端炔基標簽化合物及其制備方法

專利名稱：端炔基標簽化合物及其制備方法
技術領域：
本發明涉及端炔基標簽化合物及其制備方法。
背景技術：
蛋白質或多肽分子的質譜分析是生命分析化學中的一個重要問題。在利用質譜進 行蛋白質化學，尤其是蛋白質翻譯后修飾譜學的研究中，往往需要在蛋白質或多肽上加上 一個標簽分子片段，進而改善其質譜信號，添加質譜質量標簽或創造一個捕獲位點。近年以來，在蛋白質或者多肽分子上的修飾主要集中在小分子質譜信號增益標 簽，以及小分子可捕獲標簽方面。第一種標簽分子在修飾蛋白質或者多肽分子之后，具有增 強其質譜信號，添加質譜質量標簽的功能。第二種標簽分子在修飾蛋白質或者多肽分子的 之后，另一端可以親和方式或者可逆化學反應和蛋白質或者樹脂結合，而后被釋放出來，從 而達到蛋白質或者多肽分子的富集和分離功能。因此，利用點擊化學的原理，設計具有端炔及巰基/硫醚/氨基結構的標簽化合 物，以修飾蛋白質或多肽分子，從而達到分離富集與質譜信號增益標簽添加的多重目的。

發明內容
本發明的目的是提供一種對蛋白質或多肽具有分離富集與質譜信號增益標簽添 加功能的具有端炔基結構的標簽化合物及其制備方法。本發明提供的端炔基標簽化合物，其結構通式如式I所示，
R。=(式 I)式I結構通式中，Rtl為R-X-、笏基保護氨基端半胱氨酸酯基或笏基保護氨基端賴 氨酸酯基；其中，R-X-中，R為SH-或-NH2, X為主鏈碳原子個數為1 6、總碳原子個數為 1 10的烷基鏈或含有酯基或酰胺基的主鏈碳原子個數為2 8、總碳原子個數為2 12 的烷基鏈。當X為含酯基或酰胺基的烷基鏈的標簽化合物時，本發明提供的制備上述端炔基 標簽化合物的方法，包括如下步驟1)將巰基羧酸或半胱氨酸進行巰基保護反應；2)將所述步驟1)得到的產物進行酯化或酰胺化反應；3)將所述步驟2)得到的產物進行巰基的脫保護反應，得到所述端炔基標簽化合 物。該方法中，所述步驟1)中，巰基保護反應是按照下述a_d中的任意一種方法進行 的a、將巰基羧酸或半胱氨酸與S，S- 二苯基-S-甲氧基硫腈于有機溶劑中進行反應；所述巰基羧酸或半胱氨酸與對甲基苯磺酰氯的摩爾比為1 2 ；反應時間為30°C， 反應時間為4小時；b、將巰基羧酸或半胱氨酸溶于乙醇和氨水的混合液中，加入芐氯進行反應；所述巰基羧酸或半胱氨酸與芐氯的摩爾比為1 1-2，優選1 1.2;反應時間為 30分鐘，反應溫度為25°C ；所述乙醇和氨水的混合液中，乙醇和氨水的體積比為3 1-3； C、將巰基羧酸或半胱氨酸溶于有機溶劑中，加入芐氯和碳酸銫進行反應；所述巰基羧酸或半胱氨酸與芐氯、碳酸銫的摩爾比為1(1) 1-2(1.2) 0.2-1 優選1 1.2 0.5)；反應時間為2小時，反應溫度為20°C;所述有機溶劑為N，N-二甲基 甲酰胺；d、在堿性條件下，將巰基羧酸或半胱氨酸與對甲基苯磺酰氯于有機溶劑中進行反 應；所述堿性條件的pH值為9-12 ；所述巰基羧酸或半胱氨酸與對甲基苯磺酰氯的摩 爾比為1 1-2，優選1 1.2;反應時間為室溫，反應時間為1-6小時；所述步驟2)中，酯化反應是按照如下方法進行的將所述步驟1)得到的產物與炔 基醇、N，N’ - 二環己基二亞胺于有機溶劑中進行反應；所述步驟1)得到的產物與炔基醇、N，N’ - 二環己基二亞胺的摩爾比為 1 1-1.5 1-2;所述反應溫度為20-80°C，所述反應時間為8小時；所述步驟2)中，酰胺化反應是按照如下方法進行的將所述步驟1)的產物與炔基 胺、苯并三氮唑-N，N，N' ,N'-四甲基脲六氟磷酸鹽、1-羥基苯并三氮唑和N，N-二異丙 基乙胺進行反應；所述步驟1)得到的產物與炔基胺、苯并三氮唑-N，N，N' ,N'-四甲基脲六氟磷酸 鹽、1-羥基苯并三氮唑和N，N-二異丙基乙胺的摩爾比為1 1.5-4 0.9-1 1-2 1-3, 優選1 2 0.9 1 2 ；所述反應溫度為20-80°C，反應時間為1.5-6小時。所述步驟3)中，巰基的脫保護反應是按照e_h方法中的任意一種進行的e、將所述步驟2)的產物溶于乙醇，通入氨氣并加入鈉絲，回流反應；f、將所述步驟2)的產物溶于苯甲醚，通入氟化氫進行反應；g、在惰性氣氛保護下，將所述步驟2)的產物用乙酸乙酯溶解后，加入三氟乙酸進 行反應；h、將步驟2)得到的產物用濃氨水溶解；濃氨水的質量百分比濃度為25-28%。所述有機溶劑為苯、N，N- 二甲基甲酰胺或乙腈。在上述步驟之后，還可對產物進行純化；具體步驟可為反應完畢后將反應溶劑 除去，以硅膠柱色譜進行純化，流動相選取含有羧酸的洗脫劑，羧酸可為甲酸或乙酸等。當X為笏基保護氨基端半胱氨酸酯基或笏基保護氨基端賴氨酸酯基時，按照上述 方法的步驟2)-3)進行制備，僅將步驟2)的起始反應物替換為芴甲氧羰?；腚装彼釒€基
三苯甲基。當X為烷基鏈的標簽化合物時，本發明提供的制備上述端炔基標簽化合物的方 法，包括如下步驟1)將炔基醇進行羥基保護反應；
2)制備硫代乙酸的銫鹽；
3)將所述步驟1)得到的產物進行取代反應；4)所述步驟3)得到的產物進行保護基脫除反應，得到所述端炔基標簽化合物。該方法中，所述步驟1)是按照如下方法進行的在甲基苯磺酰氯和氯仿的混合液 中加入炔基醇和吡啶進行反應；所述炔基醇為3-丁炔-1-醇；所述反應溫度為0-10°C，反應時間為2-10小時；炔基醇、甲基苯磺酰氯、氯仿和吡啶的摩爾比為1 1.2-2 8-20 8-20 ；所述步驟2)是按照如下方法進行的將硫代乙酸、甲醇和碳酸銫混合進行反應， 得到硫代乙酸的銫鹽；硫代乙酸、甲醇和碳酸銫的摩爾比為1 0. 4-4 0. 2-1 ；反應溫度為40_85°C，反 應時間為0. 5-6小時；所述步驟3)是按照如下方法進行的將所述步驟1)的產物與所述硫代乙酸的銫 鹽進行反應；所述步驟1)的產物與硫代乙酸的銫鹽的摩爾比為1 1.2-4。所述步驟4)是按照如下方法進行的將所述步驟3)得到的產物與氨水反應后，酸 化，得到所述端炔基標簽化合物。本發明提供的端炔基標簽化合物，不僅能修飾蛋白質、多肽或類似物分子，為其提 供一個可專一性捕獲的末端，還可在后續的專一性捕獲中在蛋白質末端產生一個質譜信號 增益標簽。本發明提供的化合物在生命分析，尤其是生物質譜，蛋白質翻譯后修飾位點測定 領域具有廣闊的應用。
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。實施例1一、合成式II結構式所示的端炔基標簽化合物
SH式II在燒瓶中加入Fmoc-Cys (Trt)-OH (芴甲氧羰?；腚装彼釒€基三苯甲基)585mg， 3_ 丁炔-1-醇151 μ L，再加入干燥乙腈，加入50mg DMAP (4-二甲氨基吡啶)。體系完全澄 清后加入適量2. 2g DCC(1，3-二環己基碳二亞胺)，自然升溫至室溫。反應8小時后，過濾 除去不溶物，硅膠柱分離，將過濾所得溶液用油泵旋蒸，所得產物油泵抽干，稱重。以硅膠柱進行分離。得到的產物用乙酸乙酯溶解之后，加入TFA (三氟乙酸)，氬氣保護下，震蕩2h。而 后用氮氣吹干此物，得到最終產物。二、利用式II結構式所示的端炔基標簽化合物進行蛋白質/多肽的修飾
將磷酸化多肽Kemptide (序列為LRRApSLG)配制成0. 1 10mg/mL，優選為Img/ L的水溶液，取20微升蛋白質/多肽水溶液，加入100微升飽和氫氧化鋇水溶液，在45°C下 溫育3小時，滴加lmol/L硫酸至pH為4，過濾取濾液，得到消除之后的蛋白質/多肽溶液。在上述溶液中加入100微升式II結構式所示化合物的乙醇溶液，其中，式II結構 式所示化合物的質量百分比2% 30% (優選10% )，在45°C下溫育2小時，得到修飾之后 的蛋白質/多肽溶液。以RP-HPLC(反相高效液相色譜)法對反應液進行分離，采用C18分析柱， H2O AcCN從20 80到80 20進行梯度洗脫?？梢杂^測到磷酸化多肽Kemptide色譜 峰的消失，并在保留時間更長處出現一個新的峰。質譜檢測為Kemptide失去磷酸基團并與 一個標簽化合物分子加成的峰。實施例2一、合成式IV結構式所示的端炔基標簽化合物 (式IV)向10mL2N氫氧化鈉的溶液中加入210 μ L巰基乙酸，于冰水浴中邊攪拌邊緩慢滴 加2. 15mL對甲基苯磺酰氯，滴加后期測定體系的pH值，加氫氧化鈉控制pH值為9 10。 攪拌反應1小時后，用乙醚洗掉過量對甲基苯磺酰氯，重復乙醚洗滌步驟兩次后，用15mL乙 酸乙酯稀釋，用6M鹽酸酸化至pH值為1，分離出有機相，水相用乙酸乙酯萃取。合并有機 相，用5% (wt)氯化鈉溶液洗滌至中性，無水硫酸鈉干燥，旋蒸得到粘稠液體。在上一步的燒瓶中加入IOmL的干燥乙腈，加入50mg DMAP (4_ 二甲氨基吡啶)。等 到體系完全變成澄清的時候，加入2. 2g DCC，撤掉冷卻，讓溫度自然升高到室溫。反應8小 時之后，過濾除去不溶物。濾液經減壓蒸去溶劑，再溶于ImL混合溶劑中，該混合溶劑為石 油醚-乙酸乙酯(9 1，V V)。若有必要，可再次過濾去除殘留的脲.粗產物溶液以石 油醚-乙酸乙酯(8 2，V V)為洗脫液經過硅膠短柱快速層析，得粘稠狀目標產物。將上一步的產物以濃氨水溶解，室溫之下，1小時脫保護反應之后以石油醚-乙酸 乙酯(8 2，V V)為洗脫液經過硅膠短柱快速層析，得粘稠狀目標產物。二、利用式II結構式所示的端炔基標簽化合物進行蛋白質/多肽的修飾將磷酸化多肽Kemptide (序列為LRRApSLG)配制成0. 1-lOmg/mL,優選為lmg/L的 水溶液，取20微升蛋白質/多肽水溶液，加入100微升飽和氫氧化鋇水溶液，在45°C下溫育 3小時，滴加lmol/L硫酸至pH為4，過濾取濾液，得到消除之后的蛋白質/多肽溶液。在上述溶液中加入100微升式IV結構式所示化合物的乙醇溶液，其中，式II結構 式所示化合物的質量百分比為2% 30%，優選10%，在45°C下溫育2小時，得到修飾之后 的蛋白質/多肽溶液。以RP-HPLC(反相高效液相色譜)法對反應液進行分離，采用C18分析柱， H2O AcCN從20 80到80 20進行梯度洗脫?？梢杂^測到磷酸化多肽Kemptide色譜 峰的消失，并在保留時間更長處出現一個新的峰。質譜檢測為Kemptide失去磷酸基團并與 一個標簽化合物分子加成的峰。
實施例3一、合成式II結構式所示的端炔基標簽化合物SS-Ol 式XI1,3- 丁炔-1-醇的甲基苯磺?；Ｗo在三口燒瓶中加入4. 55g的甲基苯磺酰氯與IOmL氯仿，攪拌均勻并用冰水浴冷卻 至3°C ；將混合均勻的0. 701g 3- 丁炔-1-醇和2. 06g吡啶滴入燒瓶中，通過冰水浴和控制 滴加速度使反應溫度在6-8°C，滴加完畢，維持8-10°C繼續攪拌反應5h ；將反應混合物傾入 40mL冰水中攪拌洗滌，再用冷水洗滌兩次，用pH值8-9的碳酸鈉水溶液(溫度在3°C以下) 充分攪拌洗滌兩次，最后用蒸餾水洗滌至PH值穩定在6. 57-6. 70 ；靜置分凈水層，有機層用 無水硫酸鈉干燥后，先常壓后減壓蒸餾，蒸出所有溶劑，得無色油狀液態產物，用無水乙醇 重結晶，得白色片狀結晶。2、制備硫代乙酸的銫鹽379 μ L硫代乙酸中加入5mL甲醇，并加入1. 63g碳酸銫，攪拌至碳酸銫完全溶解，
旋蒸至干。3、甲基苯磺酰基保護的3- 丁炔-1-醇的取代反應將第一步獲得的產物用盡可能少的DMF(N，N_ 二甲基甲酰胺)溶解，加入上一步的 產物燒瓶中。加熱到70°C左右，回流反應5小時。加入適量的石油醚之后，用水逐步將DMF 洗去。最后，將石油醚旋蒸除去。獲得產品。4、保護基脫除反應取第三步的產物，加入30mL IN的氨水，攪拌5小時，此后使用4mol/L的鹽酸進行 酸化。產物用乙醚進行萃取，干燥之后，減壓蒸餾獲得產物。產物在氮氣環境下進行保存。二、利用式II結構式所示的端炔基標簽化合物進行蛋白質/多肽的修飾將磷酸化多肽Kemptide (序列為LRRApSLG)配制成0. 1 10mg/mL，優選為lmg/L 的水溶液，取20微升蛋白質/多肽水溶液，加入100微升飽和氫氧化鋇水溶液，以及100微 升式XI結構式所示SS-Ol標簽化合物的質量百分比2% 30%，優選為10%乙醇溶液，在 45°C下溫育4小時，得到修飾之后的蛋白質/多肽溶液。以RP-HPLC(反相高效液相色譜)法對反應液進行分離，采用C18分析柱， H2O AcCN從20 80到80 20進行梯度洗脫?？梢杂^測到磷酸化多肽Kemptide色譜 峰的消失，并在保留時間更長處出現一個新的峰。質譜檢測為Kemptide失去磷酸基團并與 一個標簽化合物分子加成的峰。實施例4一、合成式XII結構式所示的端炔基標簽化合物SS-Il (式 XII)
2N氫氧化鈉的溶液IOmL中加入巰基乙酸210 μ L，在冰水浴中，攪拌之下，緩慢滴 加2. 15mL的對甲基苯磺酰氯。滴加后期測量PH值，加氫氧化鈉使得pH值控制在9 10， 攪拌反應進行1小時之后，首先使用乙醚洗掉過量的對甲基苯磺酰氯，兩次，再用乙酸乙酯 15mL稀釋，用6M鹽酸酸化到pH值為1，分離出有機相，水相用乙酸乙酯萃取。合并有機相 使用5%氯化鈉洗到中性，再用無水硫酸鈉干燥，旋蒸得到粘稠液體。在上一步產物中加入0. 28g 3-丁炔-1-胺，DIEA(N，N-二異丙基乙胺)0. 26g， HOBT (1-羥基苯并三氮唑)0. 14g，HBTU(苯并三氮唑-N，N, N'，N'-四甲基脲六氟磷酸 鹽，可商業購得)0. 34g溶于20mL DMF(N，N-二甲基甲酰胺)中，于60度下回流攪拌4小 時，反應完畢除去反應溶劑，以硅膠柱色譜進行純化，流動相選取乙酸乙酯石油醚乙酸 =20 80 1比例的混合液。將上一步產物以濃氨水溶解，于室溫進行1小時的脫保護反應，以石油醚-乙酸乙 酯(8 2，V V)為洗脫液經過硅膠短柱快速層析，得到粘稠狀目標產物。二、利用式II結構式所示的端炔基標簽化合物進行蛋白質/多肽的修飾將磷酸化多肽Kemptide (序列為LRRApSLG)配制成0. 1 10mg/mL，優選為Img/ L 的水溶液，取20微升蛋白質/多肽水溶液，加入100微升飽和氫氧化鋇水溶液，以及100 微升式式XII結構式所示SS-IO標簽化合物的質量百分比2% 30%，優選為10%乙醇溶 液，在45°C下溫育4小時，得到修飾之后的蛋白質/多肽溶液。以RP-HPLC(反相高效液相色譜)法對反應液進行分離，采用C18分析柱， H2O AcCN從20 80到80 20進行梯度洗脫?？梢杂^測到磷酸化多肽Kemptide色譜 峰的消失，并在保留時間更長處出現一新峰。質譜檢測為Kemptide失去磷酸基團并與一個 標簽化合物分子加成的峰。
權利要求
一種端炔基標簽化合物，其結構通式如式I所示，所述式I結構通式中，R0為R-X-或笏基保護氨基端半胱氨酸酯基或笏基保護氨基端賴氨酸酯基；其中，所述R-X-中，R為SH-或-NH2，X為主鏈碳原子個數為1～6、總碳原子個數為1～10的烷基鏈、含有酯基或酰胺基的主鏈碳原子個數為2～8、總碳原子個數為2～12的烷基鏈。F2009100808737C0000011.tif
2.根據權利要求1所述的化合物，其特征在于所述式I結構通式中，R0為R-X-；所述 R-X-中，R為SH-或-NH2, X為含有酯基或酰胺基的主鏈碳原子個數為2 8、總碳原子個 數為2 12的烷基鏈。
3.根據權利要求1所述的化合物，其特征在于所述式I結構通式中，Rtl為R-X-；所述 R-X-中，R為SH-或-NH2,X為主鏈碳原子個數為1 6、總碳原子個數為1 10的烷基鏈。
4.根據權利要求1所述的化合物，其特征在于所述式I結構通式中，Rtl為笏基保護氨 基端半胱氨酸酯基或笏基保護氨基端賴氨酸酯基。
5.根據權利要求1-4任一所述的化合物，其特征在于所述端炔基標簽化合物為式 II-式VII結構式所示的化合物
6.一種制備權利要求2所述端炔基標簽化合物的方法，包括如下步驟1)將巰基羧酸或半胱氨酸進行巰基保護反應；2)將所述步驟1)得到的產物進行酯化或酰胺化反應；3)將所述步驟2)得到的產物進行巰基的脫保護反應，得到所述端炔基標簽化合物。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，巰基保護反應是按照下 述a_d中的任意一種方法進行的a、將巰基羧酸或半胱氨酸與S,S- 二苯基-S-甲氧基硫腈于有機溶劑中進行反應；b、將巰基羧酸或半胱氨酸溶于乙醇和氨水的混合液中，加入芐氯進行反應； C、將巰基羧酸或半胱氨酸溶于有機溶劑中，加入芐氯和碳酸銫進行反應；d、在堿性條件下，將巰基羧酸或半胱氨酸與對甲基苯磺酰氯于有機溶劑中進行反應； 所述步驟2)中，酯化反應是按照如下方法進行的將所述步驟1)得到的產物與炔基醇、N，N’ - 二環己基二亞胺于有機溶劑中進行反應；所述步驟2)中，酰胺化反應是按照如下方法進行的將所述步驟1)的產物與炔基胺、 苯并三氮唑-N，N，N' ,N'-四甲基脲六氟磷酸鹽、1-羥基苯并三氮唑和N，N-二異丙基乙 胺進行反應；所述步驟3)中，巰基的脫保護反應是按照e_h方法中的任意一種進行的e、將所述步驟2)的產物溶于乙醇，通入氨氣并加入鈉絲，回流反應；f、將所述步驟2)的產物溶于苯甲醚，通入氟化氫進行反應；g、在惰性氣氛保護下，將所述步驟2)的產物用乙酸乙酯溶解后，加入三氟乙酸進行反應；h、將所述步驟2)得到的產物用濃氨水溶解。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，方法a中，所述巰基羧酸 或半胱氨酸與對甲基苯磺酰氯的摩爾比為1 2 ；反應時間為30°C，反應時間為4小時；方法b中，所述巰基羧酸或半胱氨酸與芐氯的摩爾比為1 1-2，優選1 1.2;反應時間為30分鐘，反應溫度為25°C ；所述乙醇和氨水的混合液中，乙醇和氨水的體積比為 3 1-3 ；方法c中，所述巰基羧酸或半胱氨酸與芐氯、碳酸銫的摩爾比為1 1-2 0.2-1，優 選1 1.2 0.5;反應時間為2小時，反應溫度為20°C ；所述有機溶劑為N，N-二甲基甲 酰胺；方法d中，所述堿性條件的pH值為9-12 ；所述巰基羧酸或半胱氨酸與對甲基苯磺酰氯 的摩爾比為1 1-2，優選1 1.2;反應時間為室溫，反應時間為1-6小時；所述步驟2)中，酯化反應中，所述步驟1)得到的產物與炔基醇、N，N’ - 二環己基二亞 胺的摩爾比為1 1-1.5 1-2;所述反應溫度為20-80°C，所述反應時間為8小時；所述步驟2)中，酰胺化反應中，所述步驟1)得到的產物與炔基胺、苯并三氮唑-N， N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸鹽、1-羥基苯并三氮唑和N，N-二異丙基乙胺的摩爾比為 1 1.5-4 0.9-1 1-2 1-3，優選 1 2 0. 9 1 2 ；所述反應溫度為 20_80°C， 反應時間為1. 5-6小時。
9.根據權利要求6-8任一所述的方法，其特征在于所述有機溶劑為苯、N,N- 二甲基 甲酰胺或乙腈。
10.一種制備權利要求3所述端炔基標簽化合物的方法，包括如下步驟1)將炔基醇進行羥基保護反應；2)制備硫代乙酸的銫鹽；3)將所述步驟1)得到的產物進行取代反應；4)所述步驟3)得到的產物進行保護基脫除反應，得到所述端炔基標簽化合物。
11.根據權利要求10所述的方法，其特征在于所述步驟1)是按照如下方法進行的 在甲基苯磺酰氯和氯仿的混合液中加入炔基醇和吡啶進行反應；所述步驟2)是按照如下方法進行的將硫代乙酸、甲醇和碳酸銫混合進行反應，得到 硫代乙酸的銫鹽；所述步驟3)是按照如下方法進行的將所述步驟1)的產物與所述硫代乙酸的銫鹽進 行反應；所述步驟4)是按照如下方法進行的將所述步驟3)得到的產物與氨水反應后，酸化， 得到所述端炔基標簽化合物。
12.根據權利要求11所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，所述炔基醇為3-丁 炔-1-醇；所述反應溫度為0-10°C，反應時間為2-10小時；炔基醇、甲基苯磺酰氯、氯仿和吡啶的摩爾比為1 1.2-2 8-20 8-20 ；所述步驟2)中，硫代乙酸、甲醇和碳酸銫的摩爾比為1 0.4-4 0.2-1;反應溫度為 40-85 °C，反應時間為0. 5-6小時；所述步驟3)中，所述步驟1)的產物與硫代乙酸的銫鹽的摩爾比為1 1.2-4。
13.一種制備權利要求4所述端炔基標簽化合物的方法，包括如下步驟1)將芴甲氧羰酰基半胱氨酸巰基三苯甲基進行酯化或酰胺化反應；2)將所述步驟1)得到的產物進行巰基的脫保護反應，得到所述端炔基標簽化合物。
14.根據權利要求13所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，酯化反應是按照如下 方法進行的將芴甲氧羰酰基半胱氨酸巰基三苯甲基與炔基醇、N, N’ - 二環己基二亞胺于有機溶劑中進行反應；所述步驟1)中，酰胺化反應是按照如下方法進行的將芴甲氧羰?；腚装彼釒€基三 苯甲基與炔基胺、苯并三氮唑-N，N，N' ,N'-四甲基脲六氟磷酸鹽、1-羥基苯并三氮唑和 N，N-二異丙基乙胺進行反應；所述步驟2)中，巰基的脫保護反應是按照e_h方法中的任意一種進行的e、將所述步驟1)的產物溶于乙醇，通入氨氣并加入鈉絲，回流反應；f、將所述步驟1)的產物溶于苯甲醚，通入氟化氫進行反應；g、在惰性氣氛保護下，將所述步驟1)的產物用乙酸乙酯溶解后，加入三氟乙酸進行反應；h、將所述步驟1)得到的產物用濃氨水溶解；濃氨水的質量百分比濃度為25-28%。
15.根據權利要求14所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，酯化反應中， 芴甲氧羰?；腚装彼釒€基三苯甲基與炔基醇、N，N’ - 二環己基二亞胺的摩爾比為 1 1-1.5 1-2;所述反應溫度為20-80°C，所述反應時間為8小時；所述步驟1)中，酰胺化反應中，芴甲氧羰?；腚装彼釒€基三苯甲基與炔基胺、苯并 三氮唑-N，N，N' ,N'-四甲基脲六氟磷酸鹽、1-羥基苯并三氮唑和N，N-二異丙基乙胺的 摩爾比為1 1.5-4 0.9-1 1-2 1-3，優選1 2 0. 9 1 2 ；所述反應溫度為 20-80°C，反應時間為1. 5-6小時。
16.根據權利要求13-15任一所述的方法，其特征在于所述有機溶劑為苯、N，N-二甲 基甲酰胺或乙腈。
全文摘要
本發明公開一種端炔基標簽化合物及其制備方法。本發明提供的端炔基標簽化合物，其結構通式如式I所示，R0為R-X-、笏基保護氨基端半胱氨酸酯基或笏基保護氨基端賴氨酸酯基；其中，R-X-中，R為SH-或-NH2，X為主鏈碳原子個數為1～6、總碳原子個數為1～10的烷基鏈或含有酯基或酰胺基的主鏈碳原子個數為2～8、總碳原子個數為2～12的烷基鏈。本發明提供的端炔基標簽化合物，不僅能修飾蛋白質、多肽或類似物分子，為其提供一個可專一性捕獲的末端，還可在后續的專一性捕獲中在蛋白質末端產生一個質譜信號增益標簽。本發明提供的化合物在生命分析，尤其是生物質譜，蛋白質翻譯后修飾位點測定領域具有廣闊的應用。(式I)
文檔編號C07C229/08GK101845007SQ20091008087
公開日2010年9月29日 申請日期2009年3月26日 優先權日2009年3月26日
發明者馮玉萍, 劉沖, 盧小利, 張凌鋒, 李艷梅, 林天舒, 王芹珠, 程智慧, 胡笳, 蔡輝, 趙鐳, 魏瑋, 黃智華 申請人:清華大學