專利名稱：一種血管緊張素I(AI,Angiotensin I)免疫原制備方法
技術領域：
本發明涉及一種制備血管 緊張素I免疫原的方法和制備該多克隆抗體的方法。
背景技術：
在研究高血壓的發病機制中，現已確認腎素-血管緊張素系統(簡稱RAS)對調節 人體血壓和水、電解質平衡，維持人體內環境的穩定起著十分重要的作用。血管緊張素原分子量大約在66000-110000之間，本身無直接生理作用，其氨基端 的14肽為腎素底物，在腎素作用下可將其肽鏈上第10位和第11位上兩個亮氨酸之間的肽 鍵打斷，脫去其后無活性作用的4個氨基酸而形成一種含10肽結構的血管緊張素I (簡稱 為Al)。AI通過AI轉化酶的作用后，脫去肽鏈上羧基端的2個氨基酸，轉換成具有強烈血 管收縮效應的升壓物質——8肽結構的血管緊張素II (簡稱為All)。AI正常生理濃度下沒有生理活性，若在血漿中濃度很高時，能刺激腎上腺髓質釋 放兒茶酚胺，作用于腦中樞神經，引起周圍血管收縮，使血壓升高，還對鈉、水的重吸收產生 影響。血管緊張素I和血管緊張素II都屬于半抗原，必須與大分子載體蛋白連接制成免 疫原才能免疫動物誘發抗體產生。上海市高血壓研究所選用不同的載體(兔血清白蛋白、 牛血清白蛋白、多聚賴氨酸、聚乙烯吡咯啶酮)經碳二亞胺(EDC)或戊二醛(GDA)為聯接劑 制備了五種不同的血管緊張素II免疫原。免疫動物實驗比較表明其中的血管緊張素II-戊 二醛-牛血清白蛋白效果滿意。血管緊張素I分子量為1295. 69，可參考上述血管緊張素II免疫原的制備方法制 備血管緊張素I免疫原。但該方法制備的AII免疫原免疫動物后產生的抗體效價不夠高， 用于放射免疫分析法尚可。現今非放射性固相免疫分析法應用更為廣泛，對抗體的效價、親 和力要求更高，因而需要更有效地誘發抗體產生的免疫原及免疫方法。
發明內容
本發明提供一種制備血管緊張素I免疫原的方法和制備該多克隆抗體的方法。本 發明采用的血蘭蛋白來源于低等生物，異原性較強，能更有效地刺激兔子的免疫系統。采用 硼酸緩沖液比采用PB緩沖液制備的免疫原AI活性更高，產生的抗血清滴度也更高。以血 蘭蛋白為載體蛋白，在硼酸緩沖體系中與AI連接制備的免疫原AI活性最高，產生的AI抗 血清工作滴度也最高。
具體實施例方式實施例DAI的氨基酸順序為天門冬氨酸(Asp)-精氨酸(Arg)-頡氨酸(Val)-酪氨酸 (Tyr)-異亮氨酸(Ile)-組氨酸(His)-脯氨酸(Pro)-苯丙氨酸(Phe)-組氨酸(His)-亮 氨酸(Leu)同型雙功能試劑戊二醛作為連接劑。戊二醛的兩個醛基分別與AI和載體蛋白上的氨基形成SChiff堿，中間以五碳鍵的橋連接起來。反應式如下R-NH2+HC (CH2) 3CH+H2N"P — R-N = CH (CH2) 3CH = N-P2) AI與載體蛋白的連接選用BSA和血蘭蛋白作為載體蛋白，戊二醛作為連接劑，按下述A、B、C三種方法與 AI連接(A)稱取 IOmg BSA 和 5mg Al，溶解于 2mL 0. IM ρΗ7· 4ΡΒ 緩沖液。加入 1 %戊二醛 0. 5mL,室溫攪拌1. 5h，加入0. 25mL IM甘氨酸，室溫攪拌30min，用0. IM pH 7. 4PB緩沖液 充分透析；
(B)稱取IOmg BSA和5mg Al，溶解于2mL 0. IM pH9. 0硼酸緩沖液。以下步驟同 (A)，用0. 05M pH 8. 4硼酸緩沖液充分透析；(C)稱取IOmg血蘭蛋白和12mg Al，溶解于2ml 0. IM pH 9. 0硼酸緩沖液。加入 0. 31%戊二醛lmL，室溫攪拌2h，以下步驟同(A)，用0. 05M pH 8. 4硼酸緩沖液充分透析；3) AI抗血清制備將新西蘭白兔分成三組，每組三只，分別用A、B、C三種AI免疫原與福氏完全佐劑 充分混勻后皮下多點進行免疫。兩周后AI免疫原與福氏不完全佐劑充分混勻加強免疫，此 后間隔3-4周免疫一次，共免疫6次，用AI RIA試劑盒檢驗抗體滴度。
權利要求
1.一種血管緊張素I (Al，Angiotensin I)免疫原制備方法 步驟如下DAI的氨基酸順序為天門冬氨酸(Asp)-精氨酸(Arg)-頡氨酸(Val)-酪氨酸 (Tyr)-異亮氨酸(Ile)-組氨酸(His)-脯氨酸(Pro)-苯丙氨酸(Phe)-組氨酸(His)-亮 氨酸(Leu)同型雙功能試劑戊二醛作為連接劑，戊二醛的兩個醛基分別與AI和載體蛋白上 的氨基形成schiff堿，中間以五碳鍵的橋連接起來，反應式如下 R-NH2+HC (CH2) 3CH+H2N-P — R-N = CH(CH2)3CH = N-P 2) AI與載體蛋白的連接選用BSA和血蘭蛋白作為載體蛋白，戊二醛作為連接劑，按下面的方法與AI連接 稱取IOmg BSA和5mg Al，溶解于2mL 0. IM pH7. 4的PB緩沖液，加入戊二醛0. 5mL， 室溫攪拌1. 5小時，加入0. 25mL IM甘氨酸，室溫攪拌30分鐘，用0. IM pH 7. 4的PB緩沖 液充分透析。
2.如權利要求1所述的一種血管緊張素KALAngiotensinI)免疫原制備方法上述 與AI連接的方法可以替換為稱取IOmg BSA和5mg Al，溶解于2mL 0. IM pH 9. 0的硼酸 緩沖液，加入1 %戊二醛0. 5mL,室溫攪拌1. 5小時，加入0. 25mL IM甘氨酸，室溫攪拌30分 鐘，用0. 05M pH 8. 4硼酸緩沖液充分透析。
3.如權利要求1所述的一種血管緊張素KALAngiotensinI)免疫原制備方法上述 與AI連接的方法可以替換為稱取IOmg血蘭蛋白和12mg Al，溶解于^iil 0. IM pH 9. 0硼 酸緩沖液，加入0. 31%戊二醛lmL，室溫攪拌2小時，加入0. 25mL IM甘氨酸，室溫攪拌30 分鐘，用0. 05M pH 8. 4硼酸緩沖液充分透析。
全文摘要
本發明涉及一種制備血管緊張素I免疫原的方法和制備該多克隆抗體的方法，采用硼酸緩沖液比采用PB緩沖液制備的免疫原AI活性更高，產生的抗血清滴度也更高，以血蘭蛋白為載體蛋白，在硼酸緩沖體系中與AI連接制備的免疫原AI活性最高，產生的AI抗血清工作滴度也最高。
文檔編號C07K14/795GK102093476SQ20091025047
公開日2011年6月15日 申請日期2009年12月10日 優先權日2009年12月10日
發明者于爽, 曾玲, 白云鵬 申請人:北京北方生物技術研究所