帶穿膜序列的人Scurfin蛋白全長及片段以及制備方法

專利名稱：帶穿膜序列的人Scurfin蛋白全長及片段以及制備方法
技術領域：
本發明涉及基因工程及蛋白轉導的生物醫學技術領域。具體的說，本發明涉及帶 穿膜序列的人Scurf in全長、去除叉頭結構結構域(AForkhead domain, AFKH)人Scurf in 片段和去除富含脯氨酸結構域(AProline-rich domain, APRD)人Scurf in片段的融合蛋 白PTD-hScurf in、PTD- A hFKH及PTD- A hPRD基因序列的重組構建及由此制備的融合蛋白 對Jurkat T細胞(人急性T淋巴細胞白血病細胞系)和人外周血CD4+T細胞抑制增殖、調 節細胞因子分泌和誘導免疫耐受的作用，以及應用于調節性T樣細胞制備、預防和治療治 療炎性免疫相關性疾病(包括自身免疫病、移植排斥相關疾病)及免疫耐受誘導或腫瘤的 藥物中的用途。
背景技術：
l.Treg概述 自1995年日本京都大學Sakaguchi等首次報道CD4+CD25hi調節性T細胞 (regulatory Tcells， Treg)后，Treg隨即引起全世界相關學科學者的廣泛關注。對Treg 的分類多種多樣，目前被廣泛認同的分類方式是根據Treg發育和其特異性以及作用機 制等的差異將其分為天然Treg(Natural Treg)和獲得性或誘導性Treg(Adaptive or Induced Treg)。天然Treg主要表達CD4、CD25、hScurf in、CD134 (0X40) 、GITR(TNFRSF18)、 CD62L(L-selectin)和CD152 (CTLA-4)。盡管其數量很少，但具有很強的免疫抑制功能。其 通過細胞間接觸抑制(活化的Treg既能夠通過自身的MHC分子與效應性T細胞直接接觸介 導免疫抑制，抑制CD8+T細胞的活化；也可以通過間接抑制APC表達協同剌激分子，從而抑 制效應性T細胞的增殖以及IL-2的產生。)和分泌細胞因子抑制效應免疫細胞的作用，在 自身免疫耐受的形成和維持中發揮重要作用。其功能的誘導依賴抗原，而功能的實施則無 抗原特異性，但最近有研究表明其功能也存在一定的抗原特異性。獲得性Treg則主要通過 分泌細胞因子方式發揮抑制作用。隨后發現Treg主要受一種叉頭翼狀螺旋轉錄因子家族 成員p3(forkhead box transcription factorclass p3，Foxp3)基因編石馬的蛋白Scurfin 的調控。 一般在表示人源的基因和蛋白時用F0XP3和Scurf in表示，而鼠源性用Fo鄧3和 scurf in表示，在非特指時用Foxp3表示和scurfin。也有用F0XP3/Foxp3代表蛋白的，本 專利申請書統一用hF0XP3和hScurfin分別表示人的基因和蛋白，mFoxp3和mScurfin分 別表示鼠的基因和蛋白。非特指時用Fo鄧3和scurfin分別表示基因和蛋白。
2.人Scurfin基因與其編碼產物 人Scurf in (human Scurfin， hScurfin)的基因為叉頭翼狀螺旋轉錄因子家族 成員p3 (humanforkhead box transcription factor class p3， hF0XP3)，位于人染色體 Xpll. 23-Xpl3. 3， GenBank登錄號AF277993。屬于叉頭/翼狀螺旋轉錄調節因子家族，含 有11個外顯子，在人類中高度保守。 人F0XP3 (human F0XP3， hF0XP3)基因的編碼產物為 一 個48_kDa的蛋白質 hScurfin，其特征性結構為蛋白C端的叉頭螺旋(Forkhead/winged helix，FKH)結構，含有這一結構域的蛋白質屬于DNA結合因子家族成員之一。除了叉頭區，hScurfin蛋白還包括 一個N末端的富含脯氨酸的結構域(Proline-rich domain，PRD)。近年研究表明這些結構 域與hScurf in的抑制活性的發揮有著密切的聯系。在FKH和PRD之間還包含一個C2H2鋅 指結構以及一個亮氨酸拉鏈序列，但是沒有磷酸化的PKB/AKT位點。hScurfin屬于轉錄調 節子，主要作用是抑制轉錄，主要表達于淋巴組織的CD4+T細胞，對免疫穩態的維持作用十 分重要。 3. Scurf in是Treg相對特異性標志 對于小鼠的研究表明，缺乏mScurfin可引起一種迅速致命的淋巴細胞增生性疾 病，與缺乏CTLA-4的小鼠相似。若將mFo鄧3基因轉入CTLA-4敲除的小鼠，或對CTLA-4 缺陷鼠進行mScurfin過表達，可延遲淋巴系增生性疾病的產生，延長該鼠140天壽命， 證實mScurfin可替代缺失的CTLA-4功能。而hScurfin突變表現和Treg缺乏所致的 X染色體聯鎖的免疫失調、多內分泌腺病和腸病綜合癥綜合征(immune dysregulation， polyendocrinopathy， enteropathy, X-liked syndrome, IPEX)，也禾爾為X_相關自身免疫 性-變應性失調綜合癥(X-linkedautoimm皿ity-allergic disregulation syndrome, XLAAD)情況相似。 早先對于mScurfin的研究顯示，mScurfin在小鼠Treg中高表達，而在 CD4+CD25—細胞中表達非常低，過表達mScurfin蛋白的小鼠，則產生更多的Treg。多個實驗 室的研究證實mScurfin參與CD4+CD25hi細胞發育，Sakaguchi等通過將mFoxp3基因通過 逆轉錄病毒轉染，可使脾臟的初始T細胞轉變為CD4+CD25hiT細胞，說明mScurfin蛋白能直 接或間接誘導Treg的相關分子表達。已證實人CD4+CD25hiT細胞部分表達hScurfin，并且 hScurfin+的這群細胞具有免疫抑制功能。但與小鼠不同的是，在TCR聯合抗CD28單抗剌 激下，CD4+CD25—T細胞可轉為CD4+CD25hiT細胞，同時表達hScurf in，并具有Treg樣的抑制 性功能。2001年，Wildin和Bennett同時提出hF0XP3基因與sf突變小鼠的mFoxp3基因 具有同源性。在對自身免疫疾病的研究中，人們發現，Scurf in基因可能是參與自身免疫的 一個關鍵調節物。將Scurfin基因Fo鄧3轉導Scurfin—的非調節性CD4+T細胞，可使后者 獲得Treg的表型，且具有無反應性(即無能)，與天然的Treg活性和表型相似，在體內、外 都可介導免疫抑制作用，說明Scurfin的表達標志著免疫調節抑制活性，其具有調控Treg 的發育及功能的作用。目前已經證實Fo鄧3基因轉錄的mRNA以及編碼蛋白Scurfin特異 性表達于Treg(盡管有少量報道在其他細胞中發現，但是大多數是非持續的表達)，而其他 CD4+T細胞亞群包括靜息CD4+T細胞、活化的Thl/Th2甚至NK T細胞均極少表達Scurfin, 故認為是Treg的特異分子標記物。
4. hScurf in生物學作用 2003年，Hori S等發現，mScurfin特異性地表達于Treg，且和Treg的發生、發育 和功能密切相關，這為分子水平在體內、外研究這一特殊細胞群提供了依據和特異性標記。 此外有文獻報道hScurfin與介導Treg功能的一系列細胞膜分子和細胞因子(如CTLA-4、 GITR、 IL-10和TGF-P)的表達及其功能的發揮有著十分密切的聯系。體外實驗表明， hScurfin以IL-2依賴的受體作為轉錄阻遏物，但是體內確切的靶點仍不十分清楚。
雖然hScurfin在Treg細胞的發育和功能發揮等方面所起的作用還有待進一步研 究，但迄今為止的研究已能夠表明hScurfin是控制Treg發育及其功能效應的關鍵基因，同時也揭示外周Treg來源有兩種可能①外周原初T細胞有可能分化為Treg ;②胸腺中可能 產生具有類似Treg功能的CD25—的細胞，這種細胞活化以后有可能轉化為CD25+Treg。
Roli K等發現，mscurfin高表達的小鼠免疫系統處于抑制狀態。將mFo鄧3基因 導入小鼠后發現，T細胞數量明顯減少，低于正常水平，并且這些T細胞的增殖能力和溶細 胞能力均較低，在TCR的剌激下分泌的IL-2水平降低。雖然這類小鼠的胸腺發育正常，但 是其外周免疫器官，尤其是淋巴結，表現出無細胞狀態。這說明mScurfin蛋白影響了小鼠 外周免疫系統的發育和功能狀態。
(l)維持免疫自穩 免疫自穩是機體免疫系統的基本功能之一，免疫系統通過免疫耐受和免疫調節來 達到免疫系統內環境的自身穩定。自身免疫性疾病的發生是由于對自己或非己識別的調控 機制出現紊亂， 一些自身反應性T細胞逃避克隆清除或免疫抑制，識別外周組織抗原。在正 常情況下，所有個體均存在自身反應性T細胞，但是自身免疫病僅發生在5%的人身上，這 說明一定存在能夠調控那些潛在自身反應性T細胞的細胞或因子。將除去了 CD25+細胞的 CD4單陽性T細胞過繼轉移給T細胞缺陷小鼠，能導致宿主的各種器官特異性自身免疫病； 而將Treg和CD4單陽性T細胞共同過繼轉移，則能防止自身免疫病的發生。這一現象提示 Treg是維持自身免疫耐受的主要因素。出生3天切除胸腺的小鼠因外周Treg明顯減少可 發生器官特異性自身免疫病。如果能利用Treg的強大免疫調節作用，去特異性抑制自身反 應性T細胞的活化，便有可能找到自身免疫疾病新的治療方法。 2001年Brunkow等對自體免疫綜合癥scurfy缺陷的突變小鼠(Sf小鼠)研究時首 次發現mFo鄧3基因，并證實Sf小鼠的突變基因位點是在mFo鄧3基因第8內含子中插入了 兩個腺苷酸殘基，造成移碼突變，形成FKH缺失的蛋白。研究證明，Forkhead結構域對其核 定位及其與DNA的結合等起關鍵作用。缺少Forkhead結構域的mScurfin蛋白不能發揮轉 錄因子的功能，導致CD4+T淋巴細胞過度增殖、浸潤。hF0XP3基因突變可引起IPEX，其表現 為全面的免疫失調，并伴有自身免疫性內分泌疾病、早期發作的I型糖尿病和甲狀腺炎；在 一部分病例中可伴有嚴重的異位特異反應，包括濕疹、食物變態反應和嗜酸性炎癥等。IPEX 患者的hF0XP3基因有13個獨立的突變點，其中有6個突變可引起氨基酸替換。通過對大 量的IPEX患者hF0XP3基因的分析發現，人類的IPEX 60%是由于hF0XP3基因編碼區域突 變導致的，另外10X是mRNA表達下降導致的。 Sakaguchi等研究表明，在人類和小鼠患自身免疫性疾病時，CD4+T細胞上出現 Scurf in的表達缺失。如果將正常小鼠分離得到的Treg注入mFo鄧3基因缺陷小鼠體內， 能阻止這種小鼠自身免疫疾病的發生。此外，使用逆轉錄病毒轉化mFo鄧3基因進入未激活 CD4+CD25—T細胞使之成為與自然產生的CD4+Treg具有相類似功能的細胞。
Rundensky研究表明mScurfin轉錄因子能被CD4+CD25hiTreg特異地表達，并在T 發揮作用時成為必須因子。在致命的自體免疫綜合癥sf小鼠研究中發現mFo鄧3基因突變 和mFo鄧3基因無效突變導致CD4+CD25hiTreg缺乏，這種缺乏有別于CD4+CD25—T細胞的自身 缺陷。把CD4+CD25hiTreg轉移到新生的mFo鄧3基因缺乏的小鼠中能夠能優先擴大并起到
治療疾病的作用。
(2)抑制腫瘤 腫瘤的免疫逃逸機制主要包括腫瘤的抗原性弱及抗原調變，MHC-I表達低下，分泌免疫抑制因子如TGFI3 、IL-10以及缺乏協同剌激分子等。目前腫瘤免疫治療的研究主要集 中在打破免疫耐受和提高宿主T細胞反應。許多腫瘤抗原為自身抗原，因為Treg有利于自 身抗原耐受，通過去除組織特異性Treg可以使抗腫瘤作用得到增強，但體內應用CD25單抗 去除Treg的同時也去除了活化的CD8+CD25+T細胞，從而減弱了抗腫瘤效應。同時也發現體 內剔除CD25+細胞不足以治療已經發生的腫瘤，因此必須與其他抗腫瘤方法相結合。對于 hF0XP3表達的hScurfin蛋白來說，還存在著另外一面的作用。最近Yang Liu和Pan Zheng 報道hScurf in能表達于乳腺上皮細胞中，在乳腺癌細胞中表達下調，過表達hScurf in抑制 癌基因ErbB2 ;此外當hF0XP3基因發生突變或RNAi干擾hF0XP3基因表達時癌基因SKP2表 達上調，而且發現抑制SKP2對hScurfin蛋白介導的腫瘤生長抑制十分關鍵，這些證據都證 明了 Scurf in蛋白是腫瘤抑制基因。另外眾多的文獻報道Fo鄧3基因的表達產物Scurf in 能抑制NF-AT和NF- k B，而NF-AT和NF- k B與腫瘤的生存和增殖具有重要的作用。我們的 實驗也表明hScurfin能抑制T淋巴瘤細胞系Jurkat的增殖。綜上所述，因此hScurfin可 能可成為腫瘤治療的重要手段。
(3)對移植排斥反應影響 CD4+CD25hihSCurfin+Treg在移植耐受中起著重要的作用，是誘發機體移植耐受的 主要細胞。Treg具有抑制移植排斥的作用，隨著異體效應T細胞數量增加，其保護性作用減 弱。從正常小鼠體內除去Treg導致排斥反應增強，并降低移植物的存活；相反，如果給予缺 乏T細胞的移植術后小鼠接種同系Treg和未致敏T細胞，移植物存活時間可明顯延長。在 體外MLR中，異基因淋巴細胞剌激下，Treg可以有效地抑制CD4+T細胞和CD8+T細胞的增殖 反應。另外，運用異基因剌激細胞和高劑量IL-2，在體外可以誘導并擴增抗原特異性Treg。 已有體外實驗克隆出針對人類移植物抗原的CD4+T細胞亞群，結果表明，與Thl或Th2克隆 引起耐受相反，Treg通過過繼性轉移誘導耐受。在未受外來抗原致敏的Naive小鼠體內存 在天然抑制移植排斥的能力，只是在移植耐受鼠其抗移植排斥的能力有所增強，因此Treg 可以調控異基因的效應T細胞，從而有利于建立異體移植物耐受。在移植時，Treg的活化 對移植排斥反應具有一定的抑制作用。如果在移植前或在移植早期階段能夠產生足夠的 Treg，將可以降低非特異性免疫抑制藥物的用量，甚至可以完全代替免疫抑制性藥物。
移植物抗宿主病(GVHD)是異基因造血干細胞移植后在受者體內植活的供者淋巴 細胞對宿主器官發生的免疫性損傷為主要特征的移植排斥反應，是異基因造血干細胞移植 最大障礙。隨著對Treg的認識，人們開始對Treg在GVHD中的作用也進行了研究。研究發 現去除供者淋巴細胞中的Treg或在移植前對宿主鼠去除CD25+細胞都可增加GVHD發病； 而應用新鮮分離純化的供鼠Treg進行轉輸可明顯減輕GVHD，為臨床預防GVHD提供了新的 方法，但Treg占CD4+T細胞的比例較低，臨床應用Treg受到限制。近年來通過在體外擴增 培養可獲得數量較多的Treg，采用擴增的Treg轉輸也可明顯減少致死性GVHD的發生，因此 該方法在將來很有希望應用于臨床。轉導hF0XP3基因的透明質酸特異性轉基因CD4+CD25—T 細胞能使男性皮膚移植物免受同系基因型女性排斥。
5. HIV的TAT-PTD作用特點及機制 通過細胞穿透肽進行蛋白轉導是目前體外蛋白傳遞的一種有效方法。最常用的蛋 白轉導肽就是HIV-TAT基因的第一個外顯子編碼的第48-56位氨基酸殘基，其具有蛋白轉 導結構域(protein transduction domain, PTD)，其作用特點如下
①速度快——幾分鐘，幾小時起效。 ②溫度適應性廣。在4t:和37t:都可以進行；其入胞過程遵循一個非受體、非能量 和非胞吞的動力學機制。 ③蛋白質進入的數量依賴于培養液中融合蛋白的濃度
④引領融合蛋白穿入培養細胞效率高。 ⑤若將融合蛋白注射入動物的腹腔，在很短時間內，可以在幾乎所有的組織和器 官中看到融合蛋白。 被TAT-PTD帶入細胞的分子的命運被TAT-PTD帶入細胞的分子基本上保留了 它們各自原有的化學性質，且具有它們本來的活性，因此它們在細胞內會各盡其責，各顯其 能。 目前推測穿膜過程與蛋白轉導域中堿性氨基酸(精氨酸和賴氨酸)的存在有關， 這些氨基酸帶有強的正電荷，可能是通過直接與帶正電荷的細胞膜脂類相互作用而介導穿 膜過程。PTD可以與其他蛋白形成的融合蛋白導入幾乎所有的細胞，包括破骨細胞、外周血 單核細胞及原代細胞等常規方法難以轉染的細胞，甚至還可以穿過血腦屏障。PTD引導蛋白 和多肽入胞的主要特點是轉導速度快，效率高，不損傷細胞。近來應用此轉導技術可以將藥 物、化合物、寡核苷酸、肽段、全長蛋白(如抗體、酶、分離的蛋白質)、金屬離子、甚至200nm 的脂質體進入細胞內。操作也很簡便，只需將融合的分子直接加入到組織培養介質中，15 30分鐘左右胞內可達到最大濃度，并且每個細胞內的蛋白濃度近乎相同。這樣，既可以控制 細胞內的蛋白濃度，又可以控制作用時間，一般胞外蛋白濃度在20-1000nmol/L，即可產生 生物學作用。 6. PTD-融合蛋白亞細胞定位 TAT蛋白真正具有轉導作用的是其序列中一個富含堿性氨基酸、帶有正電荷的多 肽片段與跨膜轉導有關，因而被稱為蛋白轉導結構域(PTD，氨基酸47-57)。其核心序列為 YGRKKRRQRRR等電點12.7，為堿性。按照功能可以分為兩部分GRKKR起了蛋白核定位的 信號的作用；而序列中的精氨酸對蛋白的穿膜轉導作用十分重要。PTD通過核定位信號區 (NLS)將PTD-融合蛋白固定在核上，這可能也是其低免疫原性的原因。 一般而言，在與PTD 融合后的目的蛋白，能夠通過PTD的核定位信號被定位于靶細胞核中，因此PTD融合蛋白可 以在細胞的胞漿和胞核中同時分布。
7.其他 Krosl等采用表達的TAT-H0XB4蛋白成功擴增了造血干細胞，Veldhoen等采用酶 缺陷的Lck-HIV-Tat即酶缺陷的Lck-PTD轉導初始CD4+T細胞，結果其成功阻止了 CD4+T細 胞活化信號的內傳，抑制了 T細胞活化，造成T細胞的無能。此外最近美國學者Joon-Yo皿g Kim等發現通過逆轉錄病毒將外源性的人 hScurfin轉染至Jurkat-T細胞，可使其轉變為Treg樣的細胞，能夠抑制與其共育的 CD4+CD25—T細胞增殖，并能夠調節Treg相關基因的表達。
8. PTD穿膜序列在造血和淋巴系統的應用先例 Treg應用于移植免疫耐受的誘導在國內外已經開始，但是天然Treg數量很少，擴 增困難，因此近年來許多實驗室開始采用經Fo鄧3基因轉染后具有調節性功能的T細胞誘 導移植免疫耐受，并取得了動物實驗的成功，但轉基因最大的缺點是轉染效率低(除逆轉錄病毒載體外)，表達調控比較困難，有潛在的危險，尤其是逆轉錄病毒載體有誘發基因突變的可能。2005年Veldhoen等采用酶缺陷的Lck-PTD轉導初始CD4+T細胞，成功誘導T細胞獲得調節功能，目前國內外尚未見采用PTD與Fo鄧3基因構建表達融合蛋白應用于基礎和臨床研究的報道。

發明內容
本發明目的在于提供帶穿膜序列的人Scurfin蛋白全長及片段、及其制備方法。
本發明通過構建hScurfin全長及片段的穿膜融合蛋白原核表達載體，并對表達質粒進行
改建，獲得功能性融合蛋白。 本發明提供了以下融合蛋白 PTD-hScurf in融合蛋白，具有SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列 PTD- A h FKH融合蛋白，具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。 PTD- A hPRD融合蛋白，具有SEQ IDNO. 3所示的氨基酸序列。本文描述的PTD-hScurf in、PTD- A hFKH禾P PTD- A hPRD融合蛋白分別是人Scurf in
蛋白全長、缺失C端FKH及缺失N端PRD片段與HIV-TAT蛋白中PTD肽組成的融合蛋白。 本文描述的PTD-eGFP-hScurfin、 PTD-A hFKH-eGFP禾P PTD-A hPRD-eGFP融
合蛋白分別是帶穿膜序列的人Scurfin全長和eGFP融合蛋白、去除叉頭結構結構域
(AForkhead domain, AFKH)的人Scurf in片段和eGFP的融合蛋白和去除富含脯氨酸結
構域(AProline-rich domain, APRD)的人Scurf in片段和eGFP的融合蛋白。 本發明還提供了分別編碼上述6種融合蛋白的核酸構建體，所說的核酸構
建體，它含有編碼PTD-hScurfin、 PTD-AhFKH、 PTD-AhPRD、 PTD-eGFP-hScurfin、
PTD- A hFKH-eGFP或PTD- A hPRD-eGFP融合蛋白的氨基酸序列。 本發明提供了利用基因工程方法制備PTD-hScurfin、 PTD-AhFKH和PTD-AhPRD融合蛋白的方法，包括以下步驟①獲得編碼融合蛋白的基因序列；②將步驟①獲得的序列插入到合適的載體中，得到相應的核酸構建體；③將步驟②獲得的核酸構建體轉化適宜的表達菌；④在適宜的培養條件下，培養步驟③的表達菌，并加入適量的異丙基_ P -D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-P-D-thiogalactoside， IPTG)，O. 2mM-lmM終濃度誘導表達，從中分離出表達的融合蛋白。⑤若步驟④的融合蛋白為包涵體形式表達則通過鎳柱在變性劑存在條件下親和純化。⑥純化產物通過去鹽柱后凍存備用。 經實驗表明，本發明所公開的融合蛋白穿入Jurkat T細胞和外周T細胞后，抑制Jurkat T細胞和外周T細胞活化增殖及調控外周T細胞分泌Treg功能相關細胞因子的。為大量制備Treg樣細胞或直接抑制T淋巴細胞增殖提供了新的方法，為體內免疫耐受的誘導奠定了基礎。 上述融合蛋白作為活性成分可與其他藥用的稀釋劑、載體或賦形劑等制成藥物組合物。 上述的融合蛋白在制備Treg樣細胞、在制備預防和治療治療炎性免疫相關性疾病及免疫耐受誘導或腫瘤的藥物中的應用。 本發明首次采用構建PTD-hScurfin方式獲得融合蛋白，通過穿膜結構域直接融合目的蛋白轉導入Jurkat T和外周CD4+CD25—T細胞，以大量獲取Treg，突破制約Treg應用的瓶頸，以期最終應用于臨床的器官移植抗排斥治療。


圖1.是帶穿膜序列的載體pET28a-PTD質粒結構示意圖。
圖2.為融合蛋白構建模式圖。 圖3.是hScurfin、 AhFKH禾P AhPRD PCR產物電泳鑒定圖。M :DL2000Marker ;1泳道:hScurfin PCR產物(1313bp) ;2泳道:AhFKH PCR產物
(1008bp) ;3泳道AhPRD PCR產物(705bp)。 圖4.顯示 了 PTD-hScurfin(A、 B禾口 C) 、 PTD-A hFKH、 PTD-A hPRD、 PTD-eGFP-hScurf in、 PTD- A hFKH-eGFP、 PTD- A hPRD-eGFP融合蛋白誘導表達及純化的 SDS-PAGE電泳圖結果。 A :PTD-hScurfin在BL21和Rosetta(DE3)中誘導表達，兩種工程菌在0. 2mM的 IPTG分別誘導2h 8h :M :蛋白低分子量標準Fermentas SM0441。 B :PTD-hScurf in在不同菌種中誘導表達M :蛋白低分子量標準Fermentas SM0441 ;1、2泳道超聲裂解產物沉淀及上清。 C :1泳道總菌體蛋白；2_7泳道PTD-hScurf in鎳柱純化洗脫產物(51kDa) ;M : 蛋白低分子量標準Fermentas SM0441。 D : 1-3泳道PTD- A hFKH鎳柱純化洗脫產物(43kDa) ;M :蛋白低分子量標準 FermentasSM0441。 E : 1-5泳道PTD- A hPRD鎳柱純化洗脫產物(33kDa) ;M :蛋白低分子量標準 FermentasSM0441。 F :1泳道PTD-hScurfin-eGFP鎳柱純化洗脫產物(80kDa) ;M :蛋白低分子量標準 Fermentas SM0441。 G :1泳道PTD-eGFP-AhPRD鎳柱純化洗脫產物(70kDa) ;M :蛋白低分子量標準 Fermentas SM0441。 H :1泳道PTD-eGFP-AhFKH鎳柱純化洗脫產物(61kDa) ;M :蛋白低分子量標準 Fermentas SM0441。 圖5.顯示了 PTD-hScurfin、PTD-AhFKH和PTD-AhPRD融合蛋白表達的Western blots圖鑒定結果。 其中，1泳道PTD-hScurf in (51kDa) ;2禾口 4泳道Fermentas預染Marker ;3泳道 PTD-eGFP-hScurf in (80kDa) ;5泳道PTD-A hPRD (33kDa) ;6泳道PTD-A hFKH(43kDa) ;7 泳道PTD- A hPRD-eGFP (60kDa) ;8泳道PTD- A hFKH-eGFP (70kDa)。在該實驗中使用的一 抗為l : 1000抗6XHis-Tag ;二抗1 : 5000HRP-羊抗小鼠IgG。 圖6.顯示了融合蛋白的亞細胞定位分析的激光共聚焦照片(Hoechst33342和PI 分別染細胞核，綠色熒光是為觀察亞細胞定位構建表達的融合蛋白PTD-hScurfin-eGFP、 PTD-A hFKH-eGFP和PTD-A hPRD-eGFP中eGFP的熒光)及Western-blot圖結果(目的蛋 白鑒定的一抗為l : 1000抗6XHis-Tag，二抗1 : 5000HRP-羊抗小鼠IgG，內參蛋白的 一抗為抗GAPDH抗體)。 A :PTD-eGFP-hScurf in、PTD_eGFP- A hPRD和PTD-eGFP- A hFKH激光共聚焦顯微鏡分析圖(紫外激發光檢測呈藍色熒光的細胞核，綠色濾光片檢測呈紅色熒光的細胞核，藍 色濾光片檢測融合蛋白中eGFP綠色熒光)。 B :左圖PTD-hScurfin穿膜2h和24h免疫印跡分析；右圖胞漿和胞核蛋白提取
物中PTD-hScurfin、PTD-AhFKH和PTD-AhPRD的Western-blot圖。 圖7.顯示了分別使用PHA 0. 5ug/mL、lug/mL、5ug/mL，PHA lug/mL+PMA 25ng/mL、
PHA lug/mL+PMA 50ng/mL、PHA lug/mL+PMA 100ng/mL剌激Jurkat T細胞24h，剌激條件摸
索的實驗結果。 A:PHA lug/mL+PMA 50ng/mL剌激Jurkat T細胞12h顯微鏡下圖(10X ， 20X ， 40X)細胞表面出現突起，比較容易被分散。 B:未剌激Jurkat T細胞組，12h顯微鏡下圖(10 X ， 20 X ， 40 X)細胞保持原有容 易聚團生長特點，表面未見突起。C :PHA lug/mL+PMA 50ng/mL剌激Jurkat T細胞24h， cck_8法測定490nm吸光度
分析細胞增殖。 圖8.顯示了 PTD-hScurf in、PTD- A hFKH和PTD- A hPRD融合蛋白640nM分別對經 PHA+PMA聯合剌激24h和48h的Jurkat T細胞增殖水平影響的CCK-8法測定的實驗結果。
A:PHA lug/mL+PMA 50ng/mL剌激Jurkat T細胞24h各融合蛋白處理組(640nM， 剌激前lh加入)及各對照組cck-8法測定490nm吸光度比較細胞增殖。
B :PHA lug/mL+PMA 50ng/mL剌激Jurkat T細胞48h各融合蛋白處理組(640nM， 剌激前lh加入)及各對照組cck-8法測定490nm吸光度比較細胞增殖(*p < 0. 05)。
圖9.顯示了 PTD-hScurf in、PTD- A hFKH和PTD- A hPRD融合蛋白640nM分別對經 PHA+PMA聯合剌激活化的外周T細胞增殖的影響。 A :不同濃度PHA+PMA或PMA+Ionomycin剌激后外周血T細胞增殖情況1 : Cells Control ;2 :PHA 0. 5 ii g/mL ;3 :PHA 1 ii g/mL ;4 :PHA 2 ii g/mL ;5 :PHA 1 ii g/ mL+PMA 50ng/mL ;6 :PHA 2 ii g/mL+PMA 30ng/mL ;7 :P廳.5 ii g/mL+PMA 100ng/mL ;8 : PMA30ng/mL+Ionomycinl. 2 u g/ml ;9 :PMA50ng/mL+Ionomycin 0. 8 u g/mL ;10 :PMA70ng/ mL+Ionomycin 0. 4iig/mL。 B :不同融合蛋白(640nm/L)和CsA (3 ii M)對經PHA 1 ii g/mL+PMA 50ng/mL后 外周血淋巴細胞增殖的影響。[96孔板每孔接種IX 105， CsA、 PTD-eGFP、 PTD-hScurfin、 PTD-AhPRD和PTD-A hFKH融合蛋白分別與細胞共育lh，每組同時做3個復孔。而后加入 上述實驗得出的最適劑量的PHA/PMA(1 y g/mL/50ng/mL)剌激](*p < 0. 05)。
圖10.顯示了 Realtime PCR分析融合蛋白對外周T細胞經PHA+PMA剌激后產生 IL-2的影響。 A :PHA 1 ii g/mL+PMA 50ng/mL剌激外周血T細胞后，不同時間點IL-2的轉錄水 平。(*p < 0. 05)B :不同融合蛋白(640nm/L)和CsA (3 ii M)對經PHA 1 ii g/mL+PMA 50ng/mL后6 小時外周血T淋巴細胞產生IL-2的影響。[6孔板每孔接種1X106/ml， CsA、 PTD-eGFP、 PTD-hScurf in、 PTD-AhPRD和PTD-AhFKH融合蛋白分別與細胞共育lh。而后加入上述實 驗得出的最適劑量的PHA/PMA(1 y g/mL/50ng/mL)剌激，實驗重復三次](*p < 0. 05)
圖11.顯示了 Realtime PCR分析融合蛋白對外周T細胞經PHA+PMA剌激后產生IL-10的影響。 A :PHA 1 ii g/mL+PMA 50ng/mL剌激外周血T細胞后，不同時間點IL-10的轉錄水 平。(*p < 0. 05) B :不同融合蛋白(640nm/L)和CsA (3 ii M)對經PHA 1 ii g/mL+PMA 50ng/mL后2 小時外周血T淋巴細胞產生IL-10的影響。[6孔板每孔接種IX 106/ml， CsA、 PTD-eGFP、 PTD-hScurfin、 PTD-AhPRD和PTD-AhFKH融合蛋白分別與細胞共育lh。而后加入上述實 驗得出的最適劑量的PHA/PMA(1 y g/mL/50ng/mL)剌激，實驗重復三次](*p < 0. 05)
具體實施例方式
在具體實施方式
中所述的PTD-hScurfin、 PTD-AhFKH禾P PTD-AhPRD融合蛋白具 有SEQID NO. 1-3所示的氨基酸序列。 本發明提供了生產PTD-hScurf in、PTD- A hFKH禾P PTD- A hPRD融合蛋白的方法，該 方法包括下列步驟 1.獲得編碼PTD-hScurf in、 PTD- A hFKH和PTD- A hPRD融合蛋白的基因序列；
2.將步驟1獲得的序列插入到合適的載體中，得到相應的核酸構建體；
3.用步驟2獲得的核酸構建體轉化合適的工程表達菌； 4.在適宜的培養條件下，誘導步驟3的轉化后的工程表達菌，并從中純化出 PTD-hScurf in 、 PTD- A hFKH和PTD- A hPRD融合蛋白。 5. PTD-hScurf in 、 PTD- A hFKH和PTD- A hPRD融合蛋白或攜帶eGFP作為示蹤的融 合蛋白的激光共聚焦觀察融合蛋白的亞細胞定位實驗。 6. PTD-hScurf in、PTD- A hFKH和PTD- A hPRD融合蛋白Western-blot鑒定和亞細 胞定位實驗。 7. PTD-hScurf in 、 PTD- A hFKH和PTD- A hPRD融合蛋白或攜帶eGFP作為示蹤的融 合蛋白的流式細胞儀檢測穿膜效率實驗。 8. Jurkat T細胞和外周CD4+CD25—T細胞的PHA+PMA活化增殖條件摸索實驗
9. PTD-hScurf in、PTD- A hFKH和PTD- A hPRD融合蛋白對Jurkat T細胞的增殖抑 制實驗。 10. PTD-hScurf in、PTD- A hFKH和PTD- A hPRD融合蛋白對外周T細胞的增殖抑制 實驗。 11. PTD-hScurf in、PTD- A hFKH禾P PTD- A hPRD融合蛋白抑制外周T細胞分泌IL-2 的實驗。 12. PTD-hScurf in 、 PTD- A hFKH和PTD- A hPRD融合蛋白促進外周T細胞分泌 IL-10的實驗。 以上實驗所涉及的材料來源 pGEM T-Easy/hF0XP3質粒(Amp抗性)為日本京都大學S. Sakaguchi教授惠贈。 pET28a(帶有His-Tag)質粒購自Novagen公司產品，peGFP-Nl質粒購自invitrogen公司 產品；大腸桿菌菌株DH5 a日本TAKALA公司產品；BL_21和Rosetta(DE3)均為Novagen公 司產品均由北京大學醫學部免疫學系陳慰峰院士贈送。pET28a-PTD質粒(帶有His-tag)， pET28a-PTD-eGFP (帶有His-tag)載體本實驗室自行構建。Ex TaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶、核酸電泳分子量標準DL-2000(TaKaRa公司)；質粒小量抽提試劑盒(Axygen公司)；質 粒純化試劑盒(上海捷瑞公司)；限制性內切酶(Sac I、Xho I、HindIII)及預染色低分子 量蛋白(Fermentas公司)；Bradford蛋白定量試劑盒(北京普利萊公司)；細胞增殖試劑盒 CCK8試劑盒(日本株式會社同仁化學研究所)。純化樹脂Profinity I MAC鎳金屬螯合填 料(美國Bio-Rad公司產品)，小鼠抗-6 XHis-Tag單克隆抗體(Cell Signaling公司)，小 鼠抗人F0XP3抗體(克隆號236A/E7， eBioscience公司)，HRP標記山羊抗小鼠IgG 二抗 (北京中杉金橋公司)，ECL-plus顯色試劑盒、PD-10去鹽預裝柱(美國GE公司)，E. coli Rosetta(DE3)， pET28a(+)質粒和蛋白復性試劑盒(Novagen公司產品)，蛋白分子量標準 (Fermentas公司產品)，還原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、異丙基-P -D_硫 代半乳糖苷(IPTG Dioxane Free)(德國Merck公司產品)，PHA-P， NP_40， PMA， Hoechst 33342，青霉素，鏈霉素，卡那霉素，碘化丙啶(PI)和PMSF購自美國Sigma公司，透析袋(截 留分子量10， 000，美國Pierce公司)，小牛血清(杭州四季青公司)，Trizol， PMRH640, DMEM，小牛血清和胎牛血清購自美國Invitrogen公司，2XBri 11 iant SYBR Green QPCR Master Mix購自美國Stratagene公司，ReverTraAce購自日本T0Y0B0公司。其余常用的 各種鹽、酸、堿等化學試劑均為進口或國產分析純。 Jurkat T細胞株由北京大學醫學部T細胞研究室陳慰峰院士贈送。
引物見表l 表l.用于構建各種表達載體的引物
Primer Pairs_Primer Sequence 5'-3'_Product Annealing (^=s
Size (bp)Temperature (。C)
Sense:AAGGATCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGA
CAGCGACGAAGAGAG CTCATGGTGAGCAAGG
PTD-eGFP(單劃線處為BamHl酶切位點，雙劃線處為Sac I
(N)酶切位點，BamH I和Sac I酶切位點之間為PTD序77556°C 30sec25
(primer 1)列)； Antisense:CCOAGCICTTACTTGTACAGCTCGTC (雙劃線處為Sacl酶切位點)
PTD-eGFP (C) (primer 2)Sense:AGAAAGCTTATGGTGAGCAAGG (劃線處為 HindHI酶切位點)73956°C 30sec25
Antisense:CCCTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTC (劃線處為Xho I酶切位點)
Sense:GCCAAGCTTATGCCCAACCCCAG (劃線處為
FullFOXP3 HindIII酶切位點)129662。C30sec25
(primer 3)Antisense:GATCTCGAGTCAGGGGCCAGGTGTAG (劃 線處為XhoI酶切位點)
Sense:CATGAGCTCCGATGCCCAACCCCAG (Sac I酶
△FKH切位點)100862.9。C 30sec25
(primer 4)Antisense:GCAAGCTTCATGTTGTGGAACTTGAAG (劃線處為HindIII酶切位點)
Sense:CTGGAGCTCCGGGTGTCTGCAAGTGGCC
△PRD(SacI酶切位點)70562.9°C 30sec25
(primer 5)Antisense:TCAAGCTTGGGGCCAGGTGTAGGGTTG (劃線處為HindIII酶切位點)
以上步驟具體描述如下 1.制備并鑒定目的融合蛋白，包括步驟(1)_(4): (l)pET28a-PTD-eGFP(N)質粒(eGFP在融合蛋白的N端)的構建以peGFP-Nl質 粒為模板，用引物對primer 1 (前向引物帶有PTD序列)通過PCR擴增獲得帶PTD的eGFP 的序列，PCR產物使用GenClean瓊脂糖DNA凝膠回收試劑盒(上海捷瑞公司)進行回收后， 然后插入經BamH I和Sac I雙酶切的pET28a就完成質粒的構建。 (2)pET28a-PTD質粒的構建在pET28a-PTD-eGFP (N)質粒構建的基礎上，用Sac I 單酶切切除中間的eGFP即得到的是pET28a-PTD(圖1) (3) pET28a-PTD-eGFP (C)質粒(eGFP在融合蛋白的C端)的構建以peGFP-Nl質 粒為模板，用引物對primer 2擴增獲得的eGFP序列，PCR產物使用GenClean瓊脂糖DNA凝 膠回收后，插入經Hind III和Xho I雙酶切的pET28a-PTD質粒，即完成構建。
(3) pET28a-PTD-hF0XP3禾口 pET28a-PTD-hF0XP3-eGFP表達質粒的構建以 pGEMT-Easy/hF0XP3質粒為模板，采用引物對primer 3通過PCR擴增獲得h F0XP3的基因 序列，PCR產物使用GenClean瓊脂糖DNA凝膠回收后，分別插入經Hind III和Xho I雙酶 切的pET28a-PTD質粒和pET28a-PTD_eGFP (N)質粒，即完成構建。 (4) pET28a-PTD-A hFKH禾P pET28a-PTD_eGFP-A hFKH表達質粒的構建以 pGEMT-Easy/hF0XP3質粒為模板，采用引物對primer 4通過PCR擴增獲得A hFKH的序列， PCR產物使用GenClean瓊脂糖DNA凝膠回收后，分別插入經Sac I和Hind III雙酶切的 pET28a-PTD質粒和pET28a-PTD_eGFP (C)質粒，即完成構建。 (5) pET28a-PTD-A hPRD和pET28a-PTD_eGFP-A hPRD表達質粒的構建以 pGEMT-Easy/hF0XP3質粒為模板，采用引物對primer 5，通過PCR擴增獲得A hPRD的序列， PCR產物使用GenClean瓊脂糖DNA凝膠回收后，分別插入經Sac I和Hind III雙酶切的 pET28a-PTD質粒和pET28a-PTD_eGFP (C)質粒，即完成構建。 (6)構建的質粒分別轉化細菌，提取質粒，采用T7通用引物，經上海英駿生物 技術有限公司測序，證實PCR產物已經準確克隆到表達載體中。結果成功構建了融合蛋 白的原核表達載體pET28a-PTD-hScurfin、 pET28a_PTD-A hFKH、 pET28a_PTD-A hPRD、 pET28a-PTD-eGFP-hScurfin、 pET28a_PTD-A hFKH-eGFP、 pET28a_PTD-A hPRD-eGFP (附圖 2)。將鑒定正確的克隆后的表達載體通過熱擊法轉化到工程表達菌Rosetta(DE3)大腸埃 希菌中，并通過抗生素Kana+(終濃度為50iig/ml)篩選陽性菌落。將陽性菌落抽提質粒， 進行PCR和酶切鑒定。(附圖3) 將鑒定正確的陽性菌落在ra7.0的LB管(Kana濃度為50iig/ml)中進行增菌 培養，當OD值二 0. 4 0. 6時，加入IPTG(Sigma公司)進行誘導。經過對誘導過程中 的時間梯度、溫度梯度、IPTG濃度梯度的實驗，最終確定IPTG誘導條件，PTD-hScurfin 和PTD-hScurfin-eGFP以30 。C、0. 2mmol/L誘導8h為最適誘導條件；PTD-AhFKH、 PTD- A hPRD、 PTD- A hFKH-eGFP和PTD- A hPRD-eGFP以30°C 、0. 5mmol/L誘導8h為最適誘 導條件。通過SDS-PAGE電泳分析確定目的蛋白的表達量最大(附圖4)。
收集在上述條件下誘導的部分菌體，加入適量的PBS，冰浴中超聲破碎，12000rpm/ min離心10分鐘，分別取上清和沉淀經SDS-PAGE電泳分析，證實6種融合蛋白主要為包 涵體形式表達。然后取上清經NitlMAC柱(Bio-Red公司)進行親和層析純化。上樣前Ni+-IMAC柱先經過10倍體積的上樣緩沖液洗柱。將超聲裂解完全的包涵體用結合緩沖 液(50mMNaH2P04 2H20、300mM NaCl、5mM咪唑、8M尿素，調整pH至8. 0)溶解后過濾，收 集濾液，按照Bio-Rad公司操作說明書在離心管中將濾液和Prof inity IMAC Ni-Charged Resin結合，4t:輕搖lh，然后裝柱，將流出液反復沖洗離心管，再上柱，以免蛋白丟失。將 流出液反復過柱3-4次。加洗滌緩沖液(50mM NaH2P04 2H20、300mM NaCl、 100mM咪唑、 8M尿素，調整pH至8. 0)，測定流出液的A280值，待A280趨近于0時，準備加洗脫緩沖液 (50mMNaH2P04 2H20、300mM NaCl、300mM咪唑、8M尿素，調整pH至8. 0)。待洗滌緩沖液全 部流出后，加洗脫緩沖液。EP管收集流出液，并測定A280值。以上均在pH二8.0環境下進 行，取收集的各組分樣品進行SDS-PAGE電泳，分析目的蛋白的純化效果和效率(附圖3)。 Ni"-IMAC純化后的蛋白過GE公司PD-10預裝柱脫鹽及尿素，而后-2(TC保存于10%甘油 溶液中備用，用時Bradford法定量融合蛋白。通過以上步驟成功誘導表達和分離純化了融 合蛋白PTD-hScurf in、PTD- A hFKH、PTD- A hPRD和PTD-eGFP-hScurf in、PTD- A hFKH-eGFP、 PTD-AhPRD-eGFP(附圖4)。純化的蛋白隨后進行Western-blot鑒定( 一抗1 : 1000抗 6XHis-Tag，二抗:1 : 5000HRP-羊抗小鼠IgG)確認為我們制備的目的蛋白(附圖5)。
2.融合蛋白進行以下穿膜功能實驗
(1)細胞培養及穿膜效應的流式細胞儀檢測 Jurkat T細胞，常規培養于含10 %小牛血清、100U/mL青霉素、100g/L鏈霉素的 RPMI-1640培養液。以2X 105/孔細胞濃度種于24孔板，與不同濃度(40nM， 160nM，640nM， 1280nM)的PTD-eGFP-目的蛋白共育2h， 4h， 12h， 24h。 1000 X g離心10min分別收集各孔細 胞用PBS洗3次，FASCaliber流式細胞儀收集以及CellQuest軟件分析顯示融合蛋白最 佳穿膜濃度為640nM，穿膜的高峰在第2h，隨后隨著時間的延長穿膜效率逐漸下降。
(2)激光共聚焦顯微鏡觀測穿膜蛋白在細胞內的定位 收集分別與640nM的PTD-eGFP-hScurf in、PTD- A hFKH-eGFP和PTD- A hPRD-eGFP 融合蛋白共育2h的細胞，1000Xg離心10min。預冷PBS洗2遍，1000 X g離心，5min。加 入O. 5mL 4%多聚甲醛固定液，緩緩懸起細胞，固定30分鐘。離心去固定液，用PBS洗2遍， 洗滌期間手動晃動。加入PI染色液(終濃度50i!g/mL)緩緩懸起細胞，4t:避光染色30分 鐘，PBS洗滌。加25yL PBS重懸細胞并滴加至載玻片上，蓋上潔凈的蓋玻片，指甲油封片。 共聚焦顯微鏡下使用綠色濾光片檢測呈紅色熒光的細胞核，使用藍色濾光片檢測融合蛋白 中eGFP綠色熒光。另外加入Hoechst33342(終濃度2ug/mL)到與640nM蛋白共育2h的 活細胞體系中(24孔板中，2X107孔)37t:孵箱中染色10min，共聚焦顯微鏡下使用紫外激 發光檢測呈藍色熒光的細胞核，使用藍色濾光片檢測融合蛋白中eGFP綠色熒光。結果從影 像上確認無論活細胞還是細胞固定后對細胞核進行染色后經激光共聚焦斷層三維定位分 析均見大部分細胞胞內含帶有eGFP綠色熒光的目的融合蛋白，并且該融合蛋白能夠穿入 細胞核內。(附圖6A) (3)胞漿和胞核蛋白提取及免疫印跡檢測 1000 Xg離心10min收集分另U與640nM的PTD-hScurf in、 PTD-AhFKH和 PTD-AhPRD融合蛋白共育2h禾口24h的Jurkat T細胞，用4。C預冷的PBS洗3遍，加400 yl冷 Buffer A(10mMHEPEs、10mM KC1、0. lmM EDTA、0. lmM EGTA、0. 5mM PMSF，pH7. 9)，冰浴10min ; 加25ii 1 10% NP-40， Vortex 10s，冰浴10min， 12000Xg離心15s，收集上清，即為胞槳蛋白；力口50ii l冷Buffer B(20mM HEPEs、0. 4M NaCl、lmM EDTA、lmM EGTA、lmM PMSF、lmMDTT， pH7.9)至沉淀，置冰上30min;12000Xg離心10min，收集上清，即為胞核蛋白；加等量的 2XSDS上樣緩沖液，煮沸5min，-8(TC凍存備用。提取的胞漿胞核蛋白用12% SDS-PAGE膠 分離；350mA 2h將蛋白轉印至PVDF膜；用5%脫脂牛奶(溶解于TBS/T液)封閉lh ;加抗 6XHis-Tag(1 : 1000)，4。C過夜，用TBS/T洗滌3次；加HRP-羊抗小鼠IgG(l : 5000)，室 溫lh， TBS/T洗滌3次；加ECL-Plus化學發光劑，作用5min，掃膜，拍照；一抗二抗剝脫液 洗膜5-10min，封閉lh，4。C過夜孵育抗GAPDH抗體(1 : 1000) ， TBS/T洗滌，HRP-羊抗小鼠 IgG(l : 5000)室溫靜置lh，TBS/T洗滌后ECL-Plus顯色，掃描檢測GAPDH內參蛋白，結果 從另一方面進一步確認了激光共聚焦分析的結果制備的融合蛋白均能在2h-24h內穿透 細胞膜進入胞內并定位于核內，且截至穿膜第24h細胞核內仍存在目的融合蛋白，而此時 細胞質提取物中已無法用Western-blot檢測出靶蛋白(附圖6B)。
3.細胞增殖抑制實驗 (1) Jurkat T細胞和外周血T細胞剌激條件的摸索 分別使用PHA 0. 5ug/mL、lug/mL、5ug/mL， PHA lug/mL+PMA 25ng/mL、 PHAlug/ mL+PMA 50ng/mL、 PHA lug/mL+PMA 100ng/mL剌激Jurkat T細胞觀察6h， 12h， 24h剌激效 果，經實驗最終選取的最適剌激劑量為PHA lug/mL+PMA 50ng/mL，剌激時間選取24h(附 圖7)。 (2) CCK-8法檢測細胞增殖 Jurkat T細胞增殖抑制試驗將細胞用含10%小牛血清的1640培養液調整適量 的濃度。將Jurkat T細胞分別以2 X 104每孔種于96孔板。以環孢霉素A (CsA) ， PTD-eGFP 融合蛋白及hScurfin蛋白做對照組，實驗組分別加入640nM的各融合蛋白與細胞共育lh， 每組同時做3個復孔。而后加入最適劑量的PHA(l y g/mL)+PMA(50ng/mL)剌激，將細胞置于 37°C ， 5% C02培養箱中培養，分別于PHA+PMA剌激第18h和第42h加入CCK-8試劑10 y 1/ 孔(總體積100uL/孔)，繼續培養6小時，用酶標儀檢測490nm時的吸光度，分析數據顯示 PHA+PMA聯合剌激24h和48h后PTD-hScurf in、PTD- A hPRD (終濃度640nM)與對照組相比 對JurkatT細胞的增殖具有明顯的抑制作用，而在剌激48h后PTD-AhFKH(終濃度640nM) 也呈現出明顯抑制作用，其中PTD-hScurfin的抑制效果與CsA陽性對照組相當(附圖8)。
外周T細胞增殖抑制試驗將外周T細胞用含10%小牛血清的1640培養液調整適 量的濃度。將外周血T細胞分別以1 X 105每孔種于96孔板。以CsA (終濃度為3 ii M)為陽性 對照，以PTD-eGFP及hScurfin融合蛋白(640nM)作為陰性對照組，實驗組PTD-hScurfin、 PTD- A hPRD和PTD- A hFKH融合蛋白濃度分別以640nM分別與細胞共育lh，每組同時做3個 復孔。而后加入上述實驗得出的最適劑量的PHA(ly g/mL)+PMA(50ng/mL)剌激，將細胞置 于37°C ， 5% C02培養箱中培養，于PHA+PMA剌激第20h加入CCK-8試劑10 y1/孑L (總體積 100 y L/孔)，繼續培養4h，用酶標儀檢測490nm時的吸光度，分析數據。結果發現不加蛋 白剌激的空白組PBMC增殖明顯；不帶穿膜序列的hF0XP3蛋白，對PBMC的增殖無明顯影響； 而帶穿膜序列的全長PTD-hScurfin顯著抑制PBMC的增殖；帶穿膜序列的PTD- A hPRD片段 的抑制能力高于PTD-AhFKH片段，但均低于全長的PTD-hScurfin，說明FKH區域在Fo鄧3 的抑制功能中起重要的作用，而PRD片段(N末端富含脯氨酸區域)也有一定的抑制功能。 試驗說明，我們所構建的PTD-hScurf in、PTD- A hPRD和PTD- A hFKH融合蛋白具有抑制外周T細胞的增殖的生物學功能。(*P<0.05)。(附圖9)。
3.調控Treg功能相關細胞因子的表達實驗 細胞因子IL-2和IL-10的RT-PCR檢測采集健康人肝素抗凝外周血，經淋巴細胞
分離液分離獲得外周單個核細胞，經貼壁去除巨噬細胞和單核細胞，然后采用CD19和CDS
單抗和補體殺傷去除B細胞和CD8+T細胞，洗滌后將細胞接種于6孔板，每孔2 X 106，分別與
CsA (3 ii M) 、PTD-eGFP、PTD-hScurf in、PTD- A hPRD和PTD- A hFKH等融合蛋白(640nM)共育
lh，而后加入PHA(ly g/mL)+PMA(50ng/mL)剌激活化細胞0h， 2h， 4h， 6h， 8h，收集細胞。收集
每個樣本2X 106個細胞，按常規Trizol裂解法提取總RNA。 按照下列體現進行逆轉錄 Reagent volume 5 X reaction buffer 4. 0 li 1 d證mix (10mM each) l.Oyl Recombinant RNase inhibitor 0. 5 li 1 M-MLV reverse transcriptase l.Oul Total 6. 5ul 混勻后42"反應20分鐘，94t:加熱5分鐘滅活以終止cDNA合成，4" 5分鐘。再 按照下列體系進行梯度PCR擴增在0. 2ml PCR管中建立10 y 1PCR反應體系，加入的各成
分分別為10XPCR buffer1 ii 1d證s(10mM each)1 ii 1Forward primer0. 2ii 1Reverse primer0. 2ii 1cDNA0. 2ii 1Taq DNA聚合酶0. 06ii 1無菌水7. 34ii 1總體積10 ii 1混勻后94t:預變性2分鐘，進行梯度PCR擴增。
各基因擴增所用引物和PCR反應所選擇的溫度為
1. P —actin Forwardprimer :CAC GAA ACT ACC TTC AAC TCC ;
Reverse primer :CATACTCCTGCT TGC TGA TC ;2.IL-2Forward primer :CAA AGA AAA CAC AGC TAC AACT ;
Reverse primer :TCTCATCAGCAT ATT CAC ACAT ;3.IL-lOForward primer :AGG GCA CCC AGT CTG AGAACA ;
Reverse primer :CGGCCTTGCTCT TGT TTT CAC4.所選溫度為53. 3 °C ， 54. 2 °C ， 55. 2 °C ， 56. 4 °C ， 57. 5 °C ， 58. 5 °C ， 59. 4 °C ，60. 0°C，60. 4t:，摸索合適的退火溫度，最后確定采用56t:作為退火溫度。
將上述擴增的PCR產物回收，連接T載體，構建標準質粒，并測序鑒定。采 用realtimeRT-PCR測定細胞因子IL-2和IL-10的表達水平。以上述cDNA為模板， 2XSYBRGreen QPCRMaster MIX,在置于冰上的0. 2ml PCR管中依次加入下列成分
2XMIX7. 5ii 1腿(i : 500)0. 3ii 1Forward primer0. 2ii 1Reverse primer0. 2ii 1cDNA1. Oil 1ddH205. 8ii 1總體積15ii 1混勻，瞬時離心5秒，使各反應成分集中于PCR管底。反應條件如下95。C lOmin，
95°C 30sec，56。C 30sec，72。C lmin(acquire fluorescence) ，40循環。
外周血T細胞經過剌激PHA+PMA剌激后，在6 8h時IL_2轉錄水平最高，因此 采用剌激6h作為最合適的時間點進行試驗。結果發現PTD-hScurfin、 PTD-AhPRD和 PTD- A hFKH能夠抑制外周血T細胞分泌IL-2、其中PTD-hScurf in、PTD- A hPRD具有顯著性 意義，而PTD-AhFKH未見統計學意義(圖10)。外周血T細胞剌激后IL-10的分泌水平逐 步上升，在2h時水平比較低，因此比較適合觀察融合蛋白提高其產生IL-10的作用，因此選 擇2h剌激作為實驗時間點。結果發現PTD-hScurf in、PTD- A hPRD和PTD- A hFKH能夠促進 外周血T細胞分泌IL-10、其中PTD-hScurf in、PTD- A hPRD具有顯著性意義，而PTD- A hFKH 未見統計學意義(圖ll)。
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0180]Met Gly Ser SerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValPro
0181]151015
0182]Arg Gly Ser HisMetAlaSerMetThrGlyGlyGinGinMetGlyArg
0183]202530
0184]Gly Ser Tyr GlyArgLysLysArgArgGinArgArgArgGluLeuArg
0185]354045
0186]Arg Gin Ala LeuProAsnProArgProGlyLysProSerAlaProSer
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0188]Leu Ala Leu GlyProSerProGlyAlaSerProSerTrpArgAlaAla
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0194]AsnProMetProProSerGinLeuGinLeuProThrLeuProLeuVal
0195]115120125
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0197]130135140
0198]AlaLeuLeuGinAspArgProHisPheMetHisGinLeuSerThrVal
0199]145150155160
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一種PTD-hScurfin融合蛋白，其特征在于，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列
2. —種PTD-Ah FKH融合蛋白，其特征在于，具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
3. —種PTD-Ah PRD融合蛋白，其特征在于，具有SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列。
4. 一種核酸構建體，其特征在于，它含有編碼權利要求1-3中任何一項所述的融合蛋 白的氨基酸序列。
5. —種制備權利要求1-3中任一項所述的融合蛋白的方法，其特征在于，該方法包括 下列步驟(l)獲得編碼融合蛋白的基因序列；(2)將步驟(1)獲得的序列插入到合適的載 體中，得到相應的核酸構建體；(3)將步驟(2)獲得的核酸構建體轉化適宜的表達菌；(4) 在適宜的培養條件下，培養步驟(3)的表達菌，并加入適量的異丙基-e-D-硫代半乳糖苷， 0. 2mM-lmM終濃度誘導表達，從中分離出表達的融合蛋白。
6. 根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，當步驟(4)的融合蛋白為包涵體形式 表達的，在步驟(4)后還有將包涵體通過鎳柱在變性劑存在條件下親和純化，純化產物通 過去鹽柱后凍存備用。
全文摘要
本發明涉及基因工程及蛋白轉導的生物醫學技術領域。具體涉及帶穿膜序列的人Scurfin全長、去除叉頭結構結構域人Scurfin片段和去除富含脯氨酸結構域人Scurfin片段的融合蛋白及制備方法。所說的帶穿膜序列的人Scurfin全長、去除叉頭結構結構域人Scurfin片段和去除富含脯氨酸結構域人Scurfin片段的融合蛋白分別具有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示的氨基酸序列。本發明首次采用構建PTD-hScurfin方式獲得融合蛋白，通過蛋白穿膜結構域直接介導融合目的蛋白轉導入Jurkat T和外周CD4+CD25-T細胞，以大量獲取Treg，突破制約Treg應用的瓶頸，以期最終應用于臨床的器官移植抗排斥治療。
文檔編號C07K19/00GK101704893SQ200910221169
公開日2010年5月12日 申請日期2009年11月2日 優先權日2009年11月2日
發明者徐三榮, 田雨香, 藺欣, 許遜, 邵啟祥 申請人:江蘇大學