專利名稱：：一種小麥葉銹菌單克隆抗體及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物技術，特別是涉及一種小麥葉銹菌單克隆抗體及其制備方法與應用。
背景技術：
：小麥銹病包括至文病菌包括小麥條銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)、小麥口十誘菌(Pucciniatriticinaf.sp.tritic)禾口小麥禾干誘菌(Pucciciniagraminisf.sp.tritici)，是一類世界性禾谷類作物的重要病害。小麥銹病具有發生區域廣、暴發性強、流行頻率高、危害損失重等特點，嚴重威脅著我國小麥的生產安全，而在我國以小麥條銹病的發生最為廣泛，是影響我國小麥生產安全的首要病害，主要發生在西北、西南、長江中下游和華北等有關省(市、自治區)，每年發生面積約6000萬畝，經大力防治后仍年均減產小麥IO億公斤左右；其次是小麥葉銹病，在西南和長江流域一帶發生最重，華北和東北地區每年也有較重危害，而小麥葉銹病中，小麥葉銹菌生理小種或致病類型以K1T、THT兩個小種為主(四川農業大學，蒲志剛，碩士論文"小麥葉銹菌群體毒性與DNA多態性關系分析及生理小種分子鑒定研究"2004)，；小麥稈銹病過去主要分布在東南沿海、長江流域和福建、廣東、廣西的冬麥區及東北、內蒙古等春麥區發生流行(李振岐和曾士邁，2000)，通過沿海地區病菌越冬菌源基地治理和洛夫林系統抗病品種的廣泛種植，近30年來基本控制了該病害的流行危害，但在西南、淮北和東北等局部地區每年仍有不同程度的發生。病害的早期診斷檢測是準確測報和有效防控的基礎和前提。長期以來，銹病的診斷主要基于病原菌的生物學及病害癥狀的特征，其預測預報主要基于定期、大規模的田間病葉調查和室內病菌小種的活體分離、培養和鑒定。而條銹病和葉銹病的苗期癥狀區別不甚明顯，一些基層植保人員常常將二者混淆；在小麥銹病潛育階段，寄主的發病癥狀不易觀察，難以界定初侵染的時期和規模。這些用于銹病診斷及病情測報的傳統方法不僅耗時費工，且其準確性和可靠度在很大程度上取決于調查測報人員的經驗積累與技術水平，難以滿足病害的快速、高通量診斷檢測實際需求。因此，有必要研發簡單易行、靈敏準確的小麥銹病快速診斷和檢測技術，其于鑒別病害、提高病害預測預報的準確度均具有重要的理論意義和實際應用價值。目前，中國農業科學院植物保護研究所麥類病害實驗室已經針對這一生產中面臨的實際問題，建立了小麥條銹菌和葉銹菌種的特異性分子診斷檢測技術(Caoetal.，2007;曹麗華等，2007)。然而，該類基于PCR擴增的病菌核酸檢測技術不但需要配置一些特殊儀器如PCR儀、凝膠電泳裝置等，且對操作人員的技術水平要求較高，難以在眾多基層植保科技工作者和技術人員中推廣應用。單克隆抗體技術，是由單細胞系列產生的同一種抗體蛋白，其僅與抗原分子中的一個抗原決定簇結合，故與抗原性物質反應時相對專一，不受其它物質干擾，能區別物種間的細微差異。利用該方法檢測病原菌具有諸多優點，如易于大量生產、可高通量檢測、免用標記物，較易實現病菌的快速、實時、實地檢測(Wardetal.，2004;Werres&Steffens，1994)，促使其迅速在農學、醫學和食品學中得到廣泛應用。同時，該方法涉及的儀器化程度較低、操作簡便，特別是對樣本前處理要求簡單易于推廣，國際上許多權威機構將其列為優先發展的分析技術之一。因而，單克隆抗體技術是實現田間快速檢測病原菌的好方法(Danks&Barker，2000;Deweyetal.，1990;Wardetal.，2004)。自上世紀80年代以來，單克隆抗體技術已廣泛應用于一些卵菌病原菌的生物學、分類學及致病性方面的研究，諸如Phytophthoraci皿amomi(Hardhametal.，1986;Gaboretal.，1993)，Pythiumaphanidermat咖(Estrada-Garciaetal.，1989)，及Aphanomycesinvadans(Milesetal.，2003)，且成功石開發了水生真菌Salmonellasp.，Escherichiacoli、Listeriamonocytoenes(Bokkenetal.，2003;Fratamicoetal.，1998;Koubovesetal.，2001;Leonardetal.，2004)及幾種細菌病原菌單克隆抗體檢測技術(Ipbaletal.，2000)。丹麥農科院作為我們的合作伙伴，目前已經在小麥條銹菌的單克隆抗體研究方面取得了一些進展(Skottrupetal.，2007)，但其尚未對小麥葉銹菌的單克隆抗體制備方法進行報道。
發明內容本發明針對小麥葉銹菌單克隆抗體檢測的空白現狀，提供一種小麥葉銹菌單克隆抗體及其制備方法與應用，用于檢測小麥葉銹菌，具有特異性好、靈敏度高、操作簡便快速的優點。—種小麥葉銹菌(Pucciniatriticinaf.sp.tritic)的單克隆抗體，其制備方法包括抗原免疫動物、細胞融合制備雜交瘤細胞、雜交瘤細胞分泌單克隆抗體三個步驟，其特征在于所述抗原為小麥葉銹菌的夏孢子。所述抗原為小麥葉銹菌生理小種PHT和/或THT的夏孢子。所述抗原為小麥葉銹菌生理小種PHT的夏孢子和THT的夏孢子的等量混合物。所述抗原免疫動物之前，先以弗氏佐劑乳化所述抗原。所述動物為48周齡的Balb/C小鼠。上述單克隆抗體在檢測小麥葉銹病中的應用。上述單克隆抗體的制備方法，步驟如下(1)以小麥葉銹菌小種PHT和/或THT的夏孢子為抗原免疫小鼠，篩選出能分泌出對小麥葉銹菌小種PHT和/或THT的夏孢子特異性反應的血清的小鼠，(2)取小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合，篩選陽性雜交瘤細胞，(3)從陽性雜交瘤細胞的培養液上清中或陽性雜交瘤細胞免疫小鼠制取的腹水中分離單克隆抗體。抗小麥葉銹菌raT、THT的單克隆抗體雜交瘤細胞株，其保藏號為CGMCCNo.3464。本發明目的是為檢測小麥葉銹病提供一種小麥葉銹菌單克隆抗體，其特點在于以完全的小麥葉銹菌夏孢子為抗原對動物進行免疫、制備雜交瘤細胞、從雜交瘤細胞培養液上清液中或雜交瘤細胞免疫小鼠抽取的腹水中分離純化而得到單克隆抗體。以葉銹菌夏孢子為抗原制得的該單克隆抗體專一識別小麥葉銹菌夏孢子(即幼苗期小麥攜帶的葉銹菌)，能夠鑒別小麥幼苗期麥苗的感染情況，使植保工作人員針對致病菌進行提早防治。獲得該單克隆抗體后，植保工作人員通過目前常規的ELISA方法就可預測和鑒定小麥是否感4染小麥葉銹菌，與其他種類致病菌的鑒定方法結合使用達到鑒別診斷的目的。根據本發明單克隆抗體的技術方案，本領域技術人員可以采用不同的單一的或者混合的小麥葉銹菌生理小種的夏孢子作為抗原，制備得到專一針對某些生理小種的單克隆抗體。根據近些年來的文獻報道，大多數年份中，我國小麥葉銹菌中致病類型以PHT、THT兩個生理小種為主，因此本發明具體提供一種采用小麥葉銹菌生理小種PHT和/或THT的夏孢子作為抗原制備得到的單克隆抗體，為鑒定檢測小麥葉銹病提供一種適應性較廣泛的單克隆抗體。更進一步地，本發明采用PHT和THT兩個生理小種夏孢子的等量混合物為抗原，制備的單克隆抗體能夠識別兩種專門識別兩種這兩種生理小種的感染情況，進一步擴大了單克隆抗體的鑒別檢測范圍。本發明中優先采用弗氏佐劑對作為抗原的夏孢子或者夏孢子混合物進行乳化，弗氏佐劑分為完全佐劑和不完全佐劑，可以增強夏孢子的免疫原性，提高制備抗體的效價。本發明還提供了一株雜交瘤細胞抗小麥葉銹菌raT、THT的單克隆抗體雜交瘤細胞株LPT-l(保藏號為CGMCCNo.3464)。能夠產生高效價的本發明的單克隆抗體。本發明還提供了上述單克隆抗體的制備方法，操作步驟為制備單克隆抗體的常規技術，其特點在于采用小麥葉銹菌夏孢子為抗原，本可以技術人員可以根據本發明的制備方法制備得到本發明的單克隆抗體。抗小麥葉銹菌KIT、THT的單克隆抗體雜交瘤細胞株LPT-l。分類命名抗小麥葉銹菌KIT、THT的單克隆抗體雜交瘤細胞株。保藏號CGMCCNo.3464。保藏日期2009年11月23日。保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號。具體實施方式實驗材料小麥葉銹菌小種KIT、THT及其夏孢子，本實驗室有保存，可向公眾發放。小麥品種鄭麥5389，本實驗室有保存，可向公眾發放實施例1:小麥葉銹菌的擴繁本發明根據目前中國小麥銹菌發生流行狀況，選擇小麥葉銹菌的主要流行小種raT、THT為實驗材料，在中國農業科學院植物保護研究所的高溫室進行鑒定與大量擴繁。具體步驟如下1.種植小麥葉銹菌的感病品種鄭麥5389，等到第2片新葉長出的時候，進行K1T、THT的接種。2.接種前用裝有清水的小型噴壺把小麥葉片噴濕，操作人員的雙手經酒精消毒后，蘸取清水輕輕抹去葉面的蠟紙層，手蘸葉銹菌夏孢子，涂抹在小麥葉片上，來回多抹幾次抹勻。3.抹過銹菌后，實驗員的雙手先用70%的酒精沖洗，再用流動的自來水沖洗干凈。4.然后輕輕的把接種好的小麥苗子放入接種用的預先沖洗干凈的鋁質圓桶里，均勻的噴上水霧，看見有葉片表面有細霧即可，切忌噴水過多。5.加蓋塑料薄膜，黑暗條件下16t:下培養24小時。6.取出接種的小麥苗，室溫培養(2025tO，待接種后的小麥葉銹菌出現褪綠斑時，要剪去新葉，罩上已經高溫滅菌的干凈玻璃罩。7.采集菌種時，把花盆放在臺子上，用手平托玻璃罩，用細的鐵條輕輕敲擊，使夏孢子落入罩內，再敲擊罩子，使孢子粉在罩子內呈一條線，傾倒入寫好標簽的小試管里。實施例2:小麥葉銹菌免疫小鼠1.收集新鮮擴繁的2種小麥葉銹菌孢子，經顯微鏡計數后，稱量小麥葉銹菌PHT與THT夏孢子各0.15mg(5X105個孢子/ml)，加入675ii1生理鹽水與675iU弗氏完全佐劑(美國sigma公司，貨號F5881)，放入注射筒中，將2個注射筒接起來，來回推動混勻得到乳化抗原。2.取48周齡雌性Balb/C小鼠，取200y1乳化抗原以皮下多點注射的方式進行免疫。3周后，夏孢子懸液與弗氏不完全佐劑混合乳化，3周后，以弗氏不完全佐劑(美國sigma公司，貨號F5506)代替弗氏完全佐劑與菌液混合乳化，按照相同劑量及方式進行免疫，后續免疫均按照此方案進行。第3次加強免疫后，每次免疫后的第10天進行小鼠眼下部位采血，采用間接ELISA法測定血清的效價與特異性。3.測定血清效價時，須預先準備預包被有K1T、THT夏孢子的酶標板孔，具體操作如下(1)將步驟1中的夏孢子懸液，以100iU每孔加入酶標板孔，放置于37°。恒溫箱中孵育16h，取出后以PBS-T(含有0.05%的吐溫20)洗板3次，再向每孔加入200yl含有1%的脫脂奶粉的PBS于37t:封閉2h后儲存備用。(2)將梯度稀釋的抗血清100iU加入酶標板孔，放置于37t:孵育lh，而后加入用PBS稀釋1000倍的羊抗鼠酶標二抗，37t:孵育lh后取出洗板。(3)加入100ii1的單組份顯色底物(丹麥Kem-en-tec司，貨號4800H)，37。C孵育10min。(4)以0.2M的硫酸溶液中止反應，用酶標儀測定450nm吸光度值。表1為其中一次的測定數據。表1血清效價測定結果示例<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例3:小麥葉銹菌雜交瘤細胞株的篩選及單克隆抗體的制備取實施例2中血清效價較高的小鼠，以實施例2中的夏孢子懸液150ii1加強免疫，于5天后取小鼠脾臟與骨髓瘤細胞進行細胞融合，"二步篩選法"篩選陽性克隆，同時對于檢測出特異性抗體陽性孔的細胞，及時地轉種并進行克隆化。采用"有限稀釋法"進行雜交瘤細胞的克隆化，將細胞懸浮液連續稀釋至統計上每孔加樣僅含單個細胞，接種至培養板，就可由此單個細胞繁殖形成同源性的細胞克隆，有多孔陽性時，盡可能取單克隆孔進行再次克隆化，同時轉入24孔板，繼而轉入培養瓶中進行擴大培養，直至所有細胞孔的培養上清液均為陽性。陽性細胞株的篩選方法與實施例2中所述血清效價測定方法基本相同。唯一不同之處在于將實施例2中梯度稀釋的抗血清用陽性細胞株的培養液上清進行替換。將最終選得的陽性細胞株(保藏號CGMCCNo.3464)，擴大培養后，以體內誘生法制備腹水。將制備的腹水中單克隆抗體經鹽析沉淀后以蛋白A親和柱層析純化后備用。取與葉銹菌夏孢子同類的條銹菌夏孢子、稈銹菌夏孢子等，分別制備按照實施2的方法包被酶標板，用于包被的夏孢子的濃度為0.5mg/ml，將純化的單克隆抗體稀釋后加入酶標板孔，進行ELISA測定。根據吸光度值結果判定所篩選的單克隆抗體對這幾種孢子的交叉反應。由表2可知，所制抗體對于K1T、THT兩種葉繡孢子0D值較高(0D>0.5)，其余均較低(0D<0.5)。說明本發明制備的單克隆抗體是對PHT，THT的特異性抗體，可用于鑒別診斷小麥感染的是否是葉銹菌。表2所制備的單克隆抗體交叉反應測定結果交叉反應孢子類型交叉反應(以OD450mn值估算)葉繡PHT0.888THT1.511條銹SU140.419CY320.393稈繡21C30.37334C20.179注包被濃度為0.5mg/ml，其余條件同實施例2步驟3。實施例4:小麥葉銹菌特異性單克隆抗體在葉銹菌檢測中的應用將實施例3中純化的單克隆抗體與包被好的酶標板進行ELISA測定，具體操作方法如下(1)稱取葉銹菌孢子和待測的銹菌孢子樣品各0.3mg以實施例2的方法包被酶標板，分別作為標準孔和對照孔。(2)在酶標板孔中加入按最適合稀釋倍數稀釋好的單克隆抗體100iU，37t:避光反應30min，PBS-T洗板4次，每次間隔30s，拍干;(3)加入用PBS稀釋1000倍的羊抗鼠酶標二抗，37。C避光反應30min，PBS-T洗板4次，每次間隔30s，拍干；(4)加入單組份顯色液(丹麥Kem-en-tec司，貨號4800H)100iU，37。C避光反應30min;(5)加入0.2M的硫酸溶液100ii1終止反應，酶標儀置450nm讀數。所有酶標板加樣方式及反應時間均一致。根據標準孔和對照孔的吸光度值確定未知樣品是否是葉銹菌孢子。檢測結果見表3.7表3應用單克隆抗體酶聯免疫檢測銹菌孢子結果示例<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權利要求一種小麥葉銹菌(Pucciniatriticinaf.sp.tritic)的單克隆抗體，按以下步驟制得抗原免疫動物、細胞融合制備雜交瘤細胞、雜交瘤細胞分泌單克隆抗體三個步驟，其特征在于所述抗原為小麥葉銹菌的夏孢子。2.根據權利要求1所述的單克隆抗體，所述抗原為小麥葉銹菌生理小種PHT和/或THT的夏孢子。3.根據權利要求2所述的單克隆抗體，所述抗原為小麥葉銹菌生理小種PHT的夏孢子和THT的夏孢子等量混合物。4.根據權利要求1所述的單克隆抗體，所述抗原免疫動物之前，先以弗氏佐劑乳化所述抗原。5.根據權利要求1所述的單克隆抗體，所述動物為48周齡的Balb/C小鼠。6.權利要求15任一所述單克隆抗體在檢測小麥葉銹病中的應用。7.權利要求1所述單克隆抗體的制備方法，步驟如下(1)以小麥葉銹菌小種PHT和/或THT的夏孢子為抗原免疫小鼠，篩選出能分泌出對小麥葉銹菌小種PHT和/或THT的夏孢子特異性反應的血清的小鼠，(2)取小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合，篩選陽性雜交瘤細胞，(3)從陽性雜交瘤細胞的培養液上清中或陽性雜交瘤細胞免疫小鼠制取的腹水中分離單克隆抗體。8.抗小麥葉銹菌raT、THT的單克隆抗體雜交瘤細胞株LPT-1，其保藏號為CGMCCNo.3464。全文摘要本發明“一種小麥葉銹菌單克隆抗體及其制備方法與應用”，屬于生物
技術領域：
。本發明的單克隆抗體的制備方法包括抗原免疫動物、細胞融合制備雜交瘤細胞、雜交瘤細胞分泌單克隆抗體三個步驟，其特征在于所述抗原為小麥葉銹菌的夏孢子。用于檢測小麥葉銹菌，具有特異性好、靈敏度高、操作簡便快速的優點。文檔編號C07K16/14GK101709087SQ20091024155公開日2010年5月19日申請日期2009年11月26日優先權日2009年11月26日發明者劉太國,陳萬權,高利申請人:中國農業科學院植物保護研究所