專利名稱：近江牡蠣體內抗人類腫瘤HL60的sTRAIL蛋白質及其引物的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種近江牡蠣體內抗人類腫瘤急性早幼粒白血病細胞株 (HL60)的腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體可溶性細胞因子蛋白質及其引物。
背景技術：
腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand， TRAIL), 又稱為凋亡素2配體(AP02 ligand， AP0-2L) (Wiley et al,, 1995; Pitti et al, ， 1996)， 其胞外結構域在金屬蛋白酶的作用下，可降解形成可溶性的細胞因子sTRAIL (Soluble TRAIL ) ， sTRAIL具有TRAIL的生物學功能(Bodmer et al., 2000) 。 TRAIL是TNF超家族 中一類重要的跨膜細胞因子(Wiley et al. ， 1995; Pitti et al. ， 1996)，可選擇性地引起人 類大多數腫瘤細胞發生細胞凋亡包括腦、腎、肝、肺、胃、結腸、乳腺、前列腺、胰腺、 膽管、宮頸、皮膚和造血系統來源的腫瘤細胞，而對正常細胞無或僅具有極低的毒性(Dphil， 2007 :馬遠方，2007)。
我國是水產大國，牡蠣等貝類養殖是我國海水養殖的支柱產業之一。根據聯合國糧農組 織(FA0)的數字顯示，我國每年牡蠣的產量具全世界首位，達到300多萬噸(濕重)，占 我國海洋水產養殖總產量(約1000萬噸)的約三分之一。牡蠣不僅肉質細嫩、肉味鮮美、 營養價值高，還具有抗癌降血脂等功效，有"海洋牛奶"之美譽，是世界性的水產佳肴。目 前國內外通過提取牡蠣等貝類體內的多糖等生物活性物質，并開發出了保健食品。但以上多 為多糖等物質的混合物，是免疫調節產品，并且基礎研究資料少，對腫瘤細胞的毒性作用較 低，對其功效及副作用等所知不多。
發明內容
針對現有技術中存在的不足之處，本發明提供了一種近江牡蠣中腫瘤壞死因子相關凋亡 誘導配體可溶性細胞因子蛋白質及其引物。
為達到以上目的，本發明是通過這樣的技術方案來實現的提供一種近江牡蠣體內抗急
性早幼粒白血病細胞株(HL60)的腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體可溶性細胞因子蛋白質， 具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。本發明還提供了一種編碼前述蛋白質的基因，該基因具有SEQ ID NO: l所示的核苷酸序列。
本發明還提供了一種用于擴增前述蛋白質的基因的寡聚核苷酸引物，其結構為
TRAILf: 5' -GTGAGAGAAAGAG-3， TRAILr: 5' -TTAGCCAACTTAAAAG-3'。 本發明的有益效果在于
本發明利用基因工程技術開發的牡蠣中sTRAIL蛋白質產品，對HL60腫瘤細胞具有殺傷 性強、特異性高、安全性好、能夠大量生產、易于貯存等優點。
具體實施例方式
本發明的下述實施例所使用分子生物學的方法均為已知的技術。
本發明中，近江牡蠣sTRAIL蛋白質即腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體可溶性細胞因子 蛋白質，簡稱CasTRAIL,其中Ca代表近江牡蠣，sTRAIL代表腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配 體可溶性細胞因子；HL60即急性早幼粒白血病細胞株。
本發明的實現步驟包括
1、 以近江牡蠣cDNA為模板，設計擴增sTRAIL蛋白質基因的引物，獲得編碼sTRAIL蛋 白質的基因全序列。
2、 利用DNA重組技術將sTRAIL基因片段克隆到合適的pMD19-T載體(購自Takara公 司，日本)中，再經限制性內切酶酶切，與經同樣酶切的pET-28(a)原核表達載體(購自 Novagen公司，美國)相連接，獲得表達載體pET-28a(+)-sTRAIL。
3、 sTRAIL蛋白質的體外誘導表達，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和免疫印跡 (Western blot)等方法鑒定目的蛋白質。
4、 利用親和柱分離純化目的蛋白質，獲得重組的sTRAIL蛋白質。
5、 培養急性早幼粒白血病細胞株HL-60 (購買自中國科學院上海細胞生物研究所，中國)，
添加純化的近江牡蠣sTRAIL (CasTRAIL)重組蛋白質，培養細胞0-24小時。
6、 分別收集細胞，利用以下兩種方法鑒定HL60細胞的凋亡用流式細胞儀檢測 凋亡率；提取DNA檢測DNA ladder的形成。
具體的操作步驟如下 1、引物設計與合成
設計用于擴增sTRAIL蛋白質基因的寡聚核苷酸引物為 TRAILf: 5， -GTGAGAGAAAGAG-3， ( SEQ ID NO: 3) TRAILr: 5' -TTAGCCAACTTMAAG-3， ( SEQ ID NO: 4)。2、 PCR擴增與表達載體的構建
以近江牡蠣cDNA為模板擴增目的片段，PCR擴增的反應條件為94t:預變性3分鐘； 35個循環94°C 30秒鐘，56°C 30秒鐘，72°C 45秒鐘；72°C IO分鐘。PCR產物連入pMD19-T 載體，轉化大腸桿菌JM109 (購自Takara公司，日本)，涂布含氨芐青霉素的LB篩選平板， 挑若干個克隆進行酶切和PCR鑒定，選一陽性克隆擴大培養，以堿法抽提質粒.將制備好的 質粒以vWel和限制性內切酶(購自Takara公司，日本)雙酶切，連入經過同樣雙酶 切的pET-28a(+)載體的相應位點上，轉化大腸桿菌BL21(DE3)(購自Tiangen公司，德國)。 PCR篩選陽性克隆，經測序鑒定獲得編碼框正確的表達載體pET-28a(+)-sTRAIL。
經上述方式獲得來自于近江牡蠣體內特有的sTRAIL蛋白質(CasTRAIL)，該蛋白質具有 SEQIDNO: 2所示的氨基酸序列；編碼該蛋白質的基因具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序 列。
3、 重組蛋白質的表達與鑒定
將陽性重組質粒pET-28a(+)-sTRAIL轉化表達宿主菌BL21感受態，涂布含卡那霉素的
LB平板，37'C培養過夜。挑取一個單克隆菌落，轉入LB培養液，37'C振搖培養過夜。取適 量菌液，按1:100擴大培養至OD,為0.4-0.5時，將菌液分為若干等份，不加或分別加入 異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(購自Sangon公司，加拿大)，使其終濃度在0-1. 0 mmol/L， 繼續培養6小時，離心收集細菌。細菌經超聲波裂解后，離心分離上清液和沉淀，分別上樣， 進行SDS-PAGE電泳。
4、 重組蛋白質的純化與抗體制備
利用組氨酸親和層析柱對表達產物進行分離純化。以上述方法大量制備超聲裂解的菌 液，離心分離上清液，進行蛋白質的純化和洗脫操作，并采用12%的SDS-PAGE進行鑒定。
挑選體重約1.5 kg的健康新西蘭白雄兔進行免疫。經過一次初始免疫和兩次加強免疫 后，頸動脈取血，分離血清，存儲于-80。C。
5、 蛋白質定量與抗體效價的檢測
按Brad-ford法對蛋白質進行定量(Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein_dye binding. Anal Biochem. 1976， 72: 248-254)。
免疫后的兔血清用ELISA方法檢測效價，具體操作如下
(1) 包被與封閉用包被緩沖液將蛋白質稀釋至1-10 wg/ml。在每個聚苯乙烯酶標板 的反應孔中加0。 1 ml， 4"C過夜。棄去孔內溶液，5%的脫脂奶粉封閉2小時，用PBST洗3 次，每次3分鐘。
(2) 加樣加指定稀釋倍數的待檢樣品(待檢測的抗血清稀釋于PBST) 0.1 ml于上述已包被的反應孔中，置37'C孵育1小時，PBST洗3次，每次3分鐘(同時做空白孔，陰性 對照孔及陽性對照孔)。
(3) 加酶標抗體于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體0. lml， 37'C1小時，PBST 洗3次，每次3分鐘。
(4) 加底物液顯色于各反應孔中加入新鮮配制的0PD底物溶液0. 1 ml， 37。C顯色10-30 分鐘。
(5) 終止反應于各反應孔中加入2 M反應終止液0.05 ml。
(6) 結果分析用酶標儀490 nm測各孔OD值，大于規定的陰性對照OD值的2. 1倍， 即為陽性。計算抗體效價公式(樣本OD值-空白對照OD值)/(陰性對照OD值-空白對照 OD值)。
6、 Western blot (免疫印跡)
Western blot操作按文獻(Sambrook J, Russell DW著.黃培堂等譯.分子克隆實驗 指南，第3版.北京科學出版社，2002. (Sambrook J， Russell D W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)，
具體如下
(1) 蛋白質樣品進行SDS-PAGE電泳
(2) 轉膜(電轉)電泳結束后將膠條割至合適大小，浸入轉膜緩沖液平衡20分鐘。預 先裁好與膠條同樣大小的濾紙和PVDF膜(購自Millipore公司)，浸入轉膜緩沖液中15分鐘。 轉膜裝置的搭建:按從下至上順序依次為陰極塑料板、3層濾紙、PVDF膜、凝膠、3層濾紙、 陽極塑料板，濾紙、凝膠、膜精確對齊，每一步去除氣泡，吸干多余的液體。恒壓38V，轉 移3小時。
(3) 免疫雜交反應 a用PBST洗膜，5分鐘X3次； b加入封閉液，平穩搖動，室溫2小時； c棄封閉液，用PBST洗膜，10分鐘X3次；
d將膜轉入一抗雜交液(抗血清按預定比例稀釋于封閉液)，室溫雜交2小時。陰性對 照中以免疫前的血清取代一抗，其余步驟與實驗組相同； e棄雜交液，用PBST洗膜，10分鐘X3次；
f將膜轉入二抗雜交液(辣根過氧化物酶偶聯的二抗按合適稀釋比例稀釋于PBST)，平 穩搖動，室溫2小時；
g棄雜交液，用PBST洗膜，10分鐘X3次；
h加入顯色液，避光顯色至出現條帶時放入雙蒸水中終止反應。具體的實施例子
1、 sTRAIL重組蛋白質的表達與鑒定
將陽性pET-28a(+)-sTRAIL重組質粒轉化表達宿主菌BL21感受態，涂布LBA平板，37°C 培養過夜。挑取一個單克隆菌落，轉入LBA培養液，37。C振搖培養過夜。取適量菌液，按 1:100擴大培養至OD6。。為0.4-0.5時，將菌液分為若干等份，不加或分別加入IPTG，使其 終濃度在0-1. 0 mmol/L，繼續培養6小時，離心收集細菌。細菌經超聲波裂解后，離心分 離上清液和沉淀，分別上樣，進行SDS-PAGE電泳。
2、 sTRAIL重組蛋白質抗腫瘤活性檢測
(1) HL60細胞株懸浮生長于RPMI1640培養液(購自Gibco公司，美國)中，內含10% 小牛血清、lramol/L谷胺酰胺、青霉素和鏈霉素各100U/L。于37。C， 5°/。C02的飽和濕度孵箱 中培養，每2-3天傳代l次，于對數生長期時做后續實驗。
(2) 將純化的CasTRAIL重組蛋白質，加入HL60細胞中至5 u g/ml，分別培養0或24 小時。
(3)分別收集細胞，用以下兩種方法鑒定HL60細胞的凋亡用分別含lug/ml的FITC-Annexin V和PI標記細胞(購自聯科生物，中國)，流式細胞儀檢測凋亡率；用DNA提取試 劑盒(購自北京賽百盛，中國)提取DNA檢測DNA ladder的形成。近江牡蠣sTRAIL(CasTRAIL) 重組蛋白質24小時內平均可使近20%的HL60細胞發生凋亡，具有很強的抗癌作用。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干具體實施例框架。顯然，本發明 不限于以上實施例，本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有 變形，均應認為是本發明的保護范圍。<formula>formula see original document page 8</formula>SEQ ID NO: 3
gtgagagaaa gag 13
SEQ ID NO: 4
ttagccaact taaaag 1權利要求
1、一種近江牡蠣體內抗人類腫瘤HL60的sTRAIL蛋白質，其特征在于，具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2、 一種編碼權利要求l所述蛋白質的基因，其特征在于，該基因具有SEQIDNO: l所示的 核苷酸序列。
3、 一種用于擴增權利要求2所述蛋白質的基因的寡聚核苷酸引物，其結構為-TRAILf: 5' -GTGAGAGAAAGAG-3，TRAILr: 5' -TTAGCCAACTTAAAAG-3'。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，旨在提供近江牡蠣體內抗人類腫瘤HL60的sTRAIL蛋白質及其引物。該蛋白質具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；編碼該蛋白質的基因具有SEQ IDNO1所示的核苷酸序列本發明還用于擴增權利要求2所述蛋白質的基因的寡聚核苷酸引物。本發明利用基因工程技術開發的牡蠣中sTRAIL蛋白質產品，對HL60腫瘤細胞具有殺傷性強、特異性高、安全性好、能夠大量生產、易于貯存等優點。
文檔編號C07K14/435GK101525380SQ20091009748
公開日2009年9月9日 申請日期2009年4月7日 優先權日2009年4月7日
發明者吳信忠, 楊受保 申請人:浙江大學