幽門螺桿菌活菌載體疫苗及其專用重組菌的制作方法

專利名稱：幽門螺桿菌活菌載體疫苗及其專用重組菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種幽門螺桿菌活菌載體疫苗及其專用重組菌。
背景技術：
胃炎和消化性潰瘍是人類的常見病和多發病，胃癌也是發病率和死亡率比較高 的惡性腫瘤之一。多年來人們一直都認為這類病是普通的內科病，并沒有與病原體 的感染聯系在一起，醫學界曾經一度認為在胃內的酸性環境下，微生物是很難定 居和繁殖致病的，胃酸是形成潰瘍的關鍵因素，臨床上也通常采用中和胃酸或抑制 胃酸分泌的方法來治療這類疾病。然而，1982年，兩位澳大利亞學者Robin Warren 和Barry Marshall從人胃組織中分離到了幽門螺桿菌(/fe"'co力acter pj^or力 "pWow')。其后，許多學者對幽門螺桿菌的感染狀況與致病性進行了一系列的調 査與研究，研究證實幽門螺桿菌是慢性活動性胃炎、消化性潰瘍的最主要病因， 同時與胃腺癌和胃黏膜相關的淋巴樣組織淋巴瘤的發生密切相關，世界衛生組織國 際癌癥研究機構(IARC)已將該菌列為I級致癌因子。2005年，諾貝爾生理學或 醫學獎授予了澳大利亞的這兩位科學家。
大量的流行病學研究資料表明，";^7ori感染呈全球分布，感染率之高僅次 于齲齒，居第二位。在發達國家，"AF7a"的成人感染率為30-50%，在發展中國 家感染率相對更高，可達60%以上，且嬰幼兒和兒童的感染也很普遍；在中國，據 報道成人感染率約在60%，感染主要發生在兒童期，感染一經獲得，便在人胃內持 續數年、數十年乃至一生。在感染者中，大約有20%的人口發病，其中包括胃炎、 胃腺萎縮、胃和十二指腸潰瘍、胃腺癌及胃淋巴瘤等。兒童期感染上";^7on'已 被認為是成年期胃癌發生的一個重要因素。
目前，臨床上主要采用抗生素療法來清除"ArA^厶但是體內單一抗生素對 "Ar7ori'的根治率不足20%，三聯療法即鉍劑加兩種抗生素治療后，"A^ori的 根治率也僅達55-95%，且存在下列問題所需的費用昂貴、根除率低、耐藥菌株的 不斷增加、藥物的副作用、停藥后的復發與再感染、病人的依從性差、不能用于預 防"AK^n'感染等問題。歷史經驗告訴我們要想從大量人群中根除某種感染性疾 病，開發研制該種疾病的有效疫苗應該是優先要考慮的問題，也是最具價值效益關系的。成功的幽門螺桿菌疫苗適用人群巨大。單從我國來看，據流行病學調查表明，
我國人群中該菌的感染率在60%以上，感染者中大約有20%的人發病，因此，在我國 需要進行幽門螺桿菌疫苗根除治療的人群大約有1億5千多萬人。另外，在我國幽門 螺桿菌的感染主要發生在兒童期，而我國大約每年有1500余萬左右的新生兒出生， 因此，在我國，需要進行幽門螺桿菌疫苗預防的人群也非常巨大。
"AFhh的保護性抗原成分主要有尿素酶、熱休克蛋白、過氧化物酶、空 泡毒素和毒素相關蛋白等。研究表明，在每一種保護性抗原單獨使用時，其效果并 不理想，因而構建多價組合保護性抗原疫苗是研制"A^ori疫苗的重要目標。減 毒載體活菌苗具有不必純化抗原、本身有一定的佐劑作用、易于大量生產、服用方 便、避免抗原在胃內降解與變性，能夠誘導細胞、體液和黏膜免疫反應等優點。

發明內容
本發明的目的是提供一種重組福氏志賀氏菌(幼./7e;meri)。
本發明所提供的重組福氏志賀氏菌(幼./7e,Mri)，是將含有幽門螺桿菌尿 素酶B亞單位和幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位的融合蛋白的編碼基因導入福氏志 賀氏菌/7e;raari)得到的重組菌。
本發明所提供的福氏志賀氏菌可為2aT32，也可為其它許可在人體使用的亞型。
本發明所提供的福氏志賀氏菌(幼./7ex/7eW)疫苗株是一株經一系列傳代后 發生的自發突變減毒株，來源是中國醫學細菌保存中心。
本發明所提供的重組福氏志賀氏菌中，幽門螺桿菌尿素酶B亞單位 (AAD07143. 1)和幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位(AAD0708L 1)的融合蛋白的氨 基酸序列如序列表中序列1所示。
序列表中的序列1由702氨基酸組成，自序列1的氨基末端第1-569位為幽門 螺桿菌尿素酶B亞單位，自序列l的氨基末端第570-584位為連接肽(G4S) 3，自 序列1的氨基末端第585-702位為幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位。
所述幽門螺桿菌尿素酶B亞單位和幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位的融合蛋白 編碼基因(w/，e^《/.^ "5^-/^a4《/zM"仍"〕的核苷酸序列具體可如序列表中 序列2所示。
所述幽門螺桿菌尿素酶B亞單位和幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位的融合蛋白 編碼基因可通過重組質粒pTA-ureB-hspA導入福氏志賀氏菌(5^./7e;raen')疫苗 株。所述pTA-ureB-hspA是將所述幽門螺桿菌尿素酶B亞單位和幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位的融合蛋白編碼基因插入pTA的多克隆位點得到的重組質粒;所述pTA
為表達載體口￡1225+ (購自Novegen公司)去掉抗性基因，加入as^基因制備，
基因序列號為GI: 153560。
本發明的另一個目的是提供一種幽門螺桿菌活菌載體疫苗。 本發明所提供的幽門螺桿菌活菌載體疫苗，它的活性成分為上述重組福氏志賀氏菌。
本發明還提供了一種融合蛋白及其編碼基因。
本發明所提供的融合蛋白(UreB-HspA)是含有幽門螺桿菌尿素酶B亞單位和 幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位的融合蛋白，它的氨基酸序列如序列表中序列1所 示。
上述蛋白的編碼基因(w/ A-As; "的核苷酸序列，具體可如序列表中序列2 所示。
含有上述融合蛋白編碼基因的重組菌或重組質粒也屬于本發明的保護范圍。
本發明是利用基因重組的方法，將"P/"^尿素酶B亞單位和熱休克蛋白A亞單 位進行融合，并轉化福氏志賀氏菌疫苗株構建的幽門螺桿菌活菌載體疫苗。試驗證 明本發明的幽門螺桿菌活菌載體疫苗具有較高的免疫原性和免疫保護性在幽門螺 桿菌活菌載體疫苗的免疫原性試驗中，實驗組(免疫本發明的幽門螺桿菌活菌載體 疫苗)小鼠血清經200倍稀釋后，血清的IgG效價OD艦平均值(0.563±0. 162)要遠 高于對照組(經100倍稀釋的對照組小鼠血清)小鼠血清測定的00492平均值 (0.083±0.016)，實驗組小鼠腸液中抗幽門螺桿菌sIgA抗體測定的0D492值 (0.387±0. 147)也遠高于對照組492 (0. 114±0.035);在免疫保護性試驗中，對 照組20只小鼠胃內均有幽門螺桿菌定植，實驗組20只小鼠中有5只小鼠沒有定植， 獲得了完全保護，實驗組小鼠比對照組小鼠胃內"A^on'平均定植密度低近l個數 量級，二者之間具有顯著差異。


圖1為"af7ot7' ureB基因PCR擴增結果。
其中，泳道1為Gibco lkb Marker,泳道2為PCR擴增的wreB基因 圖2為"a^ow' hspA基因pcr擴增結果電泳圖譜。 其中，泳道1為Gibco 100bp Marker,泳道2為PCR擴增的Asa4基因 圖3為pET-ureB-hspA電泳圖。其中，泳道1為Gibco lkb marker,泳道2為用Ncol和Notl雙酶切的融合基 因片段，泳道3為用Ncol和Notl雙酶切的pET22b+,泳道4為ureB-hspA基因擴增 產物，泳道5為ureB基因擴增產物，泳道6為hspA基因擴增產物，泳道7為Gibco 100bp marker。
圖4為"py7orj' UreB-HspA重組蛋白SDS-PAGE電泳圖譜。
其中，泳道1為marker (從上至下分別為97. 4kD， 66. 2kD， 43kD， 31kD)，
泳道2為福氏2a志賀氏菌疫苗株對照，泳道3為HP-BA疫苗菌株全菌表達樣品。 圖5為一抗為兔抗UreB抗體的重組蛋白Western blot檢測試驗結果。 其中，泳道l為預染蛋白marker (從上至下分別為175kD， 83kD， 62kD， 48kD，
33kD， 25kD， 17kD， 7kD)，泳道2為兔抗UreB疫苗菌株表達抗原蛋白。 圖6為一抗為兔抗hspA抗體的重組蛋白Western blot檢測試驗結果。 其中，泳道1為預染蛋白marker (從上至下分別為175kD， 83kD， 62kD， 48kD，
33kD， 25kD， 17kD， 7kD)，泳道2為兔抗hspA疫苗菌株表達抗原蛋白。
具體實施例方式
下述實施例中所述方法如無特別說明均為常規方法。
實施例1、重組福氏志賀氏菌及幽門螺桿菌活菌載體疫苗的制備及其效果 一、重組福氏志賀氏菌及幽門螺桿菌活菌載體疫苗的制備
1、 克隆幽門螺桿菌尿素酶B亞單位(wj，e5)基因
根據幽門螺桿菌26695的wre^基因序列，用PCR引物設計和分析軟件設計了 引物(Pl: 5' -TGCGAGCTCAAAAAGATTAGCAGAAAA-3，；
P2: 5， -GGCTGCAGGAAAATGCTAAAGAGTTG-3，)，以幽門螺桿菌26695 (購自中國疾 病預防控制中心)的基因組DNA為模板，采用高保真Pyrobest DNA聚合酶(購自 Takala公司)進行了PCR擴增，獲得了 ^py7ori wreA基因，如圖1所示。
PCR擴增的ureB基因片段經純化后，經SacI和PstI (購自NEB公司)酶切連 接到載體pQE30 (購自QIAGEN公司)中。連接產物轉化大腸桿菌M15后挑選陽性克 隆，經質粒提取、酶切分析和PCR擴增鑒定后進行全自動序列分析，將含有幽門螺 桿菌尿素酶B亞單位(ureB)基因(GI: 231353)的重組質粒命名為pQE-ureB。
2、 克隆幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位(力s;^)基因
根據幽門螺桿菌26695 hspA基因序列，用PCR引物設計和分析軟件設計了一 對引物(P3: 5， -GGAGAATTCAAGTTTCAGCCATTAGGAG-3，；P4: 5， -GTTCTGCAGTTTAGTGTTTTTTGTGATC-3，)，以幽門螺桿菌26695 (購自中國 疾病預防控制中心)的基因組DNA為模板，經PCR擴增獲得約360bp的《；y^ori Asp力 擴增帶，如圖2所示。
擴增產物用PCR產物純化試劑盒純化后用EcoRI和Pstl雙酶切，與此同時將 質粒載體pUC19也用EcoRI和Pstl進行雙酶切，酶切產物用瓊脂糖凝膠電泳回收， 在T4 DNA連接酶的作用下12t;過夜連接，轉化大腸桿菌JM109后挑選陽性克隆， 經質粒酶切鑒定后進行全自動序列分析，將含有幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位 (—)基因(GI:2313085)的重組質粒命名為pUC-hspA。
3、 幽門螺桿菌尿素酶B亞單位(ureB)和幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位(hspA) 融合蛋白編碼基因的制備
以含有尿素酶B亞單位和熱休克蛋白A亞單位全長序列的重組質粒載體 pQE-ureB和pUC-hspA為模板，釆用如下PCR的方法將ureB和hspA兩基因融合起 來合成引物為P5: 5， -TGCCCATGGATAAAAAGATTAGCAGAAAA-3，； P6: 5' -GTTGCGGCCGCTTTAGTGTTTTTTGTGATC-3，； P7: 5' -CCGCCGCCGCCAGAGCCGCCGCCGCCGAAAATGCTAAAGAGTTG-3'; P8: 5' -GGCGGCGGCGGCTCTGGCGGCGGCGGCTCTAAGTTTCAGCCATTAGGAG-3，。
用引物Pl和P7擴增pQE-ureB,用引物P4和P8擴增pUC-hspA，將二者擴增 產物混合，再以二者混合物為模板再用引物P5和P6進行PCR反應得到"rey -力SA4 融合片段。PCR反應的條件為95。C變性5min，一循環為(94°C lmin， 56°C lmin， 72°C lmin),共做30循環，最后72。C延伸10min。融合基因片段經純化后，用Ncol 和Notl(購自NEB公司)進行雙酶切，并將其連接到表達載體pET22b+(購自Novegen 公司)中，連接產物轉化大腸桿菌BL21(DE3)后挑選陽性克隆，經質粒提取、酶切 分析和PCR擴增鑒定后，采用373A DNA自動分析儀進行全自動序列分析，將含有 幽門螺桿菌尿素酶B亞單位(ureB， GI:2313153)和幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞 單位(hspA， GI2313085)的融合蛋白編碼基因wre"-力s。j的重組質粒命名為 pET-ureB-hspA。 pET-ureB-hspA的鑒定結果如圖3所示。
4、 構建疫苗候選株
以重組質粒pET-ureB-hspA為模板，用引物P5和P6進行PCR擴增"re^-力印A PCR擴增產物經純化后，用Ncol和Notl(購自NEB公司)酶切并連接到質粒pTA(pTA 為表達載體pET22b十(購自Novegen公司)去掉抗性基因，加入s^基因制備，基因序列號為GI: 153560)中，連接產物用電擊轉化法將其導入福氏2a志賀氏菌 疫苗株(購自中國疾病預防控制中心)中，挑選重組轉化子獲得重組福氏志賀氏菌 (疫苗株)HP-BA。在LB試管中37'C過夜培養HP-BA菌株。按1%將過夜培養種子 液接種到新的一支LB試管中，37。C振蕩培養2-3h，使其OD600至0.4-0. 5。加入 1M IPTG使其終濃度為lmM，繼續37t:振蕩培養4-5h。離心收集lml液體培養物中 的細菌，將其重懸于0. lml裂解緩沖液中，IO(TC加熱5min。取20 u 1樣品進行10% 的SDS-PAGE電泳。經考馬斯亮蘭染色后，疫苗候選株HP-BA可見表達與預期蛋白 大小一致的相對分子質量約為77kD的幽門螺桿菌尿素酶B亞單位(UreB)和幽門 螺桿菌熱休克蛋白A亞單位(HspA)融合蛋白(UreB-HspA)，其結果見圖4。
用10%的SDS-PAGE對HP-BA菌株表達的抗原蛋白進行電泳，同時設預染蛋白 Maker。表達樣品及預染蛋白Marker用電轉移的方法轉移至硝酸纖維素膜，經封閉 后分別用兔抗幽門螺桿菌尿素酶B亞單位(UreB)抗體和兔抗幽門螺桿菌熱休克蛋 白A亞單位(HspA)抗體，作一抗進行Western Blot。顯色后兩者在約77KD的位 置均出現了特異性的棕色顯色帶(圖5和圖6)。其中，兔抗幽門螺桿菌尿素酶B 亞單位(UreB)抗體是以UreB作為免疫原免疫兔子得到的(Rokita， E et al. J， Chromatography B 2000， 737:203-212)，兔抗幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單 位(HspA)抗體是以HspA作為免疫原免疫兔子得到的(劉秀麗等，世界華人消化 雜志，2005， 13 (5) : 626 — 630)。
二、重組福氏志賀氏菌HP-BA的免疫效果
1、重組福氏志賀氏菌HP-BA外源表達抗原的免疫原性試驗 用具有實驗動物等級合格證的6 — 8周齡、體重18 — 20g的雌性SPF級BALB/c小鼠 共20只進行試驗。其中10只為實驗組，10只為對照組。將按照上述步驟一中LB液體 培養的經過lraM IPTG誘導的HP-BA菌株，離心收集菌體，用無菌生理鹽水重懸洗滌 兩次后濃縮制成5X10Vfu/ml的細菌懸液。小鼠經禁食4h、禁水2h后，先以飽和 NaHC03 200ul/只灌胃，半小時后實驗組小鼠用HP-BA菌株細菌懸液200 u 1/只灌胃 免疫，對照組小鼠用200!xl/只無菌生理鹽水灌胃。按此方法隔周免疫，共免疫3次。 最后一次免疫后10天取血、取腸液進行ELISA免疫效價測定。
用幽門螺桿菌標準株"/^A ri 26695 (購自中國疾病預防控制中心)超聲粉碎 物抗原(10ug/ml)包被酶聯免疫反應板，將采集的對照組小鼠血清進行100倍稀 釋，實驗組小鼠血清進行200倍稀釋后進行免疫測定，結果對照組小鼠血清測定的0D艦值為0. 083±0. 016(平均值士標準差)，實驗組小鼠血清OD鵬值為0. 563±0. 162 (平均值土標準差)。
用上述幽門螺桿菌標準株超聲粉碎物抗原(10ug/ml)包被的酶聯免疫反應板 測定小鼠腸液中抗幽門螺桿菌sIgA抗體，結果10只對照組小鼠測定的OD，值為 0. 114±0.035 (平均值士標準差)，IO只實驗組小鼠OD靴值為O. 387±0. 147 (平均
值土標準差)。
2、重組福氏志賀氏菌HP-BA免疫保護性試驗
用具有實驗動物等級合格證的6-8周齡雌性SPF級BALB/c小鼠40只進行實驗。 實驗小鼠隨機分為2組，每組20只。l組為實驗組，另一組為對照組。按組分籠飼 養，每籠5只。動物在免疫及攻毒實驗期間由實驗動物中心在SPF環境下詞養。
將按照上述步驟一中LB液體培養的經過lmM IPTG誘導的HP-BA菌株，離心收 集菌體，用無菌生理鹽水重懸洗滌兩次后濃縮制成5X109cfu/ml的細菌懸液。動物 經禁食4h、禁水2h后，先以飽和NaHC03 2 00ul/只灌胃，半小時后實驗組小鼠用 HP-BA菌株菌懸液200u l/只灌胃免疫；對照組小鼠用無菌生理鹽水200y 1/只灌 胃。按此方法隔周免疫，共免疫3次。最后一次免疫兩周以后，對小鼠以"pj^ow' 5"57 (購自中國疾病預防控制中心)5X108 cfu/ml灌胃2次，每次每只小鼠200 ul，隔天一次。攻毒后四周，處死小鼠，開腹取胃。將胃沿大彎縱切開，在生理 鹽水中漂洗去胃內殘留的食物殘渣，稱重。再將胃沿小彎縱切一分為二， 一半用10% 的福爾馬林緩沖液固定， 一半加入適量布氏肉湯在玻璃研磨器中研磨至肉漿，制成 1: IO倍稀釋液，繼續10X系列稀釋，取稀釋液涂布幽門螺桿菌血瓊脂平板，每個 稀釋度三塊，每塊100ul。培養平板含5%脫纖羊血，10 ug/ml萬古霉素，5 ti g/ml兩性霉素B， 10U/ml多粘菌素B， 20 u g/ml桿菌肽。置于微需氧環境(5%02, 10%C02, 85% N2)下37。C培養72-96小時，菌落計數，取同一稀釋度菌數在30-300 三塊平板菌落數的平均值，換算成CFU/g胃組織。
結果表明，對照組小鼠胃內均有幽門螺桿菌定植，實驗組有5只小鼠沒有定植， 獲得了完全保護；實驗組小鼠的平均定植密度為3. lX105cfu/g，而對照組為 2.81X106cfu/g;實驗組小鼠比對照組小鼠胃內幽門螺桿菌定植密度低近1個數量 級。統計分析表明，實驗組小鼠胃內幽門螺桿菌定植密度與對照組之間具有非常顯 著的差異(p<0.01)。序列表
〈110〉中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所
<120〉幽門螺桿菌活菌載體疫苗及其專用重組菌
<160> 1
〈210〉 1 <211> 702 <212〉 PRT
〈213〉 幽門螺桿菌6^A'coZ^"er ^^ar^ <400〉 1
Met Asp Lys Lys lie Ser Arg Lys Glu Tyr Val Ser Met Tyr Gly Pro 15 10 15
Thr Thr Gly Asp Lys Val Arg Leu Gly Asp Thr Asp Leu lie Ala Glu 20 25 30
Val Glu His Asp Tyr Thr lie Tyr Gly Glu Glu Leu Lys Phe Gly Gly 35 40 45Gly Lys Thr Leu Arg Glu Gly Met Ser Gin Ser Asn Asn Pro Ser Lys 50 55 60
Glu Glu Leu Asp Leu lie lie Thr Asn Ala Leu lie Val Asp Tyr Thr 65 70 75 80
Gly lie Tyr Lys Ala Asp lie Gly lie Lys Asp Gly Lys lie Ala Gly 85 90 95
lie Gly Lys Gly Gly Asn Lys Asp Met Gin Asp Gly Val Lys Asn Asn 100 105 110
Leu Ser Val Gly Pro Ala Thr Glu Ala Leu Ala Gly Glu Gly Leu lie 115 120 125
Val Thr Ala Gly Gly lie Asp Thr His lie His Phe lie Ser Pro Gin 130 135 140
Gin lie Pro Thr Ala Phe Ala Ser Gly Val Thr Thr Met lie Gly Gly 145 150 155 160
Gly Thr Gly Pro Ala Asp Gly Thr Asn Ala Thr Thr lie Thr Pro Gly 165 170 175Arg Arg Asn Leu Lys Trp Met Leu Arg Ala Ala Glu Glu Tyr Ser Met 180 185 190
Asn Leu Gly Phe Leu Ala Lys Gly Asn Ala Ser Asn Asp Ala Ser Leu 195 200 205
Ala Asp Gin lie Glu Ala Gly Ala lie Gly Phe Lys lie His Glu Asp 210 215 220
Trp Gly Thr Thr Pro Ser Ala lie Asn His Ala Leu Asp Val Ala Asp 225 230 235 240
Lys Tyr Asp Val Gin Val Ala lie His Thr Asp Thr Leu Asn Glu Ala 245 250 255
Gly Cys Val Glu Asp Thr Met Ala Ala lie Ala Gly Arg Thr Met His 260 265 270
Thr Phe His Thr Glu Gly Ala Gly Gly Gly His Ala Pro Asp lie lie 275 280 285Lys Val Ala Gly Glu His Asn lie Leu Pro Ala Ser Thr Asn Pro Thr 290 295 300
lie Pro Phe Thr Val Asn Thr Glu Ala Glu His Met Asp Met Leu Met 305 310 315 320
Val Cys His His Leu Asp Lys Ser lie Lys Glu Asp Val Gin Phe Ala 325 330 335
Asp Ser Arg lie Arg Pro Gin Thr lie Ala Ala Glu Asp Thr Leu His 340 345 350
Asp Met Gly lie Phe Ser lie Thr Ser Ser Asp Ser Gin Ala Met Gly 355 360 365
Arg Val Gly Glu Val lie Thr Arg Thr Trp Gin Thr Ala Asp Lys Asn 370 375 380
Lys Lys Glu Phe Gly Arg Leu Lys Glu Glu Lys Gly Asp Asn Asp Asn 385 390 395 400
Phe Arg lie Lys Arg Tyr Leu Ser Lys Tyr Thr lie Asn Pro Ala lie 405 410 415Ala His Gly lie Ser Glu Tyr Val Gly Ser Val Glu Val Gly Lys Val 420 425 430
Ala Asp Leu Val Leu Trp Ser Pro Ala Phe Phe Gly Val Lys Pro Asn 435 440 445
Met lie lie Lys Gly Gly Phe lie Ala Leu Ser Gin Met Gly Asp Ala 450 455 460
Asn Ala Ser lie Pro Thr Pro Gin Pro Val Tyr Tyr Arg Glu Met Phe 465 470 475 480
Ala His His Gly Lys Ala Lys Tyr Asp Ala Asn lie Thr Phe Val Ser 485 490 495
Gin Ala Ala Tyr Asp Lys Gly lie Lys Glu Glu Leu Gly Leu Glu Arg 500 505 510
Gin Val Leu Pro Val Lys Asn Cys Arg Asn lie Thr Lys Lys Asp Met 515 520 525Gin Phe Asn Asp Thr Thr Ala His lie Glu Val Asn Pro Glu Thr Tyr 530 535 540
His Val Phe Val Asp Gly Lys Glu Val Thr Ser Lys Pro Ala Asn Lys 545 550 555 560
Val Ser Leu Ala Gin Leu Phe Ser lie Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly 565 570 575
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Phe Gin Pro Leu Gly Glu 580 585 590
Arg Val Leu Val Glu Arg Leu Glu Glu Glu Asn Lys Thr Ser Ser Gly 595 600 605
lie lie lie Pro Asp Asn Ala Lys Glu Lys Pro Leu Met Gly Val Val 610 615 620
Lys Ala Val Ser His Lys lie Ser Glu Gly Cys Lys Cys Val Lys Glu 625 630 635 640
Gly Asp Val lie Ala Phe Gly Lys Tyr Lys Gly Ala Glu lie Val Leu 645 650 655Asp Gly Thr Glu Tyr Met Val Leu Glu Leu Glu Asp lie Leu Gly lie 660 665 670
Val Gly Ser Gly Ser Cys Cys His Thr Gly Asn His Asp His Lys His 675 680 685
Ala Lys Glu His Glu Ala Cys Cys His Asp His Lys Lys His
<210〉 2 〈211> 2109 〈212〉 腿
〈213> 幽門螺桿菌rtfeh'cofe"er pWoWj 〈400> 1
atggataaaa agattagcag aaaagaatat gtttctatgt atggccctac tacaggcgat 60 aaagtgagat tgggcgatac agacttgatc gctgaagtag aacatgacta caccattteit 120 ggcgaagagc ttaaattcgg tggcggtaaa accctgagag aaggcatgag ccaatccaac 180 肪ccctagca aagaagaatt ggatctaatc atcactaacg ctttaatcgt ggattacetcc 240 ggtatttata aagcggatat tggtattaaa gatggcaaaa tcgctggcat tggtaaaggc 300 ggtaacaaag acatgc肪ga tggcgttaaa aacaatctta gcgtaggtcc tgctactgaa 360 gccttagccg gtgaaggttt gatcgtaact gctggtggta ttgacacaca catccacttc 420 atttcacccc aacaaatccc tacagctttt gcaagcggtg taacaaccat gattggtggc 480ggaactggtc ctgctgatgg cactaatgcg actactatca ctccaggcag aagaaattta 540
aaatggatgc tcagagcggc tgaagaatat tctatgaact taggtttctt ggctaaaggt 600
aacgcttcta acgacgcgag cttagccgat caaattgaag ctggtgcgat tggctttaaa 660
atccacgaag actggggcac cactccttct gcaatcaatc atgcgttaga tgttgcagac 720
aaatacgatg tgcaagtcgc tatccacaca gacactttga atgaagccgg ttgcgtgg肌 780
gacactatgg cagctattgc cggacgcact atgcacactt tccacactga aggtgctggc 840
ggcggacacg ctcctgatat tattaaagta gctggtgaac acaacattct tcccgcttcc 900
actaacccca ctatcccttt cactgtgaat acagaagcag aacacatgga catgcttatg %0
gtgtgccacc acttggataa aagcattaaa gaagatgttc agttcgctga ttxaaggatc 1020
cgccctcaaa ccattgcggc tgaagacact ttgcatgaca tggggatttt ctcaatcacc 1080
agctctgact ctcaagctat gggtcgtgtg ggtgaagtta txactagaac ttggcaaaca 1140
gctgacaaaa ac肌aaaaga atttggccgc ttgaaagaag a^aaaggcga taacgacaac 1200
ttcaggatca aacgctactt gtctaaatac accattaacc cagcgatcgc tcatgggatt 1260
agcgagtatg taggttctgt agaagtgggc aaagtggctg acttggtatt gtggagtccc 1320
gcattctttg gcgtaaaacc caacatgatc atcaaaggcg ggttxattgc gttgagtcaa 1380
atgggtgacg cgaacgcttc tatccctacc ccacaaccag tttattacag agaaatgttc 1M0
gctcatcatg gtaaagccaa atacgatgca aacatcactt ttgtgtctca agcggcttat 1500
gacaaaggca ttaaagaaga attagggctt gaaagacaag tgttgccggt aaaaaattgc 1560
agaaacatca ctaaaaaaga catgcaattc aacgacacta ccgctcacat tgaagtcaat 1620
cctgaaactt accatgtgtt cgtggatggc aaagaagtaa cttctaaacc agccaataaa 1680gtgagcttgg cgcaactctt tagcattttc ggcggcggcg gctctggcgg cggcggctct 1740
ggcggcggcg gctctaagtt tcagccatta ggagaaaggg tcttagtaga aagacttgaa 1800
g犯gagaaca aaaccagttc aggcatcatc atccctgata acgctaagga肌agccttta 1860
atgggcgtag tca犯gcggt tagccat3aa atcagtgagg gttgcaaatg cgttaaagaa 1920
ggcgatgtga tcgcttttgg caaatacaaa ggcgcagaaa tcgttttaga cggcactgaa 1980
tacatggtgc tagaactaga agacattcta ggcattgtgg gctcaggct:c ttgttgtcat 2040
acaggtaatc atgaccataa acatgctaaa gagcatgaag cttgctgtca tgatcacaaa 2100
aaacact犯 2109
權利要求
1、一種重組福氏志賀氏菌，是將含有幽門螺桿菌尿素酶B亞單位和幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位的融合蛋白的編碼基因導入福氏志賀氏菌得到的重組菌。
2、 根據權利要求l所述的重組福氏志賀氏菌，其特征在于所述幽門螺桿菌尿素酶B亞單位和幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位的融合蛋白的氨基酸序列如序列表中 序列1所示。
3、 根據權利要求2所述的重組福氏志賀氏菌，其特征在于所述幽門螺桿菌尿 素酶B亞單位和幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位的融合蛋白編碼基因的核苷酸序列如 序列表中序列2所示。
4、 根據權利要求2或3所述的重組福氏志賀氏菌，其特征在于所述福氏志賀 氏菌疫苗株為福氏志賀氏菌2aT32。
5、 根據權利要求4所述的重組福氏志賀氏菌，其特征在于所述幽門螺桿菌尿 素酶B亞單位和幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位的融合蛋白編碼基因通過重組質粒導 入福氏志賀氏菌疫苗株。
6、 一種幽門螺桿菌活菌載體疫苗，它的活性成分為權利要求1-5中任一所述的 重組福氏志賀氏菌。
7、 一種蛋白，它的氨基酸序列為幽門螺桿菌尿素酶B亞單位和幽門螺桿菌熱休 克蛋白A亞單位的融合蛋白的氨基酸序列。
8、 權利要求7所述蛋白的編碼基因。
9、 根據權利要求8所述的基因，其特征在于所述編碼基因的核苷酸序列為幽 門螺桿菌尿素酶B亞單位和幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位的融合基因序列。
10、 含有權利要求8或9所述基因的重組菌或重組質粒。
全文摘要
本發明涉及一種幽門螺桿菌活菌載體疫苗及其專用重組菌。該專用重組菌為重組福氏志賀氏菌(Sh.flexneri)，是將含有幽門螺桿菌尿素酶B亞單位和幽門螺桿菌熱休克蛋白A亞單位的融合蛋白的編碼基因導入福氏志賀氏菌(Sh.flexneri)疫苗株得到的重組菌。本發明的幽門螺桿菌活菌載體疫苗的活性成分即為重組后的福氏志賀氏菌(Sh.flexneri)。動物實驗表明，本發明提供的幽門螺桿菌疫苗菌株的免疫原性和免疫保護性良好。
文檔編號C07K19/00GK101538550SQ20091008328
公開日2009年9月23日 申請日期2009年4月30日 優先權日2009年4月30日
發明者劉純杰, 展德文, 張兆山, 芃 王, 王令春, 王艷春, 袁盛凌, 陶好霞 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所