專利名稱：分離積雪草苷-b、羥基積雪草苷和積雪草苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及積雪草總苷中組分的分離，具體涉及一種分離積雪草苷-B、羥基積雪草苷和積雪草苷的方法，屬化工分離技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
積雪草Centella asiatica(L. )Urban，又名胡薄荷、地錢草等，為傘形科積雪草屬植物，廣泛分布在南非、印度以及我國長江流域以南各地，是一種傳統(tǒng)中草藥。據(jù)研究報(bào)道，積雪草具有消炎、增強(qiáng)記憶力、促進(jìn)膠原蛋白合成、抗抑郁和抗癌等多種生理活性。目前認(rèn)為，積雪草的主要活性成分為積雪草總苷，積雪草總苷是一種混合物，主要由三萜烷酸形成的糖苷組成，包括積雪草苷-B(Asiaticoside B， CAS No. : 125265-68-1)，羥基積雪草苷(Madecassoside ;Asiaticoside A，CAS No. :34540-22-2)禾口積雪草苷(Asiaticoside，CASNo. :16830-15-2)，它們都具有五環(huán)三萜結(jié)構(gòu)和糖苷支鏈，僅在三萜環(huán)上的羥基數(shù)目和位置存在著差異。雖然它們的結(jié)構(gòu)極其相似，但生物活性卻不盡相同，其中羥基積雪草苷具有消炎和治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等活性；積雪草苷能夠促進(jìn)傷口的愈合，對燒傷性瘢痕有明顯的治愈作用，常作為評價(jià)積雪草藥理活性的標(biāo)志性成分；由于積雪草苷-B純品難以獲得，關(guān)于它的藥理活性還未見報(bào)道。 鑒于積雪草總苷中各物質(zhì)的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)都較為接近，其中羥基積雪草苷和積雪草苷-B是一對同分異構(gòu)體，它們和積雪草苷相比只多了一個(gè)羥基，而強(qiáng)極性糖元的連接又大大地弱化了這種微小極性的差異，使得很難用常規(guī)的分離方法將這三種物質(zhì)完全分離。 專利EP 867447， CN 1194154， US 6417349， IN 183285和CN 1387868A報(bào)道了提取積雪草總苷的方法，但分離純化這三種物質(zhì)的方法卻較少。杜琪珍(Du Q Z， Jerz G， ChenP， et al.. Journal of Liquid Chromatography&Related Technologies,2004，27(14):2201-2215.)禾口 Vanhaelen-Fastr6(DialloB， Vanhaelenfastre R， Vanhaelen M. Journalof Chromatography, 1991， 558 (2) :446-450.)等采用高速逆流色譜實(shí)現(xiàn)了積雪草苷和羥基積雪草苷的分離，但該方法制備規(guī)模較小，所得產(chǎn)品質(zhì)量只能達(dá)到毫克級，而且不能分離羥基積雪草苷和積雪草苷_B。 專利US 2006/0106206A1報(bào)道了一種制取羥基積雪草苷的方法，但它所獲得的羥基積雪草苷的純度只有81%，且回收率低，消耗大量溶劑，無法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。公開號為CN101182346A的中國專利申請報(bào)道了一種用硅膠柱分離羥基積雪草苷和積雪草苷-B的方法，所得產(chǎn)品純度只能在95 %左右，且操作步驟比較繁瑣。 模擬移動床色譜(Simulated moving bed chromatography, SMBC)具有分離會g力強(qiáng)，設(shè)備結(jié)構(gòu)小，便于自動控制，并特別有利于分離熱敏性高及難以分離物系等優(yōu)點(diǎn)，適用于進(jìn)行連續(xù)性大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，它的引入能夠在保證分離純度和收率的前提下大大提高生產(chǎn)的自動化水平和生產(chǎn)效率，并且使得生產(chǎn)環(huán)境得到非常大的改善。90年代以來，SMBC技術(shù)開始應(yīng)用于精細(xì)化工和藥物尤其是手性藥物的分離。由于積雪草總苷中各成分性質(zhì)的
3復(fù)雜性和特殊性，目前尚未見到有關(guān)模擬移動床色譜分離純化積雪草總苷中各活性成分的 報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種分離積雪草苷-B、羥基積雪草苷和積雪草苷的方法，針對積雪 草總苷中復(fù)雜的活性成分，采用模擬移動床色譜，結(jié)合合適的流動相分離得到高純度的積 雪草苷-B.羥基積雪草苷和積雪草苷單體。 —種分離積雪草苷-B.羥基積雪草苷和積雪草苷的方法，包括步驟
(1)將含積雪草總苷的原料溶于甲醇水溶液中配制原料液，將原料液通入模擬移 動床色譜系統(tǒng)，以甲醇水溶液為流動相進(jìn)行洗脫，將提取液蒸除溶劑后得到積雪草苷，提余 液蒸除溶劑后得到一次固體料； (2)將一次固體料溶于含乙腈和甲基叔丁基醚的水溶液中配制一次料液，將一次
料液通入模擬移動床色譜系統(tǒng)，以含乙腈和甲基叔丁基醚的水溶液為流動相進(jìn)行洗脫，將
提取液蒸除溶劑后得到羥基積雪草苷，提余液蒸除溶劑后得到二次固體料； (3)將二次固體料溶于甲醇水溶液中配制二次料液，將二次料液通入模擬移動床
色譜系統(tǒng)，以甲醇水溶液為流動相進(jìn)行洗脫，將提取液蒸除溶劑后得到積雪草苷_B。 積雪草總苷中含積雪草苷-B.羥基積雪草苷和積雪草苷三種活性成分。其中羥基
積雪草苷和積雪草苷-B是一對同分異構(gòu)體，它們比積雪草苷多一個(gè)羥基連接在母環(huán)上，而
強(qiáng)極性糖元的連接又大大地弱化了這種極性的微小差異，所以采用吸附分離方法時(shí)，很難
用一般的固定相來實(shí)現(xiàn)這三種物質(zhì)的完全分離。因此本發(fā)明所述的模擬移動床色譜系統(tǒng)中
色譜柱的固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠，固定相的粒徑越小越有利于分離，為了保證分
離度，優(yōu)選粒徑為5iim 100iim的固定相。 當(dāng)使用十八烷基鍵合硅膠作為固定相時(shí)，極性大的物質(zhì)先出峰，極性小的物質(zhì)后 出峰。根據(jù)所要分離物質(zhì)的性質(zhì)分析，積雪草總苷中各組分出峰的先后順序是積雪草苷-B、 羥基積雪草苷、積雪草苷。而雜質(zhì)基本聚集在積雪草苷-B之前出峰，所以根據(jù)出峰時(shí)間的 先后可以逐步分離出積雪草苷、羥基積雪草苷和積雪草苷-B。同時(shí)，單柱試驗(yàn)結(jié)果表明，流 動相對色譜分離過程也有很大影響。如圖l所示，當(dāng)以甲醇水溶液為流動相時(shí)，積雪草苷-B 和羥基積雪草苷的色譜峰完全重疊，但與積雪草苷能完全分離。當(dāng)以含乙腈和甲基叔丁基 醚的水溶液為流動相時(shí)，能部分分離積雪草苷-B和羥基積雪草苷，見圖2。分離積雪草苷和 羥基積雪草苷后的物料中只含有積雪草苷-B和雜質(zhì)，此時(shí)，就可以再用甲醇水溶液為流動 相將積雪草苷-B和雜質(zhì)進(jìn)行分離，見圖3。 步驟(1)流動相中甲醇比例越高，出峰越快，而分離度降低，綜合考慮分離時(shí)間和
分離效果，所述的甲醇水溶液中甲醇與水的體積比優(yōu)選為50 : 50 80 : 20。。 步驟(2)中，流動相中乙腈比例越高，出峰越快，而分離度降低，綜合考慮分離時(shí)
間和分離效果，所述的含乙腈和甲基叔丁基醚的水溶液中水、乙腈與甲基叔丁基醚的體積
比優(yōu)選為70 : 30 : 2 80 : 20 : 2。 步驟(3)中，流動相中甲醇比例越高，出峰越快，而分離度降低，綜合考慮分離時(shí) 間和分離效果，所述的甲醇水溶液中甲醇與水的體積比優(yōu)選為50 : 50 70 : 30。
為了避免色譜柱過載，保證所得產(chǎn)品的純度，所述的原料液中原料的濃度優(yōu)選為lmg/mL 300mg/mL，所述的一次料液中一次固體料的濃度優(yōu)選為lmg/mL 300mg/mL，所述 的二次料液中二次固體料的濃度優(yōu)選為lmg/mL 300mg/mL。 所述的模擬移動床色譜(簡稱SMBC)系統(tǒng)中色譜柱的總數(shù)量一般為4根 32根， 每區(qū)色譜柱的數(shù)量為1根 8根，增加色譜柱的數(shù)量有利于提高產(chǎn)品的純度，隨著柱子數(shù)目 的增加，切換時(shí)間將縮短，而頻繁的切換將降低整個(gè)操作系統(tǒng)的使用壽命，所以優(yōu)選色譜柱 的總數(shù)量為8根 16根，每區(qū)色譜柱的數(shù)量為2根 4根。 所述的模擬移動床色譜系統(tǒng)的操作溫度為10°C 6(TC，操作溫度過高，物質(zhì)在固 定相和流動相之間傳質(zhì)加快，使得物質(zhì)出峰變快，而分離效果變差，綜合考慮優(yōu)選30°C 50°C。 為了提高色譜柱的生產(chǎn)能力，最好選用積雪草總苷的質(zhì)量百分含量為70% 100%的原料。 采用本發(fā)明的分離方法，結(jié)合合適的模擬移動床操作條件，可以使步驟(1)中的 提取液中只含最強(qiáng)吸附組分積雪草苷，使步驟(2)中的提取液中只含最強(qiáng)吸附組分羥基積 雪草苷，使步驟(3)中的提取液中只含最強(qiáng)吸附組分積雪草苷-B，實(shí)現(xiàn)積雪草苷-B、羥基積 雪草苷和積雪草苷的最大程度的完全分離。 通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)分析，步驟(1)中優(yōu)選的模擬移動床操作條件為進(jìn)樣液流量為 0. 5ml/min 2ml/min，洗脫液流量為0. 8ml/min 3. 5ml/min，提余液流量為0. 70m1/ min 2. 5ml/min，提取液流量為0. 6ml/min 2. 8ml/min，切換時(shí)間為80s 420s。
步驟(2)中優(yōu)選的模擬移動床操作條件為進(jìn)樣液流量為lml/min 2ml/min，洗 脫液流量為3ml/min 16ml/min，提余液流量為2ml/min 9ml/min，提取液流量為2ml/ min 8. 5ml/min，切換時(shí)間為60s 100s。 步驟(3)中優(yōu)選的模擬移動床操作條件為進(jìn)樣液流量為lml/min 4ml/min，洗 脫液流量為2. Oml/min 15. Oml/min，提余液流量為2ml/min 9ml/min，提取液流量為 2ml/min 9ml/min，切換時(shí)間為90s 470s。
本發(fā)明具有如下有益效果 本發(fā)明采用三步分離法，第一步以甲醇水溶液作為流動相，利用出峰時(shí)間不同將 積雪草苷單體與其它組分進(jìn)行分離，第二步以含乙腈和甲基叔丁基醚的水溶液作為流動相
將羥基積雪草苷單體與其它組分進(jìn)行分離，第三步以甲醇水溶液作為流動相將積雪草苷-B 單體與其它組分進(jìn)行分離，各步提取液蒸除溶劑后即可得到純度高于98%的單體，無需進(jìn) 行后處理，節(jié)約成本和資源，分離得到的積雪草苷-B.羥基積雪草苷和積雪草苷單體的收率 也均高于98%。 本發(fā)明方法自動化程度高、操作簡單、生產(chǎn)連續(xù)、生產(chǎn)效率高、固定相和溶劑消耗 低，且產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，整個(gè)過程不涉及化學(xué)反應(yīng)，綠色環(huán)保，適于工業(yè)化生產(chǎn)。 圖1為步驟(1)中使用甲醇水溶液(其中甲醇水=60 : 40， v/v)作為流動相 的單柱實(shí)驗(yàn)結(jié)果，圖中前20min都是雜質(zhì)峰，峰1是積雪草甘-B和羥基積雪草苷的重疊峰， 峰2是積雪草苷； 圖2為步驟(2)中使用含乙腈與甲基叔丁基醚的水溶液(水乙腈甲基叔丁基
醚=80 : 20 : 2， v/v)作為流動相的單柱實(shí)驗(yàn)結(jié)果，圖中前36min都是雜質(zhì)峰，峰l為積 雪草苷-B，峰2為羥基積雪草苷； 圖3為步驟(3)中使用甲醇水溶液(甲醇水=50 : 50)作為流動相的單柱實(shí)
驗(yàn)結(jié)果，圖中前48min都是雜質(zhì)峰，峰1為積雪草苷_B。 圖4為本發(fā)明所用的模擬移動床色譜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明針對不同含量的積雪草總苷原料，在不同的操作條件下，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn) 證。以下實(shí)施例中均采用圖4所示的模擬移動床系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括進(jìn)樣泵、洗脫液泵、 提取泵、提余泵、旋轉(zhuǎn)閥和色譜柱。SMBC系統(tǒng)有4個(gè)區(qū)，每個(gè)區(qū)一般可設(shè)置1根 8根 色譜柱，整個(gè)模擬移動床色譜系統(tǒng)中色譜柱的總數(shù)量一般為4根 32根。其工作原理 為進(jìn)料液從2區(qū)和3區(qū)之間注入，洗脫液從4區(qū)和1區(qū)之間注入，弱吸附組分(即提余 液)在3區(qū)和4區(qū)之間收集，強(qiáng)吸附組分(即提取液)在1區(qū)和2區(qū)之間收集。每隔一 定時(shí)間，進(jìn)樣液入口 、洗脫液入口 、提取液出口和提余液出口同時(shí)沿流動相流動方向切換 至下一根色譜柱出口，如圖4虛線箭頭所指位置。用HPLC法(邢華斌，蘇寶根，楊亦文， 呂秀陽，任其龍，Separation anddetermination of asiaticoside， asiaticoside-B and madecassoside in Centellaasiatica total triterpenoid saponins by HP1X. Journal of LiquidChromatography&Related Technologies, 2009， 32 (13) :1891-1900.)分析提余 液和提取液的組成。 根據(jù)圖l所示的單柱試驗(yàn)結(jié)果，在步驟(1)中選擇合適的模擬移動床操作條件，使
提取液中只含有最強(qiáng)吸附組分積雪草苷，其它弱吸附組分則全部作為提余液。 根據(jù)圖2所示的單柱試驗(yàn)結(jié)果，在步驟(2)中選擇合適的模擬移動床操作條件，使
提取液中只含有最強(qiáng)吸附組分羥基積雪草苷，其它弱吸附組分則全部作為提余液。 根據(jù)圖3所示的單柱試驗(yàn)結(jié)果，在步驟(3)中選擇合適的模擬移動床操作條件，使
提取液中只含有最強(qiáng)吸附組分積雪草苷-B，其它弱吸附組分則全部作為提余液。 實(shí)施例1 模擬移動床色譜系統(tǒng)CSEP⑧916 (德國諾爾制造)，裝配4根ID lcmX 15cm的色 譜柱，每區(qū)l根，色譜柱內(nèi)裝填的固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠，粒徑5iim。流動相(即 洗脫液)為甲醇水溶液，其中甲醇與水的體積比為70 : 30，操作溫度3(TC。
原料中積雪草總苷的質(zhì)量百分含量為70. 1X，其中積雪草苷-B的質(zhì)量百分含量 為17. 9%，羥基積雪草苷的質(zhì)量百分含量為25. 5%，積雪草苷的質(zhì)量百分含量為26. 7% 。
將含積雪草總苷的原料用流動相配制成50mg/ml的進(jìn)樣溶液。 a、操作條件
進(jìn)樣液流量UF = 0. 50ml/min 洗脫液流量UD = 0. 88ml/min 提余液流量UR = 0. 70ml/min 提取液流量UE = 0. 68ml/min
切換時(shí)間ts = 87s ;
b、成品分析
6
用HPLC分析提余液和提取液的組成，提取液中積雪草苷純度為98.95X，積雪草 苷收率為99. 02%，每生產(chǎn)lg積雪草苷消耗1. 389L流動相。
實(shí)施例2 模擬移動床色譜系統(tǒng)CSEP⑧916(德國諾爾制造)，裝配16根ID lcmX15cm的 色譜柱，每區(qū)4根，色譜柱內(nèi)裝填的固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠，粒徑50 ii m。流動相 (即洗脫液)為甲醇水溶液，其中甲醇與水的體積比為60 : 40，操作溫度40°C 。
原料中積雪草總苷的質(zhì)量百分含量為83. 3X，其中積雪草苷-B的質(zhì)量百分含量 為21. 3%，羥基積雪草苷的質(zhì)量百分含量為30. 6%，積雪草苷的質(zhì)量百分含量為31.4%。
將含積雪草總苷的原料用流動相配制成300mg/ml的進(jìn)樣溶液。 a、操作條件
進(jìn)樣液流量UF = 1. 00ml/min 洗脫液流量UD = 1. 71ml/min 提余液流量UR = 1. 28ml/min 提取液流量UE = 1. 43ml/min 切換時(shí)間ts = 146s ;
b、成品分析
用HPLC分析提余液和提取液組成，提取液中積雪草苷純度為99. 85%，積雪草苷 收率為98. 75%，每生產(chǎn)lg積雪草苷消耗1. 357L流動相。
實(shí)施例3 模擬移動床色譜系統(tǒng)CSEP⑧916(德國諾爾制造)，裝配24根ID lcmX15cm的 色譜柱，每區(qū)6根，色譜柱內(nèi)裝填的固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠，粒徑100iim。流動相 (即洗脫液)為甲醇水溶液，其中甲醇與水的體積比為50 : 50，操作溫度6(TC。
原料中積雪草總苷的質(zhì)量百分含量為97. 2X，其中積雪草苷-B的質(zhì)量百分含量 為26. 3%，羥基積雪草苷的質(zhì)量百分含量為34. 2%，積雪草苷的質(zhì)量百分含量為36. 7% 。
將含積雪草總苷的原料用流動相配制成150mg/ml的進(jìn)樣溶液。 a、操作條件
進(jìn)樣液流量UF = 2. 00ml/min 洗脫液流量UD = 3. 25ml/min 提余液流量UR = 2. 50ml/min 提取液流量UE = 2. 75ml/min 切換時(shí)間ts = 418s ;
b、成品分析
用HPLC分析提余液和提取液組成，提取液中積雪草苷純度為99. 89%，積雪草苷 收率為99. 20%，每生產(chǎn)lg積雪草苷消耗1. 31L流動相。
實(shí)施例4 模擬移動床色譜系統(tǒng)CSEP⑧916 (德國諾爾制造)，裝配8根ID lcmX 15cm的色 譜柱，每區(qū)2根，色譜柱內(nèi)裝填的固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠，粒徑20iim。流動相(即 洗脫液)為甲醇水溶液，其中甲醇與水的體積比為80 : 20，操作溫度20°C 。
原料中積雪草總苷的質(zhì)量百分含量為99. 7X，其中積雪草苷-B的質(zhì)量百分含量
7為27. 2%，羥基積雪草苷的質(zhì)量百分含量為35. 0%，積雪草苷的質(zhì)量百分含量為37. 5%,
將含積雪草總苷的原料用流動相配制成10mg/ml的進(jìn)樣溶液。 a、操作條件
進(jìn)樣液流量UF = 1. OOml/min 洗脫液流量UD = 1. 54ml/min 提余液流量UR = 1. 09ml/min 提取液流量UE = 1. 45ml/min 切換時(shí)間ts = 85s ;
b、成品分析
用HPLC分析提余液和提取液組成，提取液中積雪草苷純度為99. 82%，積雪草苷 收率為99. 30%，每生產(chǎn)lg積雪草苷消耗1. 39L流動相。
實(shí)施例5 模擬移動床色譜系統(tǒng)CSEP⑧916(德國諾爾制造)，裝配16根ID lcmX15cm的 色譜柱，每區(qū)4根，色譜柱內(nèi)裝填的固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠，粒徑10 ii m。流動相 (即洗脫液)為含乙腈和甲基叔丁基醚的水溶液，其中水、乙腈與甲基叔丁基醚的體積比為 80 : 20 : 2，操作溫度20。C。 合并實(shí)施例1和實(shí)施例2中的提余液，蒸除溶劑至干，得一次固體料，其中積雪草 苷-B的質(zhì)量百分含量為27. 6%、羥基積雪草苷的質(zhì)量百分含量為39. 6%，雜質(zhì)的質(zhì)量百分 含量為32. 8%。 取一次固體料用流動相配成200mg/ml的進(jìn)樣溶液。 a、操作條件
進(jìn)樣液流量UF = 1. OOml/min 洗脫液流量UD = 3. 39ml/min 提余液流量UR = 2. 12ml/min 提取液流量UE = 2. 27ml/min 切換時(shí)間ts = 88s ;
b、成品分析
用HPLC分析提余液和提取液組成，提取液中羥基積雪草苷純度為99. 10%，羥基 積雪草苷收率為98. 11%，每生產(chǎn)lg羥基積雪草苷消耗3. 39L流動相。
實(shí)施例6 模擬移動床色譜系統(tǒng)CSEP⑧916(德國諾爾制造)，裝配24根ID lcmX15cm的 色譜柱，每區(qū)6根，色譜柱內(nèi)裝填的固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠，粒徑50 ii m。流動相 (即洗脫液)為含乙腈和甲基叔丁基醚的水溶液，其中水、乙腈與甲基叔丁基醚的體積比為 80 : 20 : 2，操作溫度1(TC。 合并實(shí)施例3和實(shí)施例4中的提余液，蒸除溶劑至干，得一次固體料，其中積雪草 苷-B的質(zhì)量百分含量為42. 5%、羥基積雪草苷的質(zhì)量百分含量為55. 0%，雜質(zhì)的質(zhì)量百分 含量為2.5%。 取一次固體料用流動相配成50mg/ml的進(jìn)樣溶液。
a、操作條件
8
進(jìn)樣液流量UF = 2. 00ml/min
洗脫液流量UD = 8. OOml/min
提余液流量UR = 4. 27ml/min
提取液流量UE = 5. 73ml/min
切換時(shí)間ts = 68s ;
b、成品分析 用HPLC分析提余液和提取液組成。提取液中羥基積雪草苷純度為99. 72%，羥基 積雪草苷收率為99. 38%，每生產(chǎn)lg羥基積雪草苷消耗5. 19L流動相。
實(shí)施例7 模擬移動床色譜系統(tǒng)CSEP⑧916(德國諾爾制造)，裝配32根ID lcmX15cm的 色譜柱，每區(qū)8根，色譜柱內(nèi)裝填的固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠，粒徑100 ym。流動相 (即洗脫液)為含乙腈和甲基叔丁基醚的水溶液，其中水、乙腈與甲基叔丁基醚的體積比為
70 : 30 : 2，操作溫度35t:。 合并實(shí)施例3和實(shí)施例4中的提余液，蒸除溶劑至干，得一次固體料，其中積雪草 苷-B的質(zhì)量百分含量為42. 5%、羥基積雪草苷的質(zhì)量百分含量為55. 0%，雜質(zhì)的質(zhì)量百分 含量為2.5%。取一次固體料用流動相配成20mg/ml的進(jìn)樣溶液。 a、操作條件
進(jìn)樣液流量UF = 1. OOml/min 洗脫液流量UD = 6. OOml/min 提余液流量UR = 3. 40ml/min 提取液流量UE = 3. 60ml/min 切換時(shí)間ts = 70s ;
b、成品分析
用HPLC分析提余液和提取液組成，提取液中羥基積雪草苷純度為99. 83%，羥基 積雪草苷收率為98. 87%，每生產(chǎn)lg羥基積雪草苷消耗3. 50L流動相。
實(shí)施例8 模擬移動床色譜系統(tǒng)CSEP⑧916(德國諾爾制造)，裝配16根ID lcmX15cm的 色譜柱，每區(qū)4根，色譜柱內(nèi)裝填的固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠，粒徑20 ii m。流動相 (即洗脫液)為含乙腈和甲基叔丁基醚的水溶液，其中水、乙腈與甲基叔丁基醚的體積比為 75 : 25 : 2，操作溫度5(TC。 合并實(shí)施例1和實(shí)施例2中的提余液，蒸除溶劑至干，得一次固體料，其中積雪草 苷-B的質(zhì)量百分含量為27. 6%、羥基積雪草苷的質(zhì)量百分含量為39. 6%，雜質(zhì)的質(zhì)量百分 含量為32. 8%。 取一次固體料用流動相配成50mg/ml的進(jìn)樣溶液。 a、操作條件進(jìn)樣液流量UF = 2. OOml/min 洗脫液流量UD = 15. 38ml/min 提余液流量UR = 8. 92ml/min0128] 提取液流量UE = 8. 46ml/min 0129] 切換時(shí)間ts = 97s ; 0130] b、成品分析
0131] 用HPLC分析提余液和提取液組成。提取液中羥基積雪草苷純度為98. 84%，羥基 積雪草苷收率為98. 51 % ，每生產(chǎn)lg羥基積雪草苷消耗4. 09L流動相。 0132] 實(shí)施例9
0133] 模擬移動床色譜系統(tǒng)CSEP⑧916(德國諾爾制造)，裝配16根ID lcmX15cm的 色譜柱，每區(qū)4根，色譜柱內(nèi)裝填的固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠，粒徑10 i！ m。流動相 即洗脫液)為甲醇水溶液，其中甲醇與水的體積比為70 : 30，操作溫度30°C 。 0134] 合并實(shí)施例5、實(shí)施例6、實(shí)施例7和實(shí)施例8中的提余液，蒸除溶劑至干，得二次 固體料，其中積雪草苷-B的質(zhì)量百分含量為66. 5%，雜質(zhì)的質(zhì)量百分含量為33. 5%。 0135] 取二次固體料用流動相配成50mg/ml的進(jìn)樣溶液。 a、操作條件
進(jìn)樣液流量UF = 2. 00ml/min 洗脫液流量UD = 2. 95ml/min 提余液流量UR = 2. 28ml/min 提取液流量UE = 2. 67ml/min 切換時(shí)間ts = 156s ;
0136] 0137] 0138] 0139] 0140] 0141] 0142] 0143]
b、成品分析
用HPLC分析提余液和提取液組成。提取液中積雪草苷-B純度為98. 75% ，積雪草 苷-B收率為98. 90%，每生產(chǎn)lg積雪草苷-B消耗1.281L流動相。 0144] 實(shí)施例10
0145] 模擬移動床色譜系統(tǒng)CSEP⑧916(德國諾爾制造)，裝配24根ID lcmX15cm的 色譜柱，每區(qū)6根，色譜柱內(nèi)裝填的固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠，粒徑20 ii m。流動相 即洗脫液)為甲醇水溶液，其中甲醇與水的體積比為60 : 40，操作溫度40°C 。 0146] 合并實(shí)施例5、實(shí)施例6、實(shí)施例7和實(shí)施例8中的提余液，蒸除溶劑至干，得二次 固體料，其中積雪草苷-B的質(zhì)量百分含量為66. 5%，雜質(zhì)的質(zhì)量百分含量為33. 5%。 0147] 取二次固體料用流動相配成100mg/ml的進(jìn)樣溶液。 a、操作條件
進(jìn)樣液流量UF = 2. 00ml/min 洗脫液流量UD = 2. 71ml/min 提余液流量UR = 2. 24ml/min 提取液流量UE = 2. 47ml/min 切換時(shí)間ts = 178s ;
0148] 0149] 0150] 0151] 0152] 0153] 0154] 0155]
b、成品分析
用HPLC分析提余液和提取液組成。提取液中積雪草苷-B純度為99. 00% ，積雪草 苷-B收率為98. 20%，每生產(chǎn)lg積雪草苷-B消耗1.389L流動相。 0156] 實(shí)施例11
0157] 模擬移動床色譜系統(tǒng)CSEP⑧916(德國諾爾制造)，裝配8根ID lcmX15cm的色譜柱，每區(qū)2根，色譜柱內(nèi)裝填的固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠，粒徑50iim。流動相(即
洗脫液)為甲醇水溶液，其中甲醇與水的體積比為50 : 50，操作溫度5(TC。 合并實(shí)施例5、實(shí)施例6、實(shí)施例7和實(shí)施例8中的提余液，蒸除溶劑至干，得二次
固體料，其中積雪草苷-B的質(zhì)量百分含量為66. 5%，雜質(zhì)的質(zhì)量百分含量為33. 5%。 取二次固體料用流動相配成150mg/ml的進(jìn)樣溶液。 a、操作條件 進(jìn)樣液流量UF = 2. 00ml/min 洗脫液流量UD = 2. 89ml/min 提余液流量UR = 2. 22ml/min 提取液流量UE = 2. 67ml/min 切換時(shí)間ts = 470s ; b、成品分析 用HPLC分析提余液和提取液組成t
苷-B收率為99. 40 % ，每生產(chǎn)lg積雪草苷
提取液中積雪草苷-B純度為98. 25 % ，積雪草 -B消耗1.222L流動相。
權(quán)利要求
一種分離積雪草苷-B、羥基積雪草苷和積雪草苷的方法，其特征在于，包括步驟(1)將含積雪草總苷的原料溶于甲醇水溶液中配制原料液，將原料液通入模擬移動床色譜系統(tǒng)，以甲醇水溶液為流動相進(jìn)行洗脫，提取液蒸除溶劑后得到積雪草苷，提余液蒸除溶劑后得到一次固體料；(2)將一次固體料溶于含乙腈和甲基叔丁基醚的水溶液中配制一次料液，將一次料液通入模擬移動床色譜系統(tǒng)，以含乙腈和甲基叔丁基醚的水溶液為流動相進(jìn)行洗脫，提取液蒸除溶劑后得到羥基積雪草苷，提余液蒸除溶劑后得到二次固體料；(3)將二次固體料溶于甲醇水溶液中配制二次料液，將二次料液通入模擬移動床色譜系統(tǒng)，以甲醇水溶液為流動相進(jìn)行洗脫，提取液蒸除溶劑后得到積雪草苷-B；其中，所述的模擬移動床色譜系統(tǒng)中色譜柱的固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離積雪草苷-B.羥基積雪草苷和積雪草苷的方法，其特征在于，步驟(l)中，所述的甲醇水溶液中甲醇與水的體積比為50 : 50 80 : 20。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離積雪草苷-B.羥基積雪草苷和積雪草苷的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的原料液中原料的濃度為lmg/mL 300mg/mL。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離積雪草苷-B、羥基積雪草苷和積雪草苷的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的含乙腈和甲基叔丁基醚的水溶液中水、乙腈與甲基叔丁基醚的體積比為70 : 30 : 2 80 : 20 : 2。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離積雪草苷-B.羥基積雪草苷和積雪草苷的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的一次料液中一次固體料的濃度為lmg/mL 300mg/mL。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離積雪草苷-B.羥基積雪草苷和積雪草苷的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述的甲醇水溶液中甲醇與水的體積比為50 : 50 70 : 30。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離積雪草苷-B.羥基積雪草苷和積雪草苷的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述的二次料液中二次固體料的濃度為lmg/mL 300mg/mL。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離積雪草苷-B、羥基積雪草苷和積雪草苷的方法，其特征在于，所述的模擬移動床色譜系統(tǒng)中色譜柱的總數(shù)量為4根 32根，每區(qū)色譜柱的數(shù)量為1根 8根。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離積雪草苷-B.羥基積雪草苷和積雪草苷的方法，其特征在于，所述的模擬移動床色譜系統(tǒng)的操作溫度為10°C 60°C。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離積雪草苷-B、羥基積雪草苷和積雪草苷的方法，其特征在于，所述的固定相的粒徑為5iim 100iim。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分離積雪草苷-B、羥基積雪草苷和積雪草苷的方法，包括將原料溶于甲醇水溶液后通入模擬移動床色譜系統(tǒng)，用甲醇水溶液洗脫得到積雪草苷，提余液蒸除溶劑后得到一次固體料；將一次固體料溶于含乙腈和甲基叔丁基醚的水溶液后通入模擬移動床色譜系統(tǒng)，用含乙腈和甲基叔丁基醚的水溶液洗脫得到羥基積雪草苷，提余液蒸除溶劑后得到二次固體料；將二次固體料溶于甲醇水溶液后通入模擬移動床色譜系統(tǒng)，用甲醇水溶液洗脫得到積雪草苷-B。該方法自動化程度高、操作簡單、生產(chǎn)連續(xù)、生產(chǎn)效率高、固定相和溶劑消耗低，且產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，整個(gè)過程不涉及化學(xué)反應(yīng)，綠色環(huán)保，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C07J63/00GK101724006SQ200910157109
公開日2010年6月9日 申請日期2009年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日
發(fā)明者任其龍, 楊亦文, 王陽陽, 蘇云, 蘇寶根, 邢華斌, 鮑宗必 申請人:浙江大學(xué)