專利名稱：天然4-羥基-異亮氨酸的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種天然4-羥基-異亮氨酸的制備方法，屬于藥物生產技術 領域。
背景技術：
目前，因糖尿病并發癥引起的死亡人數已排在繼心血管疾病和癌癥之 后的第三位，引起了各國的高度重視。中藥治療糖尿病具有較長歷史，并
從中發現制備高效低毒的活性成分是新藥開發的重要途徑。葫盧巴
(7W卵/7eL a /be/7鵬graec"/z L.)是豆科蝶形花亞科植物，其種子為著 名補陽中藥，在國內外都有較長的藥用、食用歷史，對其營養及安全性也 進行過研究0V"z^ri"o/7 y esearc力，1996， 7& 1495)。近年來國內外的研 究結果表明從葫蘆巴種子中提取分離出的天然4-羥基-異亮氨酸經動物實 驗證明，具有明顯的刺激胰腺分泌胰島素的功能，可降低血糖濃度，提高 血糖耐受性，緩解糖尿病患者對體外胰島素的依賴，提高,身胰腺活力G4瓜 / /%yw'W.， 1999， i77: E617)。且活性實驗表明，最有效的促胰島素效 應的異構體為(2S， 3R， 4S) ( /.尸/ ar瓜，2000， 339) 。 4-羥
基-異亮氨酸由于具有三個手性碳原子，合成較為困難。葫蘆巴種子中所含 的天然4-羥基-異亮氨酸僅含兩個立體異構體，且有效立體異構體(2S， 3R， 4S)的比例占到90。/a。因此，從葫蘆巴種子中獲取4-羥基-異亮氨酸是最經 濟和安全的途徑。迄今為止，國內外有專利文獻報道從葫盧巴種子中提取 4-羥基-異亮氨酸的方法，其含量為10-70%，公開號CN 1397545A; US 2004/0009247 Al;公開號CN 1955160A,但其加工工藝復雜，成本高， 對環境有一定污染。
發明內容
為克服現有技術的不足，本發明提供一種天然4-羥基-異亮氨酸的制備 方法，以從葫蘆巴種子中提取制備高純度4-羥基-異亮氨酸，該方法避免了 有毒溶劑和酸堿的使用，操作步驟少，生產周期短，成本低，更適宜產業 化規模生產。
本發明通過下列技術方案實現 一種天然4-羥基-異亮氨酸的制備方 法，包括以下步驟
(1) 將葫蘆巴種子粉碎后，按葫蘆巴種子粉乙醇溶液=1:3 10的質 量比，用濃度為5 95%的乙醇水溶液，在30 9(TC溫度下提取2 3次， 每次2 3小時，過濾，合并各次濾液；
(2) 將上述濾液濃縮至無乙醇后，分離去沉淀，得溶液；
(3) 將上述溶液進行層析后，用2 3倍水洗滌，收集含目標成分的 水洗脫液；
(4) 將上述水洗脫液濃縮至原體積的1/4，按濃縮液:硅膠=1:2的質 量比，拌入硅膠進行常規干燥；
(5) 以乙酸乙酯、乙醇和水的混合溶液為流動相進行硅膠柱層析，洗 脫，收集含目標成分的洗脫液，回收溶劑后，按常規干燥得4-羥基-異亮氨 酸粗品；
(6) 將上述4-羥基-異亮氨酸粗品加熱溶解在有機溶劑中至飽和，過 濾后，濾液在-5 l(TC溫度條件下靜置至結晶完全，干燥結晶后得4-羥基-異亮氨酸產 叩o
所述(1)步驟的乙醇水溶液濃度最佳為30 50%。 所述(2)步驟的分離為常規的離心分離。
所述(3)步驟的層析是在現有技術的常規大孔吸附樹脂柱上完成的， 大孔吸附樹脂用乙醇清洗后還可重復使用；大孔樹脂為非極性樹脂。所述(5)步驟的流動相即乙酸乙酯、乙醇和水的混合溶液的體積比為
乙酸乙酯乙醇水=4 9:1 5:0 3。
所述(6)步驟的有機溶劑為乙醇、正丁醇或丙酮中的一種。 本發明具有下列優點和效果采用上述方案制備天然4-羥基-異亮氨酸
時，無需使用酸、堿或氯仿等有毒化學試劑，制備過程對環境無污染，且
成本低廉，適宜產業化規模化生產。
具體實施例方式
下面結合實施例，對本發明做進一步的詳細說明。
取葫蘆巴種子10公斤，粉碎，加濃度為30%的乙醇水溶液60公斤，6CTC 提取3次，每次2小時，過濾，濾液合并；濃縮濾液至除去乙醇后，離心 分離去沉淀，得溶液；將該溶液用常規的大孔吸附樹脂D-101吸附，用3 倍水洗滌，收集含目標成分的水洗脫液，大孔吸附樹脂用乙醇清洗后還可重 復使用；將水洗脫液濃縮至原體積的1/4后，按濃縮液:硅膠=1:2的質量 比，拌入100-200目的硅膠，進行常規攪拌干燥；以乙酸乙酯、乙醇和水 的混合溶液作為流動相進行硅膠柱層析，其中乙酸乙酯乙醇:水的體積比 為3:2:1，之后洗脫，收集含目標成分的洗脫液，回收溶劑后，按常規干燥 得淡黃色的固體(即4-羥基-異亮氨酸粗品)6.24克；將淡黃色固體加熱 溶解在乙醇中至飽和，過濾后，濾液在-5'C溫度下靜置至結晶完全，按常 規干燥結晶，即得5.19克4-羥基異亮氨酸產品。經高效液相法 (Phytochemistry， 1997， 44(4)， 563-566)檢測，該產品中(2S， 3R， 4S)-4-羥基-異亮氨酸的含量為91. 2%。 實施例2
取葫蘆巴種子10公斤，粉碎，加5%的乙醇水溶液30公斤，9(TC提取 2次，每次3小時，過濾，濾液合并；濃縮濾液，除去乙醇后離心分離去沉淀，得溶液；將該溶液用常規大孔吸附樹脂AB-8吸附，2倍水洗，收集含 目標成分的水洗脫液，大孔吸附樹脂用乙醇清洗后還可重復使用；將水洗 脫液濃縮到原體積的1/4，按濃縮液:硅膠=1:2的質量比，拌100-200目 硅膠，進行常規攪拌干燥；以乙酸乙酯、乙醇和水的混合溶液作為流動相 進行硅膠柱層析，其中乙酸乙酯、乙醇和水的混合溶液的體積比為乙酸 乙酯乙醇:水=9:5:0，之后洗脫，收集含目標成分的洗脫液，回收溶劑后， 按常規干燥得淡黃色的固體(即4-羥基-異亮氨酸粗品)4.98克；將黃色
固體加熱溶解在正丁醇中至飽和，過濾后，濾液在crc靜置至結晶完全，按
常規干燥結晶，得3.91克4-羥基異亮氨酸產品。經高效液相法檢測，該產 品中(2S， 3R， 4S)- 4-羥基-異亮氨酸的含量為91.4%。 實施例3
取葫蘆巴種子10公斤，粉碎，加95%的乙醇水溶液100公斤，30。C提 取2次，每次2小時，過濾，濾液合并；濃縮濾液，除去乙醇后離心分離 去沉淀，得溶液；將溶液用常規大孔吸附樹脂DM-1300吸附，3倍水洗，收
集含目標成分的水洗脫液，大孔吸附樹脂用乙醇清洗后還可重復使用；將 水洗脫液濃縮到原體積的1/4，按濃縮液:硅膠=1:2的質量比，拌100-200
目硅膠進行常規攪拌干燥；以乙酸乙酯、乙醇和水的混合溶液作為流動相 進行硅膠柱層析，其中乙酸乙酯、乙醇和水的混合溶液的體積比為乙酸乙 酯乙醇:水=5:3:1，之后洗脫，收集含目標成分的洗脫液，回收溶劑后， 按常規干燥得淡黃色的固體(即4-羥基-異亮氨酸粗品)4.13克；將黃色 固體加熱溶解在丙酮中至飽和，過濾后，在IO'C靜置至結晶完全，按常規 干燥結晶，得3.23克4-羥基異亮氨酸產品。經高效液相法檢測，該產品中 (2S， 3R, 4S)- 4-羥基-異亮氨酸的含量為89.2%。
權利要求
1、一種天然4-羥基-異亮氨酸的制備方法，其特征在于經過以下步驟(1)將葫蘆巴種子粉碎后，按葫蘆巴種子粉∶乙醇溶液＝1∶3～10的質量比，用濃度為5～95％的乙醇水溶液，在30～90℃溫度下提取2～3次，每次2～3小時，過濾，合并各次濾液；(2)將上述濾液濃縮至無乙醇后，分離去沉淀，得溶液；(3)將上述溶液進行層析后，用2～3倍水洗滌，收集含目標成分的水洗脫液；(4)將上述水洗脫液濃縮至原體積的1/4，按濃縮液∶硅膠＝1∶2的質量比，拌入硅膠進行常規干燥；(5)以乙酸乙酯、乙醇和水的混合溶液為流動相進行硅膠柱層析，洗脫，收集含目標成分的洗脫液，回收溶劑后，按常規干燥得4-羥基-異亮氨酸粗品；(6)將上述4-羥基-異亮氨酸粗品加熱溶解在有機溶劑中至飽和，過濾后，濾液在-5～10℃溫度條件下靜置至結晶完全，干燥結晶后得4-羥基-異亮氨酸產品。
2、 據權利要求1中所述的天然4-羥基-異亮氨酸的制備方法，其特征 在于所述(1)步驟的乙醇水溶液濃度為30 50%。
3、 據權利要求1中所述的天然4-羥基-異亮氨酸的制備方法，其特征 在于所述(2)步驟的分離為常規的離心分離。
4、 據權利要求1中所述的天然4-羥基-異亮氨酸的制備方法，其特征 在于所述(5)步驟的流動相即乙酸乙酯、乙醇和水的混合溶液的體積比為 乙酸乙酯乙醇水=4 9:1 5:0 3。
5、 據權利要求1中所述的天然4-羥基-異亮氨酸的制備方法，其特征 在于所述(6)步驟的有機溶劑為乙醇、正丁醇或丙酮中的一種。
全文摘要
本發明公開了一種天然4-羥基-異亮氨酸的制備方法，屬于制藥領域。將葫蘆巴種子粉碎用乙醇提取，回收乙醇后的提取液用大孔吸附樹脂柱吸附，用水洗脫，濃縮后加入硅膠拌勻，干燥，以乙酸乙酯、乙醇和水的混合溶液為流動相進行硅膠柱層析，收集含目標成分洗脫液，回收溶劑，干燥，得4-羥基-異亮氨酸粗品，將該粗品加熱溶解在有機溶劑中至飽和，過濾后，低溫放置結晶，得4-羥基-異亮氨酸純品。本發明方法無需使用酸、堿或氯仿等有毒化學試劑，制備過程對環境無污染，且成本低廉，適宜產業化規模化生產。
文檔編號C07C227/00GK101544575SQ200910094440
公開日2009年9月30日 申請日期2009年5月7日 優先權日2009年5月7日
發明者劉會靈, 曹建新, 建 樊, 程桂廣, 趙天瑞 申請人:昆明理工大學