專利名稱：一種禽蛋蛋黃中免疫球蛋白和高密度脂蛋白的聯產工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物化工、精細化工、食品工程、食品添加劑，農副產品深加工和保健 品生產領域。特別涉及一種聯產禽蛋黃蛋中免疫球蛋白和高密度脂蛋白的提取純化工藝。
背景技術：
禽蛋蛋黃中含有多種功能性蛋白，其中用處較廣的主要為水溶性的免疫球蛋白 (IgY)和脂溶性的高密度脂蛋白(HDLP)。免疫球蛋白的研究和應用越來越廣泛，包括免疫 沉淀、免疫熒光、酶聯免疫吸附測定、免疫印跡、免疫電鏡等；目前已有從蛋黃僅生產免疫球 蛋白的企業，且所生產的免疫球蛋白已用于生產兒童奶粉等。禽蛋蛋黃中高密度脂蛋白是 一種具有清除血管壁上膽固醇等作用，阻止動脈粥樣硬化發生發展。目前從蛋黃制備高密 度脂蛋白在國內尚未實現產業化。此外，已公開發表的制備高密度脂蛋白方法都是采用超 高速離心分離純化，其缺點是設備昂貴，處理量低，能耗高，無法用于工業化生產。目前沒有 從禽蛋黃中制備免疫球蛋白和高密度脂蛋白的聯產工藝。為了充分利用生產材料，提高禽蛋深加工的附加值，本發明從雞蛋黃中聯產水溶 性的免疫球蛋白和脂溶性的高密度脂蛋白，并對制備得到的樣品進行了鑒定。
發明內容
一種禽蛋蛋黃中免疫球蛋白和高密度脂蛋白的提取純化聯產工藝。禽蛋是指家養的各地方品種雞、鴨、鵝，和火雞、山雞、家鴿、鵪鶉、鴕鳥、孔雀等產 的蛋。1.前處理根據禽蛋黃中免疫球蛋白和高密度脂蛋白的性質，設計出實驗方案， 使得水溶性的免疫球蛋白和脂溶性高密度脂蛋白充分分離，形成互不干擾的兩個組分。為 兩種蛋白的聯產做好準備。2.提取純化2. 1免疫球蛋白的提取純化采用硫酸銨沉淀和聚乙二醇8000絮凝相結合的方法 分離得到免疫球蛋白。2. 2高密度脂蛋白的提取純化采用低濃度鹽洗滌，再利用硫酸銨沉淀的方法得 出較純的高密度脂蛋白。3.鑒定3.1免疫球蛋白的鑒定3. 1. 1還原與非還原法SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法利用免疫球蛋白是由輕重鏈 組成的四聚體，采用非還原性上樣緩沖液和還原性上樣緩沖液進行電泳，可以分別得出免 疫球蛋白整個分子的SDS-PAGE條帶和免疫球蛋白的輕重鏈的SDS-PAGE條帶。由此推斷目 標蛋白的分子量。3. 1. 2ffestern blotting鑒定利用酶標抗體進行IgY免疫原性實驗，DAB顯色得 到條帶。由此判斷IgY的屬性。3. 1. 3MALDI-T0F-MS/MS檢測序列鑒定通過序列比對鑒定蛋白與數據庫中序列 一致性判斷目標蛋白IgY的一級結構。
3. 2高密度脂蛋白的鑒定3.2. 1.采用不同的蛋白染色方法，可染出高密度脂蛋白的脂成分，磷成分，糖成 分，從而斷定目標蛋白所含化學組份。3. 2. 2. MALDI-T0F-MS/MS檢測序列鑒定通過序列比對鑒定蛋白與數據庫中序列 一致性斷定目標蛋白HDLP的一級結構。
1.雞蛋黃中免疫球蛋白和高密度脂蛋白的分離結果SDS-PAGE電泳圖，圖中條帶2 為免疫球蛋白，純度為74. 1 %，條帶4為高密度脂蛋白，純度為73. 3 %。M 次高分子分子量標準蛋白(D) ；1 蛋黃上清用50%硫酸銨沉淀后上清；2 樣品 經20%硫酸銨沉淀后沉淀免疫球蛋白；3 蛋黃稀釋上清；4 樣品經50%硫酸銨沉淀后的 高密度脂蛋白；5 樣品經50%硫酸銨沉淀后的上清液；6 蛋黃沉淀經0. 2M NaCl洗滌后沉 淀；7 蛋黃沉淀；8 蛋黃稀釋液。下圖為Band scan軟件分析樣品中兩種蛋白的含量表。2.免疫球蛋白的SDS-PAGE電泳鑒定圖，圖中條帶1采用非還原性上樣緩沖液，條 帶2為還原性上樣緩沖液。目標物分子量與理論吻合。Ml 次高分子量標準蛋白(KD) ；1 非還原性免疫球蛋白；2 還原性免疫球蛋白； M2 低分子量標準蛋白(KD)3.免疫球蛋白的Western blotting鑒定結果。將免疫球蛋白進行免疫印跡，1，2 為免疫印跡條帶。3，4為考馬斯亮藍染色條帶。目標條帶呈陽性反應。1、2 分別對應為條帶3、4進行Western blotting的免疫顯色條帶；3 未純化的 稀釋蛋黃上清；4 純化后的免疫球蛋白；M 次高分子量標準蛋白(KD)4.免疫球蛋白的MALDI-T0F-MS/MS分析截圖，目的蛋白與數據庫中Ig gamma chain-chicken匹配得分為160，可鑒定目的蛋白為免疫球蛋白。5.高密度脂蛋白的鑒定電泳圖1 考馬斯亮藍染色樣品；M 次高分子量標準蛋白⑶；2 甲基綠染色樣品；3 銀 染染色樣品；4 蘇丹黑染色樣品6.高密度脂蛋白的MALDI-T0F-MS/MS分析截圖，目的蛋白與數據庫中 Vitellogenin 2preCurSOr匹配得分為1020，可鑒定目的蛋白為高密度脂蛋白。
具體實施方案實例1、由雞蛋蛋黃聯產免疫球蛋白和高密度脂蛋白實驗材料新鮮雞蛋(購于本地市場)；甲基綠，北京恒業中遠化工有限公司；蘇丹黑B，北京 恒業中遠化工有限公司；5-磺基水楊酸，化學純，軍事醫學科學院；硝酸銀，北京益利精細 化學品公司；其余試劑均為國產分析純。冷凍離心機上海安亭科學儀器廠JB-2型恒溫磁力攪拌器上海雷磁儀器廠新 涇分廠；LGJlO-C型冷凍干燥機，北京四環科學儀器廠等。實驗方法
1.雞蛋黃中免疫球蛋白和高密度脂蛋白的制備工藝1. 1雞蛋預處理將雞蛋黃從雞蛋中取出后，按1 30體積比(V/V)加去離子水 稀釋，靜置12h，經抽濾，得到上清液和沉淀兩個組分。1.2上清制備免疫球蛋白在上清液中加入三聚磷酸鈉1. 5% (W/V)和氯化鈣1. 5% (W/V)進行絮凝，靜置 12h，再取其上清液加入硫酸銨至20%飽和度得沉淀，重溶沉淀后加入5%聚乙二醇8000絮 凝并棄沉淀，將上清采用中空纖維膜過濾后，獲得免疫球蛋白。1. 3沉淀物中高密度脂蛋白的分離將蛋黃沉淀用0. IM NaCl進行洗滌，攪拌12h后，在8000r/min，4°C離心30min，沉 淀為高密度脂蛋白粗品。將沉淀用0.5M氯化鈉溶液溶解后加入35%硫酸銨(W/V)沉淀， 8000r/min，4°C離心30min，取上清液再加入15%硫酸銨(W/V)沉淀，8000r/min，4°C離心 30min，得到沉淀即為高密度脂蛋白。2免疫球蛋白和高密度脂蛋白的鑒定2.1免疫球蛋白鑒定2. 1. 1還原與非還原法SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳利用還原性和非還原性兩種上樣緩沖液分別與免疫球蛋白樣品按體積比1 1混 合進行SDS-PAGE電泳(3%的濃縮膠和5%的分離膠)鑒定免疫球蛋白。還原性上樣緩沖液0.5M Tris-HCl (ρΗ6· 8) 2. OmL,甘油(丙三醇)2. 4mL, 20% (W/ V) SDS 1. OmL, β -巰基乙醇0. 2mL, 0. 1 % (W/V)溴酚蘭0. 4mL雙蒸水4. OmL ；非還原性上樣 緩沖液0.5M Tris-HCl (ρΗ6· 8)2. OmL，甘油(丙三醇)2. 4mL，20 % (ff/V)SDSl. OmL, 0. 1% (W/V)溴酚蘭0. 4mL雙蒸水4. 2mL。低分子量標準蛋白兔磷酸化酶B(97. 4KD)、牛血清白蛋白(66. 2KDX)、兔激動蛋白 (43KD)、牛碳酸酐(31KD)、胰蛋白酶抑制劑(20. 1KD)、雞蛋清溶菌酶(14. 4KD)；次高分子量 蛋白標準蛋白肌球蛋白重鏈(200KD)、鈣調素結合蛋白(130KD)、兔磷酸化酶B(97.4KD)、 牛血清白蛋白(66.2KD)、兔激動蛋白(43KD)。電泳條件電流25mA，時間4h，上樣量20 μ L。結果表明，非還原性上樣緩沖液電泳條帶在180KD的位置有明顯條帶，說明在非 還原性條件下，免疫球蛋白中的二硫鍵沒被破壞，保持蛋白完整性。還原性上樣緩沖液電泳 條帶在180KD處沒有條帶，而在22KD和70KD分別出現了條帶。這是因為還原性緩沖液中 的巰基乙醇可以破壞免疫球蛋白中的二硫鍵，將免疫球蛋白分離成70KD的重鏈和22KD的 輕鏈，由此可以鑒定該蛋白條帶為免疫球蛋白。將制得的免疫球蛋白用非還原性SDS-PAGE 電泳，高密度脂蛋白進行SDS-PAGE電泳后，采用Band scan軟件分析樣品中兩種蛋白的 含量。將免疫球蛋白進行非還原性SDS-PAGE后，180KD位置有較高濃度的免疫球蛋白， 經Bandscan軟件分析，純度為74. 1 %。，而分離出的高密度脂蛋白經軟件分析后，純度為 73. 3 % ο2. 1. 2ffestern blotting 鑒定將分離前后的目的蛋白樣品進行非還原性SDS-PAGE電泳，在次高分子量標準蛋 白兩側對稱上樣，25mA恒流電泳4h，切下其中一側將其進行考馬斯亮藍染色，另一側用半 干法從凝膠轉移至硝酸纖維素膜上，采用Towbin作為轉膜緩沖液，電流為1. 2mA/cm2，4°C下恒流轉膜2h。將膜37°C烘干，放入牛血清白蛋白封閉液(3%牛血清白蛋白溶于PBST緩沖 液中)封閉lh，用PBST緩沖液(pH7. 4的磷酸緩沖液，0. 05%吐溫-20)洗滌5minX5，浸泡 于含有0. 125%兔抗雞IgG的PBST緩沖液中，室溫下孵育lh，用PBST緩沖液洗滌5minX5， 用二氨基聯苯胺溶液(0. 05mol/L Tris,0. 0035% H2O2，0. 5g/L DAB)顯色數分鐘，PBST緩沖 液終止反應。對比考馬斯亮藍染色的蛋白條帶，在目的蛋白轉膜的對應位置，添加辣根過氧化 酶標記兔抗雞I gG孵育后，通過DAB顯色出現了棕色沉淀，這可以說明該位置有辣根過氧化 酶標記兔抗雞IgG特異性的結合，進而證明該蛋白是免疫球蛋白。2. 1. 3MALDI-T0F-MS/MS 檢測序列鑒定將電泳后膠的相應位置切下，用雙蒸水洗凈，切成1毫米見方的膠粒，送樣進行檢 測。將測序結果軟件分析，NCBI數據庫中蛋白肽段序列比對，得出分析圖。Reference 下列出的是鑒定出的蛋白名稱，Score下列出的是被鑒定蛋白的綜合得分(即被鑒定蛋 白與數據庫中蛋白序列的匹配程度，分數越高，表明該樣品真實性越大，一般30分以上即 可較確定的認定一種蛋白；30分以下則有可能是另一種蛋白)。目的蛋白與數據庫中Ig gamma chain-chicken匹配得分為160，可鑒定目的蛋白為免疫球蛋白。2. 2高密度脂蛋白鑒定2.2.1高密度脂蛋白染色鑒定根據高密度脂蛋白同時含糖、含磷和含脂的特性，分別使用脂蛋白、磷蛋白和糖蛋 白的電泳染色方法鑒定高密度脂蛋白。取樣品電泳得到四個相同的凝膠條帶，分別進行考馬斯亮藍、蘇丹黑B、甲基綠、硝 酸銀糖染色。(1)考馬斯亮藍染色將電泳條帶用凝膠固定液(甲醇400mL，乙酸IOOmL,去離子水500mL)固定30min， 再用考馬斯亮藍染色液(乙酸lOOmL，Coomassie blue 0. 25g，去離子水900mL)染色30min， 經蒸餾水洗滌后，放入凝膠脫色液(甲醇50mL，乙酸50mL，去離子水400mL)中脫色至條帶清晰。(2)脂蛋白分析將電泳條帶蒸餾水洗滌后，放入蘇丹黑的染色液(2g蘇丹黑溶于20mL丙酮， 再加入15mL乙酸和165mL水)中染色12h，然后再用脫色液(甲醇/冰醋酸/蒸餾水= 5:5: 1)進行脫色，直至背景清晰。(3)磷蛋白分析將電泳條帶在0. 5M CaCl2配制的10%磺基水楊酸(SSA)中固定2h，雙蒸水洗滌 后放入60°C的0. 5M NaOH溶液中固定30min，再用1 %鉬酸銨洗滌2次，每次lOmin，然后在 IMHNO3配制的鉬酸銨溶液中染色30min，最后用7%乙酸配制的0. 5%甲基綠染色液染 色30min，10% SSA脫色至背景較淺而磷蛋白條帶清晰為止。(4)糖蛋白分析將電泳條帶在含10%醋酸和25%異丙醇的溶液中固定30min，經蒸餾水洗滌后放 入7.5%醋酸溶液中浸泡30!^11，然后用高碘酸4°C固定lh。取出條帶用雙蒸水洗滌6次，每次5min，之后放入0.2%硝酸銀溶液(新鮮配制)中反應30min，馬上用雙蒸水洗滌 (不超過5s)，在含2. 3% Na2CO3,0.01%甲醛及0. 001 %硫代硫酸鈉的溶液中顯色15min,加 入2. 5%醋酸終止反應。電泳結果可知，樣品經考馬斯亮藍染色后，樣品中所有蛋白均可出現條帶，根據分 子量推斷出高密度脂蛋白的條帶。其中甲基綠染色條帶顯色證明此蛋白為磷蛋白；改良銀 染染色條帶顯色證明此蛋白為糖蛋白；蘇丹黑條帶顯色證明此蛋白為脂蛋白。實驗結果證 明目標蛋白就是同時含磷、含糖、含脂的高密度脂蛋白。2. 2. 2MALDI-T0F-MS/MS 檢測序列鑒定將電泳后膠的相應位置切下，用雙蒸水洗凈，切成1毫米見方的膠粒，送樣進行檢 測。將測序結果軟件分析，NCBI數據庫中蛋白肽段序列比對，得出分析圖。Reference 下列出的是鑒定出的蛋白名稱，Score下列出的是被鑒定蛋白的綜合得分(即被鑒定蛋 白與數據庫中蛋白序列的匹配程度，分數越高，表明該樣品真實性越大，一般30分以上 即可較確定的認定一種蛋白；30分以下則有可能不是一種蛋白)。目的蛋白與數據庫中 Vitellogenin 2preCurSOr匹配得分為1020，可鑒定目的蛋白為高密度脂蛋白。
權利要求
一種禽蛋蛋黃中免疫球蛋白和高密度脂蛋白的聯產工藝，其特征在于，利用同一批次蛋黃作原料，在生產免疫球蛋白的同時，也可以生產高密度脂蛋白。該工藝提高生產附加值，對禽蛋深加工有實用價值。
2.如權利要求1所述，先將雞蛋黃從雞蛋中取出后，按1 30體積比(V/V)加去離子 稀釋，靜置12h，經抽濾，得到上清液和沉淀兩個組分。上清液用于制備免疫球蛋白；沉淀物 用于分離高密度脂蛋白。
3.如權利要求2所述，高密度脂蛋白的分離不是采用超高速離心制備。而是采用一種 鹽沉加離心的工藝。將蛋黃沉淀用0. IM NaCl進行洗滌，攪拌12h后，在8000r/min，4°C離 心30min，制得高密度脂蛋白粗品。將沉淀用0.5M氯化鈉溶液溶解后加入35%硫酸銨(W/ V)沉淀，8000r/min，4°C離心30min，取上清液再加入15%硫酸銨(W/V)沉淀，8000r/min， 4°C離心30min，得到沉淀即為高密度脂蛋白。
4.如權利1如述，禽蛋不僅指家養的各品種的雞鴨鵝，也包括家養的野雞、鵪鶉、鴕鳥、 火雞、山雞、家鴿、孔雀等所產的蛋。
全文摘要
本發明涉及禽蛋蛋黃中免疫球蛋白和高密度脂蛋白的一種聯產工藝。根據禽蛋黃中免疫球蛋白和高密度脂蛋白的理化性質，設計出實驗方案，使得水溶性的免疫球蛋白和脂溶性高密度脂蛋白充分分離。先將雞蛋黃加水稀釋，靜置后抽濾，得到上清液和沉淀兩個組分。在上清液絮凝沉淀等處理后，將上清采用中空纖維膜過濾獲得免疫球蛋白。將蛋黃沉淀用鹽洗滌，中速離心得高密度脂蛋白粗品。重溶后用硫酸銨兩次沉淀，兩次中速離心得到沉淀即為高密度脂蛋白。所獲產物用多種方法鑒定。
文檔編號C07K1/36GK101880322SQ20091013624
公開日2010年11月10日 申請日期2009年5月4日 優先權日2009年5月4日
發明者劉元峰, 劉濟, 張 杰, 羅瑤, 陳勁春 申請人:北京化工大學