達托霉素類似物及其全固相合成制備方法

專利名稱：達托霉素類似物及其全固相合成制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種達托霉素類似物及其全固相合成制備方法，屬于抗生素達托霉素 (D即tomycin)及其類似物的分子設(shè)計策略和一種全固相合成方法。
背景技術(shù)：
隨著高致病耐藥菌，如MRSA、 VRE、 PRSP的不斷涌現(xiàn)，臨床上對新的抗生素需求越 來越迫切，而達托霉素的成功應(yīng)對上述耐藥菌且具有良好療效、制劑簡單、毒全副作用小使 其成為新抗生素藥研究的熱點。其化學(xué)結(jié)構(gòu)與作用機理與已有的抗生素均不同，是近40年 來應(yīng)用于臨床的唯一新結(jié)構(gòu)類別的抗生素。 達托霉素從其作用方面可以作為一類小分子抗菌肽，具有廣譜性、高效性、穩(wěn)定性 等特點，其本身不易產(chǎn)生耐藥性。從結(jié)構(gòu)方面可以稱為環(huán)脂肽，由肽環(huán)與脂肪烴組成，具有 表面活性劑的基本結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，其除了具有化學(xué)表面活性劑的特點外，且比合成表面活性 劑更具潛在的優(yōu)勢，如具有生物兼容性高、安全無毒性、可被生物降解、不會對環(huán)境造成不 利影響等優(yōu)點。隨著環(huán)保意識的增強和食品安全級別的提高，此類生物表面活性劑在食品、 醫(yī)藥、化妝品、洗滌劑和石油化工等領(lǐng)域，展示了其獨特的應(yīng)用前景；人類環(huán)保意識的增強， 更加快了生物面活性劑取代合成表面活性劑的發(fā)展進程。 達托霉素是由Lily公司最初研究，Cubist制藥公司開發(fā)的一環(huán)脂肽類抗生素。因 應(yīng)病人對新型耐藥抗生素的迫切需求，2003年底，美國食品與藥物管理局(FDA)經(jīng)過快速 審理程序批準注射用達托霉素(商品名cubicin)用于治療由一些革蘭氏陽性敏感菌株引 起的并發(fā)性皮膚及皮膚結(jié)構(gòu)感染，如膿腫、手術(shù)切口感染和皮膚潰瘍。上個世紀八十年代從 玫胞鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到了達托霉素。中國科學(xué)院上海有機化學(xué)研究所的徐紅巖博 士等巧妙地設(shè)計了達托霉素的固液相合成策略，該方法被證明可快速合成目標分子。但是 由于專利保護等原因，玫胞鏈霉菌不易得到，且固液相合成方法中采用的液相環(huán)合后再剪 切的方法使得產(chǎn)物產(chǎn)率和純度低，且作為單體的犬尿氨酸和3-甲基谷氨酸自然來源稀少， 其化學(xué)合成又非常困難。因此，希望通過對達托霉素的主骨架設(shè)計出一系列結(jié)構(gòu)相對簡單 的衍生物，以期能找到與達托霉素相似或更強生物活性的化合物，供臨床前的篩選。

發(fā)明內(nèi)容
要解決的技術(shù)問題 為了避免現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明提出一種達托霉素類似物及其全固相合成 制備方法，是針對新型抗生素達托霉素及其類似物的分子設(shè)計策略并提供其的一種全固相 合成方法。主要解決現(xiàn)有方法中步驟繁瑣、耗能費時、成本高等問題。
技術(shù)方案 —種達托霉素類 物，其特征在于序列如下
AAj-AA^AAg-AA^AAs-AAs-AA^AAg-AAg-AAn-AAu-AAc-COR
I-AA10-Z(O,S，NH) 其中所述的A^為側(cè)鏈帶羧基的氨基酸Glu、 Asp、3MeGlu，側(cè)鏈羧基未被保護， a _羧基采用0-Dmab基團保護，a -氨基采用Fmoc基團保護；所述的AA9為側(cè)鏈帶有羥基 的氨基酸Ser， Thr， Tyr，側(cè)鏈羥基采用O-Trt， 0-2-ClTrt基團保護，a -氨基采用Fmoc基 團保護，a -羧基未被保護；所述的AA2， AA3， AA4， AA5， AA6， AA7， AA8， AA1QAAn， AA12， AA13為任意 氨基酸，a _氨基采用Fmoc基團保護，a -羧基未被保護；所述的R = H， CnH2n+1_或(^11^-， 其中n = 0-17。 —種達托霉素類似物，其特征在于序列如下
AAi-AArAAg-AAfAAs-AVAVAAs-AAg-COR
^-AA10-Z(O,S,NH) 其中所述的A^為側(cè)鏈帶羧基的氨基酸Glu、 Asp MeGlu，側(cè)鏈羧基未被保護， a-羧基采用O-Dmab基團保護，a-氨基采用Fmoc基團保護；所述的AA9為側(cè)鏈帶有羥基的 氨基酸Ser， Thr， Tyr，側(cè)鏈羥基采用O-Trt， 0_2_ClTrt基團保護，a -氨基采用Fmoc基團保 護，a -羧基未被保護；所述的AA2， AA3， AA4， AA5， AA6， AA7， AA8， AA1Q，為任意氨基酸，a _氨基 采用Fmoc基團保護，a -羧基未被保護；所述的R = H， CnH2n+1_或CnH2n—「，其中n = 0-17。
—種達托霉素類似物，其特征在于序列如下
AA廣AA2-AA3-AA4-AA5-AAg-AA^AAg-AAg
I-- AAto-i(O,S,NH) 其中所述的A^為側(cè)鏈帶羧基的氨基酸Glu、 Asp MeGlu，側(cè)鏈羧基未被保護， a _羧基采用0-Dmab基團保護，a -氨基采用Fmoc基團保護；所述的AA9為側(cè)鏈帶有羥基 的氨基酸Ser， Thr， Tyr，側(cè)鏈羥基采用O-Trt， 0_2_ClTrt基團保護，a -氨基采用Fmoc基團 保護，a -羧基未被保護；所述的AA2， AA3， AA4， AA5， AA6， AA7， AA8， AA1Q，為任意氨基酸，a _氨 基采用Fmoc基團保護，a-羧基未被保護。 所述的AA9為側(cè)鏈帶有巰基的氨基酸Cys ，側(cè)鏈巰基采用S_Trt 、 S_Mmt或
S-tButhio基團保護，a -氨基采用Fmoc基團保護，a -羧基未被保護。所述的AA9為側(cè)鏈帶有氨基的氨基酸Arg、 His、 Lys、 0rn，側(cè)鏈氨基采用N-Mtt、
N-Mmt基團保護，a -氨基采用Fmoc基團保護，a -羧基未被保護。 —種制備下述達托霉素類似物的方法，
AAj-AA^AAfAArAAs-AArAA^AAfAAg-AAn-AA^-AA^COR
^--AA10-Z(O,S,NH) 其特征在于步驟如下 步驟1 :以Rink amide樹脂為載體，按照固相合成法連接第一個側(cè)鏈羧基未被保 護的氨基酸AAp脫掉a-氨基的保護基團，繼續(xù)按照固相合成法依次連接具有保護基團的 氨基酸，連接期間依次脫去氨基保護基團，得到保護的肽樹脂；所述的固相合成法是將氨基酸和H0BT溶于DMF中預(yù)反應(yīng)10 15分鐘，加入到Rink amide樹脂中混合，再加入DIC
反應(yīng)2 3小時；所述的Rink amide樹脂氨基酸HOBT : DIC = 1 : 4 : 4 : 4 ; 所述的具有保護基團的氨基酸a -氨基使用Fmoc基團保護； 所述的脫去a -氨基保護基團的步驟為先做第一次Kaiser test檢測，若第一次
Kaiser test檢測反應(yīng)為陰性直接脫a -氨基的保護基團，加入哌啶DMF = 2 : 8 (v/v)
混合溶液室溫下旋轉(zhuǎn)反應(yīng)10 15分鐘，再重復(fù)1次；脫a -氨基的保護基團結(jié)束后繼續(xù)做
第二次Kaiser test檢測，若第二次Kaiser test檢測反應(yīng)為陽性直接連接下一個氨基酸，
若第二次Kaiser test檢測反應(yīng)為陰性重復(fù)進行脫a _氨基的保護基團； 若第一次Kaiser test檢測反應(yīng)為陽性重復(fù)連接該次氨基酸，再進行第一次
Kaisertest檢測； 步驟2 :按照固相合成法依次連接AA9， AAU， AA12， AA13R ;連接完后脫掉AA9側(cè)鏈的保護基團，得到肽樹脂；將肽樹脂用三氯甲烷溶脹半個小時以上，將DCC，氨基酸，HOBT溶于45%的匿F in脫水THF中預(yù)反應(yīng)30 40分鐘，出現(xiàn)沉淀后過濾，再將濾液與DMAP
混合加入到肽樹脂中反應(yīng)5 6小時；所述的肽樹脂氨基酸hobt : dcc : dmap =i : 4 : 2 : 4 : o. 4 ; 所述的固相合成法連接r時，肽樹脂r : hobt : Dic = i : 8 : 8 : 8，反應(yīng)
3 4小時； 所述的脫掉AA9側(cè)鏈的保護基團若側(cè)鏈的保護基團為O-Trt， S-Trt， 0-2_ClTrt，S-Mmt， 、N-Mtt，在lX TFA in DCM containing 1-5% TIS條件下脫除；若側(cè)鏈的保護基團為S-tButhio，在3eq. TBP in propanol aq. or TFE aq.條件下脫除；若側(cè)鏈的保護基團為N-Mmt，在AcOH/TFE/DCM = 1 : 2 : 7條件下脫除； 步驟3:脫掉A^。的a-氨基保護基團，然后脫掉A^的a-羧基的保護基團O-Dmab，然后第一次環(huán)合；環(huán)合時采用在樹脂上直接先環(huán)合再用剪切液將環(huán)肽從樹脂上剪切下來的方法；將PyBOP和HOBT采用NMP溶劑溶解，在室溫下預(yù)反應(yīng)10 15分鐘，然后加入到肽樹脂中，再加入DIEA，室溫下旋轉(zhuǎn)反應(yīng)48小時，所述的第一次環(huán)合的環(huán)合液比例肽樹月旨PyBOP : HOBT : DIEA =1:8:8:8; 然后依次用NMP、 DMF洗滌，加入第二次環(huán)合液繼續(xù)室溫下環(huán)合反應(yīng)48小時；所述
的第二次環(huán)合的環(huán)合液比例為肽樹脂hobt : dic=i : 8 : 8; 所述的脫掉的a -羧基的保護基團O-Dmab在2% Hydrazine in DMF條件下脫除； 步驟4 :向肽樹脂中加入剪切液反應(yīng)2 3h，收集濾液，用氮氣吹使得TFA揮發(fā)，加入冷乙醚，在冰中靜置15min以上，高速離心，條件為12000rpm，4t:，15min，高速離心重復(fù)兩次，收集沉淀，置真空干燥塔內(nèi)完全干燥，即得達托霉素類似物；所述的剪切液為
tfa : tis :苯酚水=95 : i : 2 : 2。 —種制備下述達托霉素類似物的方法，
<formula>formula see original document page 8</formula> 其特征在于步驟如下
步驟1 :以Rink amide樹脂為載體，按照固相合成法連接第一個側(cè)鏈羧基未被保護的氨基酸AAp脫掉a-氨基的保護基團，繼續(xù)按照固相合成法依次連接具有保護基團的氨基酸，連接期間依次脫去a-氨基保護基團，得到保護的肽樹脂；所述的固相合成法是將氨基酸和HOBT溶于DMF中預(yù)反應(yīng)10 15分鐘，加入到Rink amide樹脂中混合，再加入DIC反應(yīng)2 3小時；所述的Rink amide樹脂氨基酸HOBT : DIC = 1 : 4 : 4 : 4 ;
所述的具有保護基團的氨基酸a -氨基使用Fmoc基團保護；
所述的脫去a -氨基保護基團的步驟為先做第一次Kaiser test檢測，若第一次Kaiser test檢測反應(yīng)為陰性直接脫a -氨基的保護基團，加入哌啶DMF = 2 : 8 (v/v)混合溶液室溫下旋轉(zhuǎn)反應(yīng)10 15分鐘，再重復(fù)1次；脫a -氨基的保護基團結(jié)束后繼續(xù)做第二次Kaiser test檢測，若第二次Kaiser test檢測反應(yīng)為陽性直接連接下一個氨基酸，若第二次Kaiser test檢測反應(yīng)為陰性重復(fù)進行脫a-氨基的保護基團；
若第一次Kaiser test檢測反應(yīng)為陽性重復(fù)連接該次氨基酸，再進行第一次Kaisertest檢測； 步驟2 :按照固相合成法依次連接AA9， R ;連接完后脫掉AA9側(cè)鏈的保護基團，得到肽樹脂；將肽樹脂用三氯甲烷溶脹半個小時以上，將DCC，氨基酸，HOBT溶于45%的匿F in脫水THF中預(yù)反應(yīng)30 40分鐘，出現(xiàn)沉淀，過濾，再將濾液與DMAP混合加入到肽樹脂中反
應(yīng)5 6小時；所述的肽樹脂氨基酸hobt : dcc : dmap = 1:4:2:4:0.4;
所述的固相合成法連接r時，肽樹脂r : hobt : dic = 1 : 8 : 8 : 8，反應(yīng)
3 4小時； 所述的脫掉AA9側(cè)鏈的保護基團若側(cè)鏈的保護基團為O-Trt， S-Trt， 0-2_ClTrt，S-Mmt， 、N-Mtt，在1% TFA in DCM containing 1-5% TIS條件下脫除；若側(cè)鏈的保護基團為S-tButhio，在3eq. TBP in propanol aq. or TFE aq.條件下脫除；若側(cè)鏈的保護基團為N-Mmt，在AcOH/TFE/DCM = 1 : 2 : 7條件下脫除； 步驟3:脫掉AAw的a-氨基保護基團，然后脫掉A^的a-羧基的保護基團O-Dmab，然后第一次環(huán)合；環(huán)合時采用在肽樹脂上直接先環(huán)合再用剪切液將環(huán)肽從肽樹脂上剪切下來的方法；將PyBOP和HOBT采用NMP溶劑溶解，在室溫下預(yù)反應(yīng)10 15分鐘，然后加入到肽樹脂中，再加入DIEA，室溫下旋轉(zhuǎn)反應(yīng)48小時，所述的第一次環(huán)合的環(huán)合液比例肽樹脂PyBOP : HOBT : DIEA =1:8:8:8; 然后用NMP、 DMF洗滌，加入第二次環(huán)合液繼續(xù)室溫下環(huán)合反應(yīng)48小時；所述的第
二次環(huán)合的環(huán)合液比例肽樹脂hobt : dic = i : 8 : 8 ; 所述的脫掉的a -羧基的保護基團0_Dmab在2% Hydrazine in DMF條件下脫除； 步驟4 :向肽樹脂中加入剪切液反應(yīng)2 3h，收集濾液，用氮氣吹使得TFA揮發(fā)，加入冷乙醚，在冰中靜置15min以上，高速離心，條件為12000rpm，4t:，15min，高速離心重復(fù)兩次，收集沉淀，置真空干燥塔內(nèi)完全干燥，即得達托霉素類似物；所述的剪切液為
tfa : tis :苯酚水=95 : i : 2 : 2。 —種制備下述達托霉素類似物的方法，
AA廣AA2-AA3陽AA4-AA5-A -AA7-AA8-AAg
I-AA10-Z(O，S,NH) 其特征在于步驟如下 步驟1 :以Rink amide樹脂為載體，按照固相合成法連接第一個側(cè)鏈羧基未被保護的氨基酸AAp脫掉a-氨基的保護基團，繼續(xù)按照固相合成法依次連接具有保護基團的氨基酸，連接期間依次脫去a-氨基保護基團，得到保護的肽樹脂；所述的固相合成法是將氨基酸和HOBT溶于DMF中預(yù)反應(yīng)10 15分鐘，加入到Rink amide樹脂中混合，再加入DIC反應(yīng)2 3小時；所述的Rink amide樹脂氨基酸HOBT : DIC = 1 : 4 : 4 : 4 ;
所述的具有保護基團的氨基酸a -氨基使用Fmoc基團保護；
所述的脫去a -氨基保護基團的步驟為先做第一次Kaiser test檢測，若第一次Kaisertest檢測反應(yīng)為陰性直接脫a-氨基的保護基團，加入哌啶DMF = 2 : 8 (v/v)混合溶液室溫下旋轉(zhuǎn)反應(yīng)10 15分鐘，再重復(fù)1次；脫a -氨基的保護基團結(jié)束后繼續(xù)做第二次Kaiser test檢測，若第二次Kaiser test檢測反應(yīng)為陽性直接連接下一個氨基酸，若第二次Kaiser test檢測反應(yīng)為陰性重復(fù)進行脫a-氨基的保護基團；
若第一次Kaiser test檢測反應(yīng)為陽性重復(fù)連接該次氨基酸，再進行第一次Kaisertest檢測； 步驟2 :按照固相合成法連接AA9 ;連接完后脫掉AA9側(cè)鏈的保護基團，得到肽樹脂；將肽樹脂用三氯甲烷溶脹半個小時以上，將DCC，氨基酸，H0BT溶于45X的匿F in脫水THF中預(yù)反應(yīng)30 40分鐘，出現(xiàn)沉淀，過濾，再將濾液與DMAP混合加入到肽樹脂中反應(yīng)
5 6小時；所述的肽樹脂氨基酸hobt : dcc : dmap =1:4:2:4:0.4; 所述的脫掉AA9側(cè)鏈的保護基團若側(cè)鏈的保護基團為O-Trt， S-Trt， 0-2_ClTrt，S-Mmt，、N-Mtt，在lX TFA in DCM containing 1-5% TIS條件下脫除；若側(cè)鏈的保護基團為S-tButhio，在3eq. TBP in propanol aq. or TFE aq.條件下脫除；若側(cè)鏈的保護基團為N-Mmt，在AcOH/TFE/DCM = 1 : 2 : 7條件下脫除； 步驟3:脫掉A^。的a-氨基保護基團，然后脫掉A^的a-羧基的保護基團O-Dmab，然后第一次環(huán)合；環(huán)合時采用在肽樹脂上直接先環(huán)合再用剪切液將環(huán)肽從肽樹脂上剪切下來的方法；將PyBOP和HOBT采用NMP溶劑溶解，在室溫下預(yù)反應(yīng)10 15分鐘，然后加入到肽樹脂中，再加入DIEA，室溫下旋轉(zhuǎn)反應(yīng)48小時，所述的第一次環(huán)合的環(huán)合液比例為月太樹月旨PyBOP : HOBT : DIEA =1:8:8:8; 然后用NMP、 DMF洗滌，加入第二次環(huán)合液繼續(xù)室溫下環(huán)合反應(yīng)48小時；所述的第
二次環(huán)合的環(huán)合液比例為肽樹脂hobt : dic = i : 8 : 8 ; 所述的脫掉AA!的a -羧基的保護基團O-Dmab在2% Hydrazine in DMF條件下脫除； 步驟4 :脫掉AA9的a -氨基保護基團后，向肽樹脂中加入剪切液反應(yīng)2 3h，收集濾液，用氮氣吹使得TFA揮發(fā)，加入冷乙醚，在冰中靜置15min以上，高速離心，條件為12000rpm，4t:，15min，高速離心重復(fù)兩次，收集沉淀，置真空干燥塔內(nèi)完全干燥，即得達托
霉素類似物；所述的剪切液為tfa : tis :苯酚水=95 : i : 2 : 2。
本發(fā)明中常用的縮寫具有以下意義 Trp :色氨酸；DSer :D_絲氨酸；Gly :甘 酸；Asp :天冬氨酸；DAla :D-丙氨酸；
0rn :鳥氨酸；Glu :谷氨酸；Thr :蘇氨酸；Tyr :酪氨酸；Cys :半胱氨酸； Arg :精氨酸；Gln :谷氨酰胺；His :組氨酸；Asn :天冬酰胺；Ser :絲氨酸； Lys :賴氨酸；Ala :丙氨酸；3MeGlu :3-甲基谷氨酸；Kyn :犬尿氨酸； AAn(n = 1-13):氨基酸;cyclo-:環(huán)-; HOBT: : 1_羥基苯并三氮唑；DIC :二異丙基碳二亞胺；DMF :二甲基甲酰胺； DCC :N， N- 二環(huán)己基碳二亞胺；DMAP :二甲氨基吡啶； THF :四氫呋喃；PyBOP :六氟磷酸苯并三唑_1_基_氧基三吡咯烷基磷； DIEA :N， N_ 二異丙基乙胺；NMP :N_甲基吡咯烷酮；TFA :三氟乙酸； TIS :苯甲硫醚；DCM :二氯甲烷；MeOH :甲醇；氯仿CHC13 ; N2H4 :肼(Hydrazine) ;TBP :磷酸三丁酯；propanol :丙醇； TFE :三氟代乙醇；AcOH :乙酸；AA :氨基酸；ESI :電噴霧質(zhì)譜儀； RP-HPLC:反相高效液相色譜法；SPPS :多肽固相合成；eq.:當(dāng)量；aq.:溶劑； DBU:l，8-二氮雜環(huán)[5，4，0] —^一烯-7;Pd(0):鈀(0)。 有益效果 本發(fā)明提出的達托霉素類似物及其全固相合成制備方法，通過對達托霉素的主骨
架設(shè)計出一系列結(jié)構(gòu)相對簡單的衍生物，以期能找到與達托霉素相似或更強生物活性的化 合物，供臨床前的篩選。


圖1 :達托霉素合成路線圖，其中a/b :SPPS ;C :脫Trt保護基團；d :酯化反應(yīng)；e : 脫Fmoc保護基團；f :脫Dmab保護基團；g :環(huán)合；h :剪切；
圖2 :達托霉素類似物合成路線；
圖3 :達托霉素及其類似物的結(jié)構(gòu)圖；
圖4 :達托霉素類似物(1)實例 cyclo_[Trp_Gln_DSer_Gly_Asp_DAla_Asp_0rn_Gly_Ser]_Asp_Asn_Trp_C0_C9H19 的結(jié)構(gòu)圖； 圖5 :達托霉素類似物(2)實例 cyclo-[Trp-Gln-DSer-Gly-Asp-DAla-Asp-0rn-Gly-Ser]-C0-C9H19的結(jié)構(gòu)圖；
圖6 :達托霉素類似物(3)實例 cyclo-[Trp-Gln-DSer-Gly-Asp-DAla-Asp-Orn-Gly-Ser]的結(jié)構(gòu)具體實施例方式
現(xiàn)結(jié)合實施例、附圖對本發(fā)明作進一步描述 合成達托霉素類似物(1)實例AA!選擇Fmoc-Glu-ODmab ， AA9選擇
Fmoc-L-Ser (Trt) -OH， R選擇C10H2002 (正葵酸)。序列為:<formula>formula see original document page 11</formula> 其結(jié)構(gòu)圖見說明書附圖4
具體合成步驟
1.配制溶液 1)脫除Fmoc保護基團(D印rotection)溶液 20 %哌啶的DMF溶液，V/V 2)Kaiser Test溶液 A. 5%茚三酮乙醇溶液，W/V B. 80X苯酚乙醇溶液，W/V C. 2% lmmol/L氰化鉀妣啶溶液，V/V 2.樹脂活化準確稱取lOOmg Rink Amide-AM Resin (0. 28mmol/g， 100 200mesh)加入2mL的 Bio Spin空柱中，加入lmL三氯甲烷(CHC13)充分混勻，置旋轉(zhuǎn)混合儀上旋轉(zhuǎn)浸泡30min以 上，使樹脂充分活化，然后將液體抽干，分別用氯仿和DMF洗滌樹脂，抽干備用。
3.脫除a-氨基Fmoc保護基團將lmL D印rotetion溶液加入到已經(jīng)活化的樹脂中，旋轉(zhuǎn)混合儀上反應(yīng)15min后， 抽干，用DMF洗滌3 5次，再加入lmL D印rotetion溶液重復(fù)反應(yīng)15min，抽干后，用DMF 洗滌3 5次。挑取少許樹脂進行Kaiser Test檢驗。
4. Kaiser Test檢驗 每次取5顆左右的樹脂于試管中，加入Kaiser Test溶液各60 y L，將試管置于 120°C的干式加熱器上1 2min后，試管口有冷凝回流，取出試管，觀察樹脂的顏色，進而判 斷反應(yīng)得進行程度。 5.連接第一個氨基酸殘基Fmoc-Glu-ODmab到樹脂上(HOBT/DIC法).
稱取76. 2mg(0. 112mmol)Fmoc_Glu_0Dmab， 15. lmg(O. 112mmol)H0BT力口 入 1.5mL離心管中，加入lmL DMF溶解反應(yīng)lOmin后，加入活化好的樹脂中，再加入12yL DIC(O. 112mmol)，反應(yīng)2h后，抽干液體，然后用DMF洗滌數(shù)次，做Kaisertest檢測，反應(yīng)陰 性直接脫保護Fmoc保護基團，陽性重復(fù)連接該次氨基酸。反應(yīng)呈陰性直接加入1ml脫保護 溶液于樹脂中，旋轉(zhuǎn)反應(yīng)15min， 2次，再做Kaiser test檢測，反應(yīng)陽性直接連接下一個氨 基酸，反應(yīng)陰性重復(fù)脫Fmoc保護基團。
6.肽鏈的延長 脫去樹脂上Fmoc-Glu-ODmab的Fmoc保護以后，依次用Fmoc-D-Ser (tBu) -OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Asp(tBu)-OH、 Fmoc-D-Ala-OH、 Fmoc-Asp(tBu)-OH、 Fmoc-Orn(Boc)-OH、 Fmoc_Gly_0H、 Fmoc_L_Ser(Trt)_0H、 Fmoc-Asp(tBu) _0H、 Fmoc_Asn(Trt) _0H、 Fmoc-Trp (Boc) -OH、 C1QH2。02 (正葵酸)代替Fmoc-Glu-ODmab重復(fù)上述的偶聯(lián)及脫Fmoc保 護的反應(yīng)，共進行13次反應(yīng)，至13個氨基酸殘基全部偶聯(lián)完為止。正葵酸連接完后，無需 進行脫Fmoc保護基團步驟。
7.Trt保護基團的脫除將帶有線性九肽的樹脂用DCM浸泡5min后，抽干液體，加入lmLl % TFA inDCM containing 5% TIS的溶液反應(yīng)2min，抽干，用DCM洗滌3 5次。重復(fù)3次。然后依次 用DCM、 MeOH、 DCM充分洗滌樹脂，真空干燥。 [cmo]8.酯化反應(yīng)
先將已連接有十三肽的樹脂用三氯甲烷溶脹半個小時以上，稱取
47. 8mg(0. 112mmol)Fmoc-Trp(Boc)-0H，23. lmg(O. 112mmol)， DCC，7. 6mg(0. 112mmol)H0BT，
1.4mg(0. 112mmol)DMAP，先將DCC，氨基酸，H0BT溶于lml 45X的DMF in THF(脫水)溶液
中預(yù)反應(yīng)30分鐘，出現(xiàn)沉淀，過濾，再將濾液與DMAP混合加入到樹脂中室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)3小
時，結(jié)束后再重復(fù)反應(yīng)一次。 9. Dmab保護基團的脫除Fmoc-Trp (Boc) -OH的N端Fmoc脫保護后，將帶有線性十肽的樹脂用DMF浸泡5min 后，抽干液體，加入lmL 2%的肼(N2H4)的DMF溶液反應(yīng)3min，抽干，用DMF洗滌3 5次。 重復(fù)3次。然后依次用DMF、 DCM、 MeOH、 DCM充分洗滌樹脂，真空干燥。
10.環(huán)合 稱取116. 6mg PyBOP(O. 224mmol) 、30. 2mg HOBT(O. 224mmol)加入lmL NMP溶解反 應(yīng)10min，期間，將帶有線性十四肽的樹脂用NMP浸泡5min，抽干液體，將溶解反應(yīng)好的環(huán)合 液加入樹脂中，再加入37 ii L DIEA (0. 224mmol)，反應(yīng)48h，使之充分環(huán)合，抽干液體，然后依 次用NMP，DMF洗滌數(shù)次。再稱取30. 2mg HOBT(O. 224mmol)加入lmLDMF溶解反應(yīng)10min，，將 此液體加入到樹脂中，再加入29iiLDIC(0. 224mmol)，繼續(xù)反應(yīng)48h，環(huán)合完后，抽干液體， 然后依次用NMP、 DMF、 DCM、 MeOH、 DCM洗滌數(shù)次，真空干燥。
11.剪切將lmL剪切溶液(TFA : TIS :苯酚水=95 : 1 : 2 : 2)加入到載有環(huán)肽的干
燥樹脂中，反應(yīng)2 3h，濾出液體，并用剪切溶液洗滌樹脂3次，合并濾液，用氮氣吹干TFA，
加入10mL冷乙醚，充分混合，在冰上靜置15min后，離心(12000rpm， 4°C ， 15min)，重復(fù)兩次，
收集沉淀，置真空干燥塔內(nèi)完全干燥，即得達托霉素類似物(1)實例樣品。合成達托霉素類似物(2)實例AAi選擇Fmoc-Glu-ODmab， AA9選擇
Fmoc-L-Ser (Trt) -OH， R選擇C10H2002 (正葵酸)。序列為: 其結(jié)構(gòu)圖見說明書附圖5。
<formula>formula see original document page 13</formula> 具體合成步驟
1.配制溶液 1)脫除Fmoc保護基團(D印rotection)溶液 20 %哌啶的DMF溶液，V/V 2)Kaiser Test溶液 A. 5%茚三酮乙醇溶液，W/V B. 80X苯酚乙醇溶液，W/V C. 2% lmmol/L氰化鉀妣啶溶液，V/V 2.樹脂活化 準確稱取100mg Rink Amide-AM Resin(O. 28mmol/g， 100 200mesh)加入2mL的 Bio Spin空柱中，加入lmL三氯甲烷(CHC13)充分混勻，置旋轉(zhuǎn)混合儀上旋轉(zhuǎn)浸泡30min以 上，使樹脂充分活化，然后將液體抽干，分別用氯仿和DMF洗滌樹脂，抽干備用。
3.脫除a-氨基Fmoc保護基團 將lmL D印rotetion溶液加入到已經(jīng)活化的樹脂中，旋轉(zhuǎn)混合儀上反應(yīng)15min后， 抽干，用DMF洗滌3 5次，再加入lmL D印rotetion溶液重復(fù)反應(yīng)15min，抽干后，用DMF 洗滌3 5次。挑取少許樹脂進行Kaiser Test檢驗。
4. Kaiser Test檢驗 每次取5顆左右的樹脂于試管中，加入Kaiser Test溶液各60 y L，將試管置于 120°C的干式加熱器上1 2min后，試管口有冷凝回流，取出試管，觀察樹脂的顏色，進而判 斷反應(yīng)得進行程度。 5.連接第一個氨基酸殘基Fmoc-Glu-ODmab到樹脂上(HOBT/DIC法).
稱取76. 2mg(0. 112mmol)Fmoc_Glu_0Dmab， 15. lmg(O. 112mmol)H0BT力口 入 1.5mL離心管中，加入lmL DMF溶解反應(yīng)lOmin后，加入活化好的樹脂中，再加入12yL DIC(O. 112mmol)，反應(yīng)2h后，抽干液體，然后用DMF洗滌數(shù)次，做Kaisertest檢測，反應(yīng)陰 性直接脫保護Fmoc保護基團，陽性重復(fù)連接該次氨基酸。反應(yīng)呈陰性直接加入1ml脫保護 溶液于樹脂中，旋轉(zhuǎn)反應(yīng)15min， 2次，再做Kaiser test檢測，反應(yīng)陽性直接連接下一個氨 基酸，反應(yīng)陰性重復(fù)脫Fmoc保護基團。
6.肽鏈的延長 脫去樹脂上Fmoc-Glu-ODmab的Fmoc保護以后，依次用Fmoc-D-Ser (tBu) _0H、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Asp(tBu)-OH、 Fmoc-D-Ala-OH、 Fmoc-Asp(tBu)_0H、 Fmoc-0rn(Boc)_0H、 Fmoc-Gly-0H、Fmoc-L-Ser(Trt)-0H、Q。H2。02(正葵酸)代替Fmoc-Glu-ODmab重復(fù)上述的偶 聯(lián)及脫Fmoc保護的反應(yīng)，共進行10次反應(yīng)，至10個氨基酸殘基全部偶聯(lián)完為止。正葵酸 連接完后，無需進行脫Fmoc保護基團步驟。
7.Trt保護基團的脫除將帶有線性十肽的樹脂用DCM浸泡5min后，抽干液體，加入lmLl % TFA inDCM containing 5% TIS的溶液反應(yīng)2min，抽干，用DCM洗滌3 5次。重復(fù)3次。然后依次 用DCM、 MeOH、 DCM充分洗滌樹脂，真空干燥。
8.酯化反應(yīng) 先將已連接有十肽的樹脂用三氯甲烷溶脹半個小時以上，稱取 47. 8mg(0. 112mmol)Fmoc-Trp(Boc)-0H，23. lmg(O. 112mmol)， DCC，7. 6mg(0. 112mmol)H0BT， 1. 4mg(0. 112mmol)DMAP，先將DCC，氨基酸，H0BT溶于lml 45%的DMF in THF(脫水)溶液 中預(yù)反應(yīng)30分鐘，出現(xiàn)沉淀，過濾，再將濾液與DMAP混合加入到樹脂中室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)3小 時，結(jié)束后再重復(fù)反應(yīng)一次。
9.Dmab保護基團的脫除 Fmoc-Trp (Boc) _0H的N端Fmoc脫保護后，將帶有線性i^一肽的樹脂用DMF浸泡 5min后，抽干液體，加入lmL 2%的肼(N2H4)的DMF溶液反應(yīng)3min，抽干，用DMF洗滌3 5 次。重復(fù)3次。然后依次用DMF、 DCM、 MeOH、 DCM充分洗滌樹脂，真空干燥。
10.環(huán)合 稱取116. 6mg PyBOP(O. 224mmol) 、30. 2mg HOBT(O. 224mmol)加入lmLNMP溶解反 應(yīng)10min，期間，將帶有線性i^一肽的樹脂用NMP浸泡5min，抽干液體，將溶解反應(yīng)好的環(huán)合 液加入樹脂中，再加入37 ii L DIEA (0. 224mmol)，反應(yīng)48h，使之充分環(huán)合，抽干液體，然后依次用NMP，DMF洗滌數(shù)次。再稱取30. 2mg HOBT(O. 224mmol)加入lmLDMF溶解反應(yīng)10min，，將 此液體加入到樹脂中，再加入29iiLDIC(0. 224mmol)，繼續(xù)反應(yīng)48h，環(huán)合完后，抽干液體， 然后依次用NMP、 DMF、 DCM、 MeOH、 DCM洗滌數(shù)次，真空干燥。
11.剪切將lmL剪切溶液(TFA : TIS :苯酚水=95 : 1 : 2 : 2)加入到載有環(huán)肽的干
燥樹脂中，反應(yīng)2 3h，濾出液體，并用剪切溶液洗滌樹脂3次，合并濾液，用氮氣吹干TFA，
加入10mL冷乙醚，充分混合，在冰上靜置15min后，離心(12000rpm， 4°C ， 15min)，重復(fù)兩次，
收集沉淀，置真空干燥塔內(nèi)完全干燥，即得達托霉素類似物(2)實例樣品。 合成達托霉素類似物(3)實例AAi選擇Fmoc-Glu-ODmab， AA9選擇
Fmoc-L-Ser(Trt)-OH。序列為 其結(jié)構(gòu)圖見說明書附圖6。
91n-DSer-Gly-Asp-DAla-Asp-0rn-Gly-Ss
-Trp-^--0 具體合成步驟
1.配制溶液 1)脫除Fmoc保護基團(D印rotection)溶液 20 %哌啶的DMF溶液，V/V 2)Kaiser Test溶 夜 A. 5%茚三酮乙醇溶液，W/V B. 80X苯酚乙醇溶液，W/V C. 2% lmmol/L氰化鉀妣啶溶液，V/V 2.樹脂活化準確稱取100mg Rink Amide-AM Resin(O. 28mmol/g， 100 200mesh)加入2mL的 Bio Spin空柱中，加入lmL三氯甲烷(CHC13)充分混勻，置旋轉(zhuǎn)混合儀上旋轉(zhuǎn)浸泡30min以 上，使樹脂充分活化，然后將液體抽干，分別用氯仿和DMF洗滌樹脂，抽干備用。
3.脫除Fmoc保護基團 將lmL D印rotetion溶液加入到已經(jīng)活化的樹脂中，旋轉(zhuǎn)混合儀上反應(yīng)15min后， 抽干，用DMF洗滌3 5次，再加入lmL D印rotetion溶液重復(fù)反應(yīng)15min，抽干后，用DMF 洗滌3 5次。挑取少許樹脂進行Kaiser Test檢驗。
4. Kaiser Test檢驗 每次取5顆左右的樹脂于試管中，加入Kaiser Test溶液各60 y L，將試管置于 120°C的干式加熱器上1 2min后，試管口有冷凝回流，取出試管，觀察樹脂的顏色，進而判 斷反應(yīng)得進行程度。 5.連接第一個氨基酸殘基Fmoc-Glu-ODmab到樹脂上(HOBT/DIC法).
稱取76. 2rng(0. 112mmol)Fmoc_Glu_0Dmab， 15. lmg(O. 112翻1)H0BT力口 入 1.5mL離心管中，加入lmL DMF溶解反應(yīng)lOmin后，加入活化好的樹脂中，再加入12yL DIC(O. 112mmol)，反應(yīng)2h后，抽干液體，然后用DMF洗滌數(shù)次，做Kaisertest檢測，反應(yīng)陰 性直接脫保護Fmoc保護基團，陽性重復(fù)連接該次氨基酸。反應(yīng)呈陰性直接加入1ml脫保護溶液于樹脂中，旋轉(zhuǎn)反應(yīng)15min， 2次，再做Kaiser test檢測，反應(yīng)陽性直接連接下一個氨 基酸，反應(yīng)陰性重復(fù)脫Fmoc保護基團。
6.肽鏈的延長 脫去樹脂上Fmoc-Glu-ODmab的Fmoc保護以后，依次用Fmoc-D-Ser (tBu) _0H、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Asp(tBu)_0H、 Fmoc-D-Ala-OH、 Fmoc-Asp(tBu)_0H、 Fmoc-0rn(Boc)_0H、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-L-Ser (Trt)-OH代替Fmoc-Glu-ODmab重復(fù)上述的偶聯(lián)及脫Fmoc保護 的反應(yīng)，共進行9次反應(yīng)，至9個氨基酸殘基全部偶聯(lián)完為止。Fmoc-L-Ser (Trt) -OH連接完 后，不需進行脫Fmoc保護基團步驟。
7.Trt保護基團的脫除將帶有線性九肽的樹脂用DCM浸泡5min后，抽干液體，加入lmLl % TFA inDCM containing 5% TIS的溶液反應(yīng)2min，抽干，用DCM洗滌3 5次。重復(fù)3次。然后依次 用DCM、 MeOH、 DCM充分洗滌樹脂，真空干燥。
8.酯化反應(yīng) 先將已連接有九肽的樹脂用三氯甲烷溶脹半個小時以上，稱取
47. 8mg(0. 112mmol)Fmoc-Trp(Boc)-0H，23. lmg(O. 112mmol)， DCC，7. 6mg(0. 112mmol)H0BT，
1.4mg(0. 112mmol)DMAP，先將DCC，氨基酸，H0BT溶于lml 45X的DMF in THF(脫水)溶液
中預(yù)反應(yīng)30分鐘，出現(xiàn)沉淀，過濾，再將濾液與DMAP混合加入到樹脂中室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)3小
時，結(jié)束后再重復(fù)反應(yīng)一次。 9. Dmab保護基團的脫除Fmoc-Trp (Boc) _0H的N端Fmoc脫保護后，將帶有線性十肽的樹脂用DMF浸泡5min 后，抽干液體，加入lmL 2%的肼(N2H4)的DMF溶液反應(yīng)3min，抽干，用DMF洗滌3 5次。 重復(fù)3次。然后依次用DMF、 DCM、 MeOH、 DCM充分洗滌樹脂，真空干燥。
10.環(huán)合 稱取116. 6mg PyBOP(O. 224mmol) 、30. 2mg HOBT(O. 224mmol)加入lmL NMP溶解反 應(yīng)10min，期間，將帶有線性十肽的樹脂用NMP浸泡5min，抽干液體，將溶解反應(yīng)好的環(huán)合液 加入樹脂中，再加入37 ii L DIEA (0. 224mmol)，反應(yīng)48h，使之充分環(huán)合，抽干液體，然后依次 用NMP，DMF洗滌數(shù)次。再稱取30. 2mg H0BT(0. 224,1)加入lmLDMF溶解反應(yīng)10min，，將 此液體加入到樹脂中，再加入29ii L DIC(O. 224mmol)，繼續(xù)反應(yīng)48h，環(huán)合完后，抽干液體， 然后依次用NMP、 DMF、 DCM、 MeOH、 DCM洗滌數(shù)次，真空干燥。
11.剪切 脫掉AA9的a -氨基Fmoc保護基團后，將lmL剪切溶液(TFA : TIS :苯酚水=
95 : i : 2 : 2)加入到載有環(huán)十肽的干燥樹脂中，反應(yīng)2 3h，濾出液體，并用剪切溶液
洗滌樹脂3次，合并濾液，用氮氣吹干TFA，加入10mL冷乙醚，充分混合，在冰上靜置15min 后，離心(12000rpm， 4°C ， 15min)，重復(fù)兩次，收集沉淀，置真空干燥塔內(nèi)完全干燥，即得達托 霉素類似物(3)實例樣品。
權(quán)利要求
一種達托霉素類似物，其特征在于序列如下其中所述的AA1為側(cè)鏈帶羧基的氨基酸Glu、Asp、3MeGlu，側(cè)鏈羧基未被保護，α-羧基采用O-Dmab基團保護，α-氨基采用Fmoc基團保護；所述的AA9為側(cè)鏈帶有羥基的氨基酸Ser，Thr，Tyr，側(cè)鏈羥基采用O-Trt，O-2-ClTrt基團保護，α-氨基采用Fmoc基團保護，α-羧基未被保護；所述的AA2，AA3，AA4，AA5，AA6，AA7，AA8，AA10，AA11，AA12，AA13為任意氨基酸，α-氨基采用Fmoc基團保護，α-羧基未被保護；所述的R＝H，CnH2n+1-或CnH2n-1-，其中n＝0-17。
2. —種達托霉素類似物，其特征在于序列如下<formula>formula see original document page 2</formula>其中所述的A^為側(cè)鏈帶羧基的氨基酸Glu、 Asp、3MeGlu，側(cè)鏈羧基未被保護，a-羧 基采用0-Dmab基團保護，a -氨基采用Fmoc基團保護；所述的AA9為側(cè)鏈帶有羥基的氨基 酸Ser， Thr， Tyr，側(cè)鏈羥基采用O-Trt， 0_2_ClTrt基團保護，a -氨基采用Fmoc基團保護， a _羧基未被保護；所述的AA2， AA3， AA4， AA5， AA6， AA7， AA8， AA1Q，為任意氨基酸，a -氨基采 用Fmoc基團保護，a -羧基未被保護；所述的R = H， CnH2n+1_或CnH2n—。其中n = 0-17。
3. —種達托霉素類似物，其特征在于序列如下<formula>formula see original document page 2</formula>其中所述的A^為側(cè)鏈帶羧基的氨基酸Glu、 Asp、3MeGlu，側(cè)鏈羧基未被保護，a-羧 基采用0-Dmab基團保護，a -氨基采用Fmoc基團保護；所述的AA9為側(cè)鏈帶有羥基的氨基 酸Ser， Thr， Tyr，側(cè)鏈羥基采用O-Trt， 0_2_ClTrt基團保護，a -氨基采用Fmoc基團保護， a _羧基未被保護；所述的AA2， AA3， AA4， AA5， AA6， AA7， AA8， AA1Q，為任意氨基酸，a -氨基采 用Fmoc基團保護，a -羧基未被保護。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1 3所述的任一種達托霉素類似物，其特征在于所述的AA9為側(cè)鏈 帶有巰基的氨基酸Cys，側(cè)鏈巰基采用S-Trt、S-Mmt或S-tButhio基團保護，a _氨基采用 Fmoc基團保護，a -羧基未被保護。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1 3所述的任一種達托霉素類似物，其特征在于所述的AA9為側(cè)鏈 帶有氨基的氨基酸Arg、His、Lys、Orn，側(cè)鏈氨基采用N-Mtt、N-Mmt基團保護，a -氨基采用 Fmoc基團保護，a -羧基未被保護。
6. —種制備權(quán)利要求1或4或5所述的任一種達托霉素類似物的方法，其特征在于步 驟如下步驟1 :以Rink amide樹脂為載體，按照固相合成法連接第一個側(cè)鏈羧基未被保護的 氨基酸AA"脫掉a -氨基的保護基團，繼續(xù)按照固相合成法依次連接具有保護基團的氨基 酸，連接期間依次脫去氨基保護基團，得到保護的肽樹脂；所述的固相合成法是將氨基酸 和HOBT溶于DMF中預(yù)反應(yīng)10 15分鐘，加入到Rink amide樹脂中混合，再加入DIC反應(yīng) 2 3小時；所述的Rink amide樹月旨氨基酸HOBT : DIC = 1 : 4 : 4 : 4 ;所述的具有保護基團的氨基酸a -氨基使用Fmoc基團保護；所述的脫去a _氨基保護基團的步驟為先做第一次Kaiser test檢測，若第一次 Kaiser test檢測反應(yīng)為陰性直接脫a -氨基的保護基團，加入哌啶DMF = 2 : 8 (v/v) 混合溶液室溫下旋轉(zhuǎn)反應(yīng)10 15分鐘，再重復(fù)1次；脫a -氨基的保護基團結(jié)束后繼續(xù)做 第二次Kaiser test檢測，若第二次Kaiser test檢測反應(yīng)為陽性直接連接下一個氨基酸， 若第二次Kaiser test檢測反應(yīng)為陰性重復(fù)進行脫a _氨基的保護基團；若第一次Kaiser test檢測反應(yīng)為陽性重復(fù)連接該次氨基酸，再進行第一次 Kaisertest檢測；步驟2 :按照固相合成法依次連接AA9， AAn， AA12， AA13， R ;連接完后脫掉AA9側(cè)鏈的 保護基團，得到肽樹脂；將肽樹脂用三氯甲烷溶脹半個小時以上，將DCC，氨基酸，HOBT溶 于45 %的DMF in脫水THF中預(yù)反應(yīng)30 40分鐘，出現(xiàn)沉淀后過濾，再將濾液與DMAP混合加入到肽樹脂中反應(yīng)5 6小時；所述的肽樹脂氨基酸hobt : dcc : dmap = i : 4 : 2 : 4 : o. 4 ;所述的固相合成法連接r時，肽樹脂r : hobt : dic=i : 8 : 8 : 8，反應(yīng)3 4小時；所述的脫掉AA9側(cè)鏈的保護基團若側(cè)鏈的保護基團為0-Trt， S-Trt， 0-2-ClTrt， S-Mmt， 、N-Mtt，在1% TFA in DCM containing 1-5% TIS條件下脫除；若側(cè)鏈的保護基團 為S-tButhio，在3eq. TBP in propanol aq. or TFE aq.條件下脫除；若側(cè)鏈的保護基團為 N-Mmt，在AcOH/TFE/DCM = 1 : 2 : 7條件下脫除；步驟3 :脫掉AA1Q的a -氨基保護基團，然后脫掉AA工的a -羧基的保護基團O-Dmab， 然后第一次環(huán)合；環(huán)合時采用在樹脂上直接先環(huán)合再用剪切液將環(huán)肽從樹脂上剪切下來 的方法；將PyB0P和HOBT采用NMP溶劑溶解，在室溫下預(yù)反應(yīng)10 15分鐘，然后加入到 肽樹脂中，再加入DIEA，室溫下旋轉(zhuǎn)反應(yīng)48小時，所述的第一次環(huán)合的環(huán)合液比例肽樹 月旨PyB0P : HOBT : DIEA =1:8:8:8;然后依次用NMP、DMF洗滌，加入第二次環(huán)合液繼續(xù)室溫下環(huán)合反應(yīng)48小時；所述的第二次環(huán)合的環(huán)合液比例為肽樹脂hobt : Die = i : 8 : 8 ;所述的脫掉的a -羧基的保護基團0-Dmab在2% Hydrazine in DMF條件下脫除； 步驟4 :向肽樹脂中加入剪切液反應(yīng)2 3h，收集濾液，用氮氣吹使得TFA揮發(fā)，加入冷 乙醚，在冰中靜置15min以上，高速離心，條件為12000rpm，4t:，15min，高速離心重復(fù)兩次， 收集沉淀，置真空干燥塔內(nèi)完全干燥，即得達托霉素類似物；所述的剪切液為TFA : TIS :苯酚水=95 : i : 2 : 2。
7. —種制備權(quán)利要求2或4或5所述的任一種達托霉素類似物的方法，其特征在于步驟如下步驟1 :以Rink amide樹脂為載體，按照固相合成法連接第一個側(cè)鏈羧基未被保護的 氨基酸AA"脫掉a -氨基的保護基團，繼續(xù)按照固相合成法依次連接具有保護基團的氨基 酸，連接期間依次脫去a -氨基保護基團，得到保護的肽樹脂；所述的固相合成法是將氨 基酸和HOBT溶于DMF中預(yù)反應(yīng)10 15分鐘，加入到Rink amide樹脂中混合，再加入DIC 反應(yīng)2 3小時；所述的Rink amide樹脂氨基酸HOBT : DIC = 1 : 4 : 4 : 4 ;所述的具有保護基團的氨基酸a -氨基使用Fmoc基團保護；所述的脫去a _氨基保護基團的步驟為先做第一次Kaiser test檢測，若第一次 Kaisertest檢測反應(yīng)為陰性直接脫a-氨基的保護基團，加入哌啶DMF = 2 : 8 (v/v)混 合溶液室溫下旋轉(zhuǎn)反應(yīng)10 15分鐘，再重復(fù)1次；脫a -氨基的保護基團結(jié)束后繼續(xù)做第 二次Kaiser test檢測，若第二次Kaiser test檢測反應(yīng)為陽性直接連接下一個氨基酸，若 第二次Kaiser test檢測反應(yīng)為陰性重復(fù)進行脫a -氨基的保護基團；若第一次Kaiser test檢測反應(yīng)為陽性重復(fù)連接該次氨基酸，再進行第一次 Kaisertest檢測；步驟2 :按照固相合成法依次連接AA9， R ;連接完后脫掉AA9側(cè)鏈的保護基團，得到肽樹 脂；將肽樹脂用三氯甲烷溶脹半個小時以上，將DCC，氨基酸，H0BT溶于45X的匿F in脫 水THF中預(yù)反應(yīng)30 40分鐘，出現(xiàn)沉淀，過濾，再將濾液與DMAP混合加入到肽樹脂中反應(yīng)5 6小時；所述的肽樹脂氨基酸hobt : dcc : dmap = 1:4:2:4:0.4; 所述的固相合成法連接r時，肽樹脂r : hobt : Die = 1 : 8 : 8 : 8，反應(yīng)3 4小時；所述的脫掉AA9側(cè)鏈的保護基團若側(cè)鏈的保護基團為O-Trt， S-Trt， 0-2-ClTrt， S-Mmt， 、N-Mtt，在1% TFA in DCM containing 1-5% TIS條件下脫除；若側(cè)鏈的保護基團 為S-tButhio，在3eq. TBP in propanol aq. or TFE aq.條件下脫除；若側(cè)鏈的保護基團為 N-Mmt，在AcOH/TFE/DCM = 1 : 2 : 7條件下脫除；步驟3 :脫掉AA1Q的a -氨基保護基團，然后脫掉AA工的a -羧基的保護基團O-Dmab， 然后第一次環(huán)合；環(huán)合時采用在肽樹脂上直接先環(huán)合再用剪切液將環(huán)肽從肽樹脂上剪切下 來的方法；將PyBOP和HOBT采用NMP溶劑溶解，在室溫下預(yù)反應(yīng)10 15分鐘，然后加入 到肽樹脂中，再加入DIEA，室溫下旋轉(zhuǎn)反應(yīng)48小時，所述的第一次環(huán)合的環(huán)合液比例肽樹 月旨PyBOP : HOBT : DIEA =1:8:8:8;然后用NMP、DMF洗滌，加入第二次環(huán)合液繼續(xù)室溫下環(huán)合反應(yīng)48小時；所述的第二次環(huán)合的環(huán)合液比例肽樹脂hobt : Die = i : 8 : 8 ;所述的脫掉的a -羧基的保護基團O-Dmab在2% Hydrazine in DMF條件下脫除； 步驟4 :向肽樹脂中加入剪切液反應(yīng)2 3h，收集濾液，用氮氣吹使得TFA揮發(fā)，加入冷 乙醚，在冰中靜置15min以上，高速離心，條件為12000rpm，4t:，15min，高速離心重復(fù)兩次， 收集沉淀，置真空干燥塔內(nèi)完全干燥，即得達托霉素類似物；所述的剪切液為TFA : TIS :苯酚水=95 : i : 2 : 2。
8. —種制備權(quán)利要求3或4或5所述的任一種達托霉素類似物的方法，其特征在于步驟如下步驟1 :以Rink amide樹脂為載體，按照固相合成法連接第一個側(cè)鏈羧基未被保護的 氨基酸AA"脫掉a -氨基的保護基團，繼續(xù)按照固相合成法依次連接具有保護基團的氨基 酸，連接期間依次脫去a -氨基保護基團，得到保護的肽樹脂；所述的固相合成法是將氨 基酸和HOBT溶于DMF中預(yù)反應(yīng)10 15分鐘，加入到Rink amide樹脂中混合，再加入DIC 反應(yīng)2 3小時；所述的Rink amide樹脂氨基酸HOBT : DIC = 1 : 4 : 4 : 4 ;所述的具有保護基團的氨基酸a -氨基使用Fmoc基團保護；所述的脫去a _氨基保護基團的步驟為先做第一次Kaiser test檢測，若第一次 Kaiser test檢測反應(yīng)為陰性直接脫a -氨基的保護基團，加入哌啶DMF = 2 : 8 (v/v)混合溶液室溫下旋轉(zhuǎn)反應(yīng)10 15分鐘，再重復(fù)1次；脫a -氨基的保護基團結(jié)束后繼續(xù)做 第二次Kaiser test檢測，若第二次Kaiser test檢測反應(yīng)為陽性直接連接下一個氨基酸， 若第二次Kaiser test檢測反應(yīng)為陰性重復(fù)進行脫a-氨基的保護基團；若第一次Kaiser test檢測反應(yīng)為陽性重復(fù)連接該次氨基酸，再進行第一次 Kaisertest檢測；步驟2 :按照固相合成法連接AA9 ;連接完后脫掉AA9側(cè)鏈的保護基團，得到肽樹脂；將肽樹脂用三氯甲烷溶脹半個小時以上，將DCC，氨基酸，HOBT溶于45%的DMFin脫水THF中 預(yù)反應(yīng)30 40分鐘，出現(xiàn)沉淀，過濾，再將濾液與DMAP混合加入到肽樹脂中反應(yīng)5 6小時；所述的肽樹脂氨基酸hobt : dcc : dmap =1:4:2:4:0.4;所述的脫掉AA9側(cè)鏈的保護基團若側(cè)鏈的保護基團為0-Trt， S-Trt， 0-2-ClTrt， S-Mmt， 、N-Mtt，在1% TFA in DCM containing 1-5% TIS條件下脫除；若側(cè)鏈的保護基團 為S-tButhio，在3eq. TBP in propanol aq. or TFE aq.條件下脫除；若側(cè)鏈的保護基團為 N-Mmt，在Ac0H/TFE/DCM = 1 : 2 : 7條件下脫除；步驟3 :脫掉AA1Q的a -氨基保護基團，然后脫掉AA工的a -羧基的保護基團0-Dmab， 然后第一次環(huán)合；環(huán)合時采用在肽樹脂上直接先環(huán)合再用剪切液將環(huán)肽從肽樹脂上剪切下 來的方法；將PyB0P和HOBT采用NMP溶劑溶解，在室溫下預(yù)反應(yīng)10 15分鐘，然后加入到 肽樹脂中，再加入DIEA，室溫下旋轉(zhuǎn)反應(yīng)48小時，所述的第一次環(huán)合的環(huán)合液比例為肽樹 月旨PyB0P : HOBT : DIEA =1:8:8:8;然后用NMP、DMF洗滌，加入第二次環(huán)合液繼續(xù)室溫下環(huán)合反應(yīng)48小時；所述的第二次環(huán)合的環(huán)合液比例為肽樹脂hobt : Die = i : 8 : 8 ;所述的脫掉的a -羧基的保護基團0-Dmab在2% Hydrazine in DMF條件下脫除； 步驟4 :脫掉AA9的a -氨基保護基團后，向肽樹脂中加入剪切液反應(yīng)2 3h，收集 濾液，用氮氣吹使得TFA揮發(fā)，加入冷乙醚，在冰中靜置15min以上，高速離心，條件為 12000rpm，4°C， 15min，高速離心重復(fù)兩次，收集沉淀，置真空干燥塔內(nèi)完全干燥，即得達托霉素類似物；所述的剪切液為tfa : :苯酚水=95 : i : 2 : 2。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種達托霉素類似物及其全固相合成制備方法，技術(shù)特征在于將第一個側(cè)鏈帶有羧基的Fmoc氨基酸(其α-羧基被選定的基團保護)連接到固相樹脂載體上，再繼續(xù)依次連接七個Fmoc氨基酸，期間依次脫Fmoc；連接第九個側(cè)鏈帶有羥基(巰基或氨基)并被選擇性基團保護的Fmoc氨基酸并脫Fmoc，再繼續(xù)依次連接后面的三個Fmoc氨基酸并脫Fmoc；連接脂肪酸后，再選擇性地脫去第九個氨基酸側(cè)鏈羥基(巰基或氨基)上的保護基團，然后將其與最后一個Fmoc氨基酸的羧基進行反應(yīng)，脫Fmoc；再脫去第一個氨基酸α-羧基的保護基團后，直接在固相樹脂上進行環(huán)合；最后將產(chǎn)物從樹脂上剪切下來，經(jīng)冷乙醚沉淀，收獲產(chǎn)品。
文檔編號C07K1/04GK101696235SQ200910218669
公開日2010年4月21日 申請日期2009年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月29日
發(fā)明者丁焰, 任錦, 尚曉婭, 徐春蘭, 牛衛(wèi)寧, 王秋雨, 欽傳光 申請人:西北工業(yè)大學(xué);