專利名稱：基于紫杉醇和氮芥的協同前藥及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種新型協同前藥及其制備方法，特別是一種基于紫杉醇-氮芥的協
同前藥及其制備方法。
背景技術：
當今在大多數國家，因惡性腫瘤而引起的死亡是僅次于心腦血管疾病的人類第二 大死因。傳統的抗腫瘤藥物除了抑制和毒害增生活躍的腫瘤細胞的同時，對其它增生較快 的正常細胞也同樣產生抑制作用，因而產生許多嚴重的毒副作用，如惡心、嘔吐、骨髓抑制 和脫發等。 隨著生活水平的提高，人們對于癌癥治療期望值有所提高，希望在治愈癌癥的同 時，人的健康不受到很大的影響。因此開發新型的、能選擇性的作用于腫瘤細胞而對正常細 胞沒有毒性的抗腫瘤藥物顯得尤為重要。 隨著分子和細胞生物學的巨大發展，為抗腫瘤新藥的研究提供了廣闊的空間。實 體腫瘤的"低氧"性為抗腫瘤藥物設計提供了一種很好的策略。實體腫瘤包含一定比例的 低氧細胞，可通過代謝作用將"可生物還原"的前藥還原而釋放出活性的藥物。
由于腫瘤細胞極易產生耐藥性，目前腫瘤的化療已經由單一化療進入了聯合化療 的階段。然而聯合用藥仍然無法避免耐藥性和全身毒副作用。如果采用協同前藥的策略給 藥，則可以大大改善這種狀況。將兩種不同類型的抗腫瘤藥物通過適當的形式偶聯而形成 的就是抗腫瘤類協同前藥。該類前藥在腫瘤組織中經過適當的機制活化而釋放出兩種不同 類型的抗腫瘤活性藥物，由此避免了同時產生耐藥性。在保證療效的前提下，還可以大大降 低毒副作用。同時，還可能提高該類藥物的抗腫瘤范圍。
發明內容
本發明的目的之一在于提供一種新的基于紫杉醇_氮芥的協同前藥。
本發明的目的之二在于提供該協同前藥的制備方法。 氮芥是第一個人工合成的抗腫瘤藥物，自從20世紀40年代用于治療惡性淋巴瘤 以來已經有60多年的應用歷史。紫杉醇是從紅豆杉屬植物中分離提取的一種具有獨特抗 癌活性的新型抗癌藥，已于1992年底被美國FDA正式批準為治療卵巢癌和乳腺癌的新藥上 市。然而它們在臨床應用中，"療效"和"無毒副作用"始終不可兼得。基于上述考慮，本發 明設計合成了一種基于紫杉醇_氮芥的協同前藥。構效關系研究表明，紫杉醇側鏈2'游離 的羥基以適當形式被酯化，紫杉醇的抗腫瘤活性大大降低4。在氮芥的苯環上引入強吸電子 基團如硝基可以大大降低該類化合物的毒性5。該硝基是協同前藥分子中活化的"扳機"，在 細胞環境中被還原，"扳機"被擊發，最終釋放出紫杉醇和氮芥活性藥物。
根據上述理論，本發明采用如下反應機理
HO OH CI CI根據上述反應機理，本發明采用如下技術方案 —種基于紫杉醇-氮芥的協同前藥，其特征在于該協同前藥的結構式為
H —種制備上述的基于紫杉醇-氮芥的協同前藥的方法，其特征在于該方法的具體 步驟為 a.將反應物5-氯-2-硝基苯甲酸溶于氯化亞砜中回流6 8個小時；蒸去氯化 亞砜，得淡黃色油狀5-氯-2-硝基苯甲酰氯，用無水四氫呋喃稀釋，得稀釋液；將該稀釋液 緩慢滴加到碳酸鉀和苯胺的無水四氫呋喃溶液中，其中碳酸鉀和苯胺的摩爾比為l : (1 2);在_10 l(TC下攪拌至反應體系中5-氯-2-硝基苯甲酰氯反應完全；抽濾，濾液蒸除 溶劑得粗產物；該粗產物用乙酸乙酯重結晶，得白色針狀晶體5-氯-2-硝基-N-苯基苯甲 酰胺，稱為化合物A; b.將化合物A溶于二乙醇胺中，惰性氣氛下，在100°C ll(TC下攪拌反應至化合
5物A反應完全，加入鹽酸中止反應并調節反應體系的pH值至6. 5 7，有大量淡黃色固體 沉淀析出；濾液用乙酸乙酯萃取，無水硫酸鎂干燥，除去溶劑得淡黃色固體；合并淡黃色固 體，經分離純化得淡黃色針狀晶體5-(雙(2-羥基乙基)氨基)-2-硝基-N-苯基苯甲酰胺， 稱為化合物B ; c.將化合物B、氯化亞砜、無水碳酸鉀和三乙基芐基氯化銨按5 : (20 25) : (2 3) : (1 2)的摩爾比溶于無水四氫呋喃中，在室溫下攪拌至反應體系中化合 物B反應完全；過濾，濾液蒸去溶劑得淡黃色油狀粗產物；該淡黃色油狀粗產物經分離純化 得淡黃色固體5-(雙(2-氯乙基)氨基)-2-硝基-N-苯基苯甲酰胺，稱為化合物C;
d.將化合物C溶于70^ 75^濃硫酸中，在9(TC IO(TC下攪拌至反應體系中化 合物C反應完全；加入水中止反應，產生棕色沉淀；抽濾得固體粗產物，用水洗滌，用乙酸乙 酯重結晶得淡黃色晶體5-(雙(2-氯乙基)氨基)-2-硝基苯甲酸，稱為化合物D;
e.將化合物D和草酰氯按1 : (3 4)的摩爾比溶于二氯甲烷中，在3(TC 4(TC 下攪拌反應至反應物D完全，除去溶劑和多于的草酰氯得淡黃色固體；該淡黃色固體用甲 苯溶解后緩慢滴加到疊氮化鈉、三乙胺和PEG-600的甲苯混合溶液中，其中疊氮化鈉、三乙 胺和PEG-600的摩爾比為1 : (4 6) : (0. 015 0. 2);將反應混合溶液先在55 60°C 溫度下攪拌1 1. 5小時，然后在70 75"下攪拌5 6小時；加入1. 5 2倍摩爾量的 叔丁基_2-羥基乙基_氨基甲酸酯；在80 85t:下繼續攪拌6 8小時；抽濾除去固體物 質，濾液蒸去溶劑得粗產物；該粗產物經過分離提純得淡黃色固體N-叔丁氧基羰基-2-氨 基乙基-5-(雙(2-氯乙基)氨基)-2-硝基-N-苯基氨基甲酸酯，稱為化合物E;
f.將化合物E溶于甲醇中，加入6 6. 5mol/L鹽酸4 6mL ;反應液在40 45。C 下攪拌至反應體系中化合物E反應完全；用飽和的碳酸氫鈉水溶液中止反應；水相用乙酸 乙酯萃取，無水硫酸鎂干燥，減壓蒸去溶劑得粗產物；該粗產物用乙酸乙酯重結晶得2-氨 基乙基-5-(雙(2-氯乙基)氨基)-2-硝基-N-苯基氨基甲酸酯，稱為化合物F;
g.將化合物F、氯甲酸對硝基苯酯和吡啶按1 : (2 2. 5) : (2 2. 5)的摩爾比 溶于二氯甲烷中；反應混合物在0 5t:下攪拌至反應體系中化合物F反應完全；加入飽和 硫酸銅溶液洗滌，水洗滌，無水硫酸鎂干燥，減壓蒸去溶劑得粗產物；該粗產物經過分離提 純得5-(雙(2-氯乙基)氨基)_2-硝基-N-苯基氨基甲酰基-2-氨基乙基_羰基-4-硝 基苯酚酯，稱為化合物G; h.將化合物G、紫杉醇和二甲基-氨基吡啶按1 : (0.8 1) : (1.7 2)的摩 爾比溶于二氯甲烷中；反應混合物在室溫下攪拌40 50小時；減壓蒸去溶劑得粗產物；該 粗產物經分離提純得5-(雙(2-氯乙基)氨基)_2-硝基-N-苯基氨基甲酰基-2-氨基乙 基_羰基紫杉醇，稱為化合物H，即為基于紫杉醇_氮芥的協同前藥。 本發明產物結構新穎，首次將兩種不同類型的抗腫瘤藥物偶聯，形成新型的抗腫 瘤協同前藥，且該協同前藥在正常狀態下毒性大大降低，具有潛在的應用價值。本發明采用 的方法簡便，特別是步驟c，在反應中添加三乙基芐基氯化銨，極大的改善了反應進程，使得 反應操作更簡便高效。
圖1為協同前藥(H)和紫杉醇在正常條件和低氧條件下對膠質細胞瘤LN299細胞的體外增殖抑制作用圖。 圖2為協同前藥(H)和紫杉醇在正常條件和低氧條件下對膠質細胞瘤D54MG細胞 的體外增殖抑制作用圖。 圖3為協同前藥(H)和紫杉醇在正常條件和低氧條件下對膠質細胞瘤U255MG細 胞的體外增殖抑制作用圖。
具體實施例方式實施例一 本發明的基于紫杉醇_氮芥的協同前藥的具體合成步驟
A. 5-氯-2-硝基苯甲酸(15. 02g，75. 4mmo1)溶解在S0C12 (80mL)中，回流6小時; 常壓蒸去大部分氯化亞砜，減壓除去殘余的部分氯化亞砜，得到棕色油狀的5-氯-2-硝基 苯甲酰氯粗產物，加入無水四氫呋喃稀釋；將此溶液通過恒壓漏斗在Ot:條件下30分鐘內 滴加入含有苯胺(7. 20g，78. 2,1)和無水K2C03(10. 30g，75. 2,1)的干燥THF(30mL)溶
液中，反應混合物繼續攪拌2小時；反應結束后，過濾除去固體物質，濾液減壓蒸去溶劑；粗
產物在乙酸乙酯中重結晶得到A(19. 79g)，收率96% 。 B.化合物A(4. 53g， 16. 4,1)溶解在二乙醇胺(10. 16g，96. 6,1)中，在氮氣保 護下105t:攪拌20小時；反應結束后加入3mol/L鹽酸中止反應，調節溶液pH值至6. 5_7左 右，有大量淡黃色沉淀析出；抽濾出淡黃色沉淀；濾液加乙酸乙酯萃取，無水MgS0-4干燥， 蒸去溶劑得淡黃色固體；合并淡黃色固體粗產物，經過硅膠柱層析(流動相乙酸乙酯/乙 醇=10 : 1)分離得到淡黃色晶體B(4.92g)，收率87X。 C. S0C12(3. 0mL，42. 3mmo1)加入無水THF(20mL)稀釋；將此溶液在40。C條件下1小 時內滴加到含有化合物B(4. 83g， 14. Ommol)、無水1(20)3(3. 87g，28. Ommol)和三乙基芐基氯 化銨(0.64g，2.8mmo1)的干燥THF(30mL)溶液中，反應混合物在相同條件下繼續攪拌4小 時；反應結束后減壓抽濾除去固體物質；濾液減壓蒸去溶劑；粗產物經過硅膠柱層析(流動 相乙酸乙酯/石油醚=1 : 2)分離得到化合物C(5.03g)，收率94X。
D.化合物C(2. 02g，5. 3mmo1)加入濃H2S04(70%， 12mL)中，在95。C條件下攪拌6 小時；反應結束后，待溶液溫度冷卻至室溫后加入H20(14mL)中止反應，有大量棕色沉淀析 出；減壓抽濾出沉淀，水(5mL)洗；固體在45。C條件下真空干燥1小時；將粗產物溶解在乙 酸乙酯(70mL)中，加入活性炭(0. 12g)，回流1小時后，減壓抽濾除去活性炭；濾液減壓濃 縮至有大量淡黃色固體析出，減壓抽濾出固體，乙酸乙酯(2mL)洗滌，45t:條件下真空干燥 1小時得到化合物D(1.43g)，收率88%。 E.化合物D (512mg， 1. 67mL)溶解在CH2C12 (60mL)中；加入草酰氯(0. 69mL， 5. 42mmo1)，在35t:條件下攪拌6小時后，減壓蒸去溶劑和過量的草酰氯，得到淡黃色固體， 鍵入新鮮處理的甲苯(20mL)溶解；將此溶液通過恒壓漏斗在6(TC條件下1小時內滴加到 含有NaN3(161mg，2.48mmol)、三乙胺(0. 91mL， 6. 51,1)和PEG-600 (5滴)的甲苯(30mL) 溶液中；反應混合物在7(TC條件下攪拌5小時；加入叔丁基-2-羥基乙基-氨基甲酸酯 (422mg，2. 62mmo1)，反應混合物在8(TC條件下攪拌6小時；反應結束后減壓抽濾除去固體 物質；濾液減壓蒸去溶劑；粗產物經過硅膠柱層析(流動相乙酸乙酯/石油醚=1 : 2) 分離得到淡黃色化合物E (481mg)，收率61 % 。F.化合物E(lOlmg，O. 22mmo1)溶解在甲醇(10mL)中；在4(TC條件下加入6mol/L的鹽酸(4mL)，在此條件下攪拌12小時；反應結束后用飽和碳酸氫鈉溶液中止反應；減壓蒸 去有機溶劑，水相用乙酸乙酯(3X50)萃取，合并有機相，無水MgS(^干燥，減壓蒸去溶劑； 粗產物在乙酸乙酯中重結晶得到淡黃色化合物F(73mg)，收率92% 。 G.化合物F(43mg，0. 09mmo1)溶解在干燥的CH2C12 (10mL)中；在0。C條件下加入氯 甲酸對硝基苯酯(47mg，0. 18mmo1)和無水吡啶(18mg，0. 18mmo1);反應混合物在此條件下 攪拌2小時，然后在室溫下繼續攪拌4小時；反應結束后，加入CH2C12 (15mL)，飽和CuS04溶 液洗滌，水洗滌，無水MgS(^干燥，減壓蒸去溶劑；粗產物經過硅膠柱層析(流動相乙酸乙 酯/石油醚=1 : 2)分離得到淡黃色化合物G(54mg)，收率87X。 H.化合物G(37mg，0. 07mmo1)溶解在干燥的CH2Cl2(6mL)中；在室溫條件下加入 紫杉醇(60mg，0.07mmo1)和4-甲基氨基妣啶(18mg，0. 14mmo1);反應混合物在此條件下 攪拌40小時；反應結束后減壓蒸去溶劑；粗產物經過制備薄層層析硅膠板(流動相乙 酸乙酯/石油醚=3 : 1)分離得到淡黃色化合物H(71mg)，收率82X。 ^ NMR(500MHz， CDCl3)ppm 10.41(s，lH)，8. 15(d， J = 10. 0Hz， 1H) ， 8. ll(d， J = 7. 5Hz， 2H) ， 7. 82 (d， J = 2. 5Hz， 1H) ，7. 73(d， J = 7. 5Hz，2H) ，7. 61-7. 58(m， 1H) ，7. 51-7. 45 (m， 4H) ， 7. 41-7. 35 (m， 5H) ，7. 31-7. 29(m， 1H) ， 7. 08(d， J = 9. OHz， 1H) ，6. 39(dd， J = 10. 0，2. 5Hz， 1H) ，6. 26(s， lH)，6.22(t，J = 9. OHz， 1H) ，5. 92(dd， J = 9. 5， 4. 5Hz， 1H) ， 5. 66 (d， J = 7. OHz，lH)， 5.53(d， J = 4. OHz， 1H) ，5. 48(t， J = 6. OHz， 1H) ， 4. 95 (d， J = 9. 5Hz， 1H) ， 4. 41 (t， J = 8. OHz， 1H) ，4. 30(d， J = 8. 5Hz， 1H) ， 4. 25—4. 21 (m， 2H) ， 4. 17(d， J = 8. 5Hz， 1H) ， 3. 87 (t， J = 6. 5Hz，4H) ，3. 78(d， J = 7. OHz， 1H) ， 3. 72(t， J = 6. 5Hz，4H) ，3. 51—3. 49(t， J = 5. 0， 2H) ，2. 53-2. 50 (m， 1H) ， 2. 41 (s，3H) ，2. 35—2. 26(m，2H) ，2. 22(s，3H) ，2. 11—2. 06 (m， 1H)， 1.90(s，3H)，1.81(s，lH)，1.66(s，3H)，1.21(s，3H)，1. 11(s，3H) ;13C NMR(125MHz， CDC13) ppm 203. 9， 171. 4， 170. 0， 168. 9， 167. 6， 167. 0， 155. 1， 153. 0， 152. 6， 142. 8， 138. 1， 136. 9， 133. 8， 133. 6， 132. 8， 132. 1， 130. 2， 129. 3， 129. 2， 129. 1， 128. 8， 127. 2， 126. 8， 126. 5， 126. 2， 115. 6， 106. 3， 100. 3， 84. 5， 81. 1，79. 1，76. 5， 75. 7， 75. 1，74. 5， 72. 2， 71. 8， 64. 6， 58. 5， 53. 7， 53. 4， 45. 7， 43. 2， 40. 5， 40. 3， 35. 7， 35. 6， 26. 8， 22. 6， 22. 2， 20. 9， 14. 8，9. 7 ; ESI-MS :m/z 1266. 2[M+Na]+. 實施例二5-(雙(2-氯乙基)氨基)-2-硝基-N-苯基氨基甲酰基-2-氨基乙
基_羰基紫杉醇的生物活性測試
具體測試過程 a. 96孔板分別植入LN229、 D54MG、 U251MG三種不同的腫瘤細胞，80000個/孔，置 37°C，5% C02培養箱內培養24小時； b.向步驟a中培養好的細胞中分別加入不同濃度的協同前藥(H)和紫杉醇溶液， 置37°C，5% C02培養箱內培養2小時； c.將步驟b中的細胞分為兩組，其中一組置371:，1% 02培養箱內培養72小時， 另一組置37°C，21% 02培養箱內培養72小時； d.向步驟c中培養好的細胞中每孔加入5mg/ml的MTT溶液20 y L，作用4h后加 入溶解液，100 L/孔，置培養箱內，溶解后用MK-2全自動酶標儀測570nm OD值。
具體測試結果請參見圖1 、圖2和圖3，結果顯示，本發明的協同前藥在正常狀態下 毒性大大降低，具有潛在的應用價值。
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權利要求
一種基于紫杉醇-氮芥的協同前藥，其特征在于該協同前藥的結構式為F2009102005329C00011.tif
2. —種制備根據權利要求1所述的基于紫杉醇-氮芥的協同前藥的方法，其特征在于該方法的具體步驟為a. 將反應物5-氯-2-硝基苯甲酸溶于氯化亞砜中回流6 8個小時；蒸去氯化亞砜， 得淡黃色油狀5-氯-2-硝基苯甲酰氯，用無水四氫呋喃稀釋，得稀釋液；將該稀釋液緩慢 滴加到碳酸鉀和苯胺的無水四氫呋喃溶液中，其中碳酸鉀和苯胺的摩爾比為1 : (1 2); 在-10 l(TC下攪拌至反應體系中5-氯-2-硝基苯甲酰氯反應完全；抽濾，濾液蒸除溶劑 得粗產物；該粗產物用乙酸乙酯重結晶，得白色針狀晶體5-氯-2-硝基-N-苯基苯甲酰胺， 稱為化合物A ;b. 將化合物A溶于二乙醇胺中，惰性氣氛下，在100°C ll(TC下攪拌反應至化合物A 反應完全，加入鹽酸中止反應并調節反應體系的pH值至6.5 7，有大量淡黃色固體沉淀析 出；濾液用乙酸乙酯萃取，無水硫酸鎂干燥，除去溶劑得淡黃色固體；合并淡黃色固體，經 分離純化得淡黃色針狀晶體5-(雙(2-羥基乙基)氨基)-2-硝基-N-苯基苯甲酰胺，稱為 化合物B ;c. 將化合物B、氯化亞砜、無水碳酸鉀和三乙基芐基氯化銨按5 : (20 25) : (2 3) : (1 2)的摩爾比溶于無水四氫呋喃中，在室溫下攪拌至反應體系中化合物B反應完 全；過濾，濾液蒸去溶劑得淡黃色油狀粗產物；該淡黃色油狀粗產物經分離純化得淡黃色 固體5-(雙(2-氯乙基)氨基)_2-硝基-N-苯基苯甲酰胺，稱為化合物C ;d. 將化合物C溶于70X 75X濃硫酸中，在9(TC IO(TC下攪拌至反應體系中化合 物C反應完全；加入水中止反應，產生棕色沉淀；抽濾得固體粗產物，用水洗滌，用乙酸乙酯 重結晶得淡黃色晶體5-(雙(2-氯乙基)氨基)-2-硝基苯甲酸，稱為化合物D;e. 將化合物D和草酰氯按1 : (3 4)的摩爾比溶于二氯甲烷中，在3(TC 4(TC下攪 拌反應至反應物D完全，除去溶劑和多于的草酰氯得淡黃色固體；該淡黃色固體用甲苯溶 解后緩慢滴加到疊氮化鈉、三乙胺和PEG-600的甲苯混合溶液中，其中疊氮化鈉、三乙胺和 PEG-600的摩爾比為1 : (4 6) : (0. 015 0. 2);將反應混合溶液先在55 6(TC溫度 下攪拌1 1. 5小時，然后在70 75t:下攪拌5 6小時；加入1. 5 2倍摩爾量的叔丁 基-2-羥基乙基-氨基甲酸酯；在80 85t:下繼續攪拌6 8小時；抽濾除去固體物質， 濾液蒸去溶劑得粗產物；該粗產物經過分離提純得淡黃色固體N-叔丁氧基羰基-2-氨基乙 基-5-(雙(2-氯乙基)氨基)-2-硝基-N-苯基氨基甲酸酯，稱為化合物E;f. 將化合物E溶于甲醇中，加入6 6. 5mol/L鹽酸4 6mL ;反應液在40 45。C下攪拌至反應體系中化合物E反應完全；用飽和的碳酸氫鈉水溶液中止反應；水相用乙酸乙酯萃取，無水硫酸鎂干燥，減壓蒸去溶劑得粗產物；該粗產物用乙酸乙酯重結晶得2-氨基乙基-5-(雙(2-氯乙基)氨基)-2-硝基-N-苯基氨基甲酸酯，稱為化合物F;g. 將化合物F、氯甲酸對硝基苯酯和吡啶按1 : (2 2. 5) : (2 2. 5)的摩爾比溶 于二氯甲烷中；反應混合物在0 5t:下攪拌至反應體系中化合物F反應完全；加入飽和硫 酸銅溶液洗滌，水洗滌，無水硫酸鎂干燥，減壓蒸去溶劑得粗產物；該粗產物經過分離提純 得5-(雙(2-氯乙基)氨基)_2-硝基-N-苯基氨基甲酰基-2-氨基乙基_羰基-4-硝基 苯酚酯，稱為化合物G;h. 將化合物G、紫杉醇和二甲基-氨基吡啶按1 : (0.8 1) : (1.7 2)的摩爾比 溶于二氯甲烷中；反應混合物在室溫下攪拌40 50小時；減壓蒸去溶劑得粗產物；該粗產 物經分離提純得5-(雙(2-氯乙基)氨基)-2-硝基-N-苯基氨基甲酰基-2-氨基乙基-羰 基紫杉醇，稱為化合物H，即為基于紫杉醇_氮芥的協同前藥。
全文摘要
本發明涉及一種基于紫杉醇-氮芥的協同前藥及其制備方法。該協同前藥的結構式為該協同前藥在正常狀態下毒性大大降低，具有潛在的應用價值。
文檔編號C07D305/14GK101747300SQ20091020053
公開日2010年6月23日 申請日期2009年12月22日 優先權日2009年12月22日
發明者林海霞, 邵軍超, 阮非, 靳丹輝, 黃嘉辰 申請人:上海大學