R Komurasaki et al. , Oncogene 15: 2841-2848(1997)) ； α 調蛋白(見下文)；神經調節蛋白-2 (NRG-2) (Carraway et al.，Nature 387 :512_516 (1997))；神經調節蛋白 _3 (NRG-3) (Zhang et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. 94 9562-9567(1997))；神經調節蛋白-4(NRG-4)(Harari et al.， Oncogene 18 :2681_89(1999))；或 cripto(CR-I)(Kannan et al. , J. Biol. Chem. 272(6) 3330-3335(1997))。結合 EGFR 的 HER 配體包括 EGF、TGF-α、雙調蛋白、betacellulin、 HB-EGF和印iregulin。結合HER3的HER配體包括調蛋白。能夠結合HER4的HER配體包 括 betacellulin、epiregulin, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 和調蛋白。“調蛋白”(HRG)在用于本文時指由調蛋白基因編碼的多肽，如美國專利 5，641，869 或 Marchionni et al.，Nature362 :312_318 (1993)中所公開的。調蛋白 的例子包括調蛋白-α、調蛋白-β 、調蛋白-β2和調蛋白-i33(HolmeS et al., Science 256 1205-1210 (1992)；及美國專利 5，641，869) ；neu 分化因子(NDF) (Peles et al.，Cell69 :205_216 (1992))；乙酰膽堿受體誘導活性(ARIA) (Falls et al.， Cell 72 :801-815 (1993))；神經膠質生長因子(GGF) (Marchionni et al.，Nature 362 312-318(1993))；感覺和運動神經元衍生因子(SMDF) (Ho et al. , J. Biol. Chem. 270 14523-14532(1995)) ； Y-調蛋白(Schaefer et al.，0ncogenel5 1385-1394(1997))。此 術語包括天然序列HRG多肽的生物學活性片段和/或氨基酸序列變體，諸如其EGF樣結構 域片段(如 HRG β 1177-244)。“HER 二聚體”在本文中指包含至少兩個不同HER受體的非共價結合二聚體。當 表達兩種或多種HER受體的細胞暴露于HER配體時可能形成此類復合物，可通過免疫沉淀 進行分離并通過 SDS-PAGE 進行分析，如例如 Sliwkowski et al. , J. Biol. Chem. 269(20) 14661-14665 (1994)中所述。此類 HER 二 聚體的例子包括 EGFR-HER2、HER2-HER3 和 HER3-HER4異二聚體。此外，HER 二聚體可包含與諸如HER3、HER4或EGFR等不同HER受體 組合的兩個或多個HER2受體。其它蛋白質，諸如細胞因子受體亞基(如gpl30)可與所述 二聚體結合。HER2上的“異二聚體結合位點”指HER2胞外域中在與EGFR、HER3或HER4形成二 聚體時，接觸EGFR、HER3或HER4胞外域中某區域或與EGFR、HER3或HER4胞外域中某區域 形成介面的區域。已發現所述區域在HER2的結構域II中。Franklin et al. ,Cancer Cell 5 317-328(2004)。"HER活化”或“HER2活化”指任一種或多種HER受體或HER2受體的活化或磷酸化 作用。一般而言，HER活化導致信號轉導(例如由HER受體胞內激酶結構域引起的，磷酸化 HER受體或底物多肽中的酪氨酸殘基)。HER活化可由結合包含目的HER受體的HER 二聚體 的HER配體介導。結合HER 二聚體的HER配體可活化二聚體中一種或多種HER受體的激酶結構域，從而導致一種或多種HER受體中酪氨酸殘基的磷酸化作用和/或其它底物多肽中 酪氨酸殘基的磷酸化作用，諸如Akt或MAPK胞內激酶。術語“抗體”在本文中使用最廣的含義，具體覆蓋完整的單克隆抗體、多克隆抗體、 由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(如雙特異性抗體)、及抗體片段，只要它們展現 所需生物學活性。術語“單克隆抗體”在用于本文時指由一群基本上同質的抗體獲得的抗體，即構成 群體的各個抗體相同和/或結合相同表位，除了生產單克隆抗體的過程中可能產生的可能 變體外，諸如本文描述的那些抗體。與典型的包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的 多克隆抗體制品不同，每種單克隆抗體針對抗原上的同一決定簇。除了它們的特異性以外， 單克隆抗體的優越性體現在它們未受到其它免疫球蛋白的污染。修飾語“單克隆”指示由基 本上同質的抗體群獲得的抗體的特征，并不解釋為需要通過任何特定方法來生產抗體。例 如，依照本發明使用的單克隆抗體可通過最初由Kohler et al. , Nature256 =495(1975)描 述的雜交瘤方法來制備，或者可通過重組DNA方法來制備(參見例如美國專利4，816，567)。 “單克隆抗體”還可使用例如 Clackson et al.，Nature 352:624-628(1991)和 Marks et al.，J. Mol. Biol. 222 :581_597 (1991)中描述的技術從噬菌體抗體庫分離。單克隆抗體在本文中具體包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生 自特定物種或屬于特定抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，而鏈的剩余部分 與衍生自另一物種或屬于另一抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，以及此類 抗體的片段，只要它們展現所需生物學活性(美國專利4，816，567 ；及Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 =6851-6855 (1984))。本文中感興趣的嵌合抗體包括包含衍生 自非人靈長類動物(如舊大陸猴類(Old World Monkey)、猿等)的可變區抗原結合序列和 人恒定區序列的“靈長類化(primatized) ”抗體。“抗體片段”包含完整抗體的一部分，優選包含其抗原結合區或可變區。抗體片段 的例子包括Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體 片段形成的多特異性抗體。“完整抗體”指包含抗原結合可變區以及輕鏈恒定區(CJ和重鏈恒定區CH1、CH2和 CH3的抗體。恒定區可以是天然序列恒定區(如人天然序列恒定區)或其氨基酸序列變體。 優選的是，完整抗體具有一項或多項效應物功能，且包含附著于其一條或兩條重鏈的寡糖 結構。抗體“效應物功能”指那些可歸于抗體Fc區(天然序列Fc區或氨基酸序列變體 Fc區)的生物學活性。抗體效應物功能的例子包括Clq結合；補體依賴性細胞毒性；Fc受 體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)；吞噬作用細胞表面受體(如B細胞受 體；BCR)的下調等。術語“Fe區”在本文中用于定義免疫球蛋白重鏈的C-端區域，包括天然序列Fc 區和變異Fc區。雖然免疫球蛋白重鏈Fc區的邊界可以變化，但是人IgG重鏈Fc區通常定 義為自其Cys226或Pro230位置的氨基酸殘基至羧基末端的區段。Fc區的C-末端賴氨酸 (殘基447，依照EU編號系統)可以消除，例如在生產或純化抗體的過程中，或者通過對編 碼抗體重鏈的核酸進行重組工程改造。因而，完整抗體組合物可以包括所有K447殘基都被 消除的抗體群、無一 K447殘基被消除的抗體群、或者混合了有K447殘基的抗體和沒有K447殘基的抗體的抗體群。除非本文另有說明，免疫球蛋白重鏈的殘基編號方式是如Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda,MD (1991)中的 EU 索引的編號方式。“如 Kabat 中的EU索引”指人IgGl EU抗體的殘基編號方式。根據完整抗體的重鏈恒定區的氨基酸序列，可將其歸入不同的“類”(class)。 完整抗體有五種主要的類別IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可進一步分為“亞 類” (subclass)(同種型)，如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。將與不同抗體類別對 應的重鏈恒定區分別稱作α、δ、ε、Y和μ。不同類別免疫球蛋白的亞基結構和三維構 造是眾所周知的。“抗體依賴性細胞介導的細胞毒性”和“ADCC”指由細胞介導的反應，其中表達Fc 受體(FcR)的非特異性細胞毒性細胞(如天然殺傷(NK)細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞) 識別靶細胞上結合的抗體，隨后引起靶細胞溶解。介導ADCC的主要細胞，NK細胞，只表達 (3^1 111，而單核細胞表達？(；^1 1、？(；^1 11禾口？(；^1 111。 Ravetch and Kinet,Annu. Rev. Immunol. 9 457-92 (1991)中第464頁表3總結了造血細胞上的FcR表達。為了評估目的 分子的ADCC活性，可進行體外ADCC測定法，諸如美國專利5，500, 362或5，821，337中所描 述的。可用于此類測定法的效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞。 或者/另外，可在體內評估目的分子的ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynes et al., PNAS (USA) 95 :652_656 (1998)中所公開的。“人效應細胞”指表達一種或多種FcR并行使效應物功能的白細胞。優選的是，該 細胞至少表達Fc y RIII并執行ADCC效應物功能。介導ADCC的人白細胞的例子包括外周 血單核細胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞和嗜中性粒細胞，優選 PBMC和NK細胞。效應細胞可以從其天然來源中分離，例如血液或PBMC，正如本文所述。術語“Fe受體”和“FcR”用于描述與抗體Fc區結合的受體。優選的FcR是天然 序列人FcR。此外，優選的FcR是與IgG抗體結合的FcR( γ受體)，包括Fc γ RI、Fc γ RII 和Fc γ RIII亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體和可變剪接形式。Fc γ RII受體 包括FcyRIIA( “活化受體”)和Fc y RIIB ( “抑制受體”)，它們具有相似的氨基酸序列， 區別主要在于其胞質域。活化受體Fc y RIIA在其胞質域中包含免疫受體基于酪氨酸的 活化基序(ITAM)。抑制受體Fc γ RIIB在其胞質域中包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基 序(ITIM)(參見綜述DaSron, Annu. Rev. Immunol. 15 :203_234(1997))。FcR 的綜述參見 Ravetch and Kinet,Annu. Rev. Immunol. 9 457-492(1991) ；Capel et al. ,Immunomethods 4:25-34(1994)；及 de Haas et al.，J. Lab. Clin. Med. 126 :330_341 (1995))。術語“FcR” 在本文中涵蓋其它FcR，包括未來將會鑒定的FcR。該術語還包括新生兒受體，FcRn，它負 責將母體的 IgG 轉移給胎兒(Guyer et al.，J. Immunol. 117 587(1976)和 Kim et al.， J. Immunol. 24 :249(1994))。“補體依賴性細胞毒性”或“CDC”指在存在補體時分子溶解靶物的能力。補體激活 途徑是由補體系統第一組分(Clq)結合與關聯抗原復合的分子(如抗體)起始的。為了評 估補體激活，可進行 CDC 測定法，例如 Gazzano-Santoro et al. , J. Immunol. Methods 202 163(1996)中所描述的。
“天然抗體”通常是由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)構成的約 150，000道爾頓的異四聚體糖蛋白。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈連接，而二硫鍵的 數目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈中有所變化。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規律的鏈內 二硫橋。每條重鏈在一端具有一個可變區(Vh)，接著是多個恒定區。每條輕鏈在一端具有 一個可變區(VJ，而另一端是一個恒定區。輕鏈的恒定區與重鏈的第一恒定區排列在一起， 而輕鏈的可變區與重鏈的可變區排列在一起。認為特定的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變區 之間形成界面。術語“可變的”指可變區中的某些部分在抗體序列中差異廣泛且用于每種特定抗 體針對其特定抗原的結合和特異性的實情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個可變 區。它集中于輕鏈和重鏈可變區中稱作高變區的三個區段。可變區中更加高度保守的部分 稱作框架區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區各自包含四個FR，它們大多采取β-折疊構象， 通過形成環狀連接且在有些情況中形成β-折疊結構一部分的三個高變區連接。每條鏈中 的高變區通過FR非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的高變區一起促成抗體的抗原結 合位點的形成(參見Kabat 等人，《Sequences of Proteins of Immunological Interest》， 第 5 片反，Public Health Service,National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991)。 恒定區不直接涉及抗體與抗原的結合，但展現多種效應物功能，諸如抗體依賴性細胞細胞 毒性(ADCC)中抗體的參與。術語“高變區”在用于本文時指抗體中負責抗原結合的氨基酸殘基。高變區通常 包含來自“互補決定區”或“⑶R”的氨基酸殘基(例如輕鏈可變區中的殘基24-34(Ll)、 50-56 (L2)和 89-97 (L3)及重鏈可變區中的 31-35 (HI)、50_65 (H2)和 95-102 (H3) ；Kabat 等人，《Sequences of Proteins of Immunological Interest》，第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)和 / 或那些來自“高 變環”的殘基(例如輕鏈可變區中的殘基26-32(Ll)、50-52(L2)和91-96 (L3)及重鏈可 變區中的 26-32(Hl)、53-55(H2)和 96-101(H3) ；Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196 901-917(1987))。“框架區”或“FR”殘基指本文定義的高變區殘基以外的可變區殘基。用木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個相同的抗原結合片段，稱作“Fab”片段，各自具有 一個抗原結合位點，和一個殘余“Fe”片段，其名稱反映了它易于結晶的能力。胃蛋白酶處 理產生一個F (ab' )2片段，它具有兩個抗原結合位點，并且仍能夠交聯抗原。“Fv”是包含完整抗原識別和抗原結合位點的最小抗體片段。該區域由緊密、非共 價結合的一個重鏈可變區和一個輕鏈可變區的二聚體組成。正是在這種構造中，各個可變 區的三個高變區相互作用而在Vh-Vl 二聚體表面確定了一個抗原結合位點。六個高變區共 同賦予抗體以抗原結合特異性。然而，即使是單個可變區(或只包含對抗原特異的三個高 變區的半個Fv)也具有識別和結合抗原的能力，盡管親和力低于完整結合位點。Fab片段還包含輕鏈的恒定區和重鏈的第一恒定區(CHl)。Fab’片段因在重鏈CHl 結構域的羧基末端增加了少數殘基而與Fab片段有所不同，包括來自抗體鉸鏈區的一個或 多個半胱氨酸。Fab’_SH是本文中對其中恒定區的半胱氨酸殘基攜帶至少一個游離硫醇基 的Fab，的稱謂。F(ab' )2抗體片段最初是作為成對Fab，片段生成的，在Fab，片段之間 具有鉸鏈半胱氨酸。還知道抗體片段的其它化學偶聯。來自任何脊椎動物物種的抗體的“輕鏈”，根據其恒定區的氨基酸序列，可歸入兩種截然不同類型中的一種，稱作卡帕(κ)和拉姆達(λ)。“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包含抗體的Vh和\結構域，其中這些結構域存在 于一條多肽鏈上。優選的是，該Fv多肽在Vh和\結構域之間還包含多肽接頭，使得scFv 形成抗原結合所需的結構。關于scFv的綜述參見PlUckthun，在《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》中，第 113 卷，Rosenburg 禾口 Moore 編，Springer-Verlag, New York, 269-315,1994。HER2 抗體 scFv 片段描述于 W093/16185 ；美國專利 5，571，894 ；和美 國專利 5，587，458。術語“雙抗體”指具有兩個抗原結合位點的小型抗體片段，該片段在同一條多肽鏈 (Vh-Vl)中包含相連的重鏈可變區(Vh)和輕鏈可變區(\)。通過使用過短的接頭使得同一 條鏈上的兩個結構域之間不能配對，迫使結構域與另一條鏈的互補結構域配對，并產生兩 個抗原結合位點。雙抗體更完整的描述于例如EP 404, 097 ；WO 93/11161 ；和Hollinger et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444_6448 (1993)。非人(如嚙齒類)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的 序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區殘基 用具有所需特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長 類的高變區殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(FR)殘基用 相應的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有發現的殘基。 進行這些修飾是為了進一步改進抗體的性能。通常，人源化抗體將包含基本上不少于至少 一個、通常兩個如下可變區，其中所有或基本上所有的高變環對應于非人免疫球蛋白的高 變環，且所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR。任選的是，人源化抗體還將包 含至少部分的免疫球蛋白恒定區(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定區。更多細節參見Jones et al. , Nature 321:522-525(1986) ；Riechmann et al. , Nature 332:323-329(1988)；及 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593_596 (1992)。人源化HER2 抗體包括 huMAb4D5_l、huMAb4D5_2、huMAb4D5_3、huMAb4D5_4、 huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7 和 huMAb4D5_8 或 Trastuzumab ( HERCEPTIN )， 如美國專利5，821，337的表3中所述，明確收入本文作為參考；人源化520C9 (W093/21319) 和人源化2C4抗體，如本文所述。為了本文的目的，“Trastuzumab”、"HERCEPTIN ”和“huMAb4D5_8” 指包含分 別在SEQ ID No. 13和14中的輕鏈和重鏈氨基酸序列的抗體。在本文中，“Pertuzumab”和“rhuMAb 2C4”指包含分別在SEQ ID No. 3和4中的輕 鏈和重鏈可變區氨基酸序列的抗體。若Pertuzumab是完整抗體，則它優選包含分別在SEQ ID No. 15和16中的輕鏈和重鏈氨基酸序列。“裸抗體”指未偶聯異源分子，諸如細胞毒性模塊或放射性標記物的抗體(如本文 所定義的)。“分離的”抗體指已經由其天然環境的成分鑒別和分離和/或回收的抗體。其天然 環境的污染成分指將會干擾抗體的診斷或治療用途的物質，可包括酶、激素、和其它蛋白質 性質或非蛋白質性質的溶質。在優選的實施方案中，將抗體純化至⑴根據Lowry法的測 定，抗體重量超過95%，最優選重量超過99%，(2)足以通過使用轉杯式測序儀獲得至少15 個殘基的N-末端或內部氨基酸序列的程度，或(3)通過使用考馬斯藍或優選銀染的還原或非還原條件下的SDS-PAGE達到同質。既然抗體的天然環境的至少一種成分不會存在，那么 分離的抗體包括重組細胞內的原位抗體。然而，分離的抗體通常將通過至少一個純化步驟 來制備。“比Trastuzumab更有效的抑制HER 二聚化的” HER2抗體指比Trastuzumab更有 效(例如有效性提高至少約2倍)的減少或消除HER 二聚體的抗體。優選的是，這樣的抗 體至少大約像選自下組的抗體那樣有效的抑制HER 二聚化鼠單克隆抗體2C4、鼠單克隆抗 體2C4的Fab片段、完整的Pertuzumabjn Pertuzumab的Fab片段。可直接通過研究HER 二聚體，或者通過評估由HER 二聚化引起的HER活化或下游信號傳導，和/或通過評估抗 體-HER2結合位點等來評估對HER 二聚化的抑制。用于篩選有能力比Trastuzumab更有 效的抑制HER 二聚化的抗體的測定法見Agus et al.，Cancer Cell 2 127-137 (2002)和 WOO1/00245 (Adams et al.)。只是作為例示，可通過評估例如下列各項來分析對HER二聚化 的抑制對HER二聚體形成的抑制(參見例如Agus et al. ,Cancer Cell 2 127-137(2002) 的附圖IA-B和WOO1/00245)；表達HER 二聚體的細胞中HER配體活化的降低(例如 WOO1/00245 和 Agus et al.，Cancer Cell 2 :127_137 (2002)的附圖 2A-B)；對 HER 配體 結合表達HER 二聚體的細胞的阻斷(例如W001/00245和Agus et al.，Cancer Cell 2 127-137(2002)的附圖2E)；在存在(或缺乏)HER配體時對表達HER 二聚體的癌細胞(如 MCF7、MDA-MD-134、ZR-75-l、MD-MB-175、T-47D 細胞)的細胞生長的抑制(例如 W001/00245 和Agus et al. ,Cancer Cell 2 127-137 (2002)的附圖3A-D)；對下游信號傳導的抑制(例 如對HRG依賴性AKT磷酸化的抑制或對HRG或TGF α依賴性MAPK磷酸化的抑制)(參見例如 WOO1/00245 和 Agus et al.，Cancer Cell 2 :127_137 (2002)的附圖 2C-D)。還可通過研究 抗體-HER2結合位點來評估抗體是否抑制HER 二聚化，例如通過評估與HER2結合的抗體的 結構或模型，諸如晶體結構(參見例如Franklin et al. ,Cancer Cell 5:317-328(2004))。HER2抗體可比Trastuzumab更有效(例如有效性提高至少2倍)的“抑制HRG依 賴性AKT磷酸化”和/或抑制“HRG或TGF α依賴性MAPK磷酸化”(參見例如Agus et al.， Cancer Cell 2 127-137(2002)和 W001/00245)。HER2抗體可以是“不抑制HER2胞外域切割”的抗體(Molina et al.，Cancer Res. 61 .4744-4749(2001)) ο“結合HER2的異二聚體結合位點的”HER2抗體結合結構域II中的殘基(且任選 還結合HER2的胞外域以外的其它結構域，諸如結構域I和III中的殘基)，且至少在一定程 度上能在空間上阻礙HER2-EGFR、HER2-HER3或HER2-HER4異二聚體的形成。Franklin et al.，Cancer Cell 5 =317-328(2004)表征了存放在 RCSB 蛋白質數據庫(ID Code IS78)的 HER2-Pertuzumab晶體結構，舉例說明了結合HER2的異二聚體結合位點的例示性抗體。“結合HER2結構域II的”抗體結合結構域II中的殘基和任選HER2的其它結構 域，諸如結構域I和III中的殘基。“生長抑制劑”在用于本文時指在體外或在體內抑制細胞，尤其是表達HER的癌細 胞生長的化合物或組合物。因此，生長抑制劑可以是顯著降低S期的表達HER細胞百分比 的藥劑。生長抑制劑的例子包括阻斷細胞周期行進(處于S期以外的位置)的藥劑，諸如 誘導Gl停滯和M期停滯的藥劑。經典的M期阻斷劑包括長春花生物堿類(長春新堿和長 春堿)、紫杉醇、和拓撲異構酶II抑制劑諸如多柔比星、表柔比星、柔紅霉素、依托泊苷和博來霉素。那些阻滯Gl的藥劑也溢出進入S期停滯，例如DNA烷化劑諸如他莫昔芬、潑尼松、 達卡巴嗪、雙氯乙基甲胺、順鉬、甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶和ara-C。其它信息可參見在《The Molecular Basis of Cancer》中，Mendelsohn 禾口 Israel 編，第 1 章，題為"Cell cycle regulation, oncogenes, and antieioplastic drugs", Murakaini 等人’ WB Saunders, Philadelphia, 1995，尤其是第 13 頁。“生長抑制性”抗體的例子是那些結合HER2并抑制過表達HER2的癌細胞生長的抗 體。優選的生長抑制性HER2抗體在約0. 5-30 μ g/ml的抗體濃度對細胞培養中SK-BR-3乳 房腫瘤細胞的生長抑制大于20%，優選大于50% (例如從約50%至約100% )，其中生長抑 制是在SK-BR-3細胞暴露于抗體后6天測定的(參見1997年10月14日發布的美國專利 5，677，171)。該專利及下文中更詳細的描述了 SK-BR-3細胞生長抑制測定法。優選的生長 抑制性抗體是鼠單克隆抗體4D5的人源化變體，例如Trastuzumab。“誘導凋亡”的抗體指那些根據膜聯蛋白V結合、DNA斷裂、細胞收縮、內質網膨脹、 細胞破裂和/或膜囊形成(稱作凋亡小體)的測定，誘導程序性細胞死亡的抗體。所述細 胞通常是過表達HER2受體的細胞。優選的是，所述細胞是腫瘤細胞，例如乳房、卵巢、胃、 子宮內膜、唾液腺、肺、腎、結腸、甲狀腺、胰或膀胱細胞。在體外，所述細胞可以是SK-BR-3、 BT474、Calu3細胞、MDA-MB-453、MDA-MB-361或SK0V3細胞。有多種方法可用于評估與凋 亡有關的細胞事件。例如，可通過膜聯蛋白結合來測量磷脂酰絲氨酸(PS)易位；可通過DNA 梯化(laddering)來評估DNA斷裂；而可通過亞二倍體細胞的任何增加來評估伴隨著DNA 斷裂的核/染色質濃縮。優選的是，誘導凋亡的抗體是在使用BT474細胞的膜聯蛋白結合 測定法(見下文)中導致對膜聯蛋白結合的誘導相對于未處理細胞提高約2至50倍，優選 約5至50倍，最優選約10至50倍的抗體。誘導凋亡的HER2抗體的例子是7C2和7F3。“表位2C4”指HER2胞外域中抗體2C4所結合的區域。為了篩選結合2C4表位的抗 體，可進行常規的交叉阻斷測定法，諸如《Antibodies，A Laboratory Manual)),Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow和David Lane，1988中所描述的。或者，可使用本領域知道 的方法進行表位作圖以評估抗體是否結合HER2的2C4表位，和/或可研究抗體-HER2結構 (Franklin et al. ,Cancer Cell 5:317-328(2004))以了解抗體結合HER2 的哪個/些結構 域。表位2C4包含來自HER2胞外域中結構域II的殘基。2C4和Pertuzumab在結構域I、II 和 III 的連接處結合 HER2 的胞外域。Franklin et al.，Cancer Cell 5 :317_328 (2004)。“表位 4D5” 指 HER2 胞外域中抗體 4D5(ATCC CRL 10463)和 Trastuzumab 所結合 的區域。此表位接近HER2的跨膜域，且在HER2的結構域IV之內。為了篩選結合4D5表位 的抗體，可進行常規的交叉阻斷測定法，諸如《Antibodies，A Laboratory Manual》，Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow 禾口 David Lane，1988 中所描述的。或者，可進 亍表 位作圖以評估抗體是否結合HER2的4D5表位(例如大約第529位殘基至大約第625位殘 基區域內的任何一個或多個殘基，含；見圖1)。“表位7C2/7F3”指HER2胞外域的結構域I內N末端處7C2和/或7 3抗體(各自保 藏于ATCC，見下文)所結合的區域。為了篩選結合7C2/7F3表位的抗體，可進行常規的交叉 阻斷測定法，諸如《Antibodies,A Laboratory Manual》,Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow和David Lane，1988中所描述的。或者，可進行表位作圖以確定抗體是否結合 HER2上的7C2/7F3表位(例如圖1中HER2的大約第22位殘基至大約第53位殘基區域內的任何一個或多個殘基)。“治療”指治療性處理和預防性措施二者。需要治療的受試者包括早就患有疾病的 受試者以及要預防疾病的受試者。因此，本文中待治療的患者可能已經診斷為患有疾病或 者可能有患上疾病的傾向性或易感性。術語“癌癥”和“癌的”指的是或描述哺乳動物中特征通常為細胞生長不受調節的 生理狀況。癌癥的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母細胞瘤(包括髓母細胞瘤和視網膜母細 胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑膜細胞肉瘤)、神經內分泌腫瘤(包括類癌瘤、胃泌素瘤和 胰島細胞癌)、間皮瘤、施旺細胞瘤(包括聽神經瘤)、腦膜瘤、腺癌、黑素瘤、和白血病或淋 巴樣惡性腫瘤。這些癌癥的更具體例子包括鱗狀細胞癌(如上皮鱗狀細胞癌)、肺癌包括 小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺的腺癌和肺的鱗癌、腹膜的癌癥、肝細胞癌癥、胃癌包括胃腸 癌、胰腺癌、成膠質細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤(h印atoma)、乳癌、結腸癌、 直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝 的癌、肛門癌、陰莖癌、睪丸癌、食道癌、膽管腫瘤、及頭和頸癌。術語“有效量”指在患者中有效治療疾病的藥物量。若疾病是癌癥，則藥物的有效 量可減少癌細胞的數目；縮小腫瘤的尺寸；抑制(即減緩到一定程度和優選阻止)癌細胞 浸潤到周圍器官中；抑制(即減緩到一定程度和優選阻止)腫瘤轉移；在某種程度上抑制 腫瘤生長；和/或在一定程度上減輕一種或多種與癌癥有關的癥狀。在藥物可阻止生長和 /或殺死現有癌細胞的程度上，它可以是抑制細胞的和/或細胞毒性的。有效量可延長無進 展存活，導致客觀響應(包括部分響應，I3R或完全響應，CR)，增加總體存活時間，和/或改 善癌癥的一種或多種癥狀。"HER2陽性癌癥”是包含在其細胞表面存在HER2蛋白質的細胞的癌癥。“過表達”HER受體的癌癥是與同一組織類型的非癌細胞相比，在其細胞表面具有 顯著更高水平的HER受體諸如HER2的癌癥。這樣的過表達可以是由基因擴增或者轉錄或 翻譯增加引起的。可在診斷或預后測定法中通過評估細胞表面上存在的HER蛋白質水平 的增加(例如通過免疫組化測定法，IHC)來確定HER受體的過表達。或者/另外，可測量 細胞中編碼HER的核酸的水平，例如通過熒光原位雜交(FISH ；參見1998年10月公布的 W098/45479)、Southern印跡或聚合酶鏈式反應(PCR)技術，諸如實時定量PCR(RT-PCR)。 還可通過測量生物學流體諸如血清中的脫落抗原(例如HER胞外域)來研究HER受體過 表達(參見例如1990年6月12日發布的美國專利4，933,294; 1991年4月18日發布的 W091/05264 ;1995 年 3 月 28 日發布的美國專利 5，401，638 ；及 Sias et al. , J. Immunol. Methods 132 :73_80 (1990))。除了上述測定法之外，熟練技術人員還可利用多種體內測定 法。例如，可將患者體內細胞暴露于任選用可檢測標記物例如放射性同位素標記的抗體，并 且可評估抗體與患者體內細胞的結合，例如通過外部掃描放射性或通過分析取自事先已暴 露于所述抗體的患者的活組織檢查切片。相反，“不過表達HER2受體”的癌癥是與同一組織類型的非癌細胞相比，不表達高 于正常水平的HER2受體的癌癥。“過表達”HER配體的癌癥是與同一組織類型的非癌細胞相比，產生顯著更高水平 的該配體的癌癥。這樣的過表達可以是由基因擴增或者轉錄或翻譯增加引起的。可通過評 估患者體內，例如腫瘤活組織檢查切片中所述配體(或編碼它的核酸)的水平，或者通過各種診斷測定法諸如IHC、FISH、Southern印跡、PCR或上文所述體內測定法在診斷上確定HER 配體的過表達。術語“胞毒劑”在用于本文時指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞破壞的物質。 該術語意欲包括放射性同位素 OnAt211、I131、I125、y9°、Re186、Re188、Sm153、Bi212、p3m Lu 的放 射性同位素)、化療劑、和毒素諸如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物起源的酶活毒素， 包括其片段和/或變體。“化療劑”指可用于治療癌癥的化學化合物。化療劑的例子包括烷化劑類，諸 如噻替哌(thiot印a)和環磷酰胺(cyclophosphamide) ( CYTOXAN );烷基磺酸 酯類，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮 丙啶類，諸如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和 烏瑞替哌(uredopa)；乙撐亞胺類(ethylenimine)和甲基蜜胺類(methylamelamine)， 包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺 (trietylenephosphoramide)、三乙撐硫代憐酉先胺(triethylenethiophosphoramide) 和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝內酯類(acetogenin)(尤其是布拉 他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone)) ； δ-9-四氫大麻酚(曲大麻酚 (dronabinol)，MARINOL ) ；β-拉帕醌(Iapachone)；拉帕醇(Iapachol)；秋水仙 素類(colchicine)；白樺月旨酸(betulinic acid)；喜樹堿(camptothecin)(包括合成 類似物拓撲替康(topotecan) ( HYCAMTIN )、CPT-Il (伊立替康(irinotecan)，
CAMPTOSAR )、乙酰喜樹堿、東莨菪素(scopolectin)和9-氨基喜樹堿)；苔蘚 抑素(bryostatin) ；callystatin ；CC-1065 (包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新 (carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼 臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隱藻素類(cryptophycin)(特別是 隱藻素1和隱藻素8)；多拉司他丁(dolastatin) ；duocarmycin (包括合成類似物KW-2189 禾口 CB1-TM1)；艾槽塞洛素(eleutherobin) ；pancratistatin ;sarcodictyin ；海綿 φ 素 (spongistatin)；氮芥類，諸如氯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、 膽磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、異磷酰胺(ifosfamide)、雙氯 乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride) > 美法倉(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽留醇(phenesterine)、松龍苯芥 (prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿啼唆氮芥(uracil mustard)；硝基脲類， 諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛 莫司汀(Iomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素類，諸 如烯二炔類(enediyne)抗生素(如加利車霉素(calicheamicin)，尤其是加利車霉素 Y II 和加利車霉素 ω Il (參見例如 Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl. 33 183-186 (1994))； 蒽環類(dynemicin)抗生素，包括dynemicin A ；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新 抑癌菌素(neocarzinostatin)發色團和相關色蛋白烯二炔類抗生素發色團)、阿克 拉霉素(aclacinomysin)、方文線菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、氮絲 氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、放線菌素 C (cactinomycin)、carabicin、 洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放線 菌素 D (dactinomycin)、柔紅霄素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6_ 二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括_ADRIAMYCIN 、嗎啉 代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、鹽酸多柔比星脂質體注射劑 (DOXIL )、脂質體多柔比星TLC D-99 (MYOCET愈)、PEG化脂質體多柔比星
(CAELYX )和脫氧多柔比星)、表柔比星(印irubicin)、依索比星(esorubicin)、依 達比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素(mitomycin)諸如絲裂霉 素 C、霉酚酸(mycophenolic acid)、諾力口霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培 來霉素(ρ印lomycin)、potfiromycin、口票呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、 羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲霉素(streptozocin)、殺 結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星 (zorubicin)；抗代謝物類，諸如甲氨喋呤、吉西他濱(gemcitabine) ( GEMZAR )、替加
氟(tegafur) ( UPTORAL )、卡培他濱(capecitabine) ( XELODA )、epothilone
和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、甲氨喋呤、蝶酰三谷氨 酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、 6_巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，諸如安西他濱(anc i tab ine)、阿扎胞 苷(azacitidine)、6_氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿 苷(dideoxyuridine)、多西氟尿唆(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷 (floxuridine)；抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、曼托坦(mitotane)、 曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸；醋葡內酯(aceglatone)；醛磷酰 胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿 啼唆(eniluracil)；氨苯口丫 唆(amsacrine) ；bestrabucil ；比生群(bisantrene)；依 達曲沙(edatraxate) ；defofamine ；地美可辛(demecolcine) ； i也 口丫 酉昆(diaziquone)； 依洛尼塞(elfornithine)；醋酸羥吡咔唑(elliptinium acetate)；依托格魯 (etoglucid)；硝酸鎵；羥脲；香菇多糖(Ientinan)；氯尼達明(Ionidamine)；美登木 素生物堿類(maytansinoids)，諸如美登素(maytansine)和美登醇(maytansinol)； 安絲菌素(ansamitocin)；米托月瓜月宗(mitoguazone)；米托惠酉昆(mitoxantrone)；莫喊 達醇(mopidamol) ； 二 胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁 (pentostatin)；蛋氨氮芥 (phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(Iosoxantrone) ；2-乙基酰胼；丙卡 巴胼(procarbazine) ；PSK 多糖復合物(JHS Natural Products, Eugene, OR)；雷佐 生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲蘭(sizofiran)；錯螺胺(spirogermanium)； 細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone) ；2,2 ‘，2〃 -三氯三 乙胺；單端孢菌素類(trichothecene)(尤其是T_2毒素、verracurin Α、桿孢菌素 A(roridin Α)和蛇形菌素(anguidine))；烏拉坦(urethan)；達卡巴嗪(dacarbazine)； 甘露酉享氮芥(mannomustine) ；二溴甘露酉享(mitobronitol) ；二溴衛矛酉享(mitolactol)； 哌泊溴燒(pipobroman) ；gacytosine ；阿糖胞苷(arabinoside) ( “Ara-C")；噻替 哌；類紫杉醇(taxoid)，例如紫杉醇(paclitaxel) ( TAXOL )、紫杉醇的清蛋白改 造納米顆粒劑型(ABRAXANE )和多西他塞(doxetaxel) ( TAXOTERE );苯丁酸 氮芥(chloranbucil) ；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲氨喋呤；鉬劑，諸如順鉬、奧沙利鉬(oxaliplatin)和卡鉬；阻止微管蛋白聚合形成微管的長春花生物堿類(vincas)，包括 長春堿(vinblastine) ( VELBAN )、長春新堿(vincristine) ( ONCOVIN )、 長春地辛(Vindesine) (ELDISINE , FILDESIN )和長春瑞賓
(vinorelbine) (NAVELBINE )；依托泊苷(etoposide) (VP-16)；異磷酰 月安(ifosfamide)；米托惠酉昆(mitoxantrone)；亞 葉酸(Ieucovovin) ； i若安托 (novantrone)；依達曲沙(edatrexate)；柔紅霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；伊拜 膦酸鹽(ibandronate)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000 ；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；類 維A酸，諸如視黃酸，包括貝沙羅汀(bexarotene) ( TARGRETIN );二碳磷酸鹽類 (bisphosphonate)，諸如氯膦酸鹽(clodronate)(例如 BONEFOS 或 OSTAC )、 etidronate (DIDROCAL )、 NE-58095、唑來勝酸(zoledronic acid) /唑來月粦酸鹽/
酯(zoledronate) ( Z〇META )、阿侖膦酸鹽 / 酯(alendronate) ( FOSAMAX )、
pamidronate ( AREDIA )、替魯膦酸鹽 / 酯(tiludronate) ( SKELID )或利塞膦 酸鹽 / 酯(risedronate) ( ACTONEL );曲沙他濱(troxacitabine) (1，3- 二氧戊 環核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是那些抑制涉及粘著性細胞增殖的信號途 經中的基因表達的反義寡核苷酸，諸如例如PKC-α、Ralf, H-Ras和表皮生長因子受體 (EGF-R)；疫苗，諸如THERATOPE 疫苗和基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN 疫苗、 LEUVECTIN 疫苗和VAXID 疫苗；拓撲異構酶1抑制劑(如LURTOTECAN )；rmRH ( ABARELIX ); ΒΑΥ439006 (sorafenib ；Bayer) ；SU-11248 (Pfizer)；哌立福辛 (perifosine), C0X-2抑制劑(如塞來考昔(celecoxib)或艾托考昔(etoricoxib))，蛋白 體抑制劑(如 PSMl) ；bortezomib ( VELCADE ); CCI-779 ；tipifamib (R11577)； orafenib，ABT5IO ;Bcl_2 抑制劑，諸如 oblimersen sodium ( GENASENSE ); pixantrone ；EGFR抑制劑(見下文定義)；酪氨酸激酶抑制劑(見下文定義)；及上述任何 物質的藥學可接受的鹽、酸或衍生物；以及上述兩種或多種的組合，諸如CHOP(環磷酰胺、 多柔比星、長春新堿和潑尼松龍聯合療法的縮寫)和F0LF0X(奧沙利鉬(EL0XATIN )聯合 5-FU和亞葉酸(leucovovin)的治療方案的縮寫)。 該定義還包括作用于調節或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素 劑，諸如具有混合的激動劑/拮抗劑特性(profile)的抗雌激素類，包括 他莫昔芬(tamoxifen) (NOLVADEX )、4_羥基他莫昔芬、托瑞米芬 (toremifene) ( FARESTON )、艾多昔芬(idoxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、雷 洛昔芬(raloxifene) ( EVISTA )、曲沃昔芬(trioxifene)、keoxifene，及選擇性雌 激素受體調節劑(SERM)，諸如SERM3 ；沒有激動劑特性的純粹的抗雌激素，諸如氟維司 群(fulvestrant) ( FASLODEX )和EM800 (此類藥劑可阻斷雌激素受體(ER) 二
聚化，抑制DNA結合，提高ER周轉，和/或遏制ER水平)；芳香酶抑制劑，包括類固醇芳 香酶抑制劑，諸如福美坦(formestane)和依西美坦(exemestane) ( AROMASIN ), 及非類固醇芳香酶抑制劑，諸如阿那曲唑(anastrozole) ( ARIMIDEX )、來 曲唑(Ietrozole) ( FEMARA )和氨魯米特(aminoglutethimide)，及其它芳 香酶抑制劑，包括伏羅唑(vorozole) ( RIVISOR )、醋酸甲地孕酮(megestrolacetate) ( MEGASE )、法倔唑(fadrozole)、咪唑(imidazole) ；lutenizing hormone 釋放激素激動劑，包括亮丙瑞林(leuprolide) ( LUPRON 和ELIGARD )、戈舍瑞 林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)和曲普瑞林(triptorelin)；性類固醇類，包括孕 激素，諸如醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)禾口醋酸甲輕孕酮(medroxyprogesterone acetate)，雌激素，諸如乙烯雌酚(diethylstilbestrol)和倍美力(premarin)，及雄激素 /類維A酸，諸如氟甲睪酮(fluoxymesterone)、所有反式維A酸(transretionic acid) 和芬維A胺(fenretinide)；奧那司酮(onapristone)；抗孕酮類；雌激素受體下調調節 劑(ERD)；抗雄激素類，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)和比卡米特 (bicalutamide)；睪內酯(testolactone)；及上述任何物質的藥學可接受的鹽、酸或衍生 物；以及兩種或多種上述物質的組合。 在用于本文時，術語“EGFR靶向藥物”指結合EGFR并任選抑制EGFR活化的治療 齊U。此類藥劑的例子包括結合EGFR的抗體和小分子。結合EGFR的抗體的例子包括MAb 579 (ATCC CRL HB 8506)、MAb 455 (ATCC CRL HB8507)、MAb 225 (ATCC CRL 8508)、MAb 528 (ATCC CRL 8509)(參見Mendelsohn等人的美國專利4，943，533及其變體，諸如嵌合化 225 (C225 或 Cetuximab ；ERBUTIX )和重構人 225 (H225)(參見 Imclone Systems Inc. 的WO 96/40210) ；IMC-11F8，完全人的EGFR靶向抗體(Imclone)；結合II型突變體EGFR 的抗體(美國專利5，212，290)；結合EGFR的人源化和嵌合抗體，如美國專利5，891，996 中所述；及結合EGFR的人抗體，諸如ABX-EGF或Panitumumab (參見Abgenix/Amgen的 WO 98/50433) ；EMD 55900(Stragliotto et al., Eur. J. Cancer 32A :636_640(1996))； EMD7200 (matuzumab)，針對EGFR且與EGF和TGF- α競爭EGFR結合的人源化EGFR抗 體(EMD/Merck)；人 EGFR 抗體，HuMax-EGFR(GenMab)；稱為 El. 1、E2. 4、E2. 5、E6. 2、 E6. 4、E2. 11、E6. 3 和 E7. 6. 3 和 US 6，235，883 中描述的完全人的抗體；MDX-447 (Medarex Inc.)；及 mAb 806 或人源化 mAb 806 (Jones et al. , J. Biol. Chem. 279(29) 30375-30384(2004))。抗EGFR抗體可與胞毒劑偶聯，由此產生免疫偶聯物(參見例如EP 659，439 A2，Merck Patent GmbH)。EGFR拮抗劑包括小分子，諸如美國專利5，616，582、 5，457，105,5，475，001,5，654，307,5，679，683,6，084，095,6，265，410,6，455，534, 6，521，620,6，596，726,6，713，484,5，770，599,6，140，332,5，866，572,6，399，602, 6，344，459,6, 602，863,6, 391，874,6, 344，455,5, 760，041,6, 002，008 和 5，747，498 以及 PCT 出版物 W098/14451、W098/50038、W099/09016 和 W099/24037 中描述的化合物。具體 的小分子 EGFR 拮抗劑包括 0SI-774(CP-358774，erlotinib, TARCEVA , Genentech/ OSIPharmaceuticals) ；PD 183805 (Cl 1033,2-propenamide, N-[4-[(3- U M ￥ 基)氨基]-7-[3-(4_嗎啉基)丙氧基]-6_喹唑啉基]-，二鹽酸化物，Pfizer Inc.)； ZD 1839，gefitinib(IRESSA ，4-(3，-氯 _4，-氟苯胺基)_7_ 甲氧基 _6_(3_ 嗎啉代丙 氧基)喹唑啉，AstraZeneca) ；ZM 105180 ((6_氨基_4_(3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉， Zeneca) ；BIBX-1382 (N8-(3-氯 _4_ 氟-苯基)-N2_(l_ 甲基-哌啶-4-基)-嘧啶并[5， 4-d]嘧啶 _2，8-二胺，Boehringer Ingelheim) ；PKI-166 ((R) _4-[4_[ (1-苯基乙基)氨 基]-IH-吡咯并[2，3-d]嘧啶-6-基]-酚)；(R)-6-(4-羥基苯基)-4-[(1_苯基乙基)氨 基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶)；CL-387785(N-[4-[(3-溴苯基)氨基]_6_喹唑啉基]-2-丁 炔酰胺(butynamide)) ；EKB-569 (N- [4- [ (3-氯-4-氟苯基)氨基]-3-氰基 _7_ 乙氧基-6-喹啉基]-4-( 二甲基氨基)-2_ 丁烯酰胺(butenamide)，Wyeth) ；AG1478 (Sugen)； AG1571(SU 5271 ；Sugen)；雙重 EGFR/HER2 酪氨酸激酶抑制劑，諸如 lapatinib (GW 572016 或N-[3-氯-4-[(3-氟苯基)甲氧基]苯基]6[5[[[2_甲基磺酰基]乙基]氨基]甲 基]-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺(quinazolinamine) ；Glaxo-SmithKline)或氰基胍喹唑啉 (cyanoguanidinequinazoline)禾口坐月安(cyanoamidine quinazolamine) ^ 生“酪氨酸激酶抑制劑”指抑制酪氨酸激酶諸如HER受體的酪氨酸激酶活性的分 子。這樣的抑制劑的例子包括上一段中提到的EGFR靶向藥物；小分子HER2酪氨酸激酶抑 制劑，諸如可從Takeda購買的TAK165 ；CP-724, 714，一種口服ErbB2受體酪氨酸激酶選擇 性抑制劑(Pfizer and 0SI)；優先結合EGFR但抑制HER2和EGFR過表達細胞的雙重HER 抑制劑，諸如 EKB-569(可從 Wyeth 購買)；lapatinib (GW572016 ；可從 Glaxo-SmithKline 購買)，一種口服HER2和EGFR酪氨酸激酶抑制劑；PKI_166(可從Novartis購買)；泛 HER(pan-HER)抑制劑，諸如 canertinib (CI-1033 ；Pharmacia) ；Raf-I 抑制劑，諸如可從 ISIS Pharmaceuticals購買的，抑制Raf-I信號傳導的反義劑ISIS-5132 ；非HER靶向TK抑 制劑，諸如可從Glaxo購買的Imatinib mesylate (GLEEVAC ) ；MAPK胞外調控激酶I抑制劑 CI-1040(可從Pharmacia購買)；喹唑啉類，諸如PD 153035，4-(3-氯苯胺基)喹唑啉；吡 啶并嘧啶類；嘧啶并嘧啶類；吡咯并嘧啶類，諸如CGP 59326、CGP 60261和CGP 62706 ；吡 唑并嘧啶類，4-(苯氨基)-7H-吡咯[2，3-d]嘧啶；姜黃素(二阿魏酰甲烷，4，5_雙(4-氟 苯胺基)-酞亞胺)；含硝基噻吩模塊的 tyrphostines ；PD-0183805 (Warner-Lambert)； 反義分子(例如那些結合HER編碼核酸的反義分子)；喹喔啉類(美國專利5，804，396)； tryphostins(美國專利 5，804，396) ;ZD6474(Astra Zeneca) ;PTK_787(Novartis/ Schering AG)；泛 HER 抑制劑，諸如 CI-1033 (Pfizer) ;Affinitac (ISIS 3521 ； Isis/Lilly) ；Imatinib mesylate(Gleevec ；Novartis) ；PKI 166 (Novartis)； GW2016(Glaxo SmithKline) ；CI-1033(Pfizer) ；EKB-569(Wyeth) ；Semaxinib(Sugen)； ZD6474 (AstraZeneca) ；PTK-787(Novartis/Schering AG) ； INC-IC 11 (Imclone) ； ft 基胍喹唑啉和氰基脒喹唑胺衍生物；或任何如下專利出版物中所記載的美國專利 5,804,396 ；W099/09016(American Cyanimid) ；WO 98/43960(American Cyanamid)； W097/38983(Warner Lambert) ；WO 99/06378(Warner Lambert) ；WO 99/06396(Warner Lambert) ；WO 96/30347 (Pfizer，Inc.) ；WO 96/33978 (Zeneca) ；WO 96/3397 (Zeneca) ；WO 96/33980(Zeneca)；及 US 2005/0101617。“抗血管生成劑”指阻斷或在某種程度上干擾血管發育的化合物。抗血管生 成因子可以是例如結合涉及促進血管生成的生長因子或生長因子受體的小分子或抗 體。在本文中優選的抗血管生成因子是結合血管內皮生長因子(VEGF)的抗體，諸如 Bevacizumab ( AVASTIN )。術語“細胞因子”指由一種細胞群釋放的、作為細胞間介質作用于另一細胞的蛋白 質的通稱。這樣的細胞因子的例子是淋巴因子、單核因子和傳統的多肽激素。細胞因子包括 生長激素，諸如人生長激素、N-甲硫氨酰人生長激素、和牛生長激素；甲狀旁腺素；甲狀腺 素；胰島素；胰島素原；松馳素；松馳素原；糖蛋白激素類，諸如促卵泡激素(FSH)、促甲狀 腺激素(TSH)和促黃體激素(LH)；肝生長因子；成纖維細胞生長因子；促乳素；胎盤催乳激 素；腫瘤壞死因子-α和-β ；穆勒氏(Mullerian)抑制性物質；小鼠促性腺激素相關肽；抑制素；激活素(activin)；血管內皮生長因子；整聯蛋白；血小板生成素(TPO)；神經生長因 子，諸如NGF-β ；血小板衍生生長因子；轉化生長因子(TGF)，諸如TGF-α和TGF-β ；胰島 素樣生長因子-I和-II ；促紅細胞生成素(EPO)；骨誘導因子(osteoinductive factor)； 干擾素，諸如干擾素-α、_ β和-γ ；集落刺激因子(CSF)，諸如巨噬細胞CSF(M-CSF)、粒細 胞-巨噬細胞 CSF(GM-CSF)和粒細胞 CSF(G-CSF)；白介素(IL)，諸如 IL-I、IL-I α、IL-2、 IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12 ；腫瘤壞死因子，諸如 TNF- α 或TNF-β ；及其它多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。在用于本文時，術語細胞因子包括 來自天然來源或來自重組細胞培養物的蛋白質和天然序列細胞因子的生物學活性等效物。II. HER2抗體變體組合物本發明至少部分關注某些HER2抗體組合物。優選的是，所述HER2抗體(主要種 類HER2抗體及其抗體變體其中任一或二者)是結合HER2結構域II，比Trastuzumab更有 效的抑制HER 二聚化，和/或結合HER2的異二聚體結合位點的抗體。本文中主要種類抗體 的優選實施方案是包含SEQ ID No. 3和4中的輕鏈和重鏈可變區氨基酸序列，且最優選包 含SEQ ID No. 15和16中的輕鏈和重鏈氨基酸序列(Pertuzumab)的抗體。本文中的組合物包含結合HER2結構域II的主要種類HER2抗體及其酸性變體，其 中所述酸性變體包括糖化變體、二硫化物還原變體、和不可還原變體中的一項、兩項、或三 項。所述組合物中的酸性變體可以包括糖化變體、脫酰胺變體、二硫化物還原變體、唾液酰 化變體、和不可還原變體中的一項、兩項、三項、四項、或五項。優選的是，所述組合物中所有 酸性變體的總量少于約25%。在一個實施方案中，糖化變體、脫酰胺變體、二硫化物還原變 體、唾液酰化變體、和不可還原變體構成所述組合物中酸性變體的至少約75-80%。本發明還關注包含主要種類HER2抗體及主要種類抗體的酸性變體的組合物，其 中所述主要種類HER2抗體包含SEQ ID No. 3和4中的可變輕鏈和可變重鏈序列，且其中所 述酸性變體包括糖化變體、脫酰胺變體、二硫化物還原變體、唾液酰化變體、和不可還原變 體中的一項、兩項、三項、四項、或五項。本發明提供一種制備藥物組合物的方法，包括(1)制備包含結合HER2結構域II 的主要種類HER2抗體及其酸性變體的組合物，所述酸性變體包括糖化變體、二硫化物還原 變體、或不可還原變體，并(2)評估所述組合物中的酸性變體，并確定其量少于約25%。所 述方法涵蓋將步驟(2)之前、期間、或之后的組合物與藥學可接受載體組合。在一個實施方 案中，在步驟(2)中評估的組合物在藥學可接受載體中。在一個實施方案中，至少約75-80%的酸性變體(構成組合物的少于約25% )選 自糖化變體、脫酰胺變體、二硫化物還原變體、唾液酰化變體、和不可還原變體。酸性變體可以通過多種方法來評估，但是優選的是所述方法包括下述一項、兩項、 三項、四項、或五項離子交換層析(IEC)，其中在IEC之前、之后、和/或期間用唾液酸酶處 理組合物(例如用于評估唾液酰化變體)；還原性CE-SDS (例如用于評估二硫化物還原變 體)；非還原性CE-SDS(例如用于評估不可還原變體)；硼酸鹽層析(例如用于評估糖化變 體)；和肽作圖(例如用于評估脫酰胺變體)。在一個實施方案中，通過離子交換層析來分析總的酸性變體，例如使用弱陽離子 交換劑和/或具有羧酸根官能團的陽離子交換劑(例如使用DI0NEXPR0PACJ WCX-10層析 柱)。在此類層析的一個實施方案中，層析條件涉及緩沖液A為20mM BisTris, pH 6.0；緩沖液 B 為 20mM BisTris, 200mM NaCl, ρΗ6. 0 ；和 1. OmL/min 的 0. 5%緩沖液 B 梯度。所述組合物任選包含氨基末端前導延伸變體。優選的是，所述氨基末端前導延伸 位于抗體變體的輕鏈上(例如位于抗體變體的一條或兩條輕鏈上)。所述主要種類HER2抗 體或抗體變體可以是完整抗體或抗體片段(如Fab或F (ab ’)2片段)，但優選二者都是完整 抗體。本文中的抗體變體可以在其任何一條或多條重鏈或輕鏈上包含氨基末端前導延伸。 優選的是，所述氨基末端前導延伸位于抗體的一條或兩條輕鏈上。所述氨基末端前導延伸 優選包含VHS-或由其組成。組合物中氨基末端前導延伸的存在可通過多種分析技術來檢 測，包括但不限于N-末端序列分析、電荷異質性的測定法(例如陽離子交換層析或毛細管 區帶電泳)、質譜等。組合物中抗體變體的量通常在如下范圍內，即從構成用于檢測變體的 任何測定法(優選陽離子交換分析)的檢測下限的量到少于主要種類抗體量的量的范圍。 通常，組合物中約20%或更少(例如從約至約15%，例如從5%至約15%，且優選從約 8%至約12%)的抗體分子包含氨基末端前導延伸。這樣的百分比量優選通過陽離子交換 分析來測定。涵蓋主要種類抗體和/或變體的其它氨基酸序列改變，包括但不限于在其一條或 所有兩條重鏈上包含C-末端賴氨酸殘基的抗體(這樣的抗體變體可以以約至約20% 的量存在)、具有一個或多個氧化后甲硫氨酸殘基的抗體(例如包含氧化后met-254的 Pertuzumab)等。此外，在上文討論的唾液酰化變體之外，主要種類抗體或變體可包含別的糖基化 變異，其非限制性例子包括包含附著于其Fc區的Gl或G2寡糖結構的抗體、包含附著于其 輕鏈的碳水化合物模塊的抗體(例如一個或多個碳水化合物模塊，諸如葡萄糖或半乳糖附 著于抗體的一條或兩條輕鏈，例如附著于一個或多個賴氨酸殘基)、包含一條或兩條非糖基 化重鏈的抗體等。任選的是，包含一條或兩條輕鏈的抗體，其中兩條輕鏈其中任一或二者包含SEQ ID No. 23中的氨基酸序列(包括其變體，諸如本文中公開的那些)。所述抗體還包含一條 或兩條重鏈，其中兩條重鏈其中任一或二者包含SEQ IDNo. 16或SEQ ID No. 24中的氨基酸 序列(包括其變體，諸如本文中公開的那些)。組合物可從表達HER2抗體的基因工程細胞系回收，從例如中國倉鼠卵巢(CHO)細 胞系回收，或者可通過肽合成來制備。III.HER2抗體的生成下文描述了用于生成依照本發明使用的抗體的例示性技術。用于生成抗體的HER2 抗原可以是例如可溶形式的HER2胞外域或其含有所需表位的部分。或者，在其細胞表面表 達HER2的細胞(例如經轉化而過表達HER2的NIH-3T3細胞；或癌細胞系，諸如SK-BR-3細 胞，參見 Stancovski et al.，PNAS (USA) 88 :8691_8695 (1991))可用于生成抗體。可用于生 成抗體的其它形式HER2對于本領域技術人員是顯而易見的。( )單克隆抗體單克隆抗體是從一群基本上同質的抗體獲得的，即構成群體的各個抗體相同和/ 或結合相同表位，除了單克隆抗體生產過程中可能產生的可能突變外，諸如本文所述那些 變體。因此，修飾語“單克隆”表示抗體的特征，即不是分立抗體的混合物。例如，單克隆抗體可通過最初由Kohler et al. ,Nature 256 :495(1975)描述的雜交瘤方法來制備，或者可通過重組DNA方法來制備(美國專利4，816，567)。在雜交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它合適的宿主動物，諸如倉鼠，以引發生 成或能夠生成如下抗體的淋巴細胞，所述抗體將特異性結合用于免疫的蛋白質。或者，可 以在體外免疫淋巴細胞。然后，使用合適的融合劑諸如聚乙二醇將淋巴細胞與骨髓瘤細胞 &，(Goding，《Monoclonal Antibodies =Principles and Practice》， 59-103，Academic Press，1986)。將如此制備的雜交瘤細胞在合適的培養基中接種和培養，所述培養基優選含有抑 制未融合的親本骨髓瘤細胞生長或存活的一種或多種物質。例如，如果親本骨髓瘤細胞缺 乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培養基通常將含有 次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培養基)，這些物質阻止HGPRT缺陷細胞生長。優選的骨髓瘤細胞是那些高效融合、支持所選抗體生成細胞穩定的高水平生成 抗體、并對諸如HAT培養基等培養基敏感的骨髓瘤細胞。在這些細胞中，優選的骨髓瘤細 胞系是鼠源骨髓瘤系，諸如那些可從Salk Institute Cell Distribution Center (San Diege，California, USA)獲得的M0PC-21和MPC-11小鼠腫瘤的衍生系，及可從American Type Culture Collection(Rockville, Maryland, USA)獲得的 SP-2 或 X63_Ag8_653 細 胞。用于生成人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系也已有描述(Kozbor， J. Immunol. 133 3001(1984) ； R Brodeur φ A, ((Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications》，51-63, Marcel Dekker, Inc. , New York,1987)。可對雜交瘤細胞正在其中生長的培養基測定針對抗原的單克隆抗體的生成。優選 的是，通過免疫沉淀或通過體外結合測定法，諸如放射性免疫測定法(RIA)或酶聯免疫吸 附測定法(ELISA)，測定由雜交瘤細胞生成的單克隆抗體的結合特異性。單克隆抗體的結合親和力可通過例如Munson et al.，Anal. Biochem. 107 220(1980)的 Scatchard 分析來測定。在鑒定得到生成具有所需特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞后，所 述克隆可通過有限稀釋流程進行亞克隆，并通過標準方法進行培養(Goding，((Monoclonal Antibodies :Principles and Practice》，59-103, Academic Press, 1986)。適于這一目的 的培養基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養基。另外，雜交瘤細胞可在動物中作為腹水瘤 進行體內培養。可通過常規抗體純化流程，諸如例如蛋白A-S印harose、羥磷灰石層析、凝膠電泳、 透析或親和層析，將亞克隆分泌的單克隆抗體與培養基、腹水或血清適當分開。編碼單克隆抗體的DNA易于通過常規流程分離并測序(例如使用能夠特異性結 合編碼鼠源抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。以雜交瘤細胞作為所述DNA的優選 來源。一旦分離，可將DNA置于表達載體中，然后將該表達載體轉染到宿主細胞中，諸如不 另外產生抗體蛋白質的大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤 細胞，以在重組宿主細胞中獲得單克隆抗體的合成。關于編碼抗體的DNA在細菌中的重組 表達的綜述性論文包括 Skerra et al.，Curr. Opinion in Immunol. 5 256-262 (1993)和 Pluckthun, Immunol. Revs. 130 :151_188(1992)。在另一個實施方案中，可從使用McCaffertyet al. ,Nature 348:552-554(1990) 所述技術構建的噬菌體抗體庫中分離單克隆抗體或抗體片段。Clackson et al.，Nature352:624-628(1991)和 Marks et al.，J. Mol. Biol. 222 :581_597 (1991)分別描述了使用 噬菌體文庫分離鼠源和人源抗體。后續出版物描述了通過鏈改組(Marks et al. , Bio/ Technology 10 :779_783 (1992))，以及組合感染和體內重組作為構建非常大的噬菌體文庫 的策略(ffaterhouse et al.，Nuc. Acids Res. 21 :2265_2266 (1993))，生成高親和力(nM 范 圍)的人源抗體。因此，這些技術是用于分離單克隆抗體的傳統單克隆抗體雜交瘤技術的 可行替代方法。還可以修飾DNA，例如通過替代即用人重鏈和輕鏈恒定區的編碼序列代替同源 鼠源序列(美國專利 4，816，567 ；及 Morrison et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851 (1984))，或通過共價接合免疫球蛋白編碼序列和非免疫球蛋白多肽的整個或部分編 碼序列。通常，用此類非免疫球蛋白多肽替代抗體的恒定區，或者用它們替代抗體的一個 抗原結合位點的可變區，以產生嵌合二價抗體，它包含對一種抗原具有特異性的一個抗原 結合位點及對不同抗原具有特異性的另一個抗原結合位點。(ii)人源化抗體本領域已經描述了用于將非人抗體人源化的方法。優選的是，人源化抗體具有一 個或多個從非人來源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常稱作“輸入”殘基，它們 通常取自“輸入”可變區。人源化可基本上依照Winter及其同事的方法進行(Jones et al., Nature 321 522-525(1986) ；Riechmann et al.，Nature 332 323-327(1988) ；Verhoeyen et al.，Science 239 1534-1536 (1988))，通過用高變區序列替代相應的人抗體序列。因 此，此類“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利4，816，567)，其中本質上少于整個人可變區 用來自非人物種的相應序列替代。在實踐中，人源化抗體通常是其中一些高變區殘基和可 能的一些FR殘基用來自嚙齒類抗體中類似位點的殘基替代的人抗體。用于制備人源化抗體的人可變區的選擇，包括輕鏈和重鏈，對于降低抗原性非常 重要。依照所謂的“最適(best-fit)”方法，用嚙齒類抗體可變區序列對已知的人可變區 序列的整個文庫進行篩選。然后選擇與嚙齒類最接近的人序列作為人源化抗體的人框架 區(FR) (Sims et al.，J. Immunol. 151 2296(1993) ；Chothia et al.，J. Mol. Biol. 196 901 (1987))。另一種方法使用由特定輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體的共有序列衍生的特定 框架區。同一框架可用于數種不同的人源化抗體(Carter et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 4285(1992) ；Presta et al.，J. Immunol. 151:2623(1993))。更為重要的是，抗體在人源化后保持對抗原的高親和力及其它有利的生物學特 性。為了實現這一目的，依照一種優選的方法，通過使用親本和人源化序列的三維模型分析 親本序列和各種概念性人源化產物的方法來制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常是 可獲得的，且為本領域熟練技術人員所熟悉。還可獲得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序 列的可能三維構象結構的計算機程序。檢查這些顯示圖像能夠分析殘基在候選免疫球蛋白 序列行使功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原的能力的殘基。這樣， 可從受體和輸入序列中選出FR殘基并進行組合，從而獲得所需抗體特征，諸如對靶抗原的 親和力提高。通常，高變區殘基直接且最實質的涉及對抗原結合的影響。美國專利第6，949，245號描述了結合HER2并阻斷HER受體的配體活化的例示性 人源化HER2抗體的生成。本文中特別感興趣的人源化抗體基本上像完整鼠單克隆抗體2C4 (或其Fab片段)一樣有效的阻斷EGF、TGF- α和/或HRG介導的MAPK激活，和/或基 本上像完整鼠單克隆抗體2C4 (或其Fab片段)一樣有效的結合HER2。本文中的人源化抗體 可例如包含摻入人重鏈可變區的非人高變區殘基，而且還可在選自69Η、71Η和73Η的位置 包含框架區(FR)替代，采用的是 Kabat 等人，《Sequences of Proteins of Immunological Interest》，第 5 版，Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD, 1991中給出的可變區編號系統。在一個實施方案中，人源化抗體在69H、71H和73H的兩 個或所有位置包含FR替代。本文中的例示性目的人源化抗體包含重鏈可變區互補決定殘基GFTFTDYTMX，其中 X優選是D或S(SEQ ID NO 7) ；DVNPNSGGSIYNQRFKG(SEQ ID NO 8)；和/或NLGPSFYFDY(SEQ ID NO :9)，任選包含那些CDR殘基的氨基酸修飾，例如其中修飾基本上保持或改善抗體的 親和力。例如，目的抗體變體可在上述重鏈可變區CDR序列中具有約1個至約7個或者約5 個氨基酸替代。這樣的抗體變體可通過親和力成熟來制備，例如如下文所述。最優選的人 源化抗體包含SEQ ID NO 4中的重鏈可變區氨基酸序列。例如，除了前一段落中的那些重鏈可變區⑶R殘基之外，人源化抗體還可包含輕 鏈可變區互補決定殘基KASQDVSIGVA(SEQ ID NO 10) ；SASYX1X2X3,其中X1優選是R或L，X2 優選是 Y 或 E，而 X3 優選是 T 或 S(SEQID NO: 11)；和 / 或 QQYYIYPYT (SEQ ID NO: 12)。這 樣的人源化抗體任選包含上述CDR殘基的氨基酸修飾，例如其中修飾基本上保持或改善抗 體的親和力。例如，目的抗體變體可在上述輕鏈可變區CDR序列中具有約1個至約7個或 者約5個氨基酸替代。這樣的抗體變體可通過親和力成熟來制備，例如如下文所述。最優 選的人源化抗體包含SEQ ID NO 3中的輕鏈可變區氨基酸序列。本申請還設想了親和力成熟的抗體，它結合HER2并阻斷HER受體的配體活化。親 本抗體可以是人抗體或人源化抗體，例如包含輕鏈和/或重鏈可變區序列分別為SEQ ID NO 3和4的抗體(即變體574)。親和力成熟的抗體優選以高于完整鼠2C4或完整變體574 的親和力結合HER2受體(例如根據采用HER2胞外域(ECD) ELISA的評估，例如親和力提高 約2倍或約4倍至約100倍或約1000倍)。例示性的用于替代的重鏈可變區CDR殘基包括 H28、H30、H34、H35、H64、H96、H99，或者兩個或多個的組合(例如這些殘基中的2、3、4、5、6 或7個)。用于改變的輕鏈可變區CDR殘基的例子包括L28、L50、L53、L56、L91、L92、L93、 L94、L96、L97，或者兩個或多個的組合(例如這些殘基中的2至3、4、5或直到約10個)。還設想了各種形式的人源化抗體或親和力成熟的抗體。例如，人源化抗體或親和 力成熟的抗體可以是抗體片段，諸如Fab，它任選與一種或多種胞毒劑偶聯以產生免疫偶聯 物。或者，人源化抗體或親和力成熟的抗體可以是完整抗體，諸如完整的IgGl抗體。(iii)人抗體作為人源化的替代方法，可生成人抗體。例如，現在有可能生成在缺乏內源免 疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫后生成人抗體完整全集的轉基因動物(如小鼠)。例 如，已經描述了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(JH)基因的純合刪除導致內源抗 體生成的完全抑制。在此類種系突變小鼠中轉移大量人種系免疫球蛋白基因將導致在 抗原攻擊后生成人抗體。參見例如Jakobovits et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993) Jakobovits et al. ,Nature 362:255-258(1993) ；Bruggermann et al. ,Year in Immuno. 7 33 (1993)；及美國專利 5，591，669,5, 89，369 和 5，545，807。
或者，噬菌體展示技術(McCaffertyet al. ,Nature 348 :552_553 (1990))可用于 在體外從來自未免疫供體的免疫球蛋白可變(V)區基因全集生成人抗體和抗體片段。依照 這種技術，將抗體V區基因克隆到絲狀噬菌體諸如M13或fd的主要或次要外殼蛋白基因的 讀碼框中，并在噬菌體顆粒表面上展示為功能性抗體片段。因為絲狀顆粒包含噬菌體基因 組的單鏈DNA拷貝，以抗體的功能特性為基礎進行的選擇也導致編碼展示那些特性的抗體 的基因的選擇。因此，噬菌體模擬B細胞的一些特性。噬菌體展示可以多種形式進行；有關 綜述參見例如 Johnson,Kevin S. and Chiswell,DavidJ. ,Current Opinion in Structural Biology 3 :564-571 (1993)。V基因區段的數種來源可用于噬菌體展示。Clackson et al.， Nature 352 =624-628(1991)從衍生自經免疫小鼠脾的小型V基因隨機組合文庫分離得到 大量不同的抗噁唑酮抗體。可本質上依照Marks et al.，J. Mol. Biol. 222 :581_597 (1991) 或Griffith et al.，EMBO J. 12 :725_734 (1993)所述技術，由未免疫人供體構建V基因全 集，并分離針對大量不同抗原(包括自身抗原)的抗體。還可參見美國專利5，565，332和 5，573，905。還可通過體外激活B細胞(參見美國專利5，567，610和5，229，275)來生成人抗體。1998年6月30日發布的美國專利5，772，997和1997年1月3日出版的 W097/00271中描述了人HER2抗體。(iv)抗體片段已經開發了用于生成抗體片段的多種技術。傳統上，通過蛋白水解消化完整抗體
Morimoto et al. ,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992)及 Brennan et al.，Science 229:81(1985))。然而，現在可 直接由重組宿主細胞生成這些片段。例如，可從上文討論的噬菌體抗體庫分離抗體片段。 或者，可直接從大腸桿菌回收Fab' -SH片段，并通過化學方法偶聯形成F(ab' )2片段 (Carter et al. ,Bio/Technology 10 163-167 (1992))。依照另一種方法，可直接從重組宿 主細胞培養物分離F(ab' )2片段。用于生成抗體片段的其它技術對熟練從業人員是顯而 易見的。在其它實施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 93/16185;美國 專利5，571，894 ；和美國專利5，587，458。抗體片段還可以是“線性抗體”，例如如美國專利 5，641，870中所述。所述線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。(V)雙特異性抗體雙特異性抗體指對至少兩種不同表位具有結合特異性的抗體。例示性的雙特異性 抗體可結合HER2蛋白質的兩種不同表位。其它此類抗體可將HER2結合位點與EGFR、HER3 和/或HER4的結合位點進行組合。或者，HER2臂可與結合白細胞上觸發分子諸如T細胞 受體分子(如 CD2 或 CD3)或 IgG 的 Fc 受體(Fe y R)，諸如 Fc y RI (CD64), FcyRII (CD32) 和Fc γ RIII (⑶16)的臂組合，使得細胞防御機制聚焦于HER2表達細胞。雙特異性抗體還 可用于將胞毒劑定位于表達HER2的細胞。這些抗體擁有HER2結合臂及結合胞毒劑(如肥 皂草毒蛋白、抗干擾素-α、長春花生物堿、蓖麻毒蛋白A鏈、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗 原)的臂。可將雙特異性抗體制備成全長抗體或抗體片段(如F(ab' )2雙特異性抗體)。WO 96/16673描述了一種雙特異性HER2/Fc γ RIII抗體，而美國專利5，837，234 公開了 一種雙特異性HER2/Fc y RI抗體IDMl (Osidem)。W098/02463顯示了一種雙特異性HER2/Fc α抗體。美國專利5，821，337教導了一種雙特異性HER2/CD3抗體。MDX-210是一 種雙特異性HER2-Fc YRIII抗體。用于制備雙特異性抗體的方法是本領域已知的。全長雙特異性抗體的傳統生成基 于兩種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達，其中兩種鏈具有不同的特異性(Millstein et al. , Nature 305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配，這些雜交瘤 (四源雜交瘤(quadroma))生成10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確 的雙特異性結構。通常通過親和層析步驟進行的正確分子的純化相當麻煩，且產物產量低。 WO 93/08829 及 Traunecker et al. , EMBO J. 10:3655-3659(1991)中公開了類似的流程。依照一種不同的方法，將具有所需結合特異性(抗體_抗原結合位點)的抗體可 變區與免疫球蛋白恒定區序列融合。融合優選使用包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區的免 疫球蛋白重鏈恒定區。優選的是，在至少一種融合物中具有包含輕鏈結合所必需的位點的 第一重鏈恒定區(CHl)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物以及，如果需要，免疫球蛋白輕鏈的 DNA插入分開的表達載體，并共轉染到合適的宿主生物體中。在用于構建的三種多肽鏈比例 不等時提供最佳產量的實施方案中，這為調整三種多肽片段的相互比例提供了很大的靈活 性。然而，在至少兩種多肽鏈以相同比率表達導致高產量時或在該比率沒有特別意義時，有 可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一個載體。在該方法的一個優選實施方案中，雙特異性抗體由一個臂上具有第一結合特異性 的雜合免疫球蛋白重鏈，和另一個臂上的雜合免疫球蛋白重鏈_輕鏈對(提供第二結合特 異性)構成。由于免疫球蛋白輕鏈僅在半個雙特異性分子中的存在提供了分離的便利途 徑，因此發現這種不對稱結構便于將所需雙特異性復合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分 開。該方法公開于W094/04690。關于生成雙特異性抗體的其它細節參見例如Suresh et al. , Methods in Enzymology 121:210(1986)。依照美國專利5，731，168中描述的另一種方法，可改造一對抗體分子之間的界 面，將從重組細胞培養物中回收的異二聚體的百分比最大化。優選的界面包含至少部分CH3 抗體恒定區。在該方法中，將第一抗體分子界面的一個或多個小氨基酸側鏈用較大側鏈 (如酪氨酸或色氨酸)替換。通過用較小氨基酸側鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)替換大氨基酸 側鏈，在第二抗體分子的界面上產生針對大側鏈的相同或相似大小的補償性“空腔”。這提 供了較之其它不想要的終產物諸如同二聚體提高異二聚體產量的機制。雙特異性抗體包括交聯或“異源偶聯”抗體。例如，異源偶聯物中的一種抗體可與 親合素偶聯，另一種抗體與生物素偶聯。例如，此類抗體建議用于將免疫系統細胞靶向不想 要的細胞(美國專利4，676，980)，和用于治療HIV感染(W0 91/00360,WO 92/200373和EP 03089)。可使用任何便利的交聯方法來制備異源偶聯抗體。合適的交聯劑是本領域眾所周 知的，并且連同許多交聯技術一起公開于美國專利4，676，980。文獻中還描述了由抗體片段生成雙特異性抗體的技術。例如，可使用化學連接來 制備雙特異性抗體。Brennan et al.，Science 229 81(1985)描述了通過蛋白水解切割完 整抗體以生成F(ab' )2片段的方法。將這些片段在存在二硫醇絡合劑亞砷酸鈉的情況下 還原，以穩定鄰近的二硫醇并防止分子間二硫鍵的形成。然后將產生的Fab’片段轉變為硫 代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后將Fab' -TNB衍生物之一通過巰基乙胺的還原重新恢 復成Fab'-硫醇，并與等摩爾量的另一種Fab' -TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。產生的雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定化試劑。最近的進展使得從大腸桿菌中直接回收Fab' -SH片段變得更加容易，這些片段 可化學偶聯以形成雙特異性抗體。Shalaby et al.，J. Exp. Med. 175 :217_225 (1992)描述 了生成完全人源化的雙特異性抗體F(ab' )2分子。每個Fab'片段由大腸桿菌分開分泌， 并在體外進行定向化學偶聯以形成雙特異性抗體。如此形成的雙特異性抗體能夠結合過表 達HER2受體的細胞和正常人T細胞，以及觸發人細胞毒性淋巴細胞針對人乳房腫瘤靶的溶 解活性。還描述了從重組細胞培養物直接制備和分離雙特異性抗體片段的多種技術。 例如，已使用亮氨酸拉鏈生成雙特異性抗體。Kostelny et al. , J. Immunol. 148(5) 1547-1553(1992)。將來自Fos和Jim蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩種不同抗 體的Fab'部分連接。抗體同二聚體在鉸鏈區還原而形成單體，然后重新氧化而形成抗 體異二聚體。這種方法也可用于生成抗體同二聚體。由Hollinger et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 =6444-6448(1993)描述的“雙抗體”技術提供了制備雙特異性抗體片段 的替代機制。該片段包含通過接頭相連的輕鏈可變區和重鏈可變區(Vh)，所述接頭 太短使得同一條鏈上的兩個結構域之間不能配對。因此，迫使一個片段上的Vh和\結構 域與另一個片段上的互補\和Vh結構域配對，由此形成兩個抗原結合位點。還報道了通 過使用單鏈Fv(sFv) 二聚體制備雙特異性抗體片段的另一種策略。參見Gruber et al., J. Immunol. 152 5368(1994)。設想了具有超過兩個效價的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt et al., J. Immunol. 147 60(1991)。(vi)其它氨基酸序列修飾設想了本文所述HER2抗體的氨基酸序列修飾。例如，可能希望改進抗體的結合親 和力和/或其它生物學特性。通過將適當的核苷酸改變引入HER2抗體核酸或者通過肽合 成來制備HER2抗體的氨基酸序列變體。此類修飾包括例如HER2抗體氨基酸序列中的殘基 刪除和/或插入和/或替代。只要最終的構建物具有所需特性，可進行刪除、插入和替代的 任何組合以獲得最終的構建物。氨基酸變化還可改變HER2抗體的翻譯后加工，諸如改變糖 基化位點的數目或位置。可用于鑒定HER2抗體中作為優選誘變位置的某些殘基或區域的一種方法稱作 “丙氨酸掃描突變”，如 Cunningham and Wells, Science 244 1081-1085 (1989)所述。這 里，鑒定了一個或一組靶殘基(例如帶電荷的殘基，諸如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸 和谷氨酸)，并用中性或帶負電荷的氨基酸(最優選丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以影響氨基 酸與HER2抗原的相互作用。然后通過在或對替代位點引入更多或其它變體，推敲那些對替 代顯示功能敏感性的氨基酸位置。因此，雖然引入氨基酸序列變異的位點是預先決定的，但 是突變本身的性質不需要預先決定。例如，為了分析在指定位點處的突變的后果，在靶密碼 子或區域進行丙氨酸掃描誘變或隨機突變，并對所表達的HER2抗體變體篩選所需活性。氨基酸序列插入包括氨基_和/或羧基_末端的融合，長度范圍從一個殘基至包 含上百或更多殘基的多肽，以及單個或多個氨基酸殘基的序列內插入。末端插入的例子包 括具有N-末端甲硫氨酰殘基的HER2抗體或與細胞毒性多肽融合的抗體。HER2抗體分子的 其它插入變體包括在HER2抗體的N-或C-末端融合酶(例如用于ADEPT)或提高抗體血清半衰期的多肽。另一類變體是氨基酸替代變體。這些變體在HER2抗體分子中有至少一個氨基酸 殘基用不同殘基替換。最感興趣進行替代誘變的位點包括高變區或CDR，但也考慮了 FR或 Fc區改變。保守替代在表1中顯示在標題“優選替代”下。如果此類替代導致生物學活性 的改變，那么可以引入表1中稱為“例示替代”的更實質性改變，或如下文中關于氨基酸種 類的進一步描述，并篩選產物。表 權利要求
一種包含結合HER2結構域II的主要種類HER2抗體及其酸性變體的組合物，其中所述酸性變體包括糖化變體、二硫化物還原變體、或不可還原變體。
2.權利要求1的組合物，其中所述組合物包含糖化變體。
3.權利要求1或權利要求2的組合物，其中所述組合物包含二硫化物還原變體。
4.前述權利要求任一項的組合物，其中所述組合物包含不可還原變體。
5.前述權利要求任一項的組合物，其中所述酸性變體包括糖化變體、脫酰胺變體、二硫 化物還原變體、唾液酰化變體、和不可還原變體。
6.前述權利要求任一項的組合物，其中所述酸性變體的量少于約25%。
7.前述權利要求任一項的組合物，其中所述主要種類HER2抗體和所述酸性變體都是 完整抗體。
8.前述權利要求任一項的組合物，其中所述主要種類HER2抗體包含SEQIDNo. 3和4 中的可變輕鏈和可變重鏈氨基酸序列。
9.權利要求8的組合物，其中所述主要種類HER2抗體包含SEQID No. 15和16中的輕 鏈和重鏈氨基酸序列。
10.前述權利要求任一項的組合物，其包含所述主要種類抗體的氨基末端前導延伸變體。
11.權利要求10的組合物，其中所述氨基末端前導延伸包含VHS-。
12.權利要求11的組合物，其中所述氨基末端前導延伸由VHS-組成。
13.前述權利要求任一項的組合物，其包含所述主要種類HER2抗體的選自下組的氨基 酸序列變體在其一條或兩條重鏈上包含C末端賴氨酸殘基的抗體，和具有一個或多個氧 化的甲硫氨酸殘基的抗體。
14.一種藥物配制劑，其在藥學可接受載體中包含前述權利要求任一項的組合物。
15.權利要求14的藥物配制劑，其是無菌的。
16.一種包含主要種類HER2抗體及該主要種類抗體的酸性變體的組合物，其中所述主 要種類HER2抗體包含SEQ ID No. 3和4中的可變輕鏈和可變重鏈序列，且其中所述酸性變 體包括糖化變體、脫酰胺變體、二硫化物還原變體、唾液酰化變體、和不可還原變體。
17.一種藥物配制劑，其在藥學可接受載體中包含權利要求16的組合物。
18.一種治療患者中HER2陽性癌癥的方法，包括以有效治療所述癌癥的量對所述患者 施用權利要求17的藥物配制劑。
19.權利要求18的方法，其中所述癌癥選自下組乳腺癌、卵巢癌、肺癌、和結腸直腸癌。
20.權利要求18的方法，其中所述主要種類抗體和酸性變體具有本質上相同的藥動學。
21.一種制備藥物組合物的方法，包括(1)制備包含結合HER2結構域II的主要種類 HER2抗體及其酸性變體的組合物，所述酸性變體包括糖化變體、二硫化物還原變體、或不可 還原變體，并(2)評估所述組合物中的所述酸性變體，并確認其量少于約25%。
22.權利要求21的方法，其中步驟(2)包括通過選自下組的方法來評估所述酸性變體 離子交換層析，其中所述組合物用唾液酸酶處理；有十二烷基硫酸鈉的還原性毛細管電泳 (CE-SDS)；非還原性CE-SDS ；硼酸鹽層析；和肽作圖。2
23.權利要求21的方法，其中步驟(2)包括通過離子交換層析來評估所述酸性變體。
24.權利要求23的方法，其包括使用具有羧酸根官能團的陽離子交換劑的陽離子交換 層析。
25.權利要求24的方法，其中所述層析的條件包括緩沖液A為20mMBisTris, pH 6.0 ；緩沖液 B 為 20mM BisTris, 200mM NaCl，pH 6. 0 ；和 1. OmL/min 的 0. 5% 緩沖液 B 梯度。
26.權利要求21的方法，其包括將步驟(2)后的組合物與藥學可接受載體組合。
27.權利要求21的方法，其中步驟(2)中評估的組合物在藥學可接受載體中。
全文摘要
描述了一種包含結合HER2結構域II的主要種類HER2抗體及其酸性變體的組合物。還公開了包含所述組合物的藥物配制劑及所述組合物的治療用途。
文檔編號C07K1/18GK101981056SQ200980111007
公開日2011年2月23日 申請日期2009年1月28日 優先權日2008年1月30日
發明者保羅·A·莫克尼克, 里德·J·哈里斯 申請人:健泰科生物技術公司