專利名稱：一種他克莫司粗品的精制方法
技術領域：
本發明屬于醫藥生物技術領域，具體涉及一種大環內酯類強效免疫抑制劑他克莫
司的精制方法，特別涉及通過反相高效液相制備色譜精制他克莫司的方法。
背景技術：
近十多年來，我國器官移植發展迅速，已躍居亞洲首位，世界第二。用于器官移植
后減少排異反應的免疫抑制劑類藥物也呈現快速增長的趨勢，普遍用于預防、抑制排斥的
免疫抑制劑是環孢菌素，但是其副作用大，給廣大患者帶來了一定的痛苦。 他克莫司(Tacrolimus)又名FK-506，是由日本藤澤制藥公司于1984年是從土壤
放線菌中提取的一種大環內酯類抗生素，具有較強的免疫抑制特性，預防各種器官移植所
出現的排斥反應的效果明顯優于環孢菌素。他克莫司能減少肝腎移植受體的急、慢性排斥
反應。他克莫司的患者，細菌和病毒感染率也較環孢菌素治療者低，尤其是該藥品有較強的
親肝性，對肝移植的功效比環孢菌素高100倍，因而大大降低了臨床使用劑量，可降低原治
療費用1/3 1/2。他克莫司和環孢菌素合用具有明顯的協同作用，效果更好。他克莫司不
僅可用于防止免疫反應的發生，還可用于治療已發生的免疫反應及自身免疫性疾病，如特
應性皮炎、風濕、類風濕性關節炎等，因此對防止器官移植的免疫反應和自身免疫性疾病的
治療具有重要意義。 由于他克莫司結構復雜，手性基團比較多，而且其發酵液中有很多異構體和類 似物，如二氫他克莫司、子囊霉素等，這些物質的存在使得他克莫司采用常規的分離純 化方法無法完全分離而達到相應的純度。關于他克莫司分離純化的文獻，主要是美國 專利U. S. 4， 894366， U. S. 6， 576， 135， U. S. 6， 881， 341， U. S. 7， 220， 357， W02005/010015， W0/2006/031664。這些專利報道了用吸附樹脂或改性硅膠來精制他克莫司，純化收率低，導 致工業化生產以后產品的成本很高，給患者造成沉重的負擔。
發明內容
本發明的目的在于提出一種他克莫司的精制方法，克服了他克莫司現有的提取技 術的不足，提高了他克莫司的收率，降低了成本，從而提供一種穩定性好，分離效果顯著，上 樣量較大，能夠實現工業化的純化方法。 為了達到上述精細分離，保證一次分離純度在98.5%以上并保證收率，本發明采 用制備色譜法純化法。本發明在篩選多種色譜材料和優化色譜條件的基礎上，確定了制備 色譜柱及色譜條件，并通過優化工藝路線，得到了如下一種他克莫司粗品的精制方法
1)室溫條件下，用有機溶劑與水的混和溶液溶解他克莫司粗品；
2)采用反相液相制備色譜進行分離純化； 3)合并收集液，減壓濃縮，有機溶劑萃取，濃縮萃取液，重結晶，即得產品。 優選地，步驟1)所述有機溶劑為乙腈_水、乙腈_四氫呋喃_水、甲醇_乙腈_水
或異丙醇_水；進一步優選地，步驟1)所述有機溶劑水溶液的濃度為60-85%;進一步優選
3地，步驟1)所述有機溶劑水溶液的濃度為80-85%。 為了得到更好的分離效果，在反相液相制備色譜分離前可以對他克莫司粗品溶液 進行微濾膜過濾，微濾膜的孔徑為0. 45 ii m。
優選地，上述步驟2)的色譜條件為 制備色譜柱C18反相色譜柱，內徑10-50mm，長度250-300mm ; 流動相選自以下中的任意一種乙腈_水、乙腈_四氫呋喃_水、甲醇_乙腈_水
或異丙醇_水； 洗脫方式梯度洗脫；
流速20-50mL/min ;
柱溫20-40。C;
最佳的檢測波長為230nm。 如果制備色譜的流動相選擇乙睛_水，則洗脫時用乙睛_水(75 : 25)洗脫2-3 個柱體積，再用乙睛-水(60 : 40)洗脫2-3個柱體積，再用乙睛-水(55 : 45)洗脫3_5 個柱體積，最后用乙睛-水(45 : 55)洗脫5-6個柱體積； 如果制備色譜的流動相選擇乙腈_四氫呋喃_水，則洗脫時用乙腈_四氫呋喃_水 (40 : 40 : 20)洗脫2-3個柱體積，再用乙腈-四氫呋喃-水(30 : 35 : 35)洗脫2-3個 柱體積，再用乙腈-四氫呋喃-水(25 : 30 : 45)洗脫2-3個柱體積，最后用乙腈-四氫 呋喃_水(25 : 25 : 50)洗脫5-6個柱體積； 如果制備色譜的流動相選擇甲醇-乙腈-水，則洗脫時用甲醇_乙腈-水 (40 : 45 : 15)洗脫2-3個柱體積，再用甲醇-乙腈-水(35 : 40 : 25)洗脫2-3個柱 體積，再用甲醇-乙腈-水(30 : 40 : 30)洗脫2-3個柱體積，最后用甲醇-乙腈-水 (30 : 30 : 40)洗脫6-8個柱體積。 如果制備色譜的流動相選擇異丙醇-水，則洗脫時用異丙醇-水(70 : 30)洗脫 2-3個柱體積，再用異丙醇-水(60 : 40)洗脫2-3個柱體積，再用異丙醇-水(50 : 50) 洗脫2-3個柱體積，然再用異丙醇-水(40 : 60)洗脫2-3個柱體積，最后用異丙醇-水 (35 : 65)洗脫6-8個柱體積。 優選地，步驟3)所述有機溶劑優選為乙酸乙酯或乙酸丁酯。 另外，步驟3)重結晶時在濃縮后的萃取液中緩慢加入環己烷至有少量晶體析出， 然后將溶液置于1 l(TC繼續析晶；優選4t:析晶。 本發明所述的他克莫司粗品來自于生物發酵后提取分離所得的他克莫司粗品，尤 其來自于鏈霉菌菌株發酵提取得到的粗品。 本發明與現有的分離技術相比，有以下的優點和效果 1、解決了他克莫司與子囊霉素，二氫他克莫司的分離難題，在制備色譜條件下，三 者可實現完全分離； 2、上樣量較大，在實現完全分離的條件下，一次上樣量可高達200mg ;
3、制備的他克莫司純度高，獲得他克莫司用HPLC檢測純度達98. 5%以上。
具體實施例方式
以下結合實施例進一步闡述本發明，應理解實施例并非用于限制本發明的保護范圍 實施例使用的分析純試劑有乙酸乙酯、環己烷、異丙醇、甲醇、乙醇、乙醚、正己烷；色譜純試劑有乙睛、四氫呋喃(進口分裝)；高壓液相色譜儀和色譜柱(20X250mm)由大連依利特公司生產。
實例1 : 稱取10g他克莫司粗品，溶解于50mL的乙腈-水(60 : 40)，然后用0. 45 y m的濾膜過濾。流動相為乙腈_水，流速為20mL/min，柱溫25°C ，色譜儀用乙睛_水(75 : 25)平衡基線后，進樣lmL，先以乙睛-水(75 : 25)洗脫2-3個柱體積，然后用乙睛-水(60 : 40)洗脫2-3個柱體積，然后用乙睛-水(55 : 45)洗脫3-5個柱體積，最后用乙睛-水(45 : 55)洗脫5-6個柱體積，根據出峰情況收集含有高純度他克莫司的洗脫液。
合并收集液進行減壓濃縮，直到無乙腈為止，濃縮液用乙酸乙酯萃取兩次，萃取后的乙酸乙酯層減壓濃縮至原體積的四分之一，然后在濃縮液中緩慢加入環己烷至晶體析出，放置4t:繼續析晶，過濾得到的晶體用少量環己烷洗滌后烘干，用HPLC檢測他克莫司的純度達98. 6% ， 二氫他克莫司含量0.21%，子囊霉素含量0. 28% ，收率72% 。
實例2 : 稱取10g他克莫司粗品，溶解于50mL的乙腈-四氫呋喃_水(40 : 40 : 20)，然后0. 45 ii m的濾膜過濾。流動相為乙腈-四氫呋喃_水，流速為15mL/min，柱溫25°C ，檢測波長為230nm。色譜儀用乙腈_四氫呋喃_水(40 : 40 : 20)平衡基線后，進樣lmL，先以乙腈-四氫呋喃-水(40 : 40 : 20)洗脫2-3個柱體積，然后用乙腈-四氫呋喃-水(30 : 35 : 35)洗脫2-3個柱體積，然后用乙腈-四氫呋喃-水(25 : 30 : 45)洗脫2-3個柱體積，最后用乙腈-四氫呋喃-水(25 : 25 : 50)洗脫5-6個柱體積，根據出峰情況收集、合并含有高純度他克莫司的洗脫液。 合并收集液進行減壓濃縮，直到無乙腈和四氫呋喃為止，濃縮液用乙酸乙酯萃取兩次，萃取后的乙酸乙酯層減壓濃縮至原體積的四分之一，然后在濃縮液中緩慢加入環己烷至晶體析出，放置4t:繼續析晶，過濾得到的晶體用少量環己烷洗滌后烘干，用HPLC檢測他克莫司的純度達98. 5 % ， 二氫他克莫司含量0. 24 % ，子囊霉素含量0. 34 % ，收率75 % 。
實例3 : 稱取108他克莫司粗品，溶解于501^的甲醇-乙腈-水(40 : 45 : 15)，然后0. 45 ii m的濾膜過濾。色譜儀使用流動相為甲醇_乙腈_水，流速為15mL/min，柱溫25°C ，檢測波長為230nm。色譜儀用甲醇_乙腈_水(40 : 45 : 15)平衡基線后，進樣lmL，先以甲醇_乙腈_水(40 : 45 : 15)洗脫2-3個柱體積，然后用甲醇_乙腈_水(35 : 40 : 25)洗脫2-3個柱體積，然后用甲醇-乙腈-水(30 : 40 : 30)洗脫2-3個柱體積，最后用甲醇-乙腈-水(30 : 30 : 40)洗脫6-8個柱體積，根據出峰情況收集、合并含有高純度他
克莫司的洗脫液。 合并收集液進行減壓濃縮，直到無乙腈和甲醇為止，濃縮液用乙酸丁酯萃取兩次，萃取后的乙酸丁酯層減壓濃縮至原體積的四分之一，然后在濃縮液中緩慢加入環己烷至晶體析出，放置4t:繼續析晶，過濾得到的晶體用少量正己烷洗滌后烘干，用HPLC檢測他克莫司的純度達98. 5% ， 二氫他克莫司含量0.15%，子囊霉素含量0. 25% ，收率79% 。
實例4:
稱取10g他克莫司粗品，溶解于50mL的異丙醇水(70 : 30)，然后用0. 45 y m的 膜過濾。色譜儀使用流動相為異丙醇水，流速為20mL/min，柱溫25t:，檢測波長為230nm。
色譜儀用異丙醇水(70 : 30)平衡基線后，進樣imL，先以異丙醇水(70 : 30)洗脫2-3 個柱體積，然后用異丙醇水(60 : 40)洗脫2-3個柱體積，然后用異丙醇水(50 : 50) 洗脫2-3個柱體積，然后用異丙醇水(40 : 60)洗脫2-3個柱體積，最后用異丙醇水
(35 : 65)洗脫6-8個柱體積，根據出峰情況收集、合并含有高純度他克莫司的洗脫液。
合并收集液進行減壓濃縮，直到無異丙醇為止，濃縮液用乙酸丁酯萃取兩次，萃取
后的乙酸丁酯層減壓濃縮至原體積的四分之一，然后在濃縮液中緩慢加入環己烷至晶體析
出，放置4t:繼續析晶，過濾得到的晶體用少量乙醚洗滌后烘干，用HPLC檢測他克莫司的純 度達99. 1 % ， 二氫他克莫司含量0. 26% ，子囊霉素含量0. 38% ，收率62% 。
權利要求
一種他克莫司粗品的精制方法，其特征在于，包括下列步驟1)室溫條件下，用有機溶劑與水的混和溶液溶解他克莫司粗品；2)采用反相液相制備色譜進行分離純化；3)合并收集液，減壓濃縮，有機溶劑萃取，濃縮萃取液，重結晶，即得產品。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)所述有機溶劑為甲醇、乙醇或乙腈。
3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟1)所述有機溶劑水溶液的濃度為60-85%。
4. 如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟1)所述有機溶劑水溶液的濃度為80-85%。
5. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，在反相液相制備色譜分離前對他克莫司溶液進行微濾膜過濾，微濾膜的孔徑為0. 45 ii m。
6. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)的色譜條件為制備色譜柱C18反相色譜柱，內徑10-50mm，長度250-300mm ;流動相選自以下中的任意一種乙腈-水、乙腈-四氫呋喃-水、甲醇-乙腈-水或異丙醇-水；洗脫方式梯度洗脫；流速20-50mlVmin ;柱溫20-40。C。
7. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，檢測波長為230nm。
8. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，洗脫時用乙睛-水(75 : 25)洗脫2-3個柱體積，再用乙睛-水(60 : 40)洗脫2-3個柱體積，再用乙睛-水(55 : 45)洗脫3_5個柱體積，最后用乙睛-水(45 : 55)洗脫5-6個柱體積。
9. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，洗脫時用乙腈-四氫呋喃-水(40 : 40 : 20)洗脫2-3個柱體積，再用乙腈-四氫呋喃-水(30 : 35 : 35)洗脫2-3個柱體積，再用乙腈-四氫呋喃-水(25 : 30 : 45)洗脫2-3個柱體積，最后用乙腈-四氫呋喃_水(25 : 25 : 50)洗脫5-6個柱體積。
10. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，洗脫時用甲醇-乙腈-水(40 : 45 : 15)洗脫2-3個柱體積，再用甲醇-乙腈-水(35 : 40 : 25)洗脫2-3個柱體積，再用甲醇-乙腈-水(30 : 40 : 30)洗脫2-3個柱體積，最后用甲醇-乙腈-水(30 : 30 : 40)洗脫6-8個柱體積。
11. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，洗脫時用異丙醇水(70 : 30)洗脫2-3個柱體積，再用異丙醇水(60 : 40)洗脫2-3個柱體積，再用異丙醇水(50 : 50)洗脫2-3個柱體積，然再用異丙醇水(40 : 60)洗脫2-3個柱體積，最后用異丙醇水(35 : 65)洗脫6-8個柱體積。
12. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述有機溶劑為乙酸乙酯或乙酸丁酯。
13. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)重結晶時在濃縮后的萃取液中緩慢加入環己烷至有少量晶體析出，然后將溶液置于1 l(TC繼續析晶。
全文摘要
本發明屬于醫藥生物技術領域，具體涉及一種大環內酯類強效免疫抑制劑他克莫司的精制方法，特別涉及通過反相高效液相制備色譜精制他克莫司的方法。本發明以他克莫司粗品作為原料，經過有機溶劑溶解，用C18反相制備液相色譜法實現他克莫司和子囊霉素、二氫他克莫司的分離純化。本發明的精制方法采用合適的洗脫體系，穩定性好，在制備色譜條件下，雜質可實現完全分離，一次上樣量可高達200mg，得到的他克莫司用HPLC檢測純度達98.5％以上，整個精制過程操作簡單，通用性好，易推廣，可以進行工業化生產。
文檔編號C07D498/18GK101712685SQ200910146378
公開日2010年5月26日 申請日期2009年6月22日 優先權日2009年6月22日
發明者劉忠 申請人:魯南制藥集團股份有限公司