專利名稱：一種雙發色團熒光探針及制備方法
技術領域：
本發明涉及一種含有羅丹明和熒光素基團的雙發色熒光探針及其制備方法。 熒光探針可以研究復雜的生物體系，但應用環境微小變化會對熒光產生巨大影 響，如果熒光物質帶有酸性或堿性取代基，溶液的pH值的改變對其熒光性能有很大的影 響。利用熒光化合物的熒光性能隨環境PH值變化而改變的特點，來檢測細胞生理范圍pH 值變化的熒光化合物被稱為PH熒光探針。 一些熒光物質在酸性或堿性條件下發生水解，環 的破裂或鍵的斷開，使熒光性能發生改變，熒光物質在酸或堿的條件熒光光譜也會有明顯 的差別。如羅丹明類熒光染料，處于酸性或中性條件下為醌式結構，有熒光；堿性條件下形 成螺式結構而無熒光產生。而熒光素由于其熒光量子產率對PH值敏感，熒光素處于酸性 條件下無熒光，在堿性條件下發射黃綠色熒光，熒光量子產率高，因此常用來檢測細胞介質 的pH值。但其熒光量子產率在pH > 8時才能達到最大，而正常細胞質液的pH值在6. 8 7. 4的變化范圍，因而降低熒光探針適合檢測的pH值，使其在細胞生理環境下熒光強度最 大，具有重要的意義。為此利用這兩類熒光探針產生熒光條件的互補性，將羅丹明與熒光素 相連在一個分子中得到一種具有雙吸收、雙發射基團的化合物，以適應較寬pH范圍的熒光 分析，具有探索價值
發明內容
本發明目的就是為了解決上述技術問題，提供一種含有羅丹明和熒光素基團的雙 發色熒光探針的制備方法。 本發明具體提供了一種新型的含有羅丹明和熒光素基團的雙發色熒光探針，其結
構式為
其中1^、1 2、1 3、1 4各自為氫、不含活潑氫的取代或未取代烷基或芳基中之一種，1 5、
R6、 R7、 R8各自為氫、鹵素、不含活潑氫的取代或未取代烷基或芳基中之一種。 n是介于1到9之間的自然數，An—選自氯離子、溴離子、高氯酸根或硫酸根中的一種。 上述雙發色團熒光探針的制備方法包括以下步驟 用氯化亞砜將羅丹明衍生物酰氯化，即得到羅丹明酰氯粗產品；加入有機溶劑使 羅丹明酰氯溶解完全，在室溫下緩慢加入二胺類物質，溶液攪拌2小時以上，得到一端氨基
背景技術：
被酰化的羅丹明酰胺，減壓除去溶劑后將其與5-羧基熒光素琥珀酰亞胺酯共同溶解在N， N-二甲基甲酰胺中，冰浴下滴加N-乙基二異丙胺，室溫反應，TLC檢測(石油醚乙酸乙酉旨 =3 : 1， Rf 二0.3)，用無機酸調pH值為中性，柱層析純化，得目標產物，即含有羅丹明和
熒光素基團的雙發色熒光探針。其反應過程如下式所示
<formula>formula see original document page 4</formula> 本發明采用的干燥有機溶劑有乙腈、二氯甲烷、二甲基亞砜、氯仿、N， N-二甲基甲 酰胺、四氫呋喃，或者它們的混合物。 本發明所述的用于調pH值的酸包括無機酸如鹽酸、氫溴酸、高氯酸或硫酸。 由于上述技術方案運用，本發明與現在技術相比具有下列優點 1.根據本發明制備的含有羅丹明和熒光素基團的雙發色熒光探針，在不同pH值
條件下表現出不同的熒光特性，能進行雙吸收、雙發射的熒光檢測，在pH二 4時，這種雙發
色熒光探針表現的熒光性能和羅丹明熒光探針相近，在pH = 10時這種雙發色熒光探針的
熒光性能與熒光素相近，可用來檢測細胞生理范圍pH值變化，還可將這類探針作為pH的熒
光指示劑。 2.本發明合成的含有羅丹明和熒光素基團的雙發色熒光探針，不含有任何生物特 征基團，具有非常高的檢測靈敏度，適合微量檢測，有良好的應用前景。
圖1是實施例1所得雙發色團熒光探針在甲醇中的紫外-可見光譜 圖2是實施例1所得雙發色團熒光探針在p = 4、pH = 10溶液中熒光發射光譜
具體實施方式
實施例1
將2. 15g(5. Ommol)羅丹明化合物溶解在15mL干燥的氯仿中，冰浴條件下滴加氯 化亞砜7mL，撤去冰浴，室溫條件下反應4小時，減壓除去溶劑后得到的深紫色固體用20mL 二氯甲烷溶解完全，在室溫下緩慢加入到O. 98g(13. 5mmol)l，3-丙二胺的二氯甲烷溶液 中，室溫反應，TLC檢測(CH30H : CH2C12=1 : llO，Rf = 0. 45)，12小時后減壓除去溶劑， 用柱層析純化，先使用CH^^將淡紅色層沖至硅膠柱2/3，洗脫劑改用CH30H : CH2C12 :
冰醋酸=10 : iooo : 5直至分離完畢，得淡紫紅色固體即一端氨基被酰化的羅丹明酰胺
2. 07g(3. 62mmol)，將所得固體與1. 75g(3. 70mmol)5-羧基熒光素琥珀酰亞胺酯完全溶解 在20mLDMF中，冰浴下滴加N_乙基二異丙胺0. 67mL (4mmo1) ， TLC檢測(石油醚乙酸乙酯 =3 : 1， Rf = 0. 3)，三天后將反應液加入20mL乙酸乙酯，稀鹽酸洗滌3次后減壓除去有 機溶劑，所得固體直接用柱層析純化，得乳白色粉末2. llg(收69. 4% )。
力畫R (d6-DMSO， 500MHz ， ppm) S :1.12(t，J = 7Hz， 12H) ， 1. 85-1. 91 (m， 2H)， 2. 24-2. 26 (m， 4H) ， 3. 31—3. 44. (m， 12H) ， 6. 10—6. 15 (m， 4H) ， 6. 23 (s， 2H) ， 6. 55 (d， J = 2. 5Hz， 2H) ， 6. 98-7. 02 (m， 2H) ， 7. 21 (d， J = 9. 5Hz， 1H) ， 7. 76-7. 79 (m， 1H) ， 7. 90 (dd， Jl = 7. 5Hz， J2 = 2Hz 1H) ，8. 10(d， J = 7. 5Hz， 1H) ，8. 53(s， 1H); 13C NMR(d6-DMS0， 500MHz ，卯m) S : 12. 6， 14. 3， 30. 1， 31. 9， 34. 2， 37. 3， 40. 1， 46. 2， 95. 3， 103. 5， 106. 2， 111. 3， 119. 5， 122. 7， 123. 8， 127. 9， 128. 2， 130. 6， 132. 5， 148. 1， 155. 4， 157. 3， 165. 2， 167. 9， 169. 5.
實施例2 為比較堿性熒光染料羅丹明與酸性熒光染料熒光素連接后熒光性能的變化，對實 施例l所得到的含有羅丹明和熒光素基團的雙發色熒光探針進行了紫外-可見光譜和熒光 光譜檢測。在pH = 4時，該探針表現的熒光性能和羅丹明B相近，最大發射波長為561nm， 熒光量子產率比羅丹明B低，(K僅有0.41 ;在pH二 IO時該探針的熒光性能與熒光素相近， 最大發射波長為520nm。熒光光譜說明，將不同pH值條件下進行熒光檢測的羅丹明、熒光 素結構橋連在一起后，兩個發色團體并沒有改變原有的熒光性能，在酸或堿的條件熒光光 譜仍會有明顯的差別。pH = 4時，雙發色熒光探針分子中羅丹明結構為醌式結構，有熒光， 熒光素部分開環，無熒光產生，雙發色熒光探針溶液呈粉紅色，表現為羅丹明部分的熒光性 質，吸收和發射波長略有藍移；pH = 10時，由于雙發色熒光探針分子中熒光素部分在堿性 條件下形成螺式結構而產生黃綠色熒光，吸收和發射波長略微紅移。利用其熒光性能隨環 境PH值變化而顯著改變的這個特點，可以來檢測細胞生理范圍pH值變化。
權利要求
一種含有羅丹明和熒光素基團的雙發色熒光探針，其特征在于所述雙發色熒光探針如下所示其中R1、R2、R3、R4各自為氫、不含活潑氫的取代或未取代烷基或芳基中之一種，R5、R6、R7、R8各自為氫、鹵素、不含活潑氫的取代或未取代烷基或芳基中之一種。n是介于1到9之間的自然數，An-選自氯離子、溴離子、高氯酸根或硫酸根中的一種。F2009102448219C00011.tif
2. 根據權利要求1所述一種雙發色團熒光探針的制備方法，其特征在于包括如下步驟用氯化亞砜將羅丹明衍生物酰氯化，即得到羅丹明酰氯粗產品；加入有機溶劑使羅丹明酰氯溶解完全，在室溫下緩慢加入二胺類物質，得到一端氨基被酰化的羅丹明酰胺，減壓除去溶劑后將其與5-羧基熒光素琥珀酰亞胺酯共同溶解在N， N- 二甲基甲酰胺中，冰浴下滴加N-乙基二異丙胺，室溫反應，TLC檢測，后用無機酸調pH值為中性，柱層析純化得目標產物，即含有羅丹明和熒光素基團的雙發色熒光探針。
3. 根據權利要求2所述的雙發色團熒光探針的制備方法，其特征在于所述的干燥有機溶劑為乙腈、二氯甲烷、二甲基亞砜、N， N-二甲基甲酰胺或者四氫呋喃。
4. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的酸包括無機酸如鹽酸、氫溴酸、高氯酸或硫酸。
5. 根據權利要求1所述含有羅丹明和熒光素基團的雙發色熒光探針，其特征在于該探針能在不同pH值條件下進行雙吸收、雙發射的熒光檢測，可用來檢測細胞生理范圍pH值變化。針如下所示
全文摘要
本發明公開了一種含有羅丹明和熒光素基團的雙發色熒光探針及制備方法。其表達式如右(I)化學結構式所示。該雙發色團熒光探針的合成方法為通過以2-位帶有羧基的羅丹明類分子與二氯亞砜等氯化試劑反應得到的羅丹明酰氯，與不同鏈長的二胺形成單酰胺產物后再與羧基熒光素琥珀酰亞胺活性酯反應，將兩種熒光探針橋鏈在一起，得到在不同pH值條件下進行熒光檢測的雙吸收、雙發射熒光探針。該探針適應較寬pH范圍的熒光分析，可用來檢測細胞生理范圍pH值變化。
文檔編號C07D493/00GK101735802SQ20091024482
公開日2010年6月16日 申請日期2009年12月16日 優先權日2009年12月16日
發明者劉冬青, 劉靜, 溫景云, 陳星 , 顏范勇 申請人:天津工業大學