專利名稱：一種鼠Ehf多肽及其抗體制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多肽及其抗體制備方法，這種抗體主要用于天然蛋白抗原的檢 測。
2.
背景技術(shù)：
Ehf屬于ETS蛋白家族，該蛋白作為一種轉(zhuǎn)錄激活因子調(diào)節(jié)上皮細胞的分化和增 生。它可以作為ETS/AP-1響應(yīng)基因特定亞型的抑制子。Ehf在絲裂原活化蛋白激酶(MAPK) 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。該蛋白與包含GGAA的核心序列綁定，Ehf通過TNFRSF10B/ DR5啟動子的Ets結(jié)合序列參與調(diào)節(jié)TNFRSF10B/DR5復(fù)合物的表達。經(jīng)檢索，除本發(fā)明中的抗Ehf抗體產(chǎn)品外，僅有Lifespan公司貨號為LS-C40314 的抗體為同類產(chǎn)品，但該公司未公布使用該抗體用于任何檢測的數(shù)據(jù)。有研究表明，Ehf蛋白在對前列腺上皮細胞的調(diào)控機制中發(fā)揮重要作用，可能在 前列腺癌細中起到腫瘤抑制的作用(Cangemi R, Mensah A et al. Oncogene. 2008 May 1 ； 27(20) :2877-85)。這提示我們，Ehf蛋白可能成為一個潛在的具有基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用價 值的藥物作用靶點。
3.
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種Ehf多肽，其序列為FTRAAGSAGQLLYS。用此多肽制備的抗Ehf 抗體可以在免疫印跡(Western blot)及免疫組化(IHC)分析中特異識別組織或細胞中的 天然Ehf蛋白?？笶hf抗體是通過以下步驟獲得的步驟一多肽序列的分析和設(shè)計利用DNAstar軟件對Ehf蛋白的氨基酸序列進 行抗原表位分析，主要評估親水性，抗原性，表面可能性，柔性區(qū)等指數(shù)，再結(jié)合過去制備抗 體的實際經(jīng)驗，最終確定Ehf蛋白93-106位14個氨基酸作為合成多肽氨基酸序列，序列為 FTRAAGSAGQLLYS。步驟二 多肽合成和交聯(lián)采用ACT396全自動多通道多肽合成儀合成目的多肽， 并采用質(zhì)譜進行鑒定；為增強多肽的抗原性，將Ehf多肽與載體蛋白KLH采用Sulfo-SMCC 交聯(lián)法進行交聯(lián)。步驟三多肽免疫和抗血清制備將交聯(lián)后的Ehf-KLH與弗氏佐劑混合乳化，在新 西蘭兔背部進行皮內(nèi)注射免疫，并反復(fù)加強免疫，至取血檢測抗體效價達到標準時停止免 疫。步驟四抗體純化實驗兔抗體效價達到標準后，采用心臟取血，分離抗血清，采 用ProteinA純化全抗體后，進一步采用肽親和純化，得到目標抗體?？笶hf抗體是通過以下步驟鑒定的步驟一免疫印跡將所獲得的Ehf抗體作為一抗，采用標準的免疫印跡方法，用 于檢測抗原，確認該抗體能夠與變性后的天然Ehf蛋白相互作用，可用于免疫印跡試驗。
步驟二 免疫組化將所獲得的Ehf抗體作為一抗，采用標準的免疫組化方法，用 于檢測組織，確認該抗體能夠與具有天然結(jié)構(gòu)的Ehf蛋白相互作用，可用于免疫組化試驗。
4.
圖ISWestern blot圖，圖中免疫印記的目的條帶為33kDa，與Ehf蛋白的理論分
子量一致。
圖2為IHC圖，圖中箭頭所指位置為抗體反應(yīng)的陽性信號。 5.
具體實施例方式1.多肽序列的分析和設(shè)計利用DNAstar軟件對Ehf蛋白的氨基酸序列進行抗原表位分析，主要評估親水 性，抗原性，表面可能性，柔性區(qū)等指數(shù)，再結(jié)合過去制備抗體的實際經(jīng)驗，考慮氨基酸 結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度，易氧化程度，合成難度，氨基酸類別和分布等，最終確定Ehf蛋白93-106 位14個氨基酸作為合成多肽氨基酸序列，序列為FTRAAGSAGQLLYS。同時，為保證后期多 肽交聯(lián)載體蛋白以及肽親和純化，在N末端增加一個半胱氨酸C，最終待合成多肽序列為 CFTRAAGSAGQLLYS。2.多肽合成和交聯(lián)采用ACT396全自動多通道多肽合成儀，按照編制好的程序自動合成目的多肽，將 合成后的多肽溶于50 %乙腈，采用質(zhì)譜儀進行鑒定，確認所獲得的多肽為目的多肽。采用 Sulfo-SMCC作為交聯(lián)劑將載體蛋白KLH與合成多肽進行交聯(lián)取IOmg KLH溶于0. 5ml超 純水中；取3mgsulfo-SMCC溶于0. 5ml超純水中，用3M NaOH調(diào)pH值7左右。在混勻情況 下，把sulfo-SMCC溶液逐滴緩慢加入KLH溶液中，室溫下旋轉(zhuǎn)混勻反應(yīng)物30min。將反應(yīng) 好的sulfo-SMCC/KLH混合液上樣到預(yù)先用平衡緩沖液(0. 05M PB, pH6. 0)平衡過30min 的S印hadex G25柱中，收集淺灰色洗脫液，即活化的sulfo-SMCC/KLH溶液。用200ul PBS(pH7. 3)溶解待2mg交聯(lián)多肽，把0. 2體積的sulfo-SMCC/KLH復(fù)合物溶液加入到多肽 溶液中，調(diào)PH值到7.3，室溫振搖4小時，-70冷凍后，用凍干機凍干24小時后備用。通過 Ellman法檢測交聯(lián)前后多肽巰基確定多肽交聯(lián)效率。3.多肽免疫和抗血清制備將交聯(lián)好的KLH-多肽400 μ g溶于400 μ 1磷酸緩沖液(0. OlM PBS)中，加入等體 積弗氏完全佐劑充分乳化(至在水中不擴散為準)。采用兔齡3個月，體重1.75-2. 25Kg的 健康新西蘭兔進行免疫，進行背部皮內(nèi)注射免疫，至少要注射20點以上。首次免疫3周后， 將300 μ g多肽溶于300 μ 1磷酸緩沖液(0. OlM PBS)中，與等量的弗氏不完全佐劑充分乳 化后進行皮內(nèi)免疫，作為第一次加強免疫，要求背部皮內(nèi)注射免疫，至少要注射15點以上。 第二次免疫3周后，進行第二次加強免疫，方法和要求同第一次加強免疫。1周后，采用耳緣 靜脈微量取血，用未交聯(lián)的合成多肽包被酶標板，間接ELISA法檢測免疫血清效價。重復(fù)加 強免疫和效價測定，直至血清效價達到1 10000以上，采用心臟取血，標準方法獲得抗血 清。4.抗體親和純化TIgG純化用移液器將50%的Protein-Α Sepharose混懸液IOml加到30ml層析 柱中，去掉頂蓋和底帽，液體流出后的柱床體積即為5ml，然后用25ml去離子水沖洗3遍。取
4出對應(yīng)的血清10ml，與2ml PBS混合后加入30ml層析柱中，旋轉(zhuǎn)混合器上室溫(20_25°C ) 混旋1小時，讓血清樣品流出。再用15ml純化洗液洗層析柱3次，加入IOml洗脫液進行洗 脫。肽親和純化在層析柱中加入Iml Sulfo-Iink凝膠懸液(0. 5ml凝膠)，待柱內(nèi)液 體流干，用4ml偶聯(lián)緩沖液沖洗層析柱。用Iml偶聯(lián)緩沖液溶解合成的Ehf多肽，并加入層 析柱，再加入Iml偶聯(lián)緩沖液至層析柱中，室溫顛倒混勻1小時。用6ml偶聯(lián)緩沖液沖洗層 析柱，然后加入3ml封閉液，室溫混勻1小時。沖洗層析柱3次，然后向?qū)游鲋鶅?nèi)加入6ml IgG及3ml PBS,室溫顛倒混勻1小時。用PBS沖洗層析柱3次，然后用2ml洗脫液洗脫。將 所獲得的純化抗體裝入透析袋內(nèi)4°C透析。透析過夜，然后4000rpmX35min離心除沉淀，收 集上清。用間接ELISA法測定抗體效價并用Bradford法測定蛋白濃度。5.免疫印跡分析按照標準方法配制SDS-PAGE凝膠，將5μ 1蛋白濃度為5mg/ml的組織裂解液加入 上樣孔中，恒壓80V約30分鐘，待樣品跑過濃縮膠基本呈一條直線時，改換160V電壓，電泳 至溴酚藍指示劑完全跑出分離膠(約60分鐘)時終止電泳，采用電轉(zhuǎn)膜方法恒壓100V電 轉(zhuǎn)80分鐘轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。將所獲得的Ehf抗體作為一抗，采用濃度為1 μ 1/ml與上述轉(zhuǎn) 膜得到的抗原在室溫下雜交1小時，然后用HRP標記的羊抗兔抗體在室溫下雜交1小時，采 用ECL顯色法進行顯色，在暗室中用X片進行顯色和曝光，得到免疫印跡結(jié)果。6.免疫組織化學(xué)分析將4%甲醛溶液固定的組織切成1. 5mmX 1. 5mmX2. 0-3. Omm的組織塊，乙醇梯度 脫水后二甲苯透明30分鐘，62°C石蠟浸蠟2小時后，在組織包埋機上將9種組織按照3X3 的排列方式用石蠟進行包埋。采用標準石蠟切片方法將切好的4-5 μ m厚的組織芯片蠟片 貼附于APES處理過的載玻片上，在烤片機60°C烤片1小時，然后在烤箱中60°C烤片6小 時。采用標準免疫組化方法，室溫下用100μ 1 10%羊血清于濕盒中封閉切片30分鐘，加入 100 μ 1濃度為2-4 μ g/ml的Ehf抗體，濕盒中4°C過夜，PBS清洗后加入生物素標記羊抗兔 IgG于濕盒中37°C孵育30分鐘，然后PBS清洗后加入HRP標記的鏈霉卵白素濃縮液，濕盒 中37°C孵育30分鐘，洗片后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，復(fù)藍，脫水，透明，封片，鏡檢，檢查 結(jié)果并拍照。
序列表
FTRAAGSAGQLLYS
權(quán)利要求
一種鼠Ehf多肽，其特征在于多肽的氨基酸序列為FTRAAGSAGQLLYS。
2.一種抗鼠Ehf多肽的抗體制備方法，其特征在于按權(quán)力要求1所述序列合成蛋白序 列中部修飾肽，將合成的蛋白序列中部修飾肽與載體蛋白交聯(lián)，用交聯(lián)的肽免疫動物，取免 疫動物的血制備抗血清，從血清中分離純化IgG。
3.根據(jù)權(quán)力要求2所述的抗體制備方法，其特征在于蛋白序列中部修飾為在序列蛋白 序列中部增加一個半胱氨酸殘基。
4.根據(jù)權(quán)力要求2所述的抗體制備方法，其特征在于載體蛋白為匙孔血藍蛋白(KLH) 或牛血清白蛋白(BSA)。
5.根據(jù)權(quán)力要求2所述的抗體制備方法，其特征在于蛋白序列中部修飾肽通過交聯(lián)劑 將其巰基與載體蛋白氨基共價交聯(lián)。
6.根據(jù)權(quán)力要求2所述的抗體制備方法，其特征在于交聯(lián)肽與免疫佐劑混合乳化后， 在兔背部通過多點皮下注射，并經(jīng)二次以上加強免疫，血清的效價大于1 10000。
7.根據(jù)權(quán)力要求2所述的抗體制備方法，其特征在于經(jīng)過硫酸銨沉淀、蛋白A親和純化 以及肽親和純化可以從抗血清中獲得高純度的IgG。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蛋白序列中部特異的鼠Ehf多肽以及抗體的制備方法，屬于以抗體為特征的體外實驗用的生物制品。蛋白序列中部特異的鼠Ehf多肽的氨基酸序列為FTRAAGSAGQLLYS?？故驟hf多肽抗體按以下方法制備(1)鼠Ehf抗原表位分析；(2)鼠Ehf蛋白序列中部多肽合成；(3)合成多肽與載體蛋白交聯(lián)；(4)制備兔抗鼠Ehf多肽抗體；(5)收集、分離得到含有抗體的血清，純化抗體，即得到抗鼠Ehf多肽的抗體。本發(fā)明制備的蛋白序列中部特異的抗鼠Ehf合成多肽抗體效價高、親和力強、特異性好，可與天然鼠Ehf發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，制備成本低，純化后的抗體可以用于免疫印跡和免疫組化。該抗體為Ehf蛋白的基礎(chǔ)研究，比如對Ehf的特性、功能、表達譜和含量的分析，及其相關(guān)疾病的研究提供了一個重要的工具。
文檔編號C07K7/08GK101928334SQ20091013656
公開日2010年12月29日 申請日期2009年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月8日
發(fā)明者張虎生, 江虹, 王越, 田睿, 石春林, 薛沿寧 申請人:北京奧維亞生物技術(shù)有限公司