非糖基化蛋白質的純化的制作方法

專利名稱：非糖基化蛋白質的純化的制作方法
技術領域：
本發明涉及多肽純化的領域。報道了利用三個層析步驟的組合純化非糖基化多肽 的一般方法。
背景技術：
蛋白質在今天的醫藥領域中起重要作用。對于人類應用，每一藥學物質必須滿足 不同的標準。為了保證生物藥劑對人類的安全性，必須特異性地去除可能引起嚴重危害的 核酸、病毒和宿主細胞蛋白質。為了滿足管理規定，制造方法后必須進行一個或更多純化步 驟。其中，純度、通量和產量在決定適當的純化方法中起重要作用。很好地建立了不同方法，并且所述方法廣泛用于蛋白質純化，如使用親硫配體、 Cu-螯合物或微生物蛋白質的親和層析(例如A蛋白或G蛋白親和層析)、離子交換層析 (例如陽離子交換層析、陰離子交換層析和混合模式層析)、親硫吸附、疏水相互作用或芳 香族吸附層析、大小排阻層析和電泳方法(如凝膠電泳、毛細管電泳)(Vijayalakshmi， Μ. Α.，App1. Biochem. Biotech. 75(1998)93—102)。例如可通過原核細胞如大腸桿菌(E. coli.)產生重組多肽。重組產生的多肽占原 核細胞多肽含量的大多數并且在原核細胞中經常沉積為不可溶的聚集物，即沉積為所謂的 包含體。為了分離重組多肽，必須崩解細胞并從細胞碎片中分離所述包含體后將該包含體 中所含的重組多肽溶解。對于增溶離液劑，使用如尿素或鹽酸胍。尤其是在堿性條件下，為 了切割二硫鍵，加入還原劑，如二硫赤蘚糖醇、二硫蘇糖醇或β-巰基乙醇。在將聚集的多 肽溶解后，必須重新建立生物活性必需的重組多肽的球形結構。在這個所謂的復性過程中， 例如通過針對合適的緩沖液進行透析來緩慢降低變性劑的濃度，其允許變性的多肽重新折 疊成生物活性結構。復性后是重組多肽純化到預期使用的可接受純度。例如，為了用作治 療蛋白，必須建立高于90%的純度。從大腸桿菌中獲得的重組產生的多肽一般伴隨有核酸、 內毒素、來自生產細胞的多肽和非復性的重組多肽。在可獲得許多不同層析方法的情況下，必須測試許多組合以尋找合適的純化方 法。在這些組合中，可使用不用的順序，甚至不同數量的層析方法。因此，期望擁有確定層 析步驟的合適順序用以純化非糖基化的多肽的方法。在WO 2007/075283中報道了靶分子純化的多步驟系統和方法。在W02007/016250 中報道了用于純化包含目的蛋白的化合物的方法。在W02006/101441中報道了僅 包括一個或很少程序步驟的純化重組蛋白的方法。Rege等(Rege，K.，Biotechnol. Bioeng. 93 (2006) 618-630)報道了用于重組蛋白質純化的高通量方法開發。在KR 2002/080108中報道了用于從重組大腸桿菌中純化人生長激素的方法。發明概述本發明的第一個方面是用于純化已經在原核細胞中重組產生的非糖基化異源多 肽的方法，其中所述方法包括以下順序的以下三個層析步驟a)選自以下的第一個層析步驟i)疏水電荷誘導層析，
ii)疏水作用層析，iii)親和層析，或iv)離子交換層析，b)選自以下的第二個層析步驟i)陰離子交換層析，ii)陽離子交換層析，iii)羥基磷灰石層析，iv)疏水作用層析，或ν)疏水電荷誘導層析，c)選自以下的第三個層析步驟i)疏水電荷誘導層析，ii)陰離子交換層析，iii)陽離子交換層析，或iv)疏水作用層析，由此，-在多肽能夠與金屬配體相互作用的情況下，第一個層析步驟是親和層析，-在多肽具有低于6.0的等電點的情況下第二個層析步驟不是羥基磷灰石層析步 驟，-在多肽具有低或高等電點的情況下可以以流通模式進行第三個層析步驟，-任選地第三個層析步驟可用于多肽的濃縮，并在步驟C)后獲得純化的非糖基化異源多肽。本發明的方法包括至少三個層析步驟，由此對于每一步驟，可不依賴于為前述步 驟或以下步驟所選的層析材料選擇層析材料，由此僅需要考慮所給出的條件。因此，本發明 的方法提供了用于純化非糖基化多肽的靈活的和可交換順序的層析步驟，由此在非糖基化 多肽經歷本發明方法后獲得的純度同樣獨立于所選層析步驟順序。在一個實施方案中，原核細胞是大腸桿菌細胞。在另一實施方案中，親和層析是金 屬螯合層析。在進一步實施方案中，方法在步驟a)或步驟b)或步驟c)后包括額外的步驟 d)將所述多肽聚乙二醇化。在一個實施方案中，所述步驟a)和b)是陽離子交換層析。又 在進一步的實施方案中是選自生長因子激動劑或拮抗劑，或干擾素或干擾素變體的非糖基 化異源多肽。本發明的第二方面是在原核細胞中重組產生非糖基化異源多肽的方法，其中所述 方法包括以下步驟a)在適合于表達異源多肽的情況下培養包含編碼異源多肽的核酸的原核細胞，b)從培養基或原核細胞中回收異源多肽，c)利用本發明的方法純化異源多肽，并由此獲得非糖基化異源多肽。在一個實施方案中，本發明的方法的特征在于至少兩個不同順序的三個層析步驟 產生具有相當純度的純化的非糖基化異源多肽。在一個實施方案中，可在具有低，即6. 0或 更低，或高，即8. 0或更高等電點的多肽的情況下以流通模式進行第三個層析步驟。發明詳述
6
一般層析方法及其用途為本領域技術人員所知。參閱例如，Chromatography， 第 5 版，Part A !Fundamentals and Techniques, Heftmann, Ε·(編 輯)，Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992) ；Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z.(編輯)，Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998) ；Chromatography Today, Poole, C. F.,禾口 Poole, S. K. , Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991), Scopes, Protein Purification-Principles and Practice (1982) ；Sambrook, J·，等(編輯)，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. ,1989 ；Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. Μ., 等(編輯)· , John Wiley & Sons, Inc. , New York ；或 Freitag, R. , Chromatographical processes in the downstream processing of(recombinant)proteins, Meth. Biotechno 1.24(2007)421-453(Animal cell biotechnology 第 2 版)。很好地建立并廣泛使用了純化多肽的方法。可單獨或組合使用它們。此類方法例 如是使用硫醇配體與絡合金屬離子(例如Ni (II)-和Cu (II)-親和材料)或微生物來源蛋 白質(例如A蛋白或G蛋白親和層析)的親和層析、離子交換層析(例如陽離子交換，羧甲 基樹脂)、陰離子交換(氨基乙基樹脂)和混合模式交換層析、親硫吸附(例如β巰基乙醇 和其它SH配體)、疏水作用或芳香族吸附層析(例如具有苯基瓊脂糖、氮雜-arenophilic 樹脂或間_氨基苯基硼酸)、大小排阻層析和制備電泳方法(如凝膠電泳、毛細管電泳) (Vijayalakshmi, Μ. A.，Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93—102)。本申請中所用的術語“緩沖的”表示溶液，其中因添加或釋放酸性或堿性物質導致 PH的改變被緩沖物質拉平。可使用產生此類效果的任何緩沖物質。優選使用藥學上可接受 的緩沖物質，例如磷酸或其鹽、乙酸或其鹽、檸檬酸或其鹽、嗎啉或其鹽、2-(N-嗎啉代)甲 磺酸或其鹽、組氨酸或其鹽、甘氨酸或其鹽，或三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)或其鹽。尤其 優選的是磷酸或其鹽，或乙酸或其鹽，或檸檬酸或其鹽，或組氨酸或其鹽。任選地，緩沖溶液 可包含額外的鹽，例如氯化鈉、硫酸鈉、氯化鉀、硫酸鉀、檸檬酸鈉或檸檬酸鉀。如本申請中所用，術語“膜”表示微孔膜或大孔膜。膜本身由聚合材料例如聚乙 烯、聚丙烯、乙烯乙酸乙烯酯共聚物、聚四氟乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚酰胺(尼龍，例如 Zetap0reTM、N66P0sidyneTM)、聚酯、乙酸纖維素、再生纖維素、纖維素復合物、聚砜、聚醚砜、 聚芳基砜、聚苯基砜、聚丙烯腈、聚偏1，1-二氟乙烯、非針織和針織織物(例如Tyvek )、 纖維材料、或無機材料如zeolithe、SiO2, A1203、TiO2或羥基磷灰石。如本申請中所用，術語“層析材料”一方面表示可在不進一步修飾為層析材料的情 況下使用的固體材料，如羥基磷灰石，或親和層析材料，并還表示包含大核心材料的材料， 層析官能團優選通過共價鍵附著大核心材料。大核心材料理解為不參與層析過程，即待分 離多肽與層析材料的層析官能團之間的相互作用。僅提供層析官能團附著的三維框架，并 且其保證含有待分離物質的溶液可接近層析官能團。優選地，所述大核心材料是固相。因 此，優選地所述“層析材料”是層析官能團優選通過共價鍵附著的固相。優選地，所述“層析 官能團”是可電離疏水基團，或疏水基團，或復雜基團，其中不同層析官能團組合以結合特 定類型多肽或共價結合的帶電基團。“固相”表示非流體物質，并包括由如聚合物制成的顆粒包括微粒和珠子)、金屬制成的顆粒(順磁性、鐵磁性顆粒)、玻璃和陶瓷；凝膠物質如硅石、礬土和聚合物凝膠；沸 石和其它多孔物質。固相可以是靜止組分，如填充的層析柱，或可以是非靜止組分，如珠 子和微粒。此類顆粒包括聚合物顆粒如聚苯乙烯和聚(異丁烯酸甲酯)；金顆粒如金納米 顆粒和金膠體；和陶瓷顆粒如硅石、玻璃和金屬氧化物顆粒。參閱例如Martin，C. R.，等， Analytical Chemistry-News & Features，May 1 (1998)322A—327A。在本申請中可互換使用的術語“疏水電荷誘導層析”或“HCIC”表示使用“疏水電 荷誘導層析材料”的層析方法。“疏水電荷誘導層析材料”是包含可在一個PH范圍內與待 分離物質形成疏水鍵并在其它PH范圍內帶正電或負電的層析官能團的層析材料，即HCIC 使用可電離疏水基團作為層析官能團。一般地，多肽在中性PH條件下結合疏水電荷誘導 材料，然后通過PH值的改變產生電荷斥力進行回收。示例性“疏水電荷誘導層析材料”是 BioSepra MEP 或 HEA Hypercel(Pall Corp.，USA)。在本申請中可互換使用的術語“疏水作用層析”或“HIC”表示其中使用“疏水作用 層析材料”的層析方法。“疏水作用層析材料”是其中疏水基團，如丁基、辛基或苯基結合為 層析官能團的層析材料。可根據其表面暴露的氨基酸側鏈的疏水性分離多肽，所述氨基酸 側鏈可與疏水作用層析材料的疏水基團相互作用。溫度、溶劑和溶劑的離子強度可影響多 肽與層析材料之間的相互作用。因為氨基側鏈的運動增加并且在較低溫度下埋入多肽內部 的疏水性氨基酸側鏈變得易接近，所以溫度升高例如支持多肽與疏水作用層析材料之間的 相互作用。對kosmotropic鹽促進和離液鹽降低的疏水作用也是一樣。“疏水作用層析材 料，，是例如 Phenykpharose CL_4B、6FF、HP、Phenyl Superose> Octylsepharose CL-4B、 4FF 禾口 Butylsepharose 4FF (均可從 Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Germany 獲得)，其可通過縮水甘油醚偶聯大批材料獲得。如本申請所用，術語“親和層析”表示使用“親和層析材料”的層析方法。在親和 層析中，基于其生物學活性或化學結構(其依賴靜電相互作用的形成、疏水鍵和/或與層析 官能團的氫鍵形成)分離多肽。為了從親和層析材料中回收特異性結合的多肽，加入競爭 配體或改變層析條件，如緩沖液的PH值、極性或離子強度。“親和層析材料”是包含復雜層 析官能團的層析材料，其中復雜層析官能團組合了不同單個層析官能團以結合特定類型多 肽。該層析材料根據其層析官能團的特異性特異地結合特定類型的多肽。示例性“親和層 析材料”是“金屬螯合層析材料”，如含Ni (II) -NTA或Cu (II) -NTA的材料，用于結合含有六 組氨酸標簽的融合多肽，或具有許多表面暴露組氨酸、半胱氨酸和/或色氨酸殘基的多肽， 或“抗體結合層析材料”如A蛋白，或“酶結合層析材料”，如包含酶底物類似物、酶輔因子或 酶抑制劑作為層析官能團的層析材料，或“凝集素結合層析材料”，如包含多糖、細胞表面受 體、糖蛋白或完整細胞作為層析官能團的層析材料。如本申請所用，術語“金屬螯合層析”表示使用“金屬螯合層析材料”的層析方法。 金屬螯合層析基于結合大批材料作為層析官能團的金屬離子，如Cu(II)、Ni (II)或Zn(II) 與多肽表面暴露的氨基酸側鏈(尤其是含咪唑的側鏈和含巰基的側鏈)的電子供體基團 之間螯合物的形成。螯合物在那些側鏈至少部分未被質子化的PH值處形成。通過pH值 的改變，即通過質子化作用從層析材料中回收結合的多肽。示例性“金屬螯合層析材料”是 HiTrap Chelating HP(Amersham Pharmacia Biotec Europe GmbH,Germany)或Fraktogel EMD(EMD Chemicals Inc，USA)。
8
如本申請所用，術語“離子交換層析”表示使用“離子交換層析材料”的層析方法。 術語“離子交換層析材料”根據在“陽離子交換層析”中是否交換陽離子表示“陽離子交換 層析材料”或在“陰離子交換層析”中是否交換陰離子表示“陰離子交換層析材料”。如本 申請所用，術語“離子交換層析材料”表示攜帶共價結合帶電基團作為層析官能團的固定 高分子量固相。對于總的電荷中性，沒有共價結合的抗衡離子與其結合。“離子交換層析 材料”具有將其非共價結合的抗衡離子交換成周圍溶液的類似荷電離子的能力。根據其可 交換抗衡離子的電荷，“離子交換層析材料”被稱為“陽離子交換層析材料”或“陰離子交 換層析材料”。進一步根據荷電基團的性質，例如在具有磺酸基(S)或羧甲基基團(CM)的 陽離子交換層析材料的情況下，稱為“離子交換層析材料”。根據荷電基團的化學性質，根 據共價結合的帶電取代基的強度，“離子交換層析材料”還可分類為強或弱離子交換層析 材料。例如，強陽離子交換層析材料具有磺酸基團作為層析官能團，并且弱陽離子交換層 析材料具有羧酸基團作為層析官能團。例如可從多個公司以名字下獲得“陽離子交換層析 材料，，，如 Bio-Rex，Macro-Prep CM(獲自 Biorad Laboratories, Hercules, CA, USA)、弱 陽離子交換劑 WCX 2 (獲自 Ciphergen，Fremont, CA, USA)、DoweX MAC-3 (獲自 Dow 化 學公司-液體分離，Midland，MI，USA)、Mustang C(獲自 Pall Corporation, East Hills, NY, USA)、Cellulose CM-23、CM-32、CM-52、hyper-D 和 partisphere (獲自 Whatman pic, Brentford，UK)、Amberlite IRC 76、IRC 747、IRC748，GT 73(獲自 Tosoh Bioscience GmbH, Stuttgart, Germany)、CM 1500，CM 3000 (獲自 BioChrom Labs, Terre Haute, IN, USA)禾口 CM-Sepharose Fast Flow(獲自 GE Healthcare-Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Germany)。如本申請所用，術語“羥基磷灰石層析”表示使用特定形式磷酸鈣作為 層析材料的層析方法。示例性羥基磷灰石層析材料是Bio-Gel HT, Bio-Gel HTP、 Macro-Prep Ceramic (獲自 Biorad Laboratories) > Pi 基 M 灰石 Type I、Type II， HA Ultrogel (Sigma Aldrich Chemical Corp. , USA)、輕基憐灰石 Fast Flow and High Resolution (Calbiochem)或 TSK 凝膠 HA-1000 (Tosoh Haas Corp. , USA) “多肽”是自然產生或合成產生的肽鍵連接的氨基酸殘基的聚合物。少于約20個 氨基酸殘基的多肽稱為“肽”。“蛋白質”是包含一條或更多多肽鏈的分子，其中至少一條包 含100個或更多氨基酸殘基。多肽和蛋白質還可包含非氨基酸成分，如碳水化合物基團。碳 水化合物基團和其它非氨基酸組分可通過產生所述多肽或蛋白質的細胞添加，并且根據細 胞類型會發生變化。多肽和蛋白質此處以其氨基酸主鏈結構定義；一般不明確說明取代基 如碳水化合物基團，但其仍然可以存在。本申請中可互換使用的術語“抗體”和“免疫球蛋白，，表示一般包含兩條輕鏈和兩 條重鏈的分子。每條重鏈和輕鏈包含可變區(一般是鏈的氨基末端部分)，其含有與抗原 相互作用的特異性結合區(⑶R，互補決定區)。每條重鏈和輕鏈還包含恒定區(一般地，鏈 的羧基末端部分)，其可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括免疫系統的多種細胞、一 些吞噬細胞和經典補體系統的第一組分(Clq)的結合。通常，免疫球蛋白的輕鏈和重鏈是 完整鏈，每條鏈基本上由可變區和完整的恒定區組成。一般地，輕鏈包含輕鏈可變域、鉸鏈 區和輕鏈恒定域，而重鏈包含重鏈可變區、鉸鏈區和由ChI結構域、CH2結構域、CH3結構域和 任選地Ch4結構域組成的重鏈恒定域。抗體可以多種形式存在，包括例如Fv、Fab和F(ab)2以及單鏈(例如 Huston，J. S.，等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(1988)5879-5883 ；Bird 等，Science 242(1988)423-426 ；和一般地，Hood 等，Immunology, Benjamin N. Y.，第 2 版 (1984)以及Hunkapiller和Hood，Nature 323(1986) 15-16)。根據重鏈恒定區的氨基酸序 列，將免疫球蛋白分為不同種類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。這些種類中的一些可進一步分 為亞類(同種型)，即IgG分為IgGU IgG2、IgG3和IgG4，或IgA分為IgAl和IgA2。根據 免疫球蛋白隸屬的免疫球蛋白類別，免疫球蛋白的重鏈恒定區分別稱為α (IgA)、δ (IgD)、 ε (IgE)、y (IgG)和 μ (IgM)。本發明中使用的術語“結合-和-洗脫模式”及其語法等同物表示層析方法的操作 方式，其中使含有目的物質的溶液與固定相，優選固相接觸，由此目的物質結合固定相。結 果，目的物質停留在固定相上，而非目的物質從流動相或上清液中去除。然后在第二步中從 固定相中洗脫目的物質，并由此用洗脫液從固定相中將其回收。這不一定表示去除了 100% 的非目的物質，而是基本上去除了 100%的非目的物質，即去除了至少50%的非目的物質， 優選去除了至少75%的非目的物質，優選去除了至少90%的非目的物質，優選去除了高于 95%的非目的物質。如本發明所用，術語“流通模式”及其語法等同物表示層析方法的操作模式，其中 使含有目的物質的溶液與固定相，優選固相接觸，其中目的物質不結合所述固定相。因此， 在流動相或上清液中獲得目的物質。溶液中也存在的非目的物質結合固定相并從所述溶液 中去除。這并不一定表示100%的非目的物質從溶液中去除，而是基本上100%非目的物質 從中去除，即至少50%的非目的物質從所述溶液中去除，優選至少75%的非目的物質從所 述溶液中去除，優選至少90%的非目的物質從所述溶液中去除，優選高于95 %的非目的物 質從所述溶液中去除。本申請中可互換使用的術語“連續洗脫”和“連續洗脫方法”表示層析方法，其中 例如引起洗脫的物質濃度，即結合物質從層析材料上的溶出持續升高或降低，即通過系列 小步驟改變濃度，每個改變不大于引起洗脫物質濃度的2%的改變，優選不大于1%。在該 “連續洗脫”中，可線性改變，或指數改變，或漸進改變一個或更多條件，例如ΡΗ、離子強度、 鹽濃度和/或層析方法的流量。優選地所述改變是線性的。本申請中可互換使用的術語“分步洗脫”和“分步洗脫方法”表示層析方法，其中 例如引起洗脫的物質濃度，即結合物質從層析材料的溶出一次性升高或降低，即直接從一 個值/水平直接升高或降低到另一個值/水平。在該“分步洗脫”中，一個或更多條件，例 如ΡΗ、離子強度、鹽濃度和/或層析方法的流量均可一次性從第一個例如起始值改變到第 二個值例如最終值。步驟中的改變大于引起洗脫物質濃度的5%，優選10%的改變。“分步 洗脫”與線性改變相反，表示增量(即逐步)改變條件。在“分步洗脫方法”中是在每次增 加后收集新的級分。每一增加后，維持條件直至洗脫方法中的下一步。“分離的多肽”是基本沒有污染性細胞組分，如碳水化合物、脂類或與天然與該多 肽結合的其它蛋白質雜質的多肽。通常，分離的多肽的制劑含有高度純化形式，即至少約 80 %純，至少約90 %純，至少約95 %純，高于95 %純或高于99 %純的多肽。顯示特定蛋白 質制劑含有分離多肽的一種方式是通過在蛋白質制劑的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰 胺凝膠電泳和凝膠的考馬斯亮藍染色后呈現單條帶。然而，術語“分離的”并不排除同一多 肽以可選物理形式，如二聚體、衍生形式、未正確折疊形式、不正確的二硫鍵形式或亂序形式存在。“異源DNA”或“異源多肽”指給定細胞中不天然存在的DNA分子或多肽，或DNA分 子群或多肽群。特定細胞異源的DNA分子可含有來自細胞物種的DNA (即內源DNA)，只要細 胞的DNA與非細胞的DNA (S卩外源DNA)組合。例如，認為含有有效連接包含啟動子的細胞 DNA區段的編碼多肽的非細胞DNA區段的DNA分子是異源DNA分子。相反，異源DNA分子 可包含與外源啟動子有效連接的內源結構基因。由非細胞DNA分子編碼的肽或多肽是“異 源”肽或多肽。目前已經驚奇地發現根據本發明方法可進行已經在原核細胞中重組產生的非糖 基化多肽的純化。已經發現僅需要少的確定數目的最多三個層析步驟，并且還發現必須測 試僅確定數目的不同層析方法以建立層析純化方法，其允許將非糖基化的重組產生的多肽 純化至允許使用所述非糖基化的重組產生的多肽用于治療目的的純度。因此，本發明第一方面提供用于純化已經在原核細胞中重組產生的非糖基化異源 多肽的方法，其包括以下順序的以下步驟a)選自以下的第一個層析步驟i)疏水電荷誘導層析，ii)疏水作用層析，iii)親和層析，或iv)離子交換層析，b)選自以下的第二個層析步驟i)陰離子交換層析，ii)陽離子交換層析，iii)羥基磷灰石層析，iv)疏水作用層析，或ν)疏水電荷誘導層析，c)選自以下的第三個層析步驟i)疏水電荷誘導層析，ii)陰離子交換層析，iii)陽離子交換層析，或iv)疏水作用層析。在一個實施方案中是本發明方法步驟C)后獲得的純化的非糖基化異源多肽。由 于不同多肽的不同特征(取決于其物理性質，如等電點(Ip)或表面暴露的氨基酸殘基的分 布)，并非所有的層析方法均適合于所有的多肽。因此，以下條件應用于本發明的方法-在多肽能夠與金屬配體相互作用的情況下，第一個層析步驟是親和層析或疏水 電荷誘導層析，-在多肽具有低于6.0的等電點的情況下第二個層析步驟不是羥基磷灰石層析步 驟，-在多肽具有低或高等電點的情況下以流通模式進行第三個層析步驟，-任選地第三個層析步驟可用于濃縮多肽溶液。將在下文示例本發明的方法。僅給出這些實例來示例本發明的方法，而不是限制本發明的范圍，該范圍在所附權利要求中給出。IGF-I 激動劑第一個示例性多肽是例如在WO 2006/066891中報道的IGF-1激動劑。為了純化IGF-I激動劑，已經進行了本發明方法的一個順序的三個層析步驟。該 順序包括層析步驟1)疏水電荷誘導層析(a_i)，2)羥基磷灰石層析(b-iii)，和3)疏水電荷誘導層析(c_i)。因為多肽具有六組氨酸標記和高于6. 0的等電點，所以該順序滿足了本發明方法 的條件。起始材料具有純度為50% (由HPLC測定)的IGF-I激動劑。在利用如上描述 的層析步驟進行本發明純化方法后獲得了高于97%的純度(由HPLC測定)。已經以結 合-和_洗脫模式進行了所有的三個層析步驟。為了顯示本發明方法的多樣性，已經根據本發明方法通過不同順序的層析步驟純 化了 IGF-I激動劑，所述順序為1)疏水作用層析(a-ii)，2)陽離子交換層析(b-ii)，和3)陰離子交換層析(c-ii)。在利用如上描述的層析步驟進行本發明純化方法后獲得了 97%的純度(由HPLC 測定)。已經以結合-和-洗脫模式進行了第一個和第二個層析步驟，并已經以流通模式進 行了第三個層析步驟。因此，已經驚奇地發現利用不同順序的三個層析步驟可將相同分子純化至相似純 度。此外已經發現了可以不同洗脫模式，即以結合-和-洗脫模式或以流通模式進行最后 的層析步驟。還發現可將不同層析步驟以分步洗脫或連續洗脫進行。因此，本發明的另一方面是用于純化多肽，尤其是如WO 2006/066891中報道的 IGF-I或IGF-I變體的方法，其包括一個順序的連續三個層析步驟，其中第一個層析步驟是 疏水電荷誘導層析，第二個層析步驟選自羥基磷灰石層析或陽離子交換層析，并且第三個 層析步驟選自疏水電荷誘導層析或陰離子交換層析。干擾素第二個示例性多肽是例如在EP 0 043 980中報道的干擾素α -2a (IFN α-2a)。為了純化IFNa _2a，已經進行了根據本發明方法的一個順序的三個層析步驟。該 順序包括層析步驟1)疏水電荷誘導層析(a_i)，2)陰離子交換層析(b-ii)，和3)疏水作用層析(c-iv)。因為重組產生的IFNa _2a沒有與金屬螯合層析材料相互作用的標記并具有高于 6. 0的等電點，所以該順序滿足了本發明方法的條件。起始材料具有49%的純度(由HPLC測定)。在利用如上描述的層析步驟進行本 發明純化方法后獲得了高于99%的純度(由HPLC測定)。已經以結合-和-洗脫模式進
12行了層析步驟。因此，本發明的另一方面是用于純化IFNa _2a的方法，其包括一個順序的連續三 個層析步驟，其中第一個層析步驟是疏水電荷誘導層析步驟，第二個層析步驟是陰離子交 換層析步驟，并且第三個層析步驟是疏水電荷誘導層析步驟。已經通過不同順序的層析步驟純化了 IFN α _2a用于比較1)疏水作用層析(a-ii)，2)陽離子交換層析(b-ii)，和3)疏水作用層析(c-iv) 0在利用如上描述的層析步驟進行本純化方法后獲得了高于97%的純度(由HPLC 測定)。因此，本發明的另一方面是用于純化IFNa _2a的方法，其包括一個順序的三個連 續層析步驟，其中第一個層析步驟是疏水作用層析，第二個層析步驟是陽離子交換層析步 驟，并且第三個層析步驟是疏水作用層析。聚乙二醇化的干擾素本發明的方法不僅應用于非糖基化的重組產生的多肽，其進一步還適合于聚乙二 醇化的非糖基化多肽的產生。對于示例性聚乙二醇化的干擾素，參閱例如EP 0 809 996。因此，本發明的另一方面是用于產生已經在原核細胞中重組產生的非糖基化的聚 乙二醇化的異源多肽的方法，其包括以下順序的以下步驟a)提供已經在原核細胞中重組產生的非糖基化的異源多肽，b)選自以下的第一個層析步驟i)疏水電荷誘導層析，ii)疏水作用層析，iii)親和層析，或iv)離子交換層析，c)選自以下的第二個層析步驟i)陰離子交換層析，ii)陽離子交換層析，iii)羥基磷灰石層析，或iv)疏水作用層析，d)選自以下的第三個層析步驟i)疏水電荷誘導層析，ii)陰離子交換層析，iii)陽離子交換層析，或iv)疏水作用層析，由此在步驟d)后聚乙二醇化后獲得所述非糖基的異源多肽。由于不同多肽的不同特征(取決于其物理性質，如等電點(Ip)或表面暴露的氨基 酸殘基的分布)，并非所有的層析方法均適合于所有的多肽。因此，以下條件應用于本發明 的方法-在多肽能夠與金屬配體相互作用的情況下，第一個層析步驟是親和層析或疏水
13電荷誘導層析，-在多肽具有低于6.0的等電點的情況下第二個層析步驟不是羥基磷灰石層析步 驟，-在多肽具有低或高等電點的情況下以流通模式進行第三個層析步驟。在EP 0 809 996中報道了示例性聚乙二醇化的IFN。為了產生聚乙二醇化的IFN，已經進行了根據本發明方法的一個順序的三個層析 步驟。該順序包括層析步驟1)疏水作用層析(b-ii)，2)陽離子交換層析(c-ii)，和3)陰離子交換層析(d-ii)，并且在步驟3)后純化的非糖基化和非聚乙二醇化IFN被聚乙二醇化。起始材料具有58%的純度(由HPLC測定)。在利用如上描述的層析步驟進行本 發明純化方法后獲得了高于90%的純度(由HPLC測定)。已經以結合-和-洗脫模式進 行了所有的層析步驟。為了顯示本發明生產方法的多樣性，也已經在聚乙二醇化前通過本發明方法其它 順序的層析步驟純化了聚乙二醇化的多肽IFN 1)金屬親和層析(b-iii)，2)陽離子交換層析(c-ii)，和3)陰離子交換層析(d-ii)，并且在步驟3)后純化的非糖基化和非聚乙二醇化IFN被聚乙二醇化。在利用如上描述的層析步驟進行完本發明純化方法后獲得了高于90%的純度 (由HPLC測定)。已經以結合-和-洗脫模式進行了所有的層析步驟。因此，本發明的另一方面是用于制備聚乙二醇化IFNa _2a的方法，其包括一個順 序的連續層析步驟，其中第一個層析步驟選自疏水作用層析或金屬親和層析，第二個層析 步驟是陽離子交換層析，并且第三個層析步驟是陰離子交換層析，并且其中在第三個層析 步驟后純化的非糖基化和非聚乙二醇化的IFN被聚乙二醇化。已經通過不同順序的如下三個層析步驟進行了聚乙二醇化IFN的制備用于比較1)疏水作用層析(b-ii)，2)陽離子交換層析(c-ii)，和3)疏水電荷誘導層析(d_i)，并且在步驟3)后純化的非糖基化和非聚乙二醇化 IFN是聚乙二醇化的。在利用如上描述的層析步驟進行完本發明純化方法后獲得了高于89%的純度 (由HPLC測定)。因此，本發明的另一方面是用于制備聚乙二醇化干擾素，尤其是IFNa _2a的方 法，其包括一個順序的三個連續層析步驟，其中第一個層析步驟是疏水作用層析，第二個層 析步驟是陽離子交換層析，并且第三個層析步驟是疏水電荷誘導層析，并且其中在第三個 層析步驟后純化的非糖基化和非聚乙二醇化的IFN被聚乙二醇化。埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、鏈霉菌屬 (Streptomyces)或芽孢桿菌屬(Bacillus)例如適合用作原核宿主生物。在一個實施方案中，原核細胞是大腸桿菌細胞。優選地，所述大腸桿菌細胞是大腸桿菌XLl-blue細胞，或大 腸桿菌BL21(DE3)細胞，或大腸桿菌K-12細胞。在另一實施方案中是選自生長因子激動劑 或拮抗劑，或干擾素或干擾素變體的非糖基化異源多肽。本發明的另一方面是用于在原核細胞中重組產生非糖基化異源多肽的方法，其特 征在于所述方法包括以下步驟a)在適合于表達所述異源多肽的情況下培養包含編碼異源多肽的核酸的原核細 胞，b)從培養基或原核細胞中回收所述異源多肽，c)利用包括以下順序的以下步驟的方法純化所述異源多肽α)選自以下的第一個層析步驟i)疏水電荷誘導層析，ii)疏水作用層析，iii)親和層析，或iv)離子交換層析，β)選自以下的第二個層析步驟i)陰離子交換層析，ii)陽離子交換層析，iii)羥基磷灰石層析，或iv)疏水作用層析，或ν)疏水電荷誘導層析，γ)選自以下的第三個層析步驟i)疏水電荷誘導層析，ii)陰離子交換層析，iii)陽離子交換層析，或iv)疏水作用層析。在一個實施方案中是在步驟C)后獲得的非糖基化異源多肽。由于不同多肽的不 同特征(取決于其物理性質，如等電點(Ip)或表面暴露的氨基酸殘基的分布)，并非所有的 層析方法均適合于所有的多肽。因此，以下條件應用于本發明的方法-在多肽能夠與金屬配體相互作用的情況下，第一個層析步驟是親和層析或疏水 電荷誘導層析，-在多肽具有低于6.0的等電點的情況下第二個層析步驟不是羥基磷灰石層析步 驟，-在多肽具有低或高等電點的情況下以流通模式進行第三個層析步驟。如本申請中所用，術語“在合適條件下”表示用于培養表達多肽的細胞并且本領域 技術人員已知或容易測定的條件。本領域技術人員已知的是這些條件可根據培養細胞的類 型和表達多肽的類型而變化。一般地，在例如在20°C和40°C之間的溫度下培養細胞，并且 培養足以允許有效生產的一段時間，例如4到28天。在一個實施方案中，以結合和洗脫模式進行所述層析步驟。如本發明中所用，術 語“結合和洗脫模式”表示純化方法的操作方式，其中將含有待純化目的物質的溶液與固定
15相，優選固相接觸，由此目的物質結合所述固定相。結果，目的物質停留在固定相，而非目的 物質隨流通去除或從上清液中去除。然后任選地在洗滌步驟后，在第二步從固定相中洗脫 目的物質，并由此用洗脫液從固定相中將其回收。術語“聚乙二醇化”表示在多肽N末端的聚乙二醇殘基和/或固有的賴氨酸殘 基處共價鍵的形成。本領域中廣泛已知蛋白質的聚乙二醇化并例如由Veronese，F. Μ.， Biomaterials 22 (2001) 405-417進行了評論。可使用不同官能團和不同分子量的聚乙 二醇、線性和分支的PEG以及不同連接基團連接PEG(也參閱Francis，G. Ε.，等，Int. J. Hematol. 68(1998) 1-18 ；Delgado, C., 等，Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 9 (1992) 249-304)。激活的PEG衍生物為本領域所知并且在例如Morpurgo，Μ.，等， J. Bioconjug. Chem. 7 (1996) 363-368描述了 PEG-乙烯基砜。線性鏈和分支鏈PEG種類適 合于聚乙二醇化片段的制備。活性PEG試劑的實例是碘代-乙酰基-甲氧基-PEG，或甲氧 基-PEG-乙烯基砜。在本發明方法的一個實施方案中是第三個層析步驟后獲得的多肽溶液中內毒素， 和/或大腸桿菌DNA，和/或大腸桿菌細胞蛋白質的含量與第一個層析步驟前的含量相比降 低了。在另一實施方案中，本發明方法是用于在原核細胞中通過包含體重組產生非糖基 化異源多肽的方法，其中所述方法包括以下步驟a)在適合于表達所述異源多肽并形成含有所述異源多肽的包含體的情況下培養 包含編碼所述異源多肽的核酸的原核細胞，b)從所述原核細胞中回收所述包含體，c)從所述包含體中溶解并復性所述異源多肽，d)通過本發明第一方面的方法純化所述異源多肽。在一個實施方案中是在步驟d)后獲得的非糖基化異源多肽。在細胞質中發現了 包含體并且其含有在水中不可溶的聚集形式的表達多肽。一般地，包含體的此類蛋白質是 變性形式(例如隨機連接的二硫鍵)。例如在細胞裂解后通過離心從其它細胞組分中分離 這些包含體。根據本發明，在變性條件下洗滌所述包含體。這些變性劑為本領域所熟知并 且例如是鹽酸胍的高度濃縮溶液(例如約6mol/l)或尿素的高度濃縮溶液(例如約Smol/ 1)。所述變性劑優選用作緩沖液。洗滌后，溶解包含體。術語“聚乙二醇化”表示聚乙二醇殘基在多肽N末端和/或固有賴氨酸殘基的共 價連接。本領域中廣泛已知蛋白質的聚乙二醇化并例如由Veronese，F. Μ.，Biomaterials 22 (2001)405-417進行了評論。可使用不同官能團和不同分子量的聚乙二醇、線性和分支的 PEG 以及不同連接基團連接 PEG (也參閱 Francis，G. Ε.，等，Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18 ； Delgado，C.，等，Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 9(1992)249-304)。在一個實施 方案中通過使用NHS激活的線性或分支PEG分子(分子量在5kDa到40kDa之間)，利用例 如WO 00/44785中描述的聚乙二醇化試劑進行聚乙二醇化。也可根據Lu，Y.，等，Reactive Polymers 22 (1994) 221-229在固相進行聚乙二醇化。根據WO 94/01451也可產生非隨機的 N末端聚乙二醇化的多肽。激活的PEG衍生物為本領域所知并且例如在Morpurgo，Μ.，等，J. Bioconjug. Chem. 7(1996)363-368中描述了 PEG-乙烯基砜。線性鏈和分支鏈PEG種類適合于聚乙二醇化片段的制備。活性PEG試劑的實例是碘代-乙酰基-甲氧基-PEG，或甲氧基-PEG-乙烯 基砜(m優選為從約450到約900的整數，并且R是C1-到C6-烷基，線性的或分支的，具有 一到六個碳原子，如甲基、乙基、異丙基等，由此在一個實施方案中R =甲基) 這些碘-激活物質的用途為本領域所知并由例如Hermanson，G. Τ.，在 Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996)第 147-148 頁所述。在一個實施方案中，PEG種類是激活的PEG酯，例如N-羥基琥珀酰亞胺基丙酸酯， 或N-羥基琥珀酰亞胺基丁酸酯，或N-羥基琥珀酰亞胺如PEG-NHS (Monfardini，C.，等， Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69)。在一個實施方案中，激活的N-羥基琥珀酰亞胺酯是 使用烷氧基-PEG-N-羥基琥珀酰亞胺，如甲氧基-PEG-N-羥基琥珀酰亞胺(MW 30000 ；Shearwater Polymers, Inc.)，其中R和m如上定義。在一個實施方案中，PEG種類 是甲氧基聚乙二醇丁酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯。術語“烷氧基”指烷基醚基團，其中所述 術語“烷基”表示直鏈或支鏈的烷基，其含有最多4個碳原子，如甲氧基、乙氧基、正丙氧基 等，優選甲氧基。本發明的一方面是用于純化已經在原核細胞中重組產生的非糖基化異源多肽的 方法，其特征在于所述方法包括以下順序的以下步驟a)選自以下的第一個層析步驟i)疏水電荷誘導層析， )疏水作用層析，iii)親和層析，或iv)離子交換層析，b)選自以下的第二個層析步驟i)陰離子交換層析， )陽離子交換層析，iii)羥基磷灰石層析，iv)疏水作用層析，或V)疏水電荷誘導層析，c)選自以下的第三個層析步驟i)疏水電荷誘導層析， )陰離子交換層析，iii)陽離子交換層析，或
iv)疏水作用層析，由此，-在多肽能夠與金屬配體相互作用的情況下，所述第一個層析步驟是親和層析或 疏水電荷誘導層析，-在多肽具有低于6.0的等電點的情況下，所述第二個層析步驟不是羥基磷灰石 層析步驟，-在多肽具有低或高等電點的情況下，以流通模式進行所述第三個層析步驟，并且條件是三個層析步驟的組合不是-親和層析、離子交換層析和疏水作用層析，_疏水作用層析、陽離子交換層析和陰離子交換層析，-陽離子交換層析、陰離子交換層析和疏水作用層析，-陽離子交換層析、疏水作用層析和陽離子交換層析，-陰離子交換層析、疏水作用層析和疏水作用層析。在本發明方法的一個實施方案中是在第三個層析步驟后獲得的非糖基化異源多 肽。如本申請所用，術語“相當的”表示兩個結果彼此在10%內。例如，90%的純度和 95%的純度是相當的，因為95%在90%純度的10%內(90% +90%的10%= 90% +9% = 99% )。提供以下實施例、參考文獻和附圖幫助理解本發明，其真實范圍在所附權利要求 中給出。應理解可在所述步驟中進行修改，而不背離本發明的精神。附圖簡述

圖1第一次HCIC之前(a)和之后(b) IGF-I激動劑的反相HPLC層析圖。圖2羥基磷灰石層析步驟之前(a)和之后(b) IGF-I激動劑的反相HPLC層析圖。圖3第二次HCIC之前(a)和之后(b) IGF-I激動劑的反相HPLC層析圖。圖4HIC之前(a)和之后(b) IGF-I激動劑的反相HPLC層析圖。圖5陽離子交換層析步驟之前(a)和之后(b) IGF-I激動劑的反相HPLC層析圖。圖6陰離子交換層析步驟之前(a)和之后(b) IGF-I激動劑的反相HPLC層析圖。實驗部分材料和方法除非另有說明，根據層析材料制造商手冊進行不同的層析方法。重組DNA技術如 Sambrook, J.,等，Molecular cloning :A laboratory manual ； Co Id Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,New York, 1989 中所述，使用標準方法操 作DNA。根據制造商的說明書使用分子生物學試劑。蛋白質測定使用基于氨基酸序列計算的摩爾消光系數，以320nm的參考波長測定280nm處的 光密度(OD)來測定蛋白質濃度。大小排阻HPLC 禾Ij用 ASI-100HPLC 系統(Dionex，Idstein, Germany)上的 Tosoh Haas TSK
183000SWXL柱進行層析法。通過UV 二極管陣列檢測器(Dionex)在280nm處監測洗脫峰。在 將濃縮樣品溶解到lmg/ml后，用200mM磷酸二氫鉀和250mM氯化鉀組成的緩沖液pH 7. 0 洗滌所述柱，直至達到穩定基線。使用0. 5ml/分鐘的流速在室溫無梯度條件下進行分析測 定 30 分鐘。用 Chromeleon(Dionex，Idstein, Germany)手工積分層析圖。反相HPLC (RP-HPLC)通過RP-HPLC分析純度。使用乙腈/水性TFA梯度在Poroshell柱上進行測定。 以在215nm處的UV吸收監測洗脫圖譜。基于洗脫蛋白質的總峰面積計算洗脫物質的百分 比。DNA閾值系統參閱例如 Merrick，H.，禾口 Hawlitschek，G. ，Biotech Forum Europe 9(1992)398-403 ο宿主細胞蛋白質測定用血清白蛋白和鏈霉抗生物素蛋白的混合物包被微量滴定板的孔壁。針對HCP的 山羊來源的多克隆抗體結合微量滴定板的孔壁。洗滌步驟后，微量滴定板的不同孔與HCP 校準系列的不同濃度和樣品溶液溫育。溫育后，用緩沖液洗滌去除未結合的樣品材料。為 了檢測，所述孔與抗體過氧化物酶綴合物溫育以檢測結合的宿主細胞蛋白。通過與ABTS溫 育和405nm處的檢測來檢測固定的過氧化物酶活性。用于分離、溶解和復性包含體的一般方法除了在引用的參考文獻中進行的方法外，例如可根據Rudolph等(Rudolph 等，Folding Proteins, In :Τ. Ε. Creighton(編 輯)Protein function :A Practical Approach, 57 (1996))中的方法進行內含體的制備。將所述內含體儲存在_70°C。也可根據 Rudolph等(錯誤！未找到引用源。)的方法進行包含體的溶解。實施例1IGF-I激動劑的純化在大腸桿菌中表達多肽。首先在HCIC柱上應用多肽，然后在羥基磷灰石柱上，最 后在第二個HCIC柱上應用所述多肽。層析條件如下第1個柱樹脂具有MEP-Hypercel (Pall Corporation, USA)的 HCIC 作為單步洗脫上樣每ml柱體積IOmg多肽緩沖液A:25mM三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液，調整至pH9. O緩沖液B IOmM乙酸鈉緩沖液，調整至pH5. O在第一個步驟中將含有IGF-I激動劑的溶液應用到含有疏水電荷誘導層析材料 (來自 Pall Corporation 的 ΜΕΡ-Hypercel)的柱上。在圖1中，給出了 HCIC之前和之后的IGF-I激動劑的反相層析圖。第2個柱樹脂羥基磷灰石層析(BioradLaboratories, USA)上樣每ml柱體積6. 5mg多肽緩沖液A :5mM磷酸鉀緩沖液，調整至pH6. 5
緩沖液B 補充有IM氯化鈉的IOmM MES緩沖液，調整至pH6. 5圖2給出了羥基磷灰石層析步驟之前和之后的反相層析圖。第3個柱樹脂具有HEA-Hypercel 的 HCIC(Pall Corporation, USA)上樣每ml柱體積20mg多肽緩沖液A :20mM乙酸鈉緩沖液，調整至pH4. 0圖3給出了第二個HCIC步驟之前和之后的反相層析圖。
柱產率]HPLC測定的純 度]起始49. 2HCIC步驟15. 786. 6羥基磷灰石層析 步驟62. 597. 0HCIC步驟94. 297. 7實施例2IGF-I激動劑的純化-與實施例1的比較實施例將多肽首先應用于HIC柱上，然后是陽離子交換層析，最后是以流通模式運行的 陰離子交換層析。第一個柱樹月旨具有Super Butyl Toyopearl 的 HIC(Tosoh Haas Corp.，USA)上樣每ml柱體積5mg多肽緩沖液A 補充有IM氯化鉀的50mM磷酸鉀緩沖液，調整至pH8. 0緩沖液B 2-丙醇 5-10% (w/v)，調整至 ρΗ4· 0以從0% (ν/ν)到100% (ν/ν)緩沖液B的線性梯度進行洗脫超過30柱體積。圖4給出了 HIC步驟之前和之后的反相層析圖。第2個柱樹脂具有CM-S印harose FF的陽離子交換層析(GE-Healthcare.，USA)上樣每ml柱體積4. Img多肽緩沖液A :50mM乙酸，調整至pH5. 8緩沖液B 補充有IM氯化鈉的IOOmM三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液，調整至pH9. 5如下進行洗脫起始時換成15% (ν/ν)的緩沖液B，將15% (ν/ν)緩沖液B維持5 個柱體積，然后在20個柱體積內線性梯度至55% (ν/ν)緩沖液B，最后將55% (ν/ν)緩沖液B維持10個柱體積。圖5給出了陽離子交換層析步驟之前和之后的反相層析圖。第3個柱樹脂流通模式的具有Q-S印harose的陰離子交換層析(GE-Healthcare.，USA)上樣每ml柱體積20mg多肽緩沖液A :25mM三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液，調整至pH9. 5緩沖液B IOmM 乙酸(ρΗ3· 6)。圖6給出了陰離子交換層析步驟之前和之后的反相層析圖。 實施例3干擾素的純化多肽首先應用到HIC柱上，然后陰離子交換柱，最后是陽離子交換柱。層析條件如下第1個柱樹脂具有Butyl Sepharose 的 HIC (GE-Healthcare.，USA)作為單步洗脫上樣每ml柱體積8mg多肽緩沖液A :20mM磷酸鉀緩沖液，調整至pH8. 0第2個柱樹脂具有Q-S印harose FF的陰離子交換層析(GE-Healthcare，USA)上樣每ml柱體積1. 5mg多肽緩沖液A :30mM乙酸銨，調整至pH 5. 9緩沖液B :1. 8mM乙酸銨，調整至pH 3. 5如下進行洗脫起始時換成15% (ν/ν)的緩沖液B，將15% (ν/ν)緩沖液B維持3 個柱體積，然后在37. 5個柱體積內線性梯度至90% (ν/ν)緩沖液B。
第3個柱樹脂具有SP-S^harose的陽離子交換層析作為單步洗脫上樣每ml柱體積2. 84mg多肽緩沖液A 補充有250mM氯化鈉的50mM硼酸鹽緩沖液，調整至pH9. 0 實施例4干擾素的純化_與實施例3的比較實施例多肽首先應用到HIC柱上，然后是陽離子交換柱，最后是陰離子交換柱。層析條件如下第1個柱樹脂具有Butyl S印harose 的 HIC (GE-Healthcare，USA)上樣每ml柱體積8mg多肽緩沖液A 補充有2m氯化鉀的20mM磷酸鉀緩沖液，調整至pH 8. 0緩沖液B :20mM磷酸鉀緩沖液，調整至pH 8. 0第2個柱樹脂具有CM Toyopearl 的陽離子交換層析(Tosoh Hass Corp.，USA)
上樣每ml柱體積5mg多肽緩沖液A 平衡75mM乙酸鈉，調整至pH 4. O洗滌15mM乙酸鈉，調整至pH 5. 5緩沖液B :30mM乙酸鈉，調整至pH 7. O第3個柱樹脂具有Q-S印harose的陰離子交換層析上樣每ml柱體積的3mg多肽緩沖液A :30mM乙酸銨緩沖液，調整至pH 6. 8
緩沖液B :l)25mM乙酸銨，調整至pH 6. 52)補充有3mM乙酸的1. 8mM乙酸銨，調整至pH 4. 5 實施例5干擾素的純化-與實施例3和實施例4的比較實施例多肽首先應用到金屬螯合柱上，然后是陽離子交換柱，最后是陰離子交換柱。層析條件如下第1個柱樹脂銅螯合S印harose (GE-Healthcare, USA)作為單步洗脫上樣每ml柱體積5 Img多肽緩沖液A 平衡補充有150mM氯化鈉和20mM磷酸鈉緩沖液的300mM鹽酸胍，調整 至 pH 6.45洗滌補充有IOOmM氯化鈉的50mM乙酸，調整至pH4. 95緩沖液B 補充有IOOmM氯化鈉的50mM乙酸，調整至pH 3. 9第2個柱樹脂具有CM Toyopearl的陽離子交換層析(Tosoh Hass Corp.，USA)作為單步 洗脫上樣每ml柱體積5mg多肽緩沖液A 平衡75mM乙酸鈉，調整至pH 4. O洗滌15mM乙酸鈉，調整至pH5. 5緩沖液B :30mM乙酸鈉，調整至pH7. O第3個柱樹脂具有Q-S印harose的陰離子交換層析上樣每ml柱體積3mg多肽
緩沖液A :30mM乙酸銨緩沖液，調整至pH 6. 8緩沖液B 1) 25mM乙酸銨緩沖液，調整至pH 6. 52)補充有3mM乙酸的1. 8mM乙酸銨，調整至pH 4. 5如下進行洗脫起始時變為10% (ν/ν)緩沖液B，將15% (ν/ν)緩沖液B維持3個 柱體積，然后在27. 5個柱體積內線性梯度至90% (ν/ν)緩沖液B。
權利要求
用于純化已經在原核細胞中重組產生的非糖基化異源多肽的方法，其特征在于所述方法包括以下順序的以下步驟a)選自以下的第一個層析步驟i)疏水電荷誘導層析，ii)疏水作用層析，iii)親和層析，或iv)離子交換層析，b)選自以下的第二個層析步驟i)陰離子交換層析，ii)陽離子交換層析，iii)羥基磷灰石層析，或iv)疏水作用層析，或v)疏水電荷誘導層析，c)選自以下的第三個層析步驟i)疏水電荷誘導層析，ii)陰離子交換層析，iii)陽離子交換層析，或iv)疏水作用層析，其中， 在多肽能夠與金屬配體相互作用的情況下，所述第一個層析步驟是親和層析或疏水電荷誘導層析， 在多肽具有低于6.0的等電點的情況下，所述第二個層析步驟不是羥基磷灰石層析步驟， 在多肽具有低或高等電點的情況下，以流通模式進行所述第三個層析步驟。
2.權利要求1的方法，其特征在于所述原核細胞是大腸桿菌細胞。
3.前述權利要求任何一項的方法，其特征在于所述親和層析是金屬螯合層析。
4.前述權利要求任何一項的方法，其特征在于所述非糖基化異源多肽選自生長因子激 動劑或拮抗劑，或干擾素或干擾素變體。
5.前述權利要求任何一項的方法，其特征在于所述方法在步驟c)后包括額外的步驟， 其為d)聚乙二醇化所述多肽。
6.前述權利要求任何一項的方法，其特征在于所述步驟a)和b)是陽離子交換層析步馬聚ο
7.在原核細胞中重組產生非糖基化異源多肽的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟a)在適合于表達所述異源多肽的條件下培養包含編碼所述異源多肽的核酸的原核細胞，b)從培養基或原核細胞中回收所述異源多肽，c)利用權利要求1的方法純化所述異源多肽。
8.用于通過包含體在原核細胞中重組產生非糖基化異源多肽的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟a)在適合于表達所述異源多肽并形成含有所述異源多肽的包含體的條件下培養包含 編碼所述異源多肽的核酸的所述原核細胞，b)從所述原核細胞中回收所述包含體，c)從所述包含體中溶解并復性所述異源多肽，d)通過權利要求1的方法純化所述異源多肽。
9.前述權利要求任何一項的方法，其特征在于在第三個層析步驟后獲得的多肽溶液中 內毒素、和/或大腸桿菌DNAjP /或大腸桿菌細胞蛋白質的含量與第一個層析步驟之前的 含量相比降低了。
10.用于純化IGF-I或IGF-I變體的方法，其包括一個順序的三個連續層析步驟，其中 第一個層析步驟是疏水電荷誘導層析，第二個層析步驟選自羥基磷灰石層析或陽離子交換 層析，并且第三個層析步驟選自疏水電荷誘導層析或陰離子交換層析。
11.用于純化IFNa-2a的方法，其包括一個順序的三個連續層析步驟，其中第一個層 析步驟是疏水電荷誘導層析，第二個層析步驟是陰離子交換層析，并且第三個層析步驟是 疏水電荷誘導層析。
12.用于純化IFNa_2a的方法，其包括一個順序的三個連續層析步驟，其中第一個層 析步驟是疏水作用層析，第二個層析步驟是陽離子交換層析，并且第三個層析步驟是疏水 作用層析。
13.用于制備已經在原核細胞中重組產生的非糖基化的聚乙二醇化的異源多肽的方 法，其包括以下順序的以下步驟a)提供已經在原核細胞中重組產生的非糖基化的異源多肽，b)選自以下的第一個層析步驟i)疏水電荷誘導層析， )疏水作用層析，iii)親和層析，或iv)離子交換層析，c)選自以下的第二個層析步驟i)陰離子交換層析， )陽離子交換層析，iii)羥基磷灰石層析，或iv)疏水作用層析，d)選自以下的第三個層析步驟i)疏水電荷誘導層析， )陰離子交換層析，iii)陽離子交換層析，或iv)疏水作用層析，其中在步驟d)后將所述非糖基的異源多肽聚乙二醇化。
14.用于制備聚乙二醇化IFNa_2a的方法，其包括一個順序的三個連續層析步驟，其 中第一個層析步驟選自疏水作用層析或金屬親和層析，第二個層析步驟是陽離子交換層析，并且第三個層析步驟是陰離子交換層析，并且其中在第三個層析步驟后將純化的非糖 基化和非聚乙二醇化的IFN α _2a聚乙二醇化。
15.用于制備聚乙二醇化干擾素的方法，其包括一個順序的三個連續層析步驟，其中第 一個層析步驟是疏水作用層析，第二個層析步驟是陽離子交換層析，并且第三個層析步驟 是疏水電荷誘導層析，并且其中在第三個層析步驟后將純化的非糖基化和非聚乙二醇化的 IFN聚乙二醇化。
16.用于純化已經在原核細胞中重組產生的非糖基化異源多肽的方法，其特征在于所 述方法包括以下順序的以下步驟a)選自以下的第一個層析步驟 i)疏水電荷誘導層析， )疏水作用層析，iii)親和層析，或iv)離子交換層析，b)選自以下的第二個層析步驟 i)陰離子交換層析， )陽離子交換層析，iii)羥基磷灰石層析，或iv)疏水作用層析，或 ν)疏水電荷誘導層析，c)選自以下的第三個層析步驟 i)疏水電荷誘導層析， )陰離子交換層析，iii)陽離子交換層析，或iv)疏水作用層析， 其中，_在多肽能夠與金屬配體相互作用的情況下，所述第一個層析步驟是親和層析或疏水 電荷誘導層析，-在多肽具有低于6. 0的等電點的情況下，所述第二個層析步驟不是羥基磷灰石層析 步驟，-在多肽具有低或高等電點的情況下，以流通模式進行所述第三個層析步驟， 并且其中至少兩個不同順序的三個層析步驟產生具有相當純度的純化的非糖基化異 源多肽。
全文摘要
本發明用于純化已經在原核細胞中重組產生的非糖基化異源多肽的方法，其中所述方法包括三個層析步驟，其中第一個層析步驟選自i)疏水電荷誘導層析，或ii)疏水作用層析，或iii)親和層析，或iv)離子交換層析，第二個層析步驟選自i)陰離子交換層析，或ii)陽離子交換層析，或iii)羥基磷灰石層析，或iv)疏水作用層析，并且第三個層析步驟選自i)疏水電荷誘導層析，或ii)陰離子交換層析，或iii)陽離子交換層析，或iv)疏水作用層析，其中第一個層析步驟在多肽能夠與金屬配體相互作用的情況下是親和層析，第二個層析步驟在多肽具有低于6.0的等電點的情況下不是羥基磷灰石層析，并且第三個層析步驟在多肽具有低或高等電點的情況下以流通模式進行。
文檔編號C07K1/36GK101918430SQ200980102331
公開日2010年12月15日 申請日期2009年1月15日 優先權日2008年1月18日
發明者A·格羅斯曼, A·肖布馬爾, B·克雷默, B·魏丹茲, C·吉賽爾, F·赫西, M·蓬皮阿蒂, N·菲爾勒, R·法爾肯施泰因, S·格賴塔納 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司