專利名稱：一種純化卡貝縮宮素的方法
技術領域：
本發明涉及一種多肽的純化方法，尤其涉及卡貝縮宮素純化的方法。
背景技術：
卡貝縮宮素(Carbetocin)是一種合成的具有激動劑性質的長效催產 素九肽類似物。硬膜外或腰麻下剖腹產術后可以立即單劑量靜脈給藥，以 預防子宮張力不足和產后出血。
卡貝縮宮素的臨床和藥理特性與天然產生的催產素類似。^f象催產素一 樣，卡貝縮宮素與子宮平滑肌的催產素受體結合，引起子宮的節律性收縮， 在原有的收縮基礎上，增加其頻率和增加子宮張力。在非妊娠狀態下，子 宮的催產素受體含量很低，在妊娠期間增加，分娩時達高峰。因此卡貝縮 宮素對非妊娠的子宮沒有作用，但是對妊娠的子宮和剛生產的子宮具有有 效的子宮收縮作用。
不論是靜脈注射還是肌肉注射卡貝縮宮素后，子宮迅速收縮，可在2 分鐘內達到一個明確強度。單劑量靜脈注射卡貝縮宮素對子宮的活性作用 可持續大約l個小時，因此足以預防剛生產后的產后出血。產后給予卡貝 縮宮素后，在收縮的頻率與幅度方面都比催產素要長，并且對有出血傾向、 需額外使用縮宮素者，卡貝縮宮素耐受性好，與縮宮素一樣有效甚至更有 效。
目前臨床常用的促進子宮縮收藥物麥角新堿，會導致惡心、嘔吐、高 血壓和冠脈痙攣等。卡貝縮宮素是一種長效的類催產素藥物。與麥角新堿 相比，使用卡貝縮宮素在預防陰道分娩婦女的產后出血方面同樣有效，并 且惡心、嘔吐、高血壓的發生比例顯著降低。
因此卡貝縮宮素在臨床上有很好的應用前景，具有4艮高的開發價值。 目前，還沒有文獻具體研究卡貝縮宮素相關純化的方法，特別是純化 的規模化方法，本發明不僅能得到HPLC純度大于98%的精肽，而且能夠規 模化生產，達到純度高、收率高、產業化的要求。
發明內容
本發明提出了一條適于產業化純化卡貝縮宮素的工藝方法，使用反相 高效液相色譜法純化純卡貝縮宮素，純度高且收率好，達到產業化要求。
為實現上述目的，本發明的技術方案包括以下步驟
a、 卡貝縮宮素粗肽溶液用反相色譜柱為固定相，以磷酸鹽緩沖溶液為 A相、乙腈為B相，進行梯度洗脫純化，其中梯度B%: 20-40%， A相 的pH為2. 5-3. 5;
b、 釆用陰離子交換法將磷酸鹽、三氟醋酸鹽轉成醋酸鹽。 所述的反相色i普柱為采用了反相色譜填充材料的色譜柱。
具體實施例方式
樣品處理卡貝縮宮素粗肽溶液配制成300-500mg/mL,用濾膜過濾后 收集濾液備用。所述卡貝縮宮素粗肽可以是純度不符合藥用標準、或者純 度不符合工業應用目的或者為通過固相合成法獲得而未經純化的卡貝縮宮素。
純化純化條件 色譜柱
使用反相色譜柱為固定相的色譜柱，優選十八烷基硅烷鍵合硅膠為填 充材料的色譜柱。色譜柱直徑和長度為15 cm x 25cm , 30cm x 25 cm ， 或5 cm x 25 cm 。
流動相
A相使用磷酸二氫鈉和磷酸的緩沖溶液，pH為2.5-3.5,優選pH為 2.8-3.3。配制方法緩沖溶液采用磷酸二氳鈉水溶液用磷酸溶液調至需要 的pH，磷酸優選分析純的磷酸。
B相乙腈，優選色譜純乙腈。流速為450-550 ml/min, 20000-2200 ml/min。,或60-80 ml/min。檢測波長230 nm。梯度B%: 20%—40%,優 選24%~38°/ 。進樣量為l-70g ,優選進樣量為1. 5-2g 、10-15g或50-65 g 。
純化過程將色語柱用50°/ 以上的乙腈沖洗干凈后上樣，線性梯度洗脫 50-85min，優選56-64min， 60-80 min,或者56-64min。收集目的峰，將 收集的目的肽溶液于水溫不超過32。C下減壓旋蒸濃縮后備用。
3、轉鹽純化條件色譜柱填料為陰離子交換樹脂所述陰離子交換樹脂為提供醋酸根的陰離子交換樹脂，優選Amber lite IRA-93或Wofatit AD—41。色i普4主直徑和長度為15 cm x 45 cm , 30 cm x 70 Cm或5 cm x 25 cm 。流動相醋酸水溶液，重量百分比濃度為G. 1-0. 5%,優選 為0. 2-0. 3%。流速50-850 ml/min ,優選50-60 ml/min 、 150-170 ml/min 或者750-850 ml/min。；險測波長280 nm。進樣量為進樣量為1-70g ,優 選進樣量為1. 5-2 g 、 10-15g或50-65 g 。
轉鹽過程將色譜柱用去離子水平衡后上樣。醋酸水溶液洗脫50-160 min,收集目的峰，將收集的目的肽溶液于水溫不超過32。C下減壓旋蒸濃 縮。后轉至合適大小西林瓶。冷凍干燥后即可得到純度大于98%的符合標 準的卡貝縮宮素，純化收率達70-76%。
下面為具體實施方法
實施例一
1、 樣品處理固相合成所得卡貝縮宮素(Carbetocin)粗肽用注射用 水溶解成500mg/mL,用0=0. 45 n m濾膜過濾后收集濾液備用。
2、 純化
純化條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱,柱子 直徑和長度為5 cm x 25 cm 。流動相A相》粦酸二氫鈉水:容液用 分析純的磷酸調pH至2. 8-3. 3 ; B相色譜純乙腈。流速60-80 ml/min。 檢測波長230 nm。梯度B°/。 24°/。~38°/。
56-64 min。進樣量為1. 5-2 g 。
純化過程將色諳柱用50%以上的乙腈沖洗干凈后上樣，上樣量為 30-40ml樣品溶液。線性梯度洗脫56-64min,收集目的峰，將收集的目的 肽溶液于水溫不超過32 。C下減壓旋蒸濃縮至約50-100 ml/g后備用。
3、 轉鹽色譜柱i真料為陰離子交換樹脂Amberlite IRA-93,柱子直 徑和長度為5 cm x 25 cm 。流動相0.2-0.3%醋酸水溶液。流速 50—60 ml/min。才企測波長280 nm。進才羊量為1. 5—2. 0g 。
轉鹽過程將色譜柱用去離子水平衡后上樣，上樣量為20-30ml樣品 溶液。0.2-0.3%醋酸水溶液洗脫50min,收集目的峰，將收集的目的肽溶 液合并于水溫不超過32。C下減壓旋蒸濃縮至約4-6 g/ml后轉至合適大小 西林瓶。冷凍干燥后即可得到純度大于98%的符合標準的卡貝縮宮素，純 化收率達75. 3°/。。
實施例二
1、樣品處理相合成所得卡貝縮宮素(Carbetocin)粗肽用注射用水溶解500mg/mL,用0=0. 45 ju m濾膜過濾后收集濾液備用。
2、 純化
純化條件色鐠柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色鐠柱，柱 子直徑和長度為15 cm x 25 cm 。流動相A相石舞酸二氫鈉水溶液 用分析純的磷酸溶液調pH至2. 8-3. 3 ; B相色譜純乙腈。流速450-550 ml/min。才企測波長230 nm。梯度B%: 24 % ~ 38% 56-64 min。進樣量 為10-15g 。
純化過程將色譜柱用50%以上的乙腈沖洗干凈后上樣，上樣量為 200ml-300ml樣品溶液。線性梯度洗脫56-64min，收集目的峰，將收集的 目的肽溶液于水溫不超過32t:下減壓旋蒸濃縮至約80-200 ml/g后備用。
3、 轉鹽純化條件色i普柱填料為陰離子交換樹脂AmberlUe IRA-93， 柱子直徑和長度為15 cm x 45cm。流動相0. 2-0. 3%醋酸水溶液。 流速150-170 ml/min。斗全測波長280 nm。進才羊量為10-15g g 。
轉鹽過程將色譜-柱用去離子水平衡后上樣，上樣量為160-180ml樣 品溶液。0. 2-0. 3%醋酸水溶液洗脫75 min，收集目的峰，將收集的目的肽 溶液于水溫不超過32。C下減壓旋蒸濃縮至約4-6 g/ml。后轉至合適大小西 林瓶。冷凍千燥后即可得到純度大于98°/。的符合標準的卡貝縮宮素 (Carbetocin),純化收率達7Q. 2%。 實施例三
1、 樣品處理相合成所得卡貝縮宮素(Carbetocin)粗肽用注射用水 溶解500mg/mL,用0=0. 45 y m濾膜過濾后收集濾液備用。
2、 純化
純化條件色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱 子直徑和長度為30cm x 25 cm 。流動相A相石粦酸二氫鈉水溶液用 分析純的磷酸溶液調pH至2. 8-3. 3 ;B相色譜純乙腈。流速20000-2200 ml/min。檢測波長230 nm。梯度B%: 24°/。~38% 56-64 min。進樣量為 50-65 g 。
純化過程將色語柱用50%以上的乙腈沖洗干凈后上樣，上樣量為 900ml-1300ml樣品溶液。線性梯度洗脫60-80 min,收集目的峰，將收集 的目的肽溶液于水溫不超過32。C下減壓旋蒸濃縮至約60-180 ml/g后備 用。
3、 轉鹽純化條件色譜柱填料為陰離子交換樹脂Amberlite IRA-93,片主子直4圣和長度為30 cm x 70 cm 。流動相0. 2-0. 3%醋酸水溶液。 流速750-850 ml/min。檢測波長280 nm。進沖羊量為50-65 g 。
轉鹽過程將色譜柱用去離子水平衡后上樣，上樣量為1000-1100ml 樣品溶液。0. 2-0. 3%醋酸水溶液洗脫160 min，收集目的峰，將收集的目 的肽溶液于水溫不超過32。C下減壓旋蒸濃縮至約4-6 g/ml后轉至合適大 小西林瓶，冷凍干燥后即可得到純度大于98%的符合標準的卡貝縮宮素 (Carbetocin )，純化收率達74. 7%。
綜上所述，用以上方法純化卡貝縮宮素(Carbetocin)才喿作簡單可行、 純度高、收率好，達到產業化要求
以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說 明，不能認定本發明的具體實施只局限于這些說明。對于本發明所屬技術 領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若 干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發明的保護范圍。
權利要求
1、一種純化卡貝縮宮素的方法，包括以下步驟a、卡貝縮宮素粗肽溶液用反相色譜柱為固定相，以磷酸鹽緩沖溶液為A相、乙腈為B相，進行梯度洗脫純化，其中梯度B％20-40％，A相的pH為2.5-3.5；b、采用陰離子交換法將磷酸鹽、三氟醋酸鹽轉成醋酸鹽。
2、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的A相的磷酸鹽 緩沖溶液pH為2. 8-3. 3。
3、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的采用陰離子交換 柱法將磷酸鹽、三氟醋酸鹽轉成醋酸鹽，使用醋酸溶液作為流動相進行洗 脫，其重量百分比濃度為0. 1-0. 5%。
4、 根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的采用陰離子交換 柱法將磷酸鹽、三氟醋酸鹽轉成醋酸鹽，使用醋酸溶液作為流動相進行洗 脫，其重量百分比濃度為0. 1-0. 5%。
5、 根據權利要求l-4任意一項所述的方法，其特征在于所述采用陰 離子交換法將磷酸鹽、三氟醋酸鹽轉成醋酸鹽，使用陰離子交換樹脂交換 法，陰離子樹脂為Amberlite IRA-93或Wofatit AD-41。
6、 根據權利要求1-4任意一項所述的方法，其特征在于梯度B優 選24%-38%。
7、 根據權利要求5所述的方法，其特征在于梯度B優選24。/。-381
8、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于梯度洗脫的時間50-85min
9、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于醋酸水溶液洗脫時間為 50-160 min。
10、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于醋酸水溶液，重量百 分比濃度為0. 2-0. 3%。
全文摘要
本發明提出了一條適于產業化純化卡貝縮宮素(Carbetocin)的工藝方法，使用反相高效液相色譜法純化卡貝縮宮素，純度高且收率好，達到產業化要求。卡貝縮宮素粗肽溶液用反相色譜柱填充材料為固定相，以磷酸鹽緩沖溶液為A相、乙腈為B相，進行梯度洗脫純化，其中梯度B％20-40％，A相的pH為2.5-3.5；采用陰離子交換法將磷酸鹽、三氟醋酸鹽轉成醋酸鹽。本發明采用一步反相高效液相色譜法純化，接一步陰離子交換柱轉鹽，高收率得到高純度醋酸卡貝縮宮素，為大量純化制備該多肽原料藥提供了一種有效純化工藝。
文檔編號C07K1/18GK101531705SQ200910106758
公開日2009年9月16日 申請日期2009年4月21日 優先權日2009年4月21日
發明者程生強, 袁建成, 覃亮政, 馬亞平 申請人:深圳市翰宇藥業有限公司