鈴鐺刺DREB轉錄因子cDNA序列及其表達載體和應用的制作方法

專利名稱：：鈴鐺刺DREB轉錄因子cDNA序列及其表達載體和應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種與植物抗逆性相關的cDNA序列及其編碼的轉錄因子，尤其涉及從沙生植物鈴鐺刺(泡"770ofe/3rfro/7力a7oofe/^rw7V.)中所分離、克隆的編碼DREB轉錄因子的cDNA序歹U，本發明還涉及含有該cDNA序列的植物高效表達載體以及它們在提高植物抗逆性中的應用，屬于植物基因工程領域。技術背景干旱、鹽堿和低溫是影響陸生植物生長和限制作物產量的三種主要的非生物脅迫因子。據統計，世界干旱半干旱地區涉及50多個國家和地區，約占全球陸地面積的34.9%。目前全世界用于農業的57億公頃可耕旱地中，約70%的耕地由于干旱等因素導致土質退化，亞洲受此影響的土地面積最廣，近14億公頃。而我國的干旱、半干旱地區約占國土面積的一半以上，年受旱面積達200-270萬公頃。其危害相當于其它自然災害之和。此外，世界鹽堿地占全球陸地面積的7.6%，隨著工業化進程加快，我國的土壤鹽漬化面積不斷擴大，目前鹽漬化土壤面積約有2600萬公頃，其中鹽堿耕地約有670萬公頃，嚴重制約了農業對土地的利用。低溫作為經常發生且危害嚴重的逆境因素之一，它不僅影響著植物的季節性生長，也影響著植物的地理性分布。據統計，我國每年因凍害造成的農業損失高達數十億元，這些非生物脅迫對農業生產、生態建設、可持續發展戰略有著直接或間接的危害作用。干旱、鹽堿和低溫等非生物逆境都會構成對植物的滲透脅迫，致使環境滲透勢低于植物細胞滲透勢而導致植物細胞失水，嚴重的可造成細胞膨壓完全喪失，甚至導致植物死亡。當然，植物為了適應環境，在長期演化過程中也形成了復雜而精細的調節機制，提高了自身對不良環境脅迫的抵抗或忍耐能力，以適應不良環境。鈴鐺刺(Ha//wo￡fe"*ow/2a/0&m/rawV.)系豆科鈴鐺刺屬中抗旱抗鹽性極強的灌木。集中分布于新疆塔克拉瑪干沙漠和內蒙古巴丹吉林沙漠和甘肅民勤等地，國外原蘇聯，蒙古也有。降雨量在130mm以下的干熱荒漠區及地下水淺的地方均可生長。鈴鐺刺系含高蛋白質放牧用豆科植物，是荒漠牲畜駱駝和羊的喜食牧草，可做改良鹽堿土和固沙植物，并可栽培做綠籬。鈴鐺刺具有極強的抗旱耐鹽堿、防風、固沙、改良土壤等能力，能夠在極度干旱缺水的環境中生長除了其形態學上的部分特點外，更主要的是由于沙生植物在長期生長進化過程3中形成了其特有的基因構成及精密的表達調控方式，能夠合成并保持較多的抗旱抗滲透脅迫保護物質，體內存在著豐富的高抗性基因資源。因此，從沙生植物鈴鐺刺中克隆與抗逆性緊密相關的基因，不僅能為基因工程育種提供優良基因源，而且對于作物抗逆育種顯得尤為重要和迫切。轉錄因子(transcriptionfactor,TF)也稱反式作用因子，是指能夠與真核生物基因啟動子區域中順式作用元件發生特異性相互作用的DNA結合蛋白，通過他們之間以及與其它相關蛋白之間的相互作用激活或抑制某些基因的轉錄。自從1987年Paz-Ares首次報道玉米轉錄因子基因的克隆以來，相繼從高等植物中分離出的調控干旱、高鹽、低溫、激素、病原反應及生長發育等相關基因表達的轉錄因子已達數百種。擬南芥基因組測序已經完成，據推測，至少有1553個編碼轉錄因子的基因，約占其估計基因總數的5.9%。擬南芥中轉錄因子數量如此之大，種類之多，表明了高等植物轉錄調控的復雜性，同時也表明轉錄因子研究的重要性。DREB轉錄因子(DehydrationResponsiveElementBindingProtein),即干旱應答元件結合蛋白，是一類和植物脫水條件下的抗逆性反應有關的、在信號傳遞和調控基因表達中起作用的轉錄因子，能特異結合DRE/CRT順式作用元件，并激活下游目的基因的轉錄。到目前為止，已經從多種植物中克隆分離到上百種DREB轉錄因子，包括單子葉植物和雙子葉植物，并且DRE/DREB順式作用元件與反式作用因子相互作用的調控模式已經在草本植物種發現并被證明，如擬南芥、小麥、黑麥草、番茄、玉米、大麥、水稻等。但是目前尚未見到從沙生植物、尤其是野生灌木類沙生植物鈴鐺刺中克隆到相關基因的報道。目前，植物抗逆基因工程的研究取得了一定進展，但是其重點均在導入個別功能基因來提高某種抗性，從而達不到使植物的抗逆性得到綜合的、根本性的改良。植物的抗逆性并不是由單個或少數幾個基因的表達來體現的，而是由多基因控制的數量性狀。雖然目前己陸續從各種植物中克隆出大量的抗逆相關基因，但這些基因大多數只能增加植物的某種單一抗性，并不能從整體上綜合提高植物的抗逆性。轉錄因子作為功能基因表達的調節開關，可以對不同的基因進行精確的調節，在植物逆境信號傳遞過程中發揮著關鍵的作用，所以通過增強某個轉錄因子的作用，可促使多個與抗逆有關的功能基因表達，這是使植物抗逆性狀獲得綜合改良的一條非常有效的途徑。DREB正是這一類的轉錄因子，在脅迫信號傳遞過程中起重要作用，它可以調控多個與植物干旱、高鹽及低溫耐性有關的功能基因的表達，從整體上增強植物的抗逆性，提高其穩定性，對于基因工程改良植物的耐逆性具有巨大的潛在應用價值，并將有巨大的應用前景。因此，克隆新的具有自主知識產權的DREB類轉錄因子基因，研究其基本的生物學特性和功能，將為整個植物抗逆基因調控網絡及脅迫應答反應機理提供理論基礎，為改良作物抗逆性、創造新的抗逆材料提供物質基礎。綜上所述，對于一個水資源緊缺、鹽漬化土壤面積不斷擴大、耕地面積有限、人口眾多的農業大國來說，克隆在植物抗逆過程中起重要作用的調控基因，對于農業的可持續發展具有重要意義。
發明內容本發明目的之一是提供一類從沙生植物鈴鐺刺(^fo"mo&"^ow力a/orfewJrawV.)中所分離、克隆的與抗逆性緊密相關的編碼DREB轉錄因子的cDNA序列。本發明目的之一是通過以下技術方案來實現的一種從沙生植物鈴鐺刺中所分離、克隆的與抗逆性緊密相關的編碼DREB轉錄因子的cDNA序列，該cDNA序列為以下(a)或(b)所示的堿基序列(a)SEQIDNO:1所示的堿基序列；或(b)將SEQIDNO:1所示的堿基序列一個或多個的堿基進行替換、缺失或/和插入而得到的堿基序列，該堿基序列所編碼的蛋白仍具有DREB轉錄因子的功能或活性。本發明根據植物中基因DNA結合域保守區設計了簡并引物，利用RT-PCR方法從沙生植物鈴鐺刺中分離到Di^石2基因的同源片段，然后通過RACE-PCR技術克隆得到新的DREB2轉錄因子基因(SEQIDNO:1)，并對其進行了序列分析和蛋白的三維結構預測，結果顯示該基因具有DREB轉錄因子所特有的三個功能結構域，即核定位信號、DNA結合域和轉錄激活域。序列比對表明該cDNA序列和其它已知的DREB基因除了在保守的AP2/EREBP結構域處具有很高的同源性外，在其它區域的序列同源性不高。通過構建植物DREB轉錄因子的系統進化樹分析發現該HhDREB2蛋白主要與DREB2類轉錄因子聚在一起，并且與雙子葉植物的DREB2類轉錄因子的親緣關系更近；分別以基因組DNA和cDNA為模板對HhDREB2進行PCR擴增，擴增產物經序列分析表明，該cDNA序列不含內含子；通過半定量RT-PCR對其組織特異性表達進行檢測，結果顯示該cDNA序列在鈴鐺刺的根、莖、葉中均有表達；通過半定量RT-PCR對其在不同的脅迫條件下進行脅迫反應檢測，結果顯示該cDNA序列的表達受干旱、高鹽和低溫環境逆境的誘導，并且其表達不依賴于ABA的調控。本發明目的之二是提供一類由上述cDNA序列所編碼的鈴鐺刺DREB轉錄因子。本發明目的之二是通過以下技術方案來實現的5一類由上述cDNA序列所編碼的鈴鐺刺DREB轉錄因子，為以下(a)或(b)所示的氨基酸序列(a)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；或(b)將SEQIDNO:2所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或/和插入而獲得的仍具有DREB轉錄因子功能或活性的氨基酸序列。優選的，本發明所述的鈴鐺刺DREB轉錄因子為SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。上文中所述的"多個"通常意味著28個，優選為24個，這些取決于DREB轉錄因子三維結構中氨基酸殘基的位置或氨基酸的種類；所述的"替換"是指分別用不同的氨基酸殘基取代一個或多個氨基酸殘基；所述的"缺失"是指氨基酸序列數量的減少，即分別剔除一個或多個氨基酸殘基；所述的"插入"是指氨基酸序列的改變，相對天然分子而言，所述改變導致添加一個或多個氨基酸殘基。本發明還涉及可以在植物中高效表達所述DREB轉錄因子cDNA序列(SEQIDNO:1)的植物表達載體。將所述DREB轉錄因子cDNA序列插入到植物表達載體合適的限制性酶切位點之間，可操作的與表達調控序列相連接，就可得到在植物中表達該cDNA序列的植物表達載體。例如，該植物表達載體可以由5'非編碼區、SEQIDNO:l所示的cDNA序列以及3'非編碼區所組成，其中，所述的5'非編碼區可以包括啟動子序列、增強子序列或/和翻譯增強序列；所述的啟動子序列可以是組成型、誘導型、組織或器官特異性誘導子。所述的3'非編碼區可以包含終止子序列、mRNA切割序列等；SEQIDNO:1所示的cDNA序列可通過將其一個或多個的堿基進行替換、缺失或/和插入而得到的堿基序列所替換，該堿基序列所編碼的蛋白仍具有DREB轉錄因子的功能。作為本發明的一個最優選的實施方案，所述的高效植物表達載體是pC13rd29A-HhDREB2。本發明還涉及包含上述植物表達載體的植物細胞。轉錄因子通過與下游基因啟動子區域的順式元件結合可以調控一系列相關功能基因的表達，在植物抗性分子育種中，導入轉錄因子基因能有效地提高轉基因植物的抗逆性。因此，可以將本發明DREB轉錄因子cDNA序列應用于提高植物的抗逆性。例如，可以將含有該cDNA序列的植物表達載體導入到植物細胞中，培育篩選得到對環境脅迫的抗性提高了的轉基因植株，其中，所述的環境脅迫可以是干旱、高鹽或低溫等逆境。為了進一步分析本發明〃力ZVffi^轉錄因子基因的功能，本發明首先構建得到含有/ftZW^H基因(SEQIDNO:1)的植物高效表達載體pC13rd29A-HhDREB2，利用農桿菌介導將陽性苗，對轉基因擬南芥苗進行干旱、高鹽及低溫等抗逆性分析并且對其相關生理生化指標進行測定，通過測定生理生化指標得出，轉基因植株的含水量、丙二醛、可溶性糖和脯氨酸含量高于對照，這些滲透調節物質的大量積累有助于減少滲透脅迫和干旱脅迫對植物的傷害，成為轉基因植物抗滲透能力和抗旱能力提高的重要生化證據，也進一步說明過表達本發明說ZW^5i"基因可提高轉基因植物的抗旱性和滲透脅迫抗性，以維持植株正常的生理生化功能。本發明DREB轉錄因子對一系列抗逆功能基因的轉錄以及對脯氨酸和糖含量的促進作用說明本發明DREB因子在植物抗逆反應中起著重要作用。圖1簡并PCR擴增結果。圖23'RACE-PCR擴增結果。圖35'RACE-PCR擴增結果。圖4HhDREB2cDNA全長序列得擴增結果。圖5HhDREB2蛋白的三維空間結構預測。圖6HhDREB2氨基酸序列的系統進化樹分析結果圖7HhDREB2基因的基因組DNA結構分析。圖8HhDREB2基因的組織特異性表達分析結果圖9不同脅迫處理下HhDREB2基因的表達模式分析。圖10表達載體pC13rd29A-HhDREB2的構建流程圖。圖ll重組質粒pC13rd29A-HhDREB2菌落PCR擴增結果。圖12重組質粒pC13rd29A-HhDREB2的酶切結果；1,質粒pC13rd29A-HhDREB2，2.Ba附i/I單酶切；2，5am/H和5^五n雙酶切。圖13含有表達載體pC13rd29A-HhDREB2的農桿菌C58C1的菌落PCR;CK+:連接有目的基因的pMD19-T(陽性對照)，CK-:農桿菌C58C1(陰性對照)。圖14轉基因擬南芥的Hyg抗性篩選圖15轉基因擬南芥的DNA水平的PCR檢測；CK+:連接有目的基因的pMD19-T(陽性對照)，CK-:野生型擬南芥基因組DNA(陰性對照)。圖16轉基因擬南芥的半定量RT-PCR檢測；CK+:連接有目的基因的pMD19-T(陽性對照)，CK-:野生型擬南芥cDNA(陰性對照)。圖17轉基因擬南芥的抗旱性分析。圖18轉基因擬南芥的耐鹽性分析。圖19轉基因擬南芥的耐低溫分析。圖20干旱對植株含水量的影響。圖21高鹽對植株含水量的影響。圖22干旱對丙二醛含量的影響。圖23高鹽對丙二醛含量的影響。圖24干旱對葉片可溶性糖含量的影響。圖25高鹽對葉片可溶性糖含量的影響。圖26干旱對葉片脯氨酸含量的影響。圖27高鹽對葉片脯氨酸含量的影響。具體實施例方式以下通過實施例來進一步描述本發明的制備方法及有益效果，應該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發明的保護范圍。以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版，j.薩姆布魯克)一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒產品說明書進行操作。實施例l鈴鐺刺DREB轉錄因子OZ/LDi^萬2)基因的分離、克隆1材料與方法1.1材料1.1.1植物材料培養及脅迫處理鈴鐺刺(i/a/Zmo^fe"draw/w/o&m/raM)種子采集于新疆塔里木河流域。用250rnM的NaCl將水培4周的鈴鐺刺幼苗進行浸根處理3h、6h，采集葉片立即用液氮處理，保存于-80'C超低溫冰箱中備用。材料的不同脅迫處理分別用250mM的NaCl、20%PEG6000、100pM的ABA溶液、IOO^iM的GA3溶液、lOOpM的BA溶液、lOO)aM的NAA溶液對水培4周的鈴鐺刺幼苗進行浸根脅迫處理，以及置于4'C培養箱中進行低溫處理，分別在處理0、1、3、6、12和24小時取材，將處理后的材料迅速用液氮冷凍，于-8(TC超低溫冰箱中保存備用。1.1.2菌株與質粒大腸桿菌CEsc/ie".c/n'aco&):DH5a本室保存pMD19-T克隆載體購自TaKaRa生物公司1.1.3酶與試劑TRIzol總RNA提取試劑購自北京康潤誠業生物科技有限公司；SuperScriptTMIIIReverseTranscriptase及GeneRacerkit購自Invitrogen公司；pMD19-T載體及限制性內切酶、Taq酶等常用酶類購自寶生物公司；EasyPureQuickGelExtractionKit、EasyPureMiniPlasmidPurificationKit、EasypurePCRPurificationkit均購自北京全式金生物技術有限公司。1.1.4溶液1.TE(pH8.0):10mmol/LTris-HCl;lmmol/LEDTA(pH8.0)2.50XTAE(1L):Tris242.0g;冰醋酸57ml;0.5mMEDTA100ml(pH8.0)3.lMTris-HCl(pH8.0，500ml):Tris60.6g;水400ml;濃HCl21.0mll丄5培養基1丄5.1LB液體培養基(1L,pH7.4):蛋白胨lO.Og，酵母提取物5.0g,NaC110.0g1丄5.2LB固體培養基(1L，pH7.4):蛋白胨lO.Og，酵母提取物5.0g,NaCllO.Og，瓊脂粉15.0g1.1.5.3B5培養基(1L,pH5.8)1.B5液體培養基(1L):lt備液I50ml貯備液II5ml貯備液III5ml貯備液IV5mlCa鹽50ml鐵鹽5ml2.貯存液I(IL)NH4N0333000mgKN0338000mgMgS047H207400mgKH2P043400mg3.貯存液II(IL)KI166mgH3B031240mgMnS044H204460mgZnS047H201720mgNa2Mn042H2050mgCuS045H205mgCoCl26H205mg4.貯存液III(IL)FeS047H205560mgNa2-EDTA2H207460mg5.貯存液IV(IL)肌醇20000mg煙酸100mgVB6100mg100mg甘氨酸400mg6.鈣鹽(IL)CaCl22H208800mg1.2實驗方法1.2.1鈴鐺刺總RNA的提取(TRIzol法)按照TRIzol法提取鈴鐺刺的總RNA;1.2.2第一鏈cDNA的合成(按Invitrogen公司反轉錄試劑盒說明書進行)1.預變性以鈴鐺刺總RNA為模板，以Oligo-dT為引物(工作濃度為10pmol4d)。反應體系如表2-l，混勻后，65。C變性5min，立即置于冰上l-2min;表1RNA預變性體系成分用量TotalRNAlOng-l昭Oligo-dTPrimer(lOpmo,)1単dNTPs(10mMeach)l単DEPCH20XTotal13(^12.反轉錄向上述離心管中加入表2中所列成分后混勻，42°Clh;70。C下15min滅活反轉錄酶；表2反轉錄體系10成分3.RNaseH消化向反應液中加入lpl(2U4U)的RNaseH，37。C20min，消化與cDNA結合的單鏈RNA,-20'(3冰箱保存反轉錄產物。1.2.3DREB轉錄因子家族基因同源片段的克隆1.2.3.1引物的設計與合成利用DNAMAN軟件對GENBANK中已公布的相關科屬植物Z>i^52類基因的氨基酸和核苷酸序列進行同源分析，然后，根據Oi^S基因DNA結合域保守區設計合成一對簡并引物(表3)。表3簡并PCR中使用的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>1.2.3.2RT-PCR根據植物中DifE萬2基因DNA結合域保守區設計的一對簡并引物SP1和ASP2，以用250mMNaCl處理3h和6h的葉片為材料提取總RNA進行RT-PCR，PCR條件為94°C5min;94°C30sec,50°C30sec,72°C30sec,30個循環；72°C10min。反應結束后用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行鑒定。1.2.3.3PCR產物的回收采用北京全式金生物技術有限公司的EasypurePCRPurificationkit回收目的片段，按照試劑盒說明書的方法進行操作。1.2.3.4目的片段與克隆載體的連接將回收的PCR產物連接至pMD19-T載體上，連接反應體系如表4，16'C連接過夜。_表4連接反應體系_<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>LigationMixTotal1.2.3.5大腸桿菌感受態的制備參照《分子克隆實驗指南》(第三版，J.薩姆布魯克)一書中所列的具體方法進行。1.2.3.6大腸桿菌的轉化(熱激法)參照《分子克隆實驗指南》(第三版，J.薩姆布魯克)一書中所列的具體方法進行。1.2.3.7菌落PCR鑒定以含有Amp的LB平板上挑取的白色單菌落，轉入lmlLB(Amp+)液體培養基中，37°C，200rpm搖菌2h，分別吸取1^1菌液作為模板，進行菌落PCR鑒定，弓l物為SPl和ASP2，擴增條件為94°C5min;94°C30sec,50°C30sec，72°C30sec,30個循環；72°C10min。反應結束后用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行鑒定。1.2.3.8重組質粒的核苷酸序列測定將菌落PCR陽性的菌落轉入含Amp的LB液體培養基，37'C下200ipm過夜培養，制備成甘油菌，送中國農業科學院作物科學研究所重大工程開放實驗室測序部測序。1.2.4鈴鐺刺Zyffi)9基因的3'cDNA的克隆1.2.4.1引物的設計與合成根據已獲得的Di^5基因的同源片段，設計1對3、RACE的巢式基因特異引物，由北京奧科生物技術有限責任公司合成，見表5。_表53'RACE反應中使用的引物_引物編號引物序列3HDGSP15，-TATTCTACCTCAGAGGTCCTTCGGC-3'3HDGSP25'-TACCTCAGAGGTCCTTCGGCTC-3,QT5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)24-3'Ql5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3'_^_5'-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3'_1.2.4.2鈴鐺刺總RNA的提取以鈴鐺刺葉片為材料提取總RNA，提取方法同1.2.1。1.2.4.3第一鏈cDNA的合成方法同1.2.2。1.2.4.4巢式PCR擴增3'-端cDNA1.以QT引物反轉錄獲得cDNA為模板，用基因特異引物3HDGSP1與通用5,0^110nl°C5min;94°C45sec,60°C45sec,72°Clmin,30個循環；72°ClOmin;4。C保存。2.將第一輪PCR產物稀釋100倍作為模板，用基因特異引物3HDGSP2與通用引物Q2進行第二輪巢式PCR，反應參數94°C5min;94。C45sec,63。C45sec,72°Clmin,30個循環；72°C10min;4"C保存。3.0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，回收PCR產物并連接至pMD19-T載體，轉化大腸桿菌DH-5cc，利用a互補及菌落PCR篩選陽性克隆，并送中國農業科學院作物科學研究所重大工程開放實驗室測序部測序，方法同1.2.3.3-1.2.3.8。1.2.5巢式PCR擴增5'端cDNA1.2.5.1引物的設計與合成根據已獲得的3'-端cDNA序列設計1對巢式基因特異引物，由北京奧科生物技術有限責任公司合成，見表6。表65'RACE反應中使用的引物引物編號引物序列5HDGSP15'-GAACCCAACCAAATCCTTGACCT-3'5HDGSP25'國AAATTGAGGCGAGCCGAAGGAC-3'GensRac6r5'primer5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3'GeneRacer5"Nestedprimer5'-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3"1.2.5.2第一鏈cDNA的合成(按照Invitrogen公司GeneRacerkit試劑盒說明進行)1.去磷酸在PCR管中加入下表所列成分混勻，離心，50'C條件下處理lh后，離心，置于冰上l-2min。_表7去磷酸化反應體系_成分TotalRNA(l-5ng)IOXCIPBufferRNaseOut(40U/(il)CIP(10U/pl)Total7|oll牟l牟l.Onl10nl2.RNA純化參照《分子克隆實驗指南》(第三版，J.薩姆布魯克)一書中所列的具體方法進行。3.去帽在PCR管中加入下表所列成分混勻，瞬間離心，37'C條件下處理lh后，瞬間離心，置于冰上l-2min。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>4.RNA純化方法同步驟2。5.RNA接頭序列的連接1)將經去磷酸化和去帽處理的RNA轉入另一PCR管中，加入RNA接頭片段，輕輕混勻，離心；2)65°C,5min，冰浴2min，離心；3)在PCR管中加入表9所列成分混勻，離心，37'C條件下處理lhr后，離心，置于冰上l-2min。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>6.RNA純化方法同步驟27.反轉錄方法同1.2.2。1.2.5.3巢式PCR擴增5'-端cDNA1.以QT引物反轉錄獲得cDNA為模板，分別用基因特異引物5HDGSP1與GeneRacer5'primer進行第一輪PCR，反應參數94°C5min;94°C30sec,60°C30sec，72°Clmin,30個循環；72°C10min;4。C保存。2.將第一輪PCR產物稀釋100倍作為模板，用基因特異引物5HDGSP2與GeneRacer5'Nestedprimer進行第二輪巢式PCR，反應參數94°C5min;94°C30sec,62。C30sec,72°Clmin,30個循環；72°C10min;4'C保存。3.0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，回收PCR產物并連接至pMD19-T載體，轉化大腸桿菌DH-5oc，利用a互補及菌落PCR篩選陽性克隆，并送中國農業科學院作物科學研究所重大工程開放實驗室測序部測序，方法同1.2.3.3-1.2.3.8。1.2.6Di五5基因cDNA全長擴增1.2.6.1引物的設計與合成拼接已知的3'-端和5'-端cDNA序列，獲得cDNA全長序列，據此，設計基因特異引物，擴增D/^S基因的cDNA全長序列，所用引物見表IO。1.2.6.2第一鏈cDNA的合成方法同1.2.2。表10cDNA全長序列擴增所使用的引物引物編號引物序列HDREB15'-GTTTTGAAGAAAGATTATCAC-3'HDREB25'-AGTTTAGCGACTCAGGTGGA-3'1.2.6.3Di^S基因cDNA全長序列的克隆及生物信息學分析1.以QT引物反轉錄獲得cDNA為模板，利用基因特異引物HDREB1與通用引物Ql配對,進行第一輪PCR，反應參數94°C5min;94。C30sec,64°C30sec，72'C2min,30個循環；72。C10min;4。C保存。2.將第一輪PCR產物稀釋100倍作為模板，利用基因特異引物HDREB2和與通用引物Q2配對，進行第二輪巢式PCR，反應參數94°C5min;94'C30sec,60°C30sec，72。C2min,30個循環；72'C10min;4'C保存。3.0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，回收PCR產物并連接至pMD19-T載體，轉化大腸桿菌DH-5a，利用cc互補及菌落PCR篩選陽性克隆，并送中國農業科學院作物科學研究所重大工程開放實驗室測序部測序，方法同1.2.3.3-1.2.3.8。4.利用DNAMAN軟件進行序列比對和分析；利用SMART(http:〃coot.embl-heidelberg.de/SMARTZ)分析///D/^S2基因的結構域；利用CPHmodels-2.0服務器分析預測HhDREB2蛋白的三維空間結構0ittD:〃ge加me.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels-2.0Server-3D.htm);禾i」用ScanProsite月艮務器(http:〃www,expasY.org/cgi-bin/prosite)分析///tD及五52基因的結構功能位點。1.2.7DNA序列的擴增及分析1.2.7.1引物的設計與合成根據已獲得的m"i^W基因的cDNA序列，分別在基因5'-端和3'-端設計基因特異引物，所用引物見表ll。表llDi^5基因的基因組擴增所使用的引物引物編號引物序列GnHD(F)5'-AGTTTAGCGACTCAGGTGGA-3'GnHD(R)5'-CGATTATCTAGGCTCAGGCA-3'1.2.7.2鈴鐺刺基因組DNA的提取參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法提取鈴鐺刺基因組DNA。1.2.7.3PCR擴增以鈴鐺刺基因組DNA為模板，以基因特異引物GnHD(F)和GnHD(R)進行PCR擴增，反應參數分別為94。C5min;94。C30sec，60。C30sec,72。Clmin，30個循環；72。C10min;0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，回收PCR產物并連接至pMD19-T載體，轉化大腸桿菌DH-5ot，利用oc互補及菌落PCR篩選陽性克隆，測序，方法同1.2.3.3-1.2.3.8。1.2.8Di^5基因的組織特異性表達1.2.8.1總RNA提取分別提取水培4周鈴鐺刺幼苗的根、莖、葉的總RNA，提取方法同1.2.1。1.2.8.2引物的設計與合成利用DNAMAN軟件對GENBANK中已公布的豆科植物肌動蛋白基因的保守區進行同源性分析，以大豆Actin(U60506)為內標基因，設計肌動蛋白基因特異引物Actin-F和Actin-R;根據已得到的i)i^基因cDNA序列，在基因的非保守區設計基因特異引物，所用引物見表12。表12i)i^5基因在脅迫下的表達分析所使用的引物引物編號引物序列HDRT(F)5'-GGCGGTTATGATGGAAGAAGA-3'HDRT(R)5'-GAAGAGCGGTTTGGATAGCAT-3'Actin-F5'-CAACCTTAATCTTCATGCTG-3'Actin-R5'-AGCAACTGGGATGACATGGAG-3'1.2.9Di^5基因在不同脅迫條件下的表達譜分析1.2.9.1引物的設計與合成16同1.2.8.2。1.2.9.2DREB轉錄因子基因對不同激素條件脅迫的應答將水培4周的鈴鐺刺幼苗分別插入含有IOOpM的生長素/萘乙酸/NAA溶液、100uM的細胞分裂素/6—芐基氨基嘌呤(BA)溶液、100UM的赤霉素(GA3)溶液以及lOOuM的脫落酸(ABA)溶液中進行不同激素脅迫處理；分別提取處理0、1、3、6、12和24小時的葉片總RNA，反轉錄獲得的cDNA作為PCR擴增模板，以肌動蛋白基因為內標基因，利用基因的特異引物HDRT(F)和HDRT(R)進行RT-PCR擴增，Actin擴增參數94。C5min;94°C30sec，60'C30sec,72'C45sec，28個循環；72°C10min;基因非特異片段擴增參數94°C5min;94°C30sec，58°C30sec,72°C30sec,28個循環；72°ClOmin;檢測基因的表達變化。1.2.9.3DREB轉錄因子基因對干旱、高鹽及低溫脅迫條件的應答將水培4周的鈴鐺刺幼苗分別插入含有250mM的NaCl溶液、20%PEG6000溶液以及置于4t培養箱中進行高鹽、干旱以及低溫脅迫處理。分別提取處理O、1、3、6、12和24小時的葉片總RNA，反轉錄獲得的cDNA作為PCR擴增模板，以肌動蛋白基因為內標基因，利用基因特異引物HDRT(F)和HDRT(F)進行RT-PCR擴增，反應參數同1.2.9.2;檢測i7/LD/^52基因的表達變化。2實驗結果與分析2.1/^￡5基因同源片段的獲得對己報道的DREB2蛋白序列進行了同源比對分析，發現DREB2蛋白的DNA結合域的氨基酸序列在不同植物、不同DREB2家族中都呈現出高度保守的特性，因此利用該保守區域進行了簡并引物的設計，以葉片總RNA反轉錄獲得的cDNA為模板，通過簡并PCR擴增出約280bp的目標帶(圖l)，與預期大小一致。將回收的PCR產物連接至pMD19-T載體上，轉化大腸桿菌DH-5a，利用oc互補及菌落PCR篩選出6個陽性克隆，測序后得到1條282bp的序列。序列檢索結果顯示，與大豆、陸地棉及擬南芥的/^fi^基因核苷酸序列具有較高的一致性，初步判斷該片段為鈴鐺刺"7ffiS基因保守區。2.2Z必59基因cDNA3'序列和5'序列的獲得經序列比對，利用已獲得的ZW^^基因同源片段，設計基因特異引物；利用基因特異引物3HDGSP1和3HDGSP2分別與3'通用引物Ql、Q2進行3'RACE擴增，電泳檢測，得到1條約530bp擴增產物(圖2)，測序結果表明，該片段為532bp,且5'端序列有149bp與原同源片段部分重疊，判斷為目標WffiS基因的3'端序列。利用特異引物5HDGSP1和5HDGSP2分別與GeneRacer5'Primer和5'NestedPrimer進行5'RACE擴增，電泳檢測得到1條約450bp的擴增產物(圖3)，測序結果表明，該片段為373bp,且3'端序列有165bp與原同源片段部分重疊，判斷為目標2W^9基因的5'端序列。2.3M，朋基因cDNA全長序列的獲得利用基因全長特異引物HDREB1和HDREB2分別與3'通用引物Ql、Q2，巢式PCR獲得1條約800bp擴增產物條帶(圖4)。測序結果表明，其全長序列為873bp，序列比對結果顯示，與多種植物Di五5家族的基因有較高相似性,推斷為新的Z)ii^基因，命名為//W)i^5入2.4鈴鐺刺Z)iEScDNA全長序列分析2.4.1Di^B基因的序列特征分析及編碼蛋白的結構功能預測利用DNAMAN軟件對ZfADi五S2基因的全長cDNA序列進行分析，結果表明i/ZzZ^五52基因序列全長為873bp，完整開放閱讀框519bp，編碼172個氨基酸。該蛋白含有一個典型的AP2/EREBP結構域，該結構域由59個氨基酸組成，其中第14位為保守的纈氨酸，而第19位為谷氨酸，屬于DREB基因家族。經PSORT分析預測該蛋白定位于細胞核，判斷為典型的DREB轉錄因子。2.4.2DREB蛋白的三維空間結構預測利用CHPmodels-2.0(http:〃genome.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels-2.0server)服務器來預測DREB2蛋白的三維空間結構(圖5)，結果顯示DREB2蛋白的空間結構中具有1個ot-螺旋，3個P-折疊組成，這是一個典型的DREB轉錄因子所具有的空間結構，這從蛋白所具有的空間結構的角度證明了該基因所編碼的蛋白是DREB類轉錄因子。2.4.3HhDREB2蛋白與其它DREB2類蛋白的同源性比對及系統進化樹分析植物中的DREB類基因可以分為兩大類，一類是由低溫誘導的DREB1類轉錄因子；另一類是由干旱、高鹽環境脅迫誘導的DREB2類轉錄因子。通過DNAMAN軟件對鈴鐺刺//M)i五52基因與其它已經克隆的DREB基因進行系統進化樹分析，結果表明i/Z^及五B2基因主要與DREB2類轉錄因子聚在一起，并且與雙子葉植物的大豆DREB2類轉錄因子的親緣關系更近。因此，將克隆到的DREB轉錄因子基因丑/tDJ^S2與植物中的DREB2類轉錄因子進行同源性比對分析，序列比對結果(圖6)顯示該轉錄因子基因全序列在蛋白水平上與其它植物DREB2類蛋白的同源性不高，一致性約為26.23%，僅在AP2/EREBP結合域中有高度保守性。并且發現DREB類轉錄因子第14位的纈氨酸(V14)非常保守，而第19位的氨基酸并不保守，有的為谷氨酸(E19)，有的為亮氨酸(L19)。進一步證明在DREB相關蛋白中決定DNA結合特異性方面，V14的作用明顯要比El9和L19重要。2.5鈴鐺刺ZfM)i五52基因的基因組DNA結構分析以鈴鐺剌基因組cDNA和DNA為模板，以GnHD(F)與GnHD(R)為引物進行PCR擴增，得到2條約750bp的擴增產物；經回收測序表明，這2個條帶均為762bp、762bp。測序結果分析顯示，///LDi^S2基因無內含子(圖7)。2.6Z)i^B基因的組織特異性表達分析分別提取鈴鐺刺的根、莖、葉的總RNA，提取方法同1.2.1。利用半定量RT-PCR對//M)i^52基因在不同組織中的表達情況進行了檢測，結果該基因在根、莖、葉中均有表達，在葉中的表達量較根和莖中高，由此可見該基因的表達均無明顯的組織特異性。(圖8)。2.7Z)i^5基因在不同脅迫條件下的表達模式分析對H/LDi^萬2基因在不同脅迫條件下進行表達模式分析(圖9)，結果顯示i7/LDi^52對高鹽、干旱和低溫均有應答。用250mMNaCl高鹽溶液處理后在1小時///lD7^B2基因表達開始積累，3h后達到峰值，隨后又逐漸減弱；干旱處理lhi/AZ)i^52基因開始表達，6h后表達量達最大；由實驗結果可以明顯看出，該基因對低溫也具有應答反應，并且低溫處理6h時達到峰值，而用激素處理時發現，NAA、GA3和BA對iZ/i)i^52基因的表達無明顯影響，此基因對外源ABA無應答反應。綜上所述，W/ld/^52基因能被高鹽、干旱和低溫所誘導表達，并且這種誘導作用并不依賴于ABA信號調節途徑。禾擁生物學軟件對說i)i^52基因進行分析，發現該基因的AP2/EREBP結構域中的第14位存在著已被證實與DRE順式作用元件具有特異性結合機制的功能性氨基酸，即纈氨酸(14V)。而第19位均為亮氨酸，并非谷氨酰胺，這也充分說明19位氨基酸的非保守性，進一步證明在DREB相關蛋白中決定DNA結合特異性方面，V14的作用明顯要比E19和L19重要。此外，根據植物DREB受不同條件的誘導表達，植物中的DREB類轉錄因子可分為DREB1和DREB2兩種類型。對不同植物DREB轉錄因子親緣關系的分析表明，HhDREB2被歸類在雙子葉植物的DREB2轉錄因子類中，與大豆的GmDREB2關系最近。研究表明，在DREB轉錄因子的C-端一般存在一個轉錄激活域，它們以富含酸性氨基酸、谷氨酰胺、脯氨酸或絲氨酸和蘇氨酸為特征，此結構域是激活目標基因轉錄所必須的。在i7/^i^52轉錄因子基因C-端具有明顯的轉錄激活域，說明該轉錄因子蛋白具有轉錄激活功能。同時說明HhDREB2蛋白中的絲氨酸富集區通過位點的磷酸化作用分別調控蛋白的DNA結合域對DRE元件的結合能力和酸性激活域的轉錄激活能力。19試驗例1含有鈴鐺刺//力/W^Si"基因的植物高效表達載體的構建及在擬南芥中的相關功能驗證2材料與方法2.1材料2.1植物材料擬南芥哥倫比亞生態型(Columia-0)，由中國農業科學院生物技術研究所梁華老師贈送。2.1.2菌種及載體大腸桿菌CB.co/!')DH5a，由本實驗室保存；農桿菌Ugra6a"en'wm^me/ade/w)菌株C58C1，由中國農業科學院作物科學研究所馬有志研究員贈送；雙子葉植物表達載體pCAMBIA-1302(說明雙子葉植物表達載體pCAMBIA-1302為常用植物表達載體，在NCBI上可以査到其全序列)，由中國科學院植物研究所沈世華研究員贈送；rd29A啟動子序列參見文獻(楊春霞.擬南芥逆境誘導型啟動子rd29A的克隆及活性檢測[J].2008年；南京林業大學學報)。pMD19-T克隆載體，購自TaKaRa。2丄3酶及化學試劑各種限制性內切酶、ExTaq酶購自Takara公司；T4DNALigase購自Promega;EasyTaq酶購自購自北京全式金生物技術有限公司；TRIzol總RNA提取試劑購自北京康潤誠業生物科技有限公司；GentamicinSulfate、SilwetL-77購自Amresco;磺基水楊酸購自國藥集團化學試劑有限公司；硫代巴比妥酸(TBA)及三氯乙酸(TCA)購自北京化學試劑公司，其他試劑均為國產或進口分析純試劑。2丄4試劑盒EasyPureQuickGelExtractionKit、EasyPureMiniPlasmidPurificationKit、EasypurePCRPurificationkit均購自北京全式金生物技術有限公司；SUPERSCRIPTIIlReverseTranscriptase購自Invitrogen公司。2.1.5培養液l.YEB培養基參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法；2丄B細菌培養基參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法；3.MS培養基參見實用植物組織培養技術教程(甘肅科學技術出版社)曹孜義主編所列的具體方法；4.MS選擇培養基MS基本培養基中加入潮霉素(30mg/L)2.2方法2.2.1引物設計與合成分別設計合成含有酶切位點《/wI和5flw/n的引物pC13rd29A(F)和pC13rd29A(R)、分別含有酶切位點5am/ZI禾卩5W五II的弓|物pC13rd29A-HhDREB2(F)和pC13rd29A-HhDREB2(R)，序列見表13。表13構建植物表達載體所用引物引物編號引物序列pC13rd29A(F)5'-CGGGGTACCACAAACTTACGAAAT-3'pC13rd29A(R)5'-CGCGGATCCCCAATAGAAGTAATC-3'pC13rd29A-HhDREB2(F)5'-ATAGGATCCACCATGATGGAAGAAGA-3'pC13rd29A-HhDREB2(R)5'-AGGGTCACCCATTATGAGAGGTATCT-3'2.2.2植物表達載體的構建2.2.2.1植物高效表達載體pC13rd29A-HhDREB2的構建參照《分子克隆實驗指南》(第三版)j.薩姆布魯克一書中所列的具體方法提取野生型擬南芥基因組DNA，以野生型擬南芥基因組DNA為模板，利用引物pC13rd29A(F)和pC13rd29A(R)進行PCR擴增，反應參數分別為94°C5min;94°C30sec,55°C30sec,72。Clmin,30個循環；72°C10min;0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，回收PCR產物并連接至pMD19-T載體，反應體系同1.2.3.4，轉化大腸桿菌DH-5cc，利用oc互補及菌落PCR篩選陽性克隆，并送中國農業科學院作物科學研究所重大工程開放實驗室測序部測序，方法同1.2.3.3-1.2.3.8。利用引物pC13rd29A(F)和pC13rd29A(R)從連接有誘導型啟動子rd29A的pMD19-T載體擴增出啟動子全長，利用引物pC13rd29A-HhDREB2(F)和pC13rd29A-HhDREB2(R)從連接有全長///lD/^52cDNA的pMD19-T載體上擴增出完整的開放閱讀框。擴增產物和載體均經相應的酶切、瓊脂糖凝膠電泳、回收后，T4連接酶，構建中間載體pC13rd29A與植物高效表達載體pC13rd29A-HKDREB2。2.2.2.2重組質粒轉化大腸桿菌DH5a及菌落PCR鑒定參照《分子克隆實驗指南》(第三版)j.薩姆布魯克一書中所列的具體方法；2.2.2.3重組質粒的小量提取及酶切鑒定21參照北京全式金生物技術有限公司EasyPureMiniPlasmidPurificationKit所列的具體方法；2.2.3擬南芥的遺傳轉化2.2.3.1農桿菌C58C1電擊感受態細胞的制備1.用接種針在YEB固體培養基平板上劃線培養單菌落；2.挑取單菌落接種于5ml含適當抗生素的YEB液體培養基中，28°C、250rpm振蕩培養過夜；3.按1:25-50接種于100ml含適當抗生素的YEB液體培養基中，繼續培養4-6小時；4.將菌液冰浴30min，期間不斷搖動；5.轉入2個50ml離心管，4°C、4000rpm、lOmin;6.去上清，加入10-15ml滅菌蒸餾水，重懸沉淀，4°C、4000rpm、lOmin;7.去上清，加入10mllO。/。滅菌甘油，重懸沉淀，4°C、4000rpm、lOmin;8.重復第7步；9.去上清，用回流的甘油重懸沉淀；10.用0.5ml離心管分裝，每管20pl，-80匸保存備用。2.2.3.2電擊轉化將連接有目的基因的質粒轉化到農桿菌C58C1中1.取20nlC58Cl感受態細胞，加入0.5^1質粒混勻；2.340-360V電壓電擊轉化；3.加入lmlLB液體培養基28°C、250rpm恢復培養3h;4.取50^1涂LB抗性平板(50mg/LKan，50mg/LRif，50mg/LGent)28。C培養2-3天。2.2.3.3含有重組質粒的農桿菌的PCR鑒定挑取LB平板上的單菌落，接種于5mlLB液體培養基(含50mg/LKan，50mg/LRif，50mg/LGent)中，28'C培養l-2d，以未轉化的農桿菌作對照，進行菌落PCR鑒定。2.2.3.4擬南芥的培養1.種子處理取適量種子于1.5ml離心管中用70。/。的乙醇洗3min，無菌水洗3次，0.5%次氯酸鈉(NaClO)洗10min，無菌水洗3次，均勻撒播于MS培養基平板上，注意每次洗脫用Vortex充分混勻；2.播種后MS平板于4'C春化3天；3.將MS平板放置于22光照培養箱培養；4.待小苗長出四片真葉后移栽至用MS液體培養基澆灌過蛭石中生長，保濕2-3天；2.2.3.5Floral-dip法轉化擬南芥植株1.挑鑒定過的農桿菌單菌落，接種于5mlLB液體培養基中28'C、250rpm培養24h;2.按1:50轉接，28°C、250rpm繼續培養至OD4.53.0;3.室溫離心，5000rpm、15min;4.用懸浮液懸浮菌體，180rpm慢慢將菌體搖勻；5.將已經交足水開花的擬南芥倒置，使花蕾朝下侵染液中42s;6.取出轉化后的擬南芥植株平放，蓋好保鮮膜，低光照強度下生長24h后置于正常光照條件下直立生長培養；附懸浮液(滅菌蒸餾水，10mMMgCl2，5%蔗糖，0.3%Silwelt-77)。2.2.4轉基因擬南芥的篩選2.2.4.1Hyg抗性苗的篩選將T。代收獲的種子消毒(參考本實例2.2.3.4)，均勻撒播于含有Hyg抗性的MS平板上進行抗性篩選。2.2.4.2轉基因擬南芥的DNA水平鑒定利用CTAB法小量提取在含有Hyg培養基中生長的擬南芥總DNA，通過PCR檢測進一步篩選陽性擬南芥植株。若擴增出了目標片段，而陰性對照中沒有擴增出片段，即初步證明目的基因整合到擬南芥基因組中。2.2.4.3轉基因擬南芥的RT-PCR檢測選擇PCR確定的陽性轉化株，剪取葉片，TRIzol提取總RNA，反轉錄獲得cDNA作為模板，RT-PCR檢測篩選陽性轉化苗。方法參照實例1中的1.2.6.1-1.2.6.1;PCR反應參數94°C5min;94°C30sec,60°C30sec，72°C2min,30個循環；72°C10min;0.8%的瓊脂糖凝膠電泳。2.2.5轉基因擬南芥的耐脅迫分析用生長2周左右的的擬南芥植株進行非生物脅迫抗性鑒定，設三個重復l.耐旱鑒定將野生型植株與轉基因型植株置于22°C光照培養箱中，控水處理4周；分別在0d、7d、14d取樣，液氮處理后，置于-80°C保存；待處理4周之后，復水觀察其生長狀況。2.耐鹽鑒定將250mM的NaCl溶液澆于栽有野生型和轉基因型擬南芥的盆中，22°C光照培養箱中處理4周；分別在Od、7d、14d取樣，用液氮處理后，置于-80°C保存；待處理4周后復水觀察植株的生長情況。3.耐低溫鑒定把轉基因植株與野生型植株置于-6'C處理12h，轉到fC適應2h后，轉移到正常的生長條件下繼續培養2周，觀察植株的生長情況。2.2.6轉基因擬南芥在逆境條件下的生理生化指標測定2.2.6.1脅迫處理完畢后，收取整株植株，用蒸餾水沖洗干凈，吸水紙吸干表面水分。每個處理取6棵單株，并迅速測其鮮重，之后放入12CTC烘箱中烘烤30min，8(TC烘烤48h至恒重，稱量其干重。對上述測得的干、鮮重，采用公式組織含水量(占鮮重％)=(鮮重-干重)/鮮重進行含水量的計算。2.2.6.2丙二醛(MDA)及可溶性糖的測定丙二醛的提取稱取經逆境脅迫處理的植株葉片0.5g，加入少量石英砂和10%三氯乙酸4mL，研磨至勻漿，然后以4000ipm離心10min，其上清液即為丙二醛提取液，每個處理取6棵單株。顯色反應及測定取若干干凈試管并編號，各加入1mL的提取液，對照加lmL蒸餾水；然后再加入2mL0.6%硫代巴比妥酸溶液；搖勻，將混合液在沸水浴中反應15min,迅速冷卻后低速離心；然后取上清液分別在532nm、600nm和450nm波長處測定吸光度值。可溶性糖及MDA含量的計算C(糖)=11.7"A450(腿ol/L)C(MDA)=6.45*(A532—A600)—0.56*^50(,ol/L)公式中A450—在450nm波長下測得的吸光度值八532—在532nm波長下測得的吸光度值A6()o—在600nm波長下測得的吸光度值C糖、C(MDA)分別是反應混合液中可溶性糖、MDA的濃度。2.2.6.3轉基因植株脯氨酸含量分析脯氨酸的提取用液氮迅速研磨經不同處理的待測植株葉片，并轉移至大試管中快速稱重約0.3g(差量法)，然后向各管分別加入5mL3%的磺基水楊酸溶液，管口加蓋玻璃球，在沸水浴中提取10min，提取過程中要經常搖動，冷卻后低速離心，上清即為脯氨酸提取液，將上清轉移至干凈的試管中待測。脯氨酸含量的測定采用日立835-0200氨基酸自動分析儀對脯氨酸含量進行分析3實驗結果與分析3.1植物表達載體的構建3.1.1表達載體pC13rd29A-HhDREB2的構建利用引物pC13rd29A(F)和pC13rd29A(R)從連接有全長啟動子的pMD19-T載體上擴增出其全長。擴增產物和載體均經相應的酶切、瓊脂糖凝膠電泳、回收后，T4連接酶將W2A4連接至pCAMBIA1302相應的酶切位點，轉化大腸桿菌DH5a，PCR擴增篩選重組質粒，并進行相應的酶切鑒定，構建中間載體pC13rd29A。利用引物pC13rd29A-HhDREB2(F)、pC13rd29A-HhDREB2(R)從連接有//M)i^52基因全長的pMD19-T載體上擴增出其的全長。擴增產物和中間載體均經相應的酶切、瓊脂糖凝膠電泳、回收后，T4連接酶將7/;^i^52連接至pC13rd29A相應的酶切位點，構建植物表達載體pC13rd29A-HhDREB2。構建過程見圖10。3丄2重組質粒的菌落PCR鑒定在重組質粒的轉化LB(Kan+)平板上，分別挑取三個白色單菌落，進行菌落PCR鑒定，結果/^Di^52有兩個陽性，見圖11。3丄3重組質粒的酶切鑒定將PCR檢測的陽性菌落轉入LB(Kan+)液體培養基，37。C搖菌過夜，EasyPureMiniPlasmidPurificationKit試劑盒小量提取重組質粒，進行酶切鑒定。pC13rd29A-HhDREB2重組質粒均被切出目標帶，酶切結果正確，見圖12。3.2含有表達載體的農桿菌PCR檢測將重組質粒pC13rd29A-HhDREB2轉化農桿菌C58C1，以轉化后的農桿菌的菌液作模板，未轉化的農桿菌作陰性對照，質粒做陽性對照，進行菌落PCR鑒定。檢測結果表明，該重組質粒已成功轉入農桿菌中，見圖13。3.3轉基因擬南芥的篩選與鑒定3.3.1Hyg抗性苗的篩選采用Floral-dip法轉化擬南芥，收集轉基因當代植株的種子(T,代)，在Hyg-MS培養基上篩選(圖14)。野生型植株為黃花苗，不能正常生長，轉基因植株在Hyg-MS培養基上能正常生長。播種后十三天將綠苗轉入蛭石草炭土=3:1的培養土中繼續培養。3.3.2轉基因擬南芥的DNA水平鑒定25選取正常生長Hyg抗性苗，剪取其葉片，采用CTAB法提取其DNA，以擬南芥DNA為模板，以構建植物表達載體時設計的pC13rd29A-HhDREB2(F)和pC13rd29A-HhDREB2(R)引物為引物，采用PCR技術，對Hyg抗性苗進行DNA水平的檢測。結果表明，檢測pC13rd29A-HhDREB2轉化的Hyg抗性苗26株，22株為陽性，陽性率84.6%，部分植株PCR檢測見圖15，證明/^i)i^萬2已經整合到擬南芥基因組中。3.3.3轉基因擬南芥的RT-PCR檢測分別選取DNA水平鑒定的22株陽性擬南芥植株葉片為材料，提取總RNA，以反轉錄獲得的cDNA為模板，RT-PCR對陽性苗作進一步的檢測。結果表明，22株pC13rd29A-HhDREB2轉化的擬南芥植株葉片中，20株檢測為陽性，陽性率90.9%，部分植株RT-PCR檢測見圖16。3.4轉基因擬南芥的耐脅迫分析耐旱性分析結果轉基因植株和野生型植株在正常生長條件下培養，但不澆水，4周后，發現野生型植株全部死亡，而/f/LDi^52轉基因植株有60。/。存活，復水后繼續生長，并正常結實，見圖17。耐鹽性分析結果轉基因植株和野生型植株用250mM的NaCl溶液處理，4周后野生型植株全部死亡，統計結果表明H/LDi^52轉基因植株，仍有36%存活下來，轉移至生長條件下仍能生長，見圖18。耐低溫分析結果轉基因植株和野生型植株在-6'C處理12h，發現野生型植株的葉片多數凍傷萎蔫，而轉基因植株大多數仍然正常。轉到4'C適應2h后，再轉移到正常生長條件下培養，2周后統計成活率，野生型植株僅5%存活下來，然而表型出現生長緩慢，植株矮小；而H/LDi^52轉基因植株有3P/。存活下來，并有部分植株正常開花結實，見圖19。3.5轉基因擬南芥在逆境條件下的生理生化指標測定3.5.1脅迫處理對植株含水量的影響表14轉基因植株與對照干旱脅迫下植株含水量差異o天7天14天野生型植株含水量平均值92.3%87.5%82,1%轉基因植株含水量平均值92.2%90.1%86.3%表15轉基因植株與對照高鹽脅迫下植株含水it差異o天7天14天野生型植株含水量平均值92.3%89.2%88.4%轉基因植株含水量平均值92.1%90.2%89.6%已有研究表明，干旱和高鹽逆境都可造成植物體的滲透脅迫，導致細胞失水，嚴重的可造成細胞膨壓喪失，導致死亡。本實例通過測定脅迫條件下野生型與轉基因型植株含水量的26變化，從而在個體水平上獲得轉基因植株較野生型植株抗逆性有顯著提高的直接證據。結果顯示，干旱(表14與圖20)和高鹽(表15與圖21)處理后野生型和轉基因植株的含水量都呈下降趨勢。在脅迫處理前，轉基因植株的含水量與野生型植株的含水量沒有明顯差異；當脅迫處理達到7d和14d時，轉基因型植株的葉片含水量明顯高于野生型植株的葉片含水量。這表明插入的外源基因^力ZW^H，對干旱和高鹽脅迫下的細胞失水有了一定的緩解作用，從而提高了植株在脅迫下的耐逆性。3.5.2脅迫處理對植株MDA含量的影響表16轉基因植株與對照干旱脅迫下植株MDA含量的差異(單位ymol/g)0天7天14天野生型植株MDA含量平均值0.0150.0220.025轉基因植株MDA含量平均值0.014_0.0150.017表17轉基因植株與對照高鹽脅迫下植株MDA含量的差異(單位timol/g)0天7天14天野生型植株MDA含量平均值0.0150.0240.037轉基因植株MDA含量平均值0.016_0.0210.017植物器官衰老或遭受逆境脅迫傷害時，往往會發生膜脂過氧化作用，丙二醛(MDA)是膜脂過氧化作用的最終分解產物，它的含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度。表16與圖22結果顯示，隨著干旱處理時間的增加，轉基因和野生型植株的MDA含量都呈上升趨勢，這表明干旱脅迫對轉基因和野生型植株均造成了一定程度的傷害。但隨著脅迫處理時間的增加，野生型植株MDA含量增加更為顯著。其中干旱脅迫處理14d后，野生型植株的MDA含量比沒有經過干旱處理的植株增加66.7%，而轉基因型植株的MDA含量僅增加21.4%。T-test統計分析結果表明，干旱處理下轉基因型植株的MDA含量顯著低于野生型植株的MDA含量(p<0.05)。從表17與圖23可以看出，鹽脅迫處理可以極顯著提高野生型植株的MDA含量(pO.Ol)。轉基因型植株經7d鹽脅迫處理后，MDA含量有所提高，但14d鹽脅迫處理的植株的MDA含量反而要低于7d脅迫處理下植株的MDA含量。這可能是由于DREB轉錄因子的下游與鹽脅迫以及抗氧化有關的信號分子產生了應答，從而降低了MDA含量。野生型和轉基因型植株的MDA含量分析結果表明，轉錄因子在逆境脅迫下能夠降低脂膜過氧化作用從而保證細胞內脂膜的完整性。這可能是由于F/LDi￡52下游信號與過氧化自由基抗性分子(如谷胱甘肽，過氧化氫酶，過氧化物酶等)相偶聯，從而保護了細胞膜。3.5.3脅迫處理后植株可溶性糖含量的變化表18轉基因植株與對照高鹽脅迫下植株可溶性糖含量的差異(單位mmol/g)0天7天14天野生型植株可溶性糖含量平均值0.0790.1140.142轉基因植株可溶性糖含量平均值0.0760.1260.169表19轉基因植株與對照高鹽脅迫下植株可溶性糖含量的差異(單位mmol/g)0天7天14天野生型植株可溶性糖含量平均值0.0780.0840.121轉基因植株可溶性糖含量平均值0.0770.1050.130在脅迫的環境中，植物為了減緩由脅迫造成的生理代謝不平衡，細胞內大量積累一些小分子有機化合物。可溶性糖便是脅迫誘導的小分子溶質之一，通過滲透調節來降低水勢，維持較高的滲透壓，保證細胞的正常生理功能。從表18、圖24和表19、圖25可以看出，干旱脅迫和鹽脅迫都能夠使植株內可溶性糖含量增加。這說明植株在脅迫條件下會自發的產生相應的應答機制來抵抗逆境脅迫。但隨著處理時間的增長，轉基因植株可溶性糖含量的增加要高于野生型植株可溶性糖含量的增加。在干旱脅迫處理14d后，野生型植株可溶性糖含量是未經處理的1.79倍，而轉基因型可溶性糖含量是未經處理的2.22倍。鹽脅迫處理下可溶性糖含量也要顯著高于野生型可溶性糖含量(p<0.05)。植株的可溶性糖含量分析結果表明，在逆境脅迫條件下，植物可以自發產生可溶性糖從而保證細胞體內正常的代謝過程。插入/f/^i^52轉錄因子的轉基因植株，可以在逆境條件下產生更多的可溶性糖來抵抗逆境脅迫。3.5.4脅迫處理后脯氨酸含量變化表20轉基因植株與對照高鹽脅迫下植株脯氨酸含量的差異(單位mmol/g)<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>表21轉基因植株與對照高鹽脅迫下植株脯氨酸含i<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，具有很強的水和能力，其疏水端可和蛋白質結合，親水端可與水分子結合，使蛋白質可以借助脯氨酸束縛更多的水，從而防止滲透脅迫下蛋白質的脫水變性。因此，脯氨酸在植物的滲透調節中起重要作用。在正常的條件下，植物體內脯氨酸的含量并不高，但當遭受干旱、鹽害等脅迫時，游離脯氨酸便會大量積累，并且積累指數與植物的抗逆性有關，在一定程度上反映植物受水分和鹽脅迫的情況，可作為植物抗逆性的一項生理指標。從表20、圖26可以看出經7d干旱脅迫處理后野生型植株的脯氨酸含量有所上升，但是當14d干旱處理的植株的脯氨酸含量卻低于7d處理。這可能是由于14d干旱處理后，野生型植株的代謝調控機制已經紊亂，不能夠產生出抵抗干旱脅迫的相應應答。而轉基因型植株的脯氨酸含量隨著處理時間的增長而提高。這表明轉基因型植株對干旱脅迫有更好的適應能力。從表21、圖27可以看出，在鹽脅迫處理下，野生型植株和轉基因植株的脯氨酸含量都有所增加，但是轉基因型植株的脯氨酸含量顯著高于野生型(p<0.05)。這一結果表明，///LDi^52轉錄因子在擬南芥體內過量表達后，其下游信號的放大會導致脯氨酸大量合成，從而提高轉基因植株對逆境脅迫的耐受性。植物對滲透脅迫和干旱的抗性可以從三方面進行考察:第一，表現在逆境下的形態特征，第二，轉錄水平脅迫相關基因的表達量變化，第三，植物生理生化的變化也高度適應逆境抗性。脅迫相關基因轉錄水平的變化可以從分子水平提供植物抗性增強的佐證；脯氨酸的含量作為植物抗旱指標，成為衡量植物是否抗旱的生化依據，可溶性糖作為滲透調節物質，在滲透脅迫下的積累，有助于植物細胞降低滲透勢和水勢，減少滲透脅迫對植物的危害，這些滲透調節物質的含量也成為植物抗滲透脅迫的重要指標；而丙二醛(MDA)是膜脂過氧化作用的最終分解產物，它的含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度。本實例通過測定野生型和轉基因型植株在不同時間干旱、鹽脅迫處理下的各項生理指標，來研究野生型植株和轉基因型植株對干旱和鹽脅迫的耐受性。通過生理生化指標研究得出，轉基因植株的植株含水量、可溶性糖和脯氨酸含量高于對照，而丙二醛含量低于對照，此四項指標均成為轉基因植物抗滲透能力和抗旱能力提高的重要生化證據，也進一步說明過表達基因可能通過調節滲透調節物質的含量提高轉基因擬南芥的抗旱性和滲透脅迫抗性，以維持植株正常的生理生化功能。29序列表<110>中國農業科學院生物技術研究所<120〉與植物抗逆性相關的cDNA序列及其表達載體和應用<130〉xulie0887<160>2<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>873<212>DNA<213>HalimodendronhalodendronV.<400>1gttttgaagaaagattatcacatatagttagttactaggtatttggttaagtttagcgac60tcaggtggatgatataggtagggagcagaggcggaattaaggcggttatgatggaagaag120aaagagattgttgttcaacgatcacaagaagcagaatcagcaacagccctccagagaagc180ggaaacaacaacagcaagagaagccatacagaggaataaggaggaggaagtgggggaagt240gggtggcagagatcagagaaccaaacaaaaggtcaaggatttggttgggttcttacacca300cccctgtagccgctgcacgtgcctacgacatcgccgtattctacctcagaggtccttcgg360ctcgcctcaatttcccggaattgttattccaagacgacgacgacgaagtcggttccgtcc420aacaagctgcaggcgacatgtccgccgattcaatacgcaaaaaagccacccgagtcggcg480caagagtggatgctatccaaaccgctcttcaggcctcctcccgctccacttccactcgat540tcacctccgacaaaccggatttgaacgagtttccaaagcctgaagattcccttgatgact600ttgaattgttaacagagcgtatatagcaagaactagatacctctcataatgcaactttct660tttaaggtttttttttaagaaagtaccatgaatttaattgttcactttgtgtgtgggttc720tctttgacggagcatgtgtatgagttttatcaggtttggtctgttgcaagttgtacaagg780tgtgtgtctgttgcctgagcctagataatcgaatcaaaataaccaattttcgttggttga840atttttcttcasaaaaaaasaaaaaaaasa3a3873<210>2<211>172<212>PRT<213>HalimodendronhalodendronV.<400>2MetMetGluGluGluArgAspCysCysSerThrlieThrArgSerArg151015lieSerAsnSerProProGluLysArgLysGinGinGinGinGluLys202530ProTyrArgGlylieArgArgArgLysTrpGlyLysTipValAlaGlu354045lieArgGluProAsnLysArgSerArglieTrpLeuGlySerTyrThr505560ThrProValAlaAlaAlaArgAlaTyrAsplieAlaValPheTyrLeu65707580ArgGlyProSerAlaArgLeuAsnPheProGluLeuLeuPheGinAsp859095AspAspAspGluValGlySerValGinGinAlaAlaGlyAspMetSer100105110AlaAspSerlieArgLysLysAlaThrArgValGlyAlaArgValAsp115120125AlalieGinThrAlaLeuGinAlaSerSerArgSerThrSerThrArg130135140PheThrSerAspLysProAspLeuAsnGluPheProLysProGluAsp145150155160SerLeuAspAspPheGluLeuLeuThrGluArglie165170權利要求1、一種從鈴鐺刺中所分離的編碼干旱應答元件結合蛋白的cDNA序列，其特征在于該cDNA序列為以下(a)或(b)所示的堿基序列(a)SEQIDNO1所示的堿基序列；或(b)將SEQIDNO1所示的堿基序列一個或多個的堿基進行替換、缺失或/和插入而得到的堿基序列，該堿基序列所編碼的蛋白仍具有干旱應答元件結合蛋白的功能或活性。2、根據權利要求1所述的cDNA序列，其特征在于該cDNA序列的堿基序列為SEQIDNO:1所示。3、一種由權利要求l或2所述cDNA序列編碼的干旱應答元件結合蛋白，其特征在于該干旱應答元件結合蛋白的氨基酸序列為(a)或(b)所示(a)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；或(b)將SEQIDNO:2所示的氨基酸序列通過一個或多個氨基酸殘基的替換、缺失或/和插入而獲得的仍具有干旱應答元件結合蛋白功能或活性的氨基酸序列。4、根據權利要求3所述的干旱應答元件結合蛋白，其特征在于該干旱應答元件結合蛋白的氨基酸序列為SEQIDNO:2所示。5、一種含有權利要求1或2所述cDNA序列的植物表達載體。6、根據權利要求5所述的植物表達載體，其特征在于該植物表達載體是pC13rd29A-HhDREB2。7、一種包含權利要求5所述植物表達載體的植物細胞。8、一種根據權利要求3所述干旱應答元件結合蛋白在提高植物抗逆性中的應用。9、一種根據權利要求1或2所述cDNA序列在提高植物抗逆性中的應用。10、根據權利要求9所述的應用，其特征在于，所述應用包括構建含有權利要求l或2所述cDNA序列的植物表達載體；將該植物表達載體轉化到植物細胞中，在植物中表達所述cDNA序列。全文摘要本發明公開了鈴鐺刺DREB轉錄因子cDNA序列及其表達載體和應用。本發明從沙生植物鈴鐺刺中分離到與抗逆性緊密相關的DREB轉錄因子cDNA序列(SEQIDNO1)。該cDNA序列在鈴鐺刺的根、莖、葉中均有表達，其表達受干旱、高鹽和低溫環境逆境的誘導，不依賴ABA的調控。本發明構建了含有該cDNA序列的高效植物表達載體并將該植物表達載體轉化到擬南芥中，對轉基因擬南芥進行了干旱、高鹽及低溫等抗逆性分析并且對其相關生理生化指標進行了測定，結果表明轉基因擬南芥植株的含水量、丙二醛、可溶性糖和脯氨酸含量明顯高于正常對照，說明本發明cDNA序列可提高植物的抗旱性和滲透脅迫抗性，與植物的抗逆性緊密相關。文檔編號C07K14/415GK101671678SQ200910105979公開日2010年3月17日申請日期2009年3月12日優先權日2009年3月12日發明者水劉,吳燕民,陰翠翠,陳陽春,雷江麗,靜高,高舉明申請人:深圳市鐵漢生態環境股份有限公司;中國農業科學院生物技術研究所;深圳市園林科學研究所