專利名稱：：一種由萬壽菊干花顆粒制備高含量反式葉黃素晶體的方法
技術領域：
：本發明涉及一種由萬壽菊干花顆粒制備高含量反式葉黃素晶體的方法。
背景技術：
：萬壽菊是富含葉黃素類物質的天然原料，萬壽菊提取物在國際上已商業化。葉黃素屬于類胡羅卜素類的四萜類化合物，廣泛存在于花卉、水果、蔬菜等植物中。純度較高的葉黃素為橙黃色粉末，有弱的干草氣味，難溶于水、甲醇等極性較高的溶劑，易溶于四氫呋喃、乙酸乙酯、石油醚等極性較低的有機溶劑中。葉黃素的潛在價值包括提高免疫功能、抑制細胞質自身氧化、保護細胞單元免受氧化劑帶來的破壞，治療癌癥、以及防治老年人視黃斑退化等。目前葉黃素類物質的制備工藝，如化學合成和發酵工藝等，都面臨著化學合成中不能有效除去毒性溶媒，以及得率低的問題。可行的方法就是改進葉黃素類物質的制備方法。通過改進提取工藝提高葉黃素類物質提取率已有報道，但處理過程需較高的溫度(70°C)和較長的處理時間，從而導致葉黃素的降解和異構體的出現。另外，萬壽菊中游離葉黃素含量非常低，大部分與月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸等飽和脂肪酸結合成為葉黃素酯。游離葉黃素可被人體和禽類直接吸收利用，而以葉黃素酯形式存在的葉黃素不易被人體和動物吸收，因此提取和分離游離葉黃素已成為研究焦點之一。由于葉黃素化學結構具有3個手性中心，理論上有8種幾何異構體，實際上自然界只存在一種異構體。因合成工藝太復雜，費時費力，成本很高，工業化人工合成單一異構體的葉黃素迄今尚未成功。目前只有從羽衣甘藍或金盞菊、萬壽菊等天然植物中提取的葉黃素才含真正具有抗氧化作用的活性物質，而且比較經濟，適合大規模工業化生產。葉黃素晶體的制備早已規模化生產，但是至今高含量、高純度反式葉黃素晶體的制備的生產廠家還甚少，其中一個重要原因就是生產工藝還不夠成熟，如產品不穩定、皂化不完全、反應時間長，工藝復雜、成本高、溶劑不易回收以及對環境造成污染等。萬壽菊花中葉黃素主要以酯的形式存在，在生物體內葉黃素反式構象的活性較順式構象強很多，當其長時間在光、氧、熱條件作用下時，極易轉化為順式異構體，從而失去生理活性。目前葉黃素晶體的制備技術在國內外已有相關文獻和專利報道，但這些技術仍存在一些不足之處。Khachik等(U.S.Pat.No.5382714)提出了一種從皂化的萬壽菊油樹脂中分離、純化和重結晶出游離態葉黃素的工藝，但由于使用了含氯有機溶劑，得到的產品不適合食品和藥物上使用。U.S.Pat.No.6262284中使用四氫呋喃從萬壽菊顆粒中萃取、皂化和重結晶葉黃素，但粗提和皂化時四氫呋喃用量很大，成本高，且四氫呋喃腐蝕性強，設備維護費高，不適合工業化生產。U.S.Pat.No.5648564中應用丙二醇皂化葉黃素酯，再重結晶，但丙二醇粘度大，皂化溫度高，整個反應體系7(TC保持10個小時，會導致葉黃素反式結構轉化為順式，隨后的分離過程也比較困難，葉黃素收率只有59%。目前生產葉黃素的方法大多采用提取、皂化、分離、純化等步驟，其中，提取和皂化較為費時，若能將這兩步同時進行，將大大縮短制備時間。U.S.Pat.No.6262284在2001年首次將葉黃素的提取和皂化同時進行，使用了大量四氫呋喃作為提取溶劑，同時純化過程3使用的硅膠柱層析，需要消耗大量溶劑，費時費力，不經濟。國內王振等在2006年發表在《中國農業大學學報》期刊一文中報道了以四氫呋喃為提取劑，對常溫下萬壽菊中葉黃素的同時提取皂化工藝進行研究。分別考察了溶劑倍量、反應時間、氫氧化鉀乙醇溶液質量濃度對葉黃素提取率的影響，結果表明溶劑倍量和反應時間對葉黃素提取率有較顯著的影響。在單因素試驗的基礎上，采用L9(34)正交試驗考察3種因素對葉黃素提取率的影B向，以提取率和HPLC檢測量為指標綜合考慮，優化工藝參數為溶劑倍量50毫升/克，反應時間6小時，氫氧化鉀乙醇溶液質量濃度0.15克/毫升，此條件下葉黃素提取率達到90%以上。有研究表明四氫呋喃容易形成過氧化物，可能會導致葉黃素的分解。
發明內容技術問題本發明的目的在于提供一種工藝簡單、反式葉黃素含量高的葉黃素晶體的制備方法。技術方案本發明以萬壽菊干花顆粒為原料制備高含量反式葉黃素晶體的方法，是將萬壽菊干花顆粒粉碎過篩后，加入有機溶劑和堿溶液進行同時提取和皂化處理，提取皂化液經過濾去除濾渣后真空減壓濃縮，然后向濃縮液中加入50%乙醇水溶液，并調pH值至7.0，離心，經真空冷凍干燥得到反式葉黃素粗品。將反式葉黃素粗品用乙酸乙酯溶解，用去離子水沖洗，將乙酸乙酯相減壓濃縮，向濃縮液中加入正己烷/丙酮混合溶劑，在室溫下靜置后過濾，再用冷乙醇和去離子水洗滌，經真空冷凍干燥而制得反式葉黃素晶體。一種由萬壽菊干花顆粒制備高含量反式葉黃素晶體的方法，包括如下步驟(1)將萬壽菊干花顆粒粉碎后過2040目篩，待用；(2)將過篩后的萬壽菊花粉1:31:5加入提取溶劑石油醚，再向萬壽菊花粉中按料液質量體積比用量為1:1.51:2.5加入100克/升氫氧化鉀乙醇溶液，4065t:攪拌回流加熱14小時進行同時提取皂化處理；(3)提取皂化液過濾，將濾液進行真空減壓濃縮，其真空度為-0.020.08Mpa，溫度3545t:，真空減壓濃縮至沒有餾出液；(4)向濃縮液中加入57倍體積的50%乙醇水溶液，攪拌均勻，加入25%乙酸水溶液調PH值至7.O，待反式葉黃素結晶析出后，離心并經真空冷凍干燥得到反式葉黃素粗PR(5)用乙酸乙酯溶解反式葉黃素粗品，用去離子水沖洗去除多余的皂化物質和水溶性雜質，將乙酸乙酯相減壓濃縮，回收溶劑；(6)向濃縮物中加入正己烷/丙酮混合溶劑，正己烷/丙酮按體積比9:l7:3，混合溶劑與濃縮物的質量比為為4:17:i。在室溫下靜置30分鐘后過濾，濾餅分別用o5t:無水乙醇和去離子水洗滌至濾液無色，經真空冷凍干燥后制得反式葉黃素晶體。其中步驟(4)和步驟(6)所述真空冷凍干燥時的真空度1550Pa，溫度低于-4(TC，干燥時間20-24小時。步驟(1)(6)均在避光條件下進行。有益效果1.本發明簡化了反式葉黃素晶體制備過程中的提取與皂化工藝。將萬壽菊干花顆粒中反式葉黃素的提取和皂化過程同時進行，大大縮短了反應時間，節省了溶劑用量，同時使得具有生理活性的反式葉黃素的結構破壞和損失程度降到最低。為了提高反式葉黃素得率，本發明采用響應曲面法對萬壽菊干花顆粒中反式葉黃素提取皂化工藝進行了優化，并根據實際情況，確定最佳工藝參數為石油醚用量4.2升/千克，提取皂化溫度為5『C，氫氧化鉀乙醇質量濃度為100克/升，在此條件下獲得反式葉黃素得率為1.49%。響應曲面如圖1-3所示。2.選擇乙酸乙酯、丙酮、四氫呋喃、正己烷和石油醚5種有機溶劑作為反式葉黃素的提取溶劑，研究結果表明(表1)，用石油醚作為提取溶劑，反式葉黃素得率最高，為1.447%，乙酸乙酯的得率最低，為0.255%。因此，對萬壽菊干花顆粒中反式葉黃素的提取可選石油醚。而且石油醚在后續分離提純工序中易于除去，從而也降低了成本。表1不同提取溶劑對反式葉黃素得率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>3.用50%的乙醇水溶液促使反式葉黃素結晶析出，可以除去原花青素、反應生成的鉀鹽以及甾醇類物質等。Khachik(2001)在研究過程中采用50%的乙醇水溶液多次大量地沖洗皂化后的產物，從而使其呈中性，而不用酸調pH值。研究結果顯示此處理使得反式葉黃素大量的損失，而用酸調節皂化后產物的酸堿度則可以避免類似情況。本發明采用酸性較弱的乙酸進行調節，避免了PH值波動范圍過大。4.本發明采用高效液相色譜分析檢測萬壽菊干花顆粒中的反式葉黃素，使用的色譜分離柱為C3。柱。C3。柱是繼C18柱之后又一廣泛應用的反相吸附色譜固定相，在分離類胡蘿卜素幾何異構體方面顯示出優勢，可以準確地對反式葉黃素進行定性定量分析。經檢測，本發明所制備的晶體中反式葉黃素含量高達90%以上，且生物活性高，有機溶劑殘留量低，可應用于醫藥、保健食品領域。圖1石油醚用量和溫度對反式葉黃素得率影響的響應曲面圖圖2石油醚用量和堿溶液濃度對反式葉黃素得率影響的響應曲面圖圖3溫度和堿溶液濃度對反式葉黃素得率影響的響應曲面圖圖4本發明制得的反式葉黃素晶體的HPLC色譜圖具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步闡述，但不因此而限制本發明。實施例1將萬壽菊干花顆粒粉碎過20目篩，稱取1千克萬壽菊花粉，依次加入3升石油醚(沸程3060°C)，100克/升氫氧化鉀乙醇溶液2升，55t:回流提取皂化3小時。提取皂化液經過濾除去濾渣，將濾液于3545t:真空減壓濃縮至無餾出液，然后向濃縮液中加入0.6升50%乙醇水溶液，攪拌均勻，并加入25%醋酸水溶液調pH值至7.O，待反式葉黃素結晶析出后以5000轉/分鐘離心15分鐘，倒掉上清液，獲得含反式葉黃素的沉淀物，經真空冷凍干燥得到反式葉黃素粗品230.4克，真空冷凍干燥時的真空度1550Pa，溫度低于-4(TC，干燥時間20-24小時。經HPLC檢測，反式葉黃素得率為1.416%。將反式葉黃素粗品用1.5升乙酸乙酯溶解，加入1.5升去離子水洗滌，去除水溶性雜質，將乙酸乙酯相減壓濃縮。向濃縮液中加入100毫升己烷/丙酮(體積比為9:1)，在室溫下靜置30分鐘后過濾，去除脂溶性雜質，得到的反式葉黃素晶體分別用少量O5t:乙醇和去離子水洗滌，經真空冷凍干燥制得反式葉黃素晶體16.1克，其中反式葉黃素含量91.15%。反式葉黃素HPLC分析檢測條件。儀器設備美國安捷倫高效液相色譜儀HPLC1200，在線真空脫氣機，四元梯度洗脫泵，柱溫箱，DAD檢測器；色譜柱Q。柱，預CCarotenoidS-5(4.6X250mm);流動相甲醇/MTBE(甲基叔丁基醚)=95:5。流速1.0mL/min，柱溫25°C，進樣量20y1，檢測波長450nm。按反式葉黃素的HPLC測定方法，以積分峰面積為縱坐標(y)，標準使用液濃度(yg/mL)為橫坐標(x)，繪制標準曲線，其方程為y=187.62x-97.07，R2=0.9992。如圖4所示。實施例2將萬壽菊干花顆粒粉碎過40目篩，稱取0.8千克萬壽菊花粉，依次加入3.2升石油醚(沸程3060°C)，100克/升氫氧化鉀乙醇溶液2.5升，60°C回流提取皂化2.5小時。提取皂化液經過濾除去濾渣，將濾液于3545t:真空減壓濃縮至無餾出液，然后向濃縮液中加入0.5升50%乙醇水溶液，攪拌均勻，并加入25%醋酸水溶液調pH值至7.0，待反式葉黃素結晶析出后以5000轉/分鐘離心15分鐘，倒掉上清液，獲得含反式葉黃素的沉淀物，經真空冷凍干燥得到反式葉黃素粗品237.4克，經HPLC檢測，反式葉黃素得率為1.450%。將反式葉黃素粗品用1.5升乙酸乙酯溶解，加入1.5升去離子水洗滌，去除水溶性雜頂，將乙酸乙酯相減壓濃縮。向濃縮液中加入100毫升己烷/丙酮(體積比為7:3)，在室溫下靜置30分鐘后過濾，去除脂溶性雜質，得到的反式葉黃素晶體分別用少量O5°C乙醇和去離子水洗滌，經真空冷凍干燥制得反式葉黃素晶體14.8克，其中反式葉黃素含量90.06%。實施例3將萬壽菊干花顆粒粉碎過40目篩，稱取0.9千克萬壽菊花粉，依次加入2.7升石油醚(沸程3060°C)，100克/升氫氧化鉀乙醇溶液1.5升，58t:回流提取皂化3小時。提取皂化液經過濾除去濾渣，將濾液于3545t:真空減壓濃縮至無餾出液，然后向濃縮液中加入0.7升50%乙醇水溶液，攪拌均勻，并加入25%醋酸水溶液調pH值至7.0，待反式葉黃素結晶析出后以5000轉/分鐘離心15分鐘，倒掉上清液，獲得含反式葉黃素的沉淀物，經真空冷凍干燥得到反式葉黃素粗品240.5克，經HPLC檢測，反式葉黃素得率為1.487%。將反式葉黃素粗品用1.5升乙酸乙酯溶解，加入1.5升去離子水洗滌，去除水溶性雜質，將乙酸乙酯相減壓濃縮。向濃縮液中加入ioo毫升己烷/丙酮(體積比為4:i)，在室溫下靜置30分鐘后過濾，去除脂溶性雜質，得到的反式葉黃素晶體分別用少量O5°C乙醇和去離子水洗滌，經真空冷凍干燥制得反式葉黃素晶體16.83克，其中反式葉黃素含量91.4%。權利要求一種由萬壽菊干花顆粒制備高含量反式葉黃素晶體的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將萬壽菊干花顆粒粉碎后過20～40目篩，待用；(2)將過篩后的萬壽菊花粉1∶3～1∶5加入提取溶劑石油醚，再向萬壽菊花粉中按料液質量體積比用量為1∶1.5～1∶2.5加入100克/升氫氧化鉀乙醇溶液，40～65℃攪拌回流加熱1～4小時進行同時提取皂化處理；(3)提取皂化液過濾，將濾液進行真空減壓濃縮，其真空度為-0.02～0.08Mpa，溫度35～45℃，真空減壓濃縮至沒有餾出液；(4)向濃縮液中加入5～7倍體積的體積比50％乙醇水溶液，攪拌均勻，加入體積比25％乙酸水溶液調pH值至7.0，待反式葉黃素結晶析出后，離心并經真空冷凍干燥得到反式葉黃素粗品；(5)用乙酸乙酯溶解反式葉黃素粗品，用去離子水沖洗去除多余的皂化物質和水溶性雜質，將乙酸乙酯相減壓濃縮，回收溶劑；(6)按混合溶劑與濃縮物的質量比為為4∶1～7∶1向濃縮物中加入正己烷/丙酮混合溶劑，正己烷/丙酮按體積比9∶1～7∶3；在室溫下靜置30分鐘后過濾，濾餅分別用0～5℃無水乙醇和去離子水洗滌至濾液無色，經真空冷凍干燥后制得反式葉黃素晶體。2.根據權利要求1所述一種由萬壽菊干花顆粒制備高含量反式葉黃素晶體的方法，其特征在于步驟(4)和步驟(6)所述真空冷凍干燥時的真空度1550Pa，溫度低于_40°C，干燥時間20-24小時。述一種由萬壽菊干花顆粒制備高含量反式葉黃素晶體的方法，其特征在于步驟(6)所述。3.根據權利要求1或2所述一種由萬壽菊干花顆粒制備高含量反式葉黃素晶體的方法，其特征在于所述步驟(1)(6)均在避光條件下進行。全文摘要本發明涉及一種由萬壽菊干花顆粒制備高含量反式葉黃素晶體的方法。該方法是將萬壽菊干花顆粒粉碎過篩后，加入有機溶劑和堿溶液進行同時提取和皂化處理，提取皂化液經過濾去除濾渣后真空減壓濃縮，然后向濃縮液中加入50％乙醇水溶液，并調pH值至7.0，離心，經真空冷凍干燥得到反式葉黃素粗品。將反式葉黃素粗品用乙酸乙酯溶解，用去離子水沖洗，將乙酸乙酯相減壓濃縮，向濃縮液中加入正己烷/丙酮混合溶劑，在室溫下靜置后過濾，再用冷乙醇和去離子水洗滌，經真空冷凍干燥而制得反式葉黃素晶體。本發明工藝簡單，反式葉黃素得率高，適合工業化生產。文檔編號C07C403/24GK101774955SQ200910232358公開日2010年7月14日申請日期2009年12月8日優先權日2009年12月8日發明者劉春泉,宋江峰,李大婧,王闖申請人:江蘇省農業科學院