專利名稱：煙草所含的二氫查耳酮類化合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于煙草化學(xué)領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明涉及一種新的煙草所含的
二氳查耳酮類化合物及其制備方法，同時，還涉及其在抗氧化和抗HIV-1中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
煙草是人類所認(rèn)識的各種植物中含化學(xué)物質(zhì)最多的一種.經(jīng)過幾十年的研 究.人們目前從煙草中鑒定出來的單體化學(xué)物質(zhì)就超過3000多種，而且還有許 多成分尚未鑒定出來。煙草除主要用于巻煙生產(chǎn)外，還可從中提取多種有利用 價值的化學(xué)成分，因此除作為巻煙消費外，加強(qiáng)煙草及其廢棄物的綜合利用具 有重要意義。
黃酮類化合物廣泛存在于自然界的植物中，屬植物次生代謝產(chǎn)物。根據(jù)其 結(jié)構(gòu)特點，可將黃酮類化合物分類為黃酮、黃酮醇、黃烷醇、二氫黃酮、二氫 黃酮醇、花色素、查爾酮、雙黃酮等。黃酮與多糖、生物堿同為植物來源的三 大天然產(chǎn)品，大量的實驗研究表明，黃酮類化合物具有抗氧化、抗過敏、抗菌 消炎、降血糖、抗病毒、抗腫瘤和護(hù)胃保肝等功能。本發(fā)明從煙草中分離得到 了一種具有抗養(yǎng)化和抗HIV-1活性的新的二氫查耳酮類化合物，該化合物至今 尚未見到相關(guān)報道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的二氫查耳酮類化合物。 本發(fā)明的另 一個目的是提供一種所述化合物的制備方法。 本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供所述化合物在在抗氧化和抗HIV-1中的應(yīng)用。 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案予以實現(xiàn)。本發(fā)明中所采用的百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。
A.本發(fā)明從煙草中分離出一種新的二氫查耳酮類化合物，該化合物具有下
述結(jié)構(gòu)式
該化合物的命名為煙草酮A (Tobenone A)。
B. 本發(fā)明提供了一種所述化合物的制備方法，該方法采用以下步驟
(1)煙草樣品粉碎后以70%的丙酮分3次用超聲提取，合并提取液；(2)減壓 濃縮提取液至小體積，靜置后濾除沉淀物；(3)濾液用乙酸乙酯分3次萃取， 獲得乙酸乙酯部分萃取液；(4)將萃取液濃縮成浸膏，浸膏用硅膠柱層析初 分，然后采用高效液相半制備色譜進(jìn)一步分離，即得到所需的該新化合物。
C. 本發(fā)明對所述的新化合物進(jìn)行了抗氧化活性檢測和抗HIV-l效果試驗， 化合物顯示出良好的抗氧化活性和抗HIV-l效果。
圖1為化合物的高分辨質(zhì)譜(HRESIMS); 圖2為化合物的核磁共振氫譜(^腿R); 圖3為化合物的核磁共振炭鐠(13C麗R); 圖4為化合物主要麗BC相關(guān)(—)。
具體實施例方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實 施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅 僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
實施例1一一化合物的制備
煙草樣品采于云南玉溪，品種為K326。將煙草樣品取樣2. 5 kg粉碎到30 目，以70%的丙酮用超聲提取3次，提取液合并，過濾，減壓濃縮提取液至小 體積，靜置后濾除沉淀物，濾液用乙酸乙酯分3次萃取，合并乙酸乙酯萃取液 并濃縮成浸膏，得浸膏58.4 g。浸膏用適量氯仿溶解后用80 g粗硅膠(80 -100目)拌樣，1. 5 kg硅膠(160 - 200目)裝柱進(jìn)行硅膠柱層析，氯仿丙 酮(l: 0 — 0: l)梯度洗脫，TLC監(jiān)測合并相同的部分，得到8個部分(純 氯仿、氯仿-丙酮20:1、氯仿-丙酮9:1、氯仿-丙酮8:2、氯仿-丙酮3:2、 氯仿-丙酮1:1、氯仿-丙酮1:2、純丙酮)，其中氯仿-丙酮(l: l)洗脫部分 4.18 g用安捷侖1100半制備高效液相色譜分離，以45%的曱醇為流動相， Zorbax SB-C18 (9.4 x 250 mm, 5 —半制備柱為固定相，紫外檢測器檢測 波長為254 nm,每次進(jìn)樣50 pL，收集15. 7 min的色語峰，多次累加后蒸 干，再次用純甲醇溶解，再以曱醇為流動相，用Sephadex LH-20凝膠柱層析 分離，可得該新化合物。
實施例2
——化合物的鑒定
本專利化合物為淡黃色粉末；紫外光譜(溶劑為曱醇)，lx (log 入 (log ￡ ) 285 (4.08)， 234 (4.41), 210 (4.62) nm;紅外光譜(溴化鉀壓片) iz固3547， 3502, 2897, 2871， 1748， 1672， 1648, 1615, 1430, 1386， 1128， 1052, 918 cm-1; HRES腦(圖-1)給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 387.1052 [M+Na]T (計算值387. 1056)。結(jié)合^和13 C麗R譜給出一個分子式C18H2。08，不飽和度 為9。從4和"C麗R譜(圖-2和圖-3,數(shù)據(jù)歸屬見表-l)信號可以看出從^ 和"C麗R譜可以看到化合物中有2個苯環(huán)(包括4個雙鍵次曱基碳，5C 106.4、 117.2、 106.0、 106.0);此外還有1個羰基(5c 198.0)， 1個次曱基 (5C 56.9)， 1個氧化的亞'曱基(5C 66.1)， 3個曱氧基(5C 55.2， 55.8, 55.8)，由此可推測該化合物為二氫查耳酮類化合物。在炭譜中一個苯環(huán)只有4個炭信號(包括1個雙4建次甲基碳和3個季炭信號，其中次甲基雙鍵炭和1 個季碳信的信號明顯比其它炭信號強(qiáng))，氬鐠中只有1組未裂分的單峰(從峰 面積看是2個氫)；由此可推測該化合物的一個苯環(huán)為對稱取代，經(jīng)HMBC相關(guān) (圖-4)證實即C-8、 C-3， 、 C-5，為曱氧基取代，C-5、 C-7、 C-4，為羥基； 至此本專利化合物的結(jié)構(gòu)得以確定。
表-l化合物的和13C NMR數(shù)據(jù)No.5c (mult.)& (mult, /, Hz)
la IP66. 1 t4.85, dd， 7=10.8, 8. 6 4.18， dd, 7=10.8, 6. 0
256.9 d5.15-5.19， m
3198. 0 s
4123.8 s
5151.6s
6106.4 d6.26, s
7150.6 s
8144.5 s
9117.2 d7. 03, s
r130. 7 s
2，106. 0 d6.07， s
3，153. 1 s
4，135.7 s
5，153.1 s
6，106.0 d6.07, s
0Me-855. 2 q3. 74, s
OMe-3，55. 8 q3. 78， s
OMe-4'55.9 q3. 75， s
實施例3
——化合物抗氧化活性4企測
抗氧化活性以清除DPPH自由基能力的大小表示；以50 pg/mL為初篩濃 度，測定其清除脂性自由基DPPH的活性。取一塊costar 96孔板，加入新鮮 配制的DPPH乙醇溶液(6. 5 xlO 5 mol/L) 190 (iL/孔，加入;f寺測樣品10 pL/ 孔，空白孔加10 |iL生理鹽水，充分混勻，用封板膜封板后室溫下避光靜置 30分鐘，于UV2401分光光度計上測定儀上測定各孔吸光度值，測定波長為 517 nm;樣品對脂性自由基DPPH清除率按下式計算 DPPH清除率(W = (A空白-A樣品)/ A空自xlO(WA空白空白對照組吸光度值；A料加樣品組吸光度值。 樣品平行5次檢測，計算半數(shù)清除濃度IC50測定結(jié)果為6.22 |_ig/L,表 明化合物具有良好的抗氧化活性。 實施例4
——對本發(fā)明化合物的抗HIV活性檢測
(1) HIV-1感染性滴定按Johnson & Byington所述方法改良進(jìn)行滴 定；按Reed&Muench方法計算病毒的TCID5Q (50% Tissue Culture Infection Dose)。
(2) 樣品對C8166宿主細(xì)胞的細(xì)胞毒性檢4 x io5/rai C8166細(xì)胞懸液 100 ul與待測化合物溶液混合，設(shè)三個重復(fù)孔。同時設(shè)置不含化合物的對照 孔，溫度37°C, 5% C02培養(yǎng)三天，采用MTT比色法;f企測細(xì)胞毒性。ELx800 ELISA儀測定0D值，測定波長為595咖，參考波長為630 mn。計算得到CC5。 值(50% Cytotoxic Concentration),即對50%的正常T淋巴細(xì)胞系C8166 產(chǎn)生毒性時的化合物濃度。
(3) 樣品對HIV-lmB誘導(dǎo)C8166細(xì)胞病變(CPE)的抑制試驗將8x lOVmL C8166細(xì)胞50 )aL/孔接種到含有100 ja L/孔倍比稀釋化合物的96孔細(xì) 胞培養(yǎng)板上，然后加入50 juL的HIV-l訓(xùn)稀釋上清(M.O. I. 0.0016)。設(shè)三個 重復(fù)孔。同時設(shè)置不含化合物的正常細(xì)胞對照孔。37°C, 5% C02培養(yǎng)三天，倒 置顯微鏡下(100x)計數(shù)合胞體的形成。EC5。(50% Effective Concentration) 為抑制合胞體形成50 %時的化合物濃度。
(4) 樣品對HIV感染細(xì)胞的保護(hù)作用試驗將8 x loVml MT由胞50ul/孔 接種到含有100 jul/孔倍比稀釋化合物的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，培養(yǎng)板的一半 孔加入50 ju 1的HIV-lmB稀釋(M. 0, I. 0. 006)，另一半孔加入50(al培養(yǎng)基。 每個濃度梯度2個重復(fù)孔，同時設(shè)置不含化合物的對照孔和空白對照孔， 37。C、 5% C02培養(yǎng)，第三天每孔補(bǔ)加100 jil新鮮培養(yǎng)基，第五天或第六天采 用MTT比色法檢測細(xì)胞存活率。ELxSOO ELISA儀測定0D值，測定波長為
7595nm,參考波長為630 ntn。用公式計算出化合物對正常細(xì)胞的毒性和對HIV-
l!m感染細(xì)胞的保護(hù)作用。
(5)計算公式根據(jù)實驗結(jié)果繪制劑量反應(yīng)曲線，按Reed&Muench法計 算出化合物抑制病毒的50%有效濃度(EC5。) ， 50%抑制細(xì)胞生長濃度 (CCs。)及抗HIV-1活性的治療指數(shù)TI值(Therapeutic index)為TI -
CC50/EC
細(xì)胞生長存活率(%)=實驗孔OD值/對照孔0D值x 100
細(xì)胞生長抑制率(W =(卜實驗孔OD值/對照孔OD值)xlOO
HIV-1致細(xì)胞病變的抑制率(%) = (l-實驗孔合胞體數(shù)/對照孔合胞體數(shù))xlOO
感染細(xì)胞的保護(hù)率(％) - (實驗孔OD值-陽性對照孔OD值)/ (陰性對照孔OD值-陽性對照孔OD
值)xioo
(6)實驗結(jié)果實驗結(jié)果清楚地表明，該化合物顯示出一定的抗HIV-1活 性，其治療指數(shù)為85. 6,揭示了本發(fā)明的化合物在制備抗愛滋病的藥物中有 良好的應(yīng)用前景。
以上所述僅為本發(fā)明的4支佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā) 明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明 的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物
2. —種權(quán)利要求1所述化合物的制備方法，其特征在于，該方法采用以下 步驟(1)煙草樣品粉碎后以70%的丙酮分3次用超聲^是取，合并提取液；(2)減壓濃縮提取液至小體積，靜置后濾除沉淀物；(3)濾液用乙酸乙酯分 3次萃取，獲得乙酸乙酯部分萃取液；(4)將萃取液濃縮成浸膏，浸膏用硅 膠柱層析初分，然后采用高效液相半制備色譜進(jìn)一步分離，即得到所需的化合 物。
3. 權(quán)利要求1所述的化合物作為抗氧化劑的應(yīng)用。
4. 權(quán)利要求1所述的化合物在制備用于抗HIV-1藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種煙草所含的新二氫查耳酮類化合物(I)及其制備方法和應(yīng)用。系將煙草樣品粉碎后以70％的丙酮分3次用超聲提取，合并提取液，過濾，減壓濃縮提取液至小體積，靜置后濾除沉淀物，濾液用乙酸乙酯分3次萃取，獲得乙酸乙酯部分萃取液；將萃取液濃縮成浸膏，浸膏用硅膠柱層析初分，然后采用高效液相半制備色譜進(jìn)一步分離，即得到所需新化合物。對該化合物進(jìn)行了抗抗氧化活性和抗HIV-1活性篩選，實驗結(jié)果顯示化合物顯示出較強(qiáng)的抗氧化和抗HIV-1活性。
文檔編號C07C49/84GK101648857SQ200910094910
公開日2010年2月17日 申請日期2009年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月1日
發(fā)明者何順琴, 曹靖麗, 忠 李, 楊光宇, 薛景嬌, 陳永寬 申請人:云南煙草科學(xué)研究院