一種多苯并咪唑金屬配合物非病毒基因載體及其制備與應用的制作方法

專利名稱：一種多苯并咪唑金屬配合物非病毒基因載體及其制備與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新型的非病毒基因載體，具體地講是一種多苯并咪唑金屬配合物
非病毒基因載體及其制備與應用。
背景技術：
基因治療是指將人的正常基因或有治療作用的基因通過一定方式導入人體靶細 胞，以糾正基因缺陷從而達到治療疾病的目的。基因治療的關鍵是獲得安全、有效的進行基 因轉染的載體。基因治療的載體一般分為病毒型和非病毒型，前者轉染效率較高，但存在導 向性差、攜帶能力低、具免疫原性和潛在致癌性等缺點；后者則具有低毒性、低免疫原性、低 致癌性、易制備等優點因此近年來備受關注。 非病毒基因釋放的載體包括陽離子脂類、金屬配合物、聚合物(如聚-L-賴氨酸 和聚胺等)、樹狀物(端基主要為胺基)、多肽(肽核酸)、納米粒子(如量子點和碳納米管 等)和環糊精衍生物等，這些化合物具有低毒性、攜帶基因能力高、低免疫原性、低致癌性、 易制備等優點。研究表明大多數陽離子基因載體均能通過其帶正電基團與DNA的帶負電 荷磷酸基發生靜電作用，從而減弱DNA鏈上磷酸根負電荷之間的排斥作用，導致DNA彎曲、 凝聚(壓縮)，甚至使DNA被包裹。這些化合物的不足之處主要是(l)由于受到細胞內外 屏障的阻礙，細胞轉染效率較低；(2)由于載體-DNA復合物是通過靜電作用與生物膜結合， 故不能轉染膜表面含大量蛋白多糖的不帶負電荷的細胞系；(3)由于載體的細胞毒性通常 與其正電荷密度成正比，表面帶過多正電荷的載體-DNA復合物易與血清白蛋白等血液組 分相互作用，從而不利于靶細胞吸收。然而，非病毒基因載體優良的生物兼容性、對基因的 大小基本沒有限制和可大劑量生產等優點，使其在基因治療中具有強大的吸引力和潛在的 應用價值。研究者盡管設計合成了大量可驅動DNA凝聚的陽離子化合物，且在一定程度上 能克服基因治療中的體內、體外障礙，但金屬配合物作為一類潛在有效的基因載體，卻一直 沒有得到重視。 與其它陽離子化合物相比，多苯并咪唑金屬配合物具有水溶性好、結構多樣化、正 電荷密度合理、制備容易等特點，故是一類潛力巨大的基因載體。由于這類配合物分子中具 有較多電中性苯并咪唑基團，對細胞內的酸性環境具有顯著的緩沖作用，這樣由多種驅動 力共同作用(包括靜電作用以及金屬配合物與DNA分子間堿基對的插入作用)誘導的DNA 凝聚體不會因為稀釋或與其他陰離子物種相互作用而解離，并且聚集體表面也不會積聚過 高的正電荷，有助于減弱與血液中帶負電物種間的相互作用，從而更加有利于凝聚體進入 細胞核并被細胞吸收。申請人在工作中發現，驅動DNA凝聚的作用力包括靜電作用和配合 物與DNA堿基對間的插入作用。這是首次發現以多苯并咪唑為主配體的多核金屬配合物對 DNA凝聚具有顯著促進作用。

發明內容
本發明目的旨在提供一種多苯并咪唑金屬配合物非病毒基因載體及其制備與應 用，該類金屬配合物具有較好的水溶性、結構多樣性和合理的正電荷密度等特點，而且容易 制備，故是一類潛力巨大的基因載體。
本發明的技術方案包括 —種非病毒基因載體，它是以多苯并咪唑為配體的多核金屬配合物，具體是由1， 1，4，7，10，10-六(2-苯并咪唑甲基)-三乙基四胺、l，l，4，7，7-五(2-苯并咪唑甲基)-二 乙基三胺、N，N，N'，N'-四(2-苯并咪唑甲基)-1，10-二氮-4，7-二氧癸烷、&&『，『-四 (2-苯并咪唑亞甲基)-l，2-二乙胺、N，N-二 (2-苯并咪唑甲基)亞胺或者三(2-苯并咪唑 基甲基)胺為主配體，以苯環或脂肪鏈多元羧酸為橋連配體，以H20、Cr、N(V、Ac—或C1(V為 輔助配體或抗衡陰離子，合成的同多核或雜多核Mg2+、 Ca2+、 Zn2+、 Cu2+、 Co2+/3+、 Mn2+、 Fe2+/3+或 Ni2+金屬離子的配合物。 其中，所述的配體l，l，4，7，10，10-六(2-苯并咪唑甲基)-三乙基四胺(TTHB)的
合成，由三乙四胺六乙酸與鄰苯二胺按物質的量之比i : 4 i : s，優選i : e，以乙二醇
為溶劑，160 18(TC共熱縮合6 8小時，直到無水蒸汽放出為止；縮合產物冷卻至120°C 倒入燒杯中，邊攪拌邊加入蒸餾水；冷卻至室溫，變粘稠，加入適量無水乙醇，靜置過夜；過 濾得到紅褐色粗產品，然后粗產品用無水乙醇重結晶2 3次得到白色固體產物，用丙酮洗 滌，得到白色固體粉末或無色晶體目的產品。 所述的配體1，1，4，7，7_五(2-苯并咪唑甲基)-二乙基三胺(DTPB)的合成(參 見圖1、圖2)，由二乙三胺五乙酸(DTPA)與鄰苯二胺按物質的量之比1 : 5，以乙二醇為溶 劑，160 18(TC共熱縮合6 8小時，直到無水蒸汽放出為止；縮合產物冷卻至12(TC倒入 燒杯中，邊攪拌邊加入蒸餾水；冷卻至室溫，變粘稠，加入無水乙醇，靜置過夜；過濾得到紅 褐色粗產品，然后粗產品用無水乙醇重結晶2 3次得到白色固體產物，用丙酮洗滌，得到 白色固體粉末或無色晶體目的產品。 所述的配體N，N，N'，N'-四(2-苯并咪唑甲基)-l，10-二氮-4，7-二氧癸烷(EGTB) 的合成，由乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)與鄰苯二胺按物質的量之比1 : 2 1 : 6，優選1 : 4，以乙二醇為溶劑，160 18(TC共熱縮合6 8小時，直到無水蒸汽放出 為止；縮合產物冷卻至12(TC倒入燒杯中，邊攪拌邊加入蒸餾水；冷卻至室溫，變粘稠，加入 無水乙醇，靜置過夜；過濾得到紅褐色粗產品，然后粗產品用無水乙醇重結晶2 3次得到 白色固體產物，用丙酮洗滌，得到白色固體粉末或無色晶體目的產品。
所述的配體N， N， N'， N'-四(2-苯并咪唑亞甲基)-l，2-二乙胺(EDTB)的合成， 由乙二胺四乙酸(EGTA)和鄰苯二胺按物質的量之比l : 2 1 : 6，優選1 : 4，以乙二醇 為溶劑，160 18(TC共熱縮合6 8小時，直到無水蒸汽放出為止；縮合產物冷卻至120°C 倒入燒杯中，邊攪拌邊加入蒸餾水；冷卻至室溫，變粘稠，加入無水乙醇，靜置過夜；過濾得 到紅褐色粗產品，然后粗產品用無水乙醇重結晶2 3次得到白色固體產物，用丙酮洗滌， 得到白色固體粉末或無色晶體目的產品。 所述的配體三(2-苯并咪唑基甲基)胺(NTB)的合成，由胺基三乙酸(NTA)與鄰
苯二胺按物質的量之比i : i i : 5，優選i : 3，以乙二醇為溶劑，160 18(rc共熱縮
合6 8小時，直到無水蒸汽放出為止；縮合產物冷卻至12(TC倒入燒杯中，邊攪拌邊加入蒸餾水；冷卻至室溫，變粘稠，加入無水乙醇，靜置過夜；過濾得到紅褐色粗產品，然后粗產 品用無水乙醇重結晶2 3次得到白色固體產物，用丙酮洗滌，得到白色固體粉末或無色晶 體目的產品。 所述的配體N，N-二 (2'-苯并咪唑甲基)亞胺(IDB)的合成，由亞胺基二乙酸與
鄰苯二胺按物質的量之比i : i i : 3，優選i : 2，以乙二醇為溶劑，160 lscrc共熱
縮合6 8小時，直到無水蒸汽放出為止；縮合產物冷卻至12(TC倒入燒杯中，邊攪拌邊加 入蒸餾水；冷卻至室溫，變粘稠，加入無水乙醇，靜置過夜；過濾得到紅褐色粗產品，然后粗 產品用無水乙醇重結晶2 3次得到白色固體產物，用丙酮洗滌，得到白色固體粉末或無色 晶體目的產品。 本發明的非病毒基因載體的制備方法，其特征是，以1， 1，4， 7， 10， 10-六(2-苯并 咪唑甲基)-三乙基四胺(TTHB)、l，l，4，7，7-五(2-苯并咪唑甲基)-二乙基三胺(DTPB)、 N， N， N' ， N'-四-(2-苯并咪唑甲基)-1 ， 10- 二氮-4， 7- 二氧癸烷(EGTB) 、 N， N， N' ， N'-四 (2-苯并咪唑亞甲基)-l，2-二乙胺(EDTB)、或者N，N-二 (2'-苯并咪唑甲基)亞胺(IDB) 為配體的金屬配合物的合成將配體溶于甲醇或乙醇溶液，然后加入所述金屬離子的可溶 性鹽，配體和金屬鹽的摩爾比為1 : 0. 5 1 : 4，60 9(TC反應1 4小時，然后過濾、干 燥得到產品，用自然揮發或擴散法得到多苯并咪唑金屬配合物非病毒基因載體晶體。
以三(2-苯并咪唑基甲基)胺(NTB)為配體的金屬配合物的合成，合成步驟為
步驟1 、配合物[Cu (NTB) (H20) ] (C104) 2 5. 2 (H20)的合成: 將4mL CuCl2 *2H20(0. 02mol)乙醇溶液逐滴加入到200mLNTB (0. 02mol)乙醇溶液 中，攪拌，水浴加熱30 9(TC，反應半個小時后，加入10mlNaC104(0 . 04mmol)水溶液，繼續 使反應進行2 6個小時，冷卻靜置，過夜，有淺綠色晶體析出，過濾，洗滌，真空干燥得到淺 黃綠色片狀固體，即為目的配合物； 步驟2、將步驟1得到的配合物和所述金屬離子的可溶性鹽按摩爾比1 : 0.5 1 : 4加入蒸餾水中，然后在每一種配體和金屬離子的溶液中再分別加入苯甲酸鈉、4， 4'-聯吡啶、對苯二甲酸、均苯四甲酸、均苯三甲酸、煙酸、異煙酸、丁二酸、反丁烯二酸、戊二 酸或已二酸橋連配體，橋連配體和金屬鹽的摩爾比為1 : 0.5 1 : 5，調節溶液pH 4.0 9.0，將混合溶液轉移到聚四氟乙烯反應釜中并封閉在80 18(TC反應36 80h，然后以 5°C /h的速率降低反應溫度至室溫，在混合液中得到適于X-射線單晶衍射的多苯并咪唑金 屬配合物非病毒基因載體晶體。 本發明的非病毒基因載體的應用，其特征是，用于誘導DNA凝聚形成凝聚體。該載 體和DNA形成的凝聚體，用于細胞核的轉染染色。


圖1 、配體DTPB合成路線。 圖2、配體DTPB配體分子結構圖。 圖3、配合物[Cu2(DTPB)Cl2]Cl2 5H20 2(^3011分子結構圖。 圖4、用ctDNA滴定配合物[Cu2 (DTPB) Cl2] Cl2 5H20 2CH30H的紫夕卜_可見光譜圖。 測試方法不同濃度的ctDNA在20mM Tris-HCl (pH7. 4)的緩沖體系中滴定濃度為M的配合物，37t:下反應相同時間，掃描測定體系在200 450nm的吸收值，采用雙通道 方法，用相應濃度的ctDNA樣品作為空白，測定紫外吸收光譜。
圖5、配合物[Cu2 (DTPB) Cl2] Cl2 5H20 2CH30H與入DNA凝聚體電鏡圖。
測試方法濃度為2 50 ii M的配合物與A DNA在20mM Tris-HCl (pH7. 4)的緩 沖體系中，37°C反應不同的時間，然后取5 L的樣品，滴加于銅網上，自然干燥，用Tecnai G220透射電鏡在175kV觀察(未染色)，單獨DNA體系作為對照一并進行。圖5中圖a、b、 c、 d依次表示的是5. 6iiMADNA和10iiM配合物分別反應30min、30min、60min、 120min形 成凝聚體的形貌。 圖6、配合物[Cu2 (EGTB) (C104) 2 (H20) 2] (C104) 2 6H20與入DNA凝聚體在細胞中的 定位。 測試方法5 ii M的配合物和5 ii M的A DNA反應30min后與細胞共培養，然后加入 熒光染料DAPI和Greenview分別對對細胞核和凝聚體進行標記，然后通過倒置熒光顯微鏡 觀察凝聚體在細胞中的定位。圖六中箭頭所指黃色部分為凝聚體在細胞核內的定位，綠色 部分為整個細胞核。 圖7、配合物1、2、3、4與A DNA凝聚體的毒性實驗結果。
其中，配合物1為[Cu2 (EGTB) (C104) 2 (H20) 2] (C104) 2 6H20，
配合物2為[Cu2 (DTPB) Cl2 (H20) ] (N03) 2 2CH30H H20，
配合物3為[Co2 (DTPB) Cl3] CI 5H20， 配合物4為[Cu2 (DTPB) (N03) CI (H20) ] (N03) 2 3CH30H 5H20。 測試方法不同濃度的配合物和A DNA反應30min后與細胞共培養，MTT法檢測凝
聚體的細胞毒性。用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞
數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。 圖8、單獨配合物1、2、3、4的細胞毒性 其中，配合物1為[Cu2 (EGTB) (C104) 2 (H20) 2] (C104) 2 6H20， 配合物2為[Cu2 (DTPB) Cl2 (H20) ] (N03) 2 2CH30H H20， 配合物3為[Co2 (DTPB) Cl3] CI 5H20， 配合物4為[Cu2 (DTPB) (N03) CI (H20) ] (N03) 2 3CH30H 5H20的細胞毒性。
圖9、配合物1、2、3、4與質粒pGL3-Control Vector凝聚體的轉染實驗結果。
配合物1為[Cu2 (EGTB) (C104) 2 (H20) 2] (C104) 2 6H20，
配合物2為[Cu2 (DTPB) Cl2 (H20) ] (N03) 2 2CH30H H20，
配合物3為[Co2 (DTPB) Cl3] CI 5H20、 配合物4為[Cu2 (DTPB) (N03) CI (H20) ] (N03) 2 3CH30H 5H20。 測試方法不同濃度的配合物和質粒pGL3-Control Vector反應30min后和細胞 共培養，通過熒光素酶檢測法分析配合物種類及配合物濃度對pGL3-Contro1 Vector質粒 轉染效率的影響。
具體實施方式

實施例1 [Mn2 (TTHB) Cl2] Cl2 □ 2/3C2H50H □ 4H20的合成
稱取提純后的TTHB (0. 5mmo1)粉末溶解于20mL乙醇中，然后加入含有 MnCl2 2H20(1. 5mmo1)乙醇溶液，控溫75。C攪拌反應5h，冷卻、過濾，得到澄清的無色溶液；
將溶液靜置于室溫下數周后析出的方形單晶即為目的物。
實施例2 [Cu2 (DTPB) Cl2] Cl2 5H20 2CH30H的合成 稱取提純后的DTPB(O. 5mmo1)粉末溶解于20mL甲醇中，然后加入含有 CuCl2 '2H20(lmmo1)甲醇溶液，控溫6(TC攪拌反應2h，冷卻、過濾，得到澄清的綠色溶液；將
溶液靜置于室溫下數周后析出的方形單晶即為目的物(參見圖3)。
實施例3 [Cu2 (EGTB) (H20) 2] (C104) 4的合成稱取提純后的EGTB (0. 5mmo1)粉末溶解于20mL甲醇中，然后加入含有 Cu (C104)2 *6H20(lmmol)的甲醇溶液，控溫6(TC攪拌反應2h，冷卻、過濾，得到綠色的粉末與 綠色溶液；將溶液靜置于室溫下數周后析出的塊狀單晶即為目的物。
實施例4 Cu (EDTB) (C104) 2 CH30H的合成 稱取提純后的EDTB(lmmol)粉末溶解于2mL乙二醇中，然后加入含有 (Cu(C104)2 6H20) (lmmol)的10mL水溶液中，控溫60。C攪拌反應2h，冷卻、過濾，得到綠色
的粉末與綠色溶液；將溶液靜置于室溫下數周后析出的塊狀單晶即為目的物。
實施例5 [Cu(IDB)Cl2] CH30H的合成 稱取提純后的IDB(O. 5mmo1)粉末溶解于20mL甲醇中，然后加入含有 CuCl2 '2H20(lmmo1)甲醇溶液，控溫6(TC攪拌反應2h，冷卻、過濾，得到澄清的綠色溶液；將
溶液靜置于室溫下數周后析出的方形單晶即為目的物。
實施例6 由芳香羧酸橋連的銅的NTB配合物 步驟1 、 [Cu (NTB) (H20) ] (C104) 2 5H20的合成 將4mL CuCl2 *2H20(0. 02mol)乙醇溶液逐滴加入到200mLNTB (0. 02mol)乙醇溶液 中，攪拌，水浴加熱6(TC，反應半個小時后，加入10mLNaC104(0 . 04mmol)水溶液，繼續使反應 進行3個小時，冷卻靜置，過夜，有淺綠色晶體析出。過濾，依次用少量乙醇，乙醚，洗滌，真 空干燥得到淺黃綠色片狀固體即為目的物。 步驟2、 [Cu (NTB) (PhCOO) ] C104的合成(PhCOO代表苯甲酸) 將步驟1得到的化合物(0. 2mmo1)加入到15mL蒸餾水中，然后加入lmL苯甲酸鈉 (0. 2mmo1)水溶液，并調節溶液pH7. 2，將混合好的溶液轉移到25mL聚四氟乙烯反應釜中并 封閉在120°C反應72h，然后以5°C /h的速率降低反應溫度至室溫，濾液中得到適于X-射線
單晶衍射的黃綠色塊狀晶體，手工分離出晶體即為目的物。
實施例7 由脂肪羧酸橋連的銅的NTB配合物 {[Cu (NTB) ] 2 (ii -f麗)} (C104) 2 8 (H20)的合成(f麗代表反丁烯二酸根)
將實施例6步驟1得到的化合物(0. 2mmo1)加入到10mL蒸餾水中，然后加入5mL反丁烯二酸(0. lmmol)水溶液，并調節溶液pH值pH7. 2 ;將混合好的溶液轉移到25mL聚四 氟乙烯反應釜中并封閉在12(TC反應72h，然后以5°C /h的速率降低反應溫度至室溫，濾液 中得到適于X-射線單晶衍射的藍色片狀晶體，手工分離出晶體即為目的物。
實施例8 透射電子顯微鏡(TEM)觀察DNA凝聚體形態在20mM Tris-HCl (pH7. 4)緩沖液中，加入5. 6 ii DNA和2 50 ii M濃度的配合 物(Cu2(DTPB)Cl2]Cl2 5H20 2CH30H) ， 37。C反應5min 2h不同時間。然后取5ii L樣品， 滴加于銅網上，自然干燥，用Tecnai G2 20透射電鏡在175kV觀察(未染色)，單獨DNA體 系作為對照一并進行，結果見圖5。
實施例9 共聚焦顯微鏡觀察凝聚體跨膜實驗 凝聚體制備實驗在細胞培養用D-Hank' s緩沖液中進行，5iiM的ctDNA分別 與5iiM的配合物(Cu2(EGTB) (C104)2 (H20)2] (C104)2 6H20)于37。C反應30min ;加入熒光 染料Greenview( —種可替代溴化乙錠的新型核酸染料)于37。C繼續反應30min，實驗中 61^6群1^用于雙鏈0脆凝聚體染色，4，6-二氨基-2-苯基噴哚(DAPI)用于細胞核染色。
細胞培養H印G2肝癌細胞培養于含10%新生小牛血清及雙抗(100U/mL青霉素、 100ii g/mL鏈霉素)的DMEM培養基中，37t:、5X C02的培養箱中進行培養。每隔一天更換 一次細胞培養液，每隔三天細胞傳代一次。培養一段時間后以合適的密度接種細胞至6孔 培養板進行分組培養，培養條件為37°C、5% C02的培養箱中培養24h。分組情況為空白組 (加入無血清培養基50 ii L)、配合物系列組(各孔加入對應樣品50 ii L)。
細胞樣后處理(1)加入藥物培養24h后，加入DAPI繼續培養20min ; (2)用磷酸 鹽緩沖液PBS (含有EDTA的磷酸鹽緩沖液稱取適量EDTA鈉鹽溶于pH為8. 3的0. 1M磷酸 鹽溶液中配成含有5mM EDTA的磷酸鹽緩沖液)洗滌細胞3次；(3)用0. 25%胰蛋白酶消化 細胞使其從培養板上脫落，即時制板于激光共聚焦顯微鏡下觀察，結果參見圖6。
實施例10
凝聚體細胞毒性實驗 收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100 ii L，鋪板使待測細胞調密度至 1000 10000孔，邊緣孔用無菌PBS填充。5% 0)2，371:孵育，至細胞單層鋪滿孔底(96孔 平底板)，加入濃度梯度(5、10、20、40、75微摩爾/升)的藥物。5XC02，37。C孵育16 48 小時，倒置顯微鏡下觀察；每孔加入20 ii L MTT溶液(5mg/ml，即0. 5% MTT)，繼續培養4h。 終止培養，吸去孔內培養液；每孔加入150iiL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結 晶物充分溶解；在酶聯免疫檢測儀OD 490nm處測量各孔的吸光值。同時設置調零孔(培養 基、MTT、二甲基亞砜)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜) 結果參見圖7、圖8。
實施例11 熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測凝聚體的轉染效率 采用上述圖9中所述的配合物1 : [Cii2(EGTB) (C104) 2 (H20) 2] (C104)2 6H20， 配合物2 : [Cu2 (DTPB) Cl2 (H20) ] (N03) 2 2CH30H H20， 配合物3 : [Co2 (DTPB) Cl3] CI 5H20，
配合物4 : [Cu2 (DTPB) (N03) CI (H20) ] (N03) 2 3CH30H 5H20， 在37°C，5% C02條件下，在含0. 5%雙抗和10%胎牛血清的DMEM培養基中，培養 人肝癌細胞H印G2，當細胞鋪滿培養瓶壁95%左右時，接種到96孔板在相同的條件下繼續 培養24h至細胞鋪滿率達90X。pGL3-Contro1 Vector質粒分別與不同濃度的配合物反應， 在室溫下于pH7. 4， 20mM Tris-HCl緩沖液中反應30min。用180 y L不含血清DMEM培養基 置換培養板中的細胞培養介質，30min后，每孔加入20 L轉染溶液(質粒-配合物凝聚體 溶液)，質粒最終堿基對濃度為1. 5 M，配合物濃度依次為1、2、3、4、5 M，細胞在37°C ， 5% C02的培養箱中繼續培養4h，然后每孔加入200 L含10%小牛血清的新鮮DMEM培養基溶 液置換原來的培養液。細胞在37°C，5% C02的培養箱中繼續培養48h。
熒光素酶檢測實驗通過熒光素酶檢測法分析配合物種類及配合物濃度對 pGL3-Control Vector質粒轉染效率的影響。吸凈培養基后，每孔細胞用100 y L PBS/ Triton裂解液裂解，然后加入100 y L螢火蟲熒光素酶檢測試劑，混勻后在酶標儀上設定激 發波長為338nm，最大發射波長為590nm測定熒光強度，結果參見圖9。
權利要求
一種非病毒基因載體，其特征是它是以多苯并咪唑為配體的多核金屬配合物，具體是由1，1，4，7，10，10-六(2-苯并咪唑甲基)-三乙基四胺、1，1，4，7，7-五(2-苯并咪唑甲基)-二乙基三胺、N，N，N’，N’-四(2-苯并咪唑甲基)-1，10-二氮-4，7-二氧癸烷、N，N，N’，N’-四(2-苯并咪唑亞甲基)-1，2-二乙胺、N，N-二(2-苯并咪唑甲基)亞胺或者三(2-苯并咪唑基甲基)胺為主配體，以苯環或脂肪鏈多元羧酸為橋連配體，以H2O、Cl-、NO3-、Ac-或ClO4-為輔助配體或抗衡陰離子，合成的同多核或雜多核Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Co2+/3+、Mn2+、Fe2+/3+或Ni2+金屬離子的配合物。
2. 如權利要求1所述的一種非病毒基因載體，其特征是，所述的配體1， 1，4， 7， 10， 10-六(2-苯并咪唑甲基)-三乙基四胺，由三乙四胺六乙酸與鄰苯二胺按物質的量之比 1 : 4 1 : 8，以乙二醇為溶劑，160 18(TC共熱縮合6 8小時，直到無水蒸汽放出為 止；縮合產物冷卻至12(TC倒入燒杯中，邊攪拌邊加入蒸餾水；冷卻至室溫，變粘稠，加入無 水乙醇，靜置過夜；過濾得到紅褐色粗產品，然后粗產品用無水乙醇重結晶2 3次得到白 色固體產物，用丙酮洗滌，得到白色固體粉末或無色晶體目的產品。
3. 如權利要求2所述的一種非病毒基因載體，其特征是，所述的三乙四胺六乙酸與鄰 苯二胺的物質的量之比為1 : 6。
4. 如權利要求l所述的一種非病毒基因載體，其特征是，所述的配體l，l，4，7，7-五 (2-苯并咪唑甲基)-二乙基三胺，由二乙三胺五乙酸與鄰苯二胺按物質的量之比1 : 5， 以乙二醇為溶劑，160 18(TC共熱縮合6 8小時，直到無水蒸汽放出為止；縮合產物冷 卻至12(TC倒入燒杯中，邊攪拌邊加入蒸餾水；冷卻至室溫，變粘稠，加入無水乙醇，靜置過 夜；過濾得到紅褐色粗產品，然后粗產品用無水乙醇重結晶2 3次得到白色固體產物，用 丙酮洗滌，得到白色固體粉末或無色晶體目的產品。
5. 如權利要求1所述的一種非病毒基因載體，其特征是，所述的配體N， N， N'， N'-四 (2-苯并咪唑甲基)-1 ， 10- 二氮-4， 7- 二氧癸烷，由乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸與鄰 苯二胺按物質的量之比l : 2 1 : 6，以乙二醇為溶劑，160 18(TC共熱縮合6 8小時， 直到無水蒸汽放出為止；縮合產物冷卻至12(TC倒入燒杯中，邊攪拌邊加入蒸餾水；冷卻至 室溫，變粘稠，加入無水乙醇，靜置過夜；過濾得到紅褐色粗產品，然后粗產品用無水乙醇重 結晶2 3次得到白色固體產物，用丙酮洗滌，得到白色固體粉末或無色晶體目的產品。
6. 如權利要求5所述的一種非病毒基因載體，其特征是，所述的乙二醇雙(2-氨基乙基 醚)四乙酸與鄰苯二胺的物質的量之比為1 : 4。
7. 如權利要求1所述的一種非病毒基因載體，其特征是，所述的配體N， N， N'， N'-四 (2-苯并咪唑亞甲基)-l，2-二乙胺，由乙二胺四乙酸和鄰苯二胺按物質的量之比l : 2 1 : 6，以乙二醇為溶劑，160 18(TC共熱縮合6 8小時，直到無水蒸汽放出為止滯合產 物冷卻至12(TC倒入燒杯，邊攪拌邊加入蒸餾水；冷卻至室溫，變粘稠，加入無水乙醇，靜置 過夜；過濾得到紅褐色粗產品，然后粗產品用無水乙醇重結晶2 3次得到白色固體產物， 用丙酮洗滌，得到白色固體粉末或無色晶體目的產品。
8. 如權利要求7所述的一種非病毒基因載體，其特征是，所述的乙二胺四乙酸和鄰苯 二胺的物質的量之比為1 : 4。
9. 如權利要求l所述的一種非病毒基因載體，其特征是，所述的配體三(2-苯并咪唑基甲基)胺，由胺基三乙酸與鄰苯二胺按物質的量之比i : i i : 5，以乙二醇為溶劑，160 18(TC共熱縮合6 8小時，直到無水蒸汽放出為止；縮合產物冷卻至12(TC倒入燒 杯中，邊攪拌邊加入蒸餾水；冷卻至室溫，變粘稠，加入無水乙醇，靜置過夜；過濾得到紅褐 色粗產品，然后粗產品用無水乙醇重結晶2 3次得到白色固體產物，用丙酮洗滌，得到白 色固體粉末或無色晶體目的產品。
10. 如權利要求9所述的一種非病毒基因載體，其特征是，所述的胺基三乙酸與鄰苯二 胺的物質的量之比為1 : 3。
11. 如權利要求1所述的一種非病毒基因載體，其特征是，所述的配體N， N-二 (2-苯并咪唑甲基)亞胺，由亞胺基二乙酸與鄰苯二胺按物質的量之比i : i i : 3，以乙二醇為溶劑，160 18(TC共熱縮合6 8小時，直到無水蒸汽放出為止；縮合產物冷卻至120°C 倒入燒杯中，邊攪拌邊加入蒸餾水；冷卻至室溫，變粘稠，加入無水乙醇，靜置過夜；過濾得 到紅褐色粗產品，然后粗產品用無水乙醇重結晶2 3次得到白色固體產物，用丙酮洗滌， 得到白色固體粉末或無色晶體目的產品。
12. 如權利要求11所述的一種非病毒基因載體，其特征是，所述的亞胺基二乙酸與鄰 苯二胺的物質的量之比為1 : 2。
13. 權利要求l所述的一種非病毒基因載體的制備方法，其特征是，以1，1，4，7，10， 10-六(2-苯并咪唑甲基)-三乙基四胺、l，l，4，7，7-五(2-苯并咪唑甲基)-二乙基三胺、 N，N，N'，N，-四-(2-苯并咪唑甲基)-1，10-二氮-4，7-二氧癸烷、&&^，『-四(2-苯 并咪唑亞甲基)-l，2-二乙胺，或者N， N-二 (2'-苯并咪唑甲基)亞胺為配體的金屬配合 物的合成步驟將配體溶于甲醇或乙醇溶液，然后加入所述金屬離子的可溶性鹽，配體和金 屬鹽的摩爾比為l : 0. 5 1 : 4，60 90。C反應l 4小時，然后過濾、干燥得到產品，用 自然揮發或擴散法得到非病毒基因載體晶體。
14. 權利要求l所述的一種非病毒基因載體的制備方法，其特征是，以三(2-苯并咪唑 基甲基)胺為配體的金屬配合物的合成步驟為步驟1、配合物[Cu(NTB) (H20)] (C104)2 5. 2(H20)的合成:將4mL CuCl2 2H20(0. 02mol)乙醇溶液逐滴加入到200mLNTB(0. 02mol)乙醇溶液中， 攪拌，水浴加熱30 90°C ，反應半個小時后，加入10mlNaC104 (0 . 04mmol)水溶液，繼續使反 應進行2 6個小時，冷卻靜置，過夜，有淺綠色晶體析出，過濾，洗滌，真空干燥得到淺黃綠 色片狀固體，即為目的配合物；步驟2、將步驟1得到的配合物和所述金屬離子的可溶性鹽按摩爾比1 : 0.5 1 : 4 加入蒸餾水中，然后在每一種配體和金屬離子的溶液中再分別加入苯甲酸鈉、4，4'-聯吡 啶、對苯二甲酸、均苯四甲酸、均苯三甲酸、煙酸、異煙酸、丁二酸、反丁烯二酸、戊二酸或己 二酸橋連配體，橋連配體和金屬鹽的摩爾比為1 : 0. 5 1 : 5，調節溶液pH 4. 0 9. 0， 將混合溶液轉移到聚四氟乙烯反應釜中并封閉在80 18(TC反應36 80h，然后以5°C / h的速率降低反應溫度至室溫，在混合液中得到適于X-射線單晶衍射的非病毒基因載體晶 體。
15. 權利要求1所述的一種非病毒基因載體的應用，其特征是用于誘導DNA凝聚形成凝 聚體。
16. 按權利要求15所述的一種非病毒基因載體的應用，其特征是，該載體和DNA形成的 凝聚體，用于細胞核的轉染染色。
全文摘要
本發明涉及一種非病毒基因載體的制備與應用。該非病毒基因載體為多苯并咪唑金屬配合物。它是由多苯并咪唑TTHB、DTPB、EGTB、EDTB、IDB或者NTB為主配體，含苯環或脂肪鏈多元羧酸為橋連配體，H2O、Cl-、NO3-、Ac-或ClO4-為輔助配體或抗衡陰離子，合成和表征了大量含一個、兩個或多個相同及不同的Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Co2+/3+、Mn2+、Fe2+/3+或Ni2+金屬離子的配合物。該類配合物作為新型基因載體，具有合成方法簡單高效、水溶性好、細胞毒性低和轉染效率高的特點。通過紫外-可見吸收光譜、光散射、透射電鏡等實驗發現這類配合物可有效誘導DNA凝聚；倒置熒光顯微鏡和細胞轉染實驗證實多苯并咪唑金屬配合物作為載體釋放的基因可以有效地進入細胞核內進行表達。
文檔編號C07F15/06GK101705245SQ20091027280
公開日2010年5月12日 申請日期2009年11月17日 優先權日2009年11月17日
發明者劉梁, 劉長林, 孟祥高, 張航, 殷俊, 胡思 申請人:華中師范大學