專利名稱：：一種植物葉綠體發育相關蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種植物葉綠體發育相關蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術：
：葉色突變體是研究植物光合作用、光形態建成、激素生理、植物生長發育等-一系列生理代謝過程的理想材料。此外，由于葉發育過程中細胞核和葉綠體間存在著復雜的調節信號互作，細胞質突變體對揭示核-質信號調節機制有重要意義。近年來隨著突變機理研究不斷深入，葉色突變體的利用價值受到越來越多關注。首先，在作物雜交育種中，葉色可作為標記性狀，鑒定雜種純度，及時剔除假雜種，保證大田雜交稻的純度。其次，葉色突變體為提高作物產量、改良作物品質和培育觀賞植物新品種提供優良種質資源，因此，開展葉色突變體研究具有深遠的理論和實踐意義。水稻(03^"Mriw7L.)作為我國乃至世界最重要的糧食作物之一，其產量的提高對解決未來全球糧食問題具有十分重要的戰略意義。長期以來，傳統的雜交育種手段在提高光能利用方面尚未取得令人滿意的效果。葉色突變體是研究水稻光能利用的理想材料。目前，水稻中已報道的葉色突變體有77個，其中一類苗期轉綠型(Virescent)白葉突變體是研究葉片和葉綠體發育以及核-質間基因相互協調作用及作物雜交育種中剔除假雜種的理想材料，因為與大多數苗期白化致死突變體相比，轉綠型白葉突變體在苗期表現白化，伴隨著苗的生長發育，葉片慢慢轉綠，突變體恢復正常生長。水稻中已發現的14個轉綠型突變體都是利用形態標記定位在染色體上，還未見利用分子標記的精細定位和圖位克隆轉綠型白葉突變基因的報道。植物PPR蛋白基因家族的典型特征是在基因編碼的蛋白內部含有35個氨基酸構成前后相連的PPR基序，每個PPR蛋白平均含有226個PPR結構域，每個PPR結構域含有2個01-螺旋。在高等植物中，PPR蛋白是一個超家族。根據生物信息學分析，已測序的雙子葉模式植物擬南芥和單子葉模式植物水稻分別含有450個和650個核編碼的PPR蛋白，它們大多定位在葉綠體和線粒體中，但目前只有少數PPR基因得到分離并對其生物學功能進行了分析。Kodiveri等從水稻cDNA文庫中篩選克隆到了一個定位于葉綠體的PPR蛋白，定名為OsPPRl，其編碼810個氨基酸，含有11個PPR基序，利用反義技術獲得的OsPPRl功能缺失水稻轉化植株，葉綠體發育不良，苗期白化致死。
發明內容本發明的目的是提供一種植物葉綠體發育相關蛋白及其編碼基因與應用。本發明所提供的植物葉綠體發育相關蛋白，來源于稻屬水稻(Or/MM^'ravar.Lansheng)，名稱為0sPPR2，是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列l所示的氨基酸序列組成的蛋白質。(b)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物葉綠體發育相關的由序列1衍生的蛋白質。序列表中的序列1由742個氨基酸殘基組成。所述一個或數幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。為了使(a)中的OsPPR2便于純化，可在由序列表中序列l所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表l所示的標簽。表l標簽的序列標簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)RRRRRPoly-His2-10(通常為6個)HHHH朋FLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc—myc10EQKLISEEDL上述(b)中的OsPPR2可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(b)中的OsPPR2的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。所述植物葉綠體發育相關蛋白(OsPPR2)的編碼基因也屬于本發明的保護范圍。所述植物葉綠體發育相關蛋白(OsPPR2)的編碼基因為如下l)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與l)限定的DNA序列雜交且編碼所述植物葉綠體發育相關蛋白的DNA分子；3)與序列表中SEQIDW2:2的核苷酸序列具有80%以上的同源性的且編碼蛋4白具有與植物葉綠體發育相關功能的核苷酸序列。序列表中的序列2由2436個核苷酸組成。所述嚴格條件可為在0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液中，在65°C下雜交并洗膜。含有所述植物葉綠體發育相關蛋白編碼基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發明的保護范圍。本發明的植物葉綠體發育相關蛋白與葉綠體發育、光合效率及相關光合指標，該水稻葉綠體發育相關蛋白的編碼基因被破壞可導致植物葉片白化，將其應用于植物遺傳改良等工作，是重要的指示基因，如可作為目的基因應用于水稻育種材料不育系當中，以改變葉片的葉色，用于水稻兩系雜交稻制種或遺傳育種。圖1為突變基因在第3染色體上的部分連鎖圖圖2為突變基因的精細定位圖3為野生型培矮64S和突變體玉兔S轉綠前后葉片光合色素組成測定結果圖4為野生型培矮64S和突變體玉兔S轉綠前后葉綠體電鏡觀察結果圖5為轉pCAMBIA2300-OsPPR2植株PCR分子鑒定結果圖6為轉pCAMBIA2300-OsPPR2植株表型鑒定結果圖7為轉pCAMBIA2300-OsPPR2植株葉綠體電鏡觀察鑒定結果具體實施例方式下述實施例中所述的方法，如無特別說明，均為常規方法。實施例1、植物葉綠體發育相關蛋白及其編碼基因的獲得及其功能驗證一、植物葉綠體發育相關蛋白及其編碼基因的獲得1、水稻苗期轉綠型白葉突變體玉兔S及其遺傳分析本研究利用一個由6<)0)-Y射線誘變培矮64S得到的水稻苗期轉綠型白葉突變體玉兔S。玉兔S與OsPPRl功能缺失水稻轉化植株致死表型不同，該突變體的主要特征是苗期葉色白化，至4葉期葉色轉綠，其后恢復正常生長，其它農藝性狀表現正常。突變體第12幼葉表現白化，僅葉尖和葉鞘表現少許綠色，第3葉剛抽出時，葉尖為白色，后慢慢轉綠，到葉片全展后轉為綠色，第4葉開始恢復至正常綠色。轉綠以后突變體葉色正常，其它農藝性狀與野生型相仿。對突變體玉兔S(購自中國農業科學院作物科學研究所種質資源庫)轉綠前后葉片光合色素組成進行測定，以同一生長時期的野生型培矮64S(購自中國農業科學院作物科學研究所種質資源庫)為對照，結果如圖3所示。從圖3中可以看出，轉綠前突變體葉片葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)、P-類胡蘿卜素(Car)、總葉綠素(Chl)含量均顯著低于野生型(圖3中a)，轉綠后突變體4種色素含量均升高，達到野生型水平(圖3中b)。同時我們還比較了轉綠前后突變體葉綠素a/b比值的變化，發現都在3-4之間(數據未列出)，與正常水稻相同。表明轉綠型白葉突變體在苗期表現白葉是由于總色素的減少而造成的，并不是某種色素成分大量缺少而引起的。圖中葉綠素a(Chla)，葉綠素b(Chlb)，總葉綠素(Chl)，P-類胡蘿卜素(Car),圖3中a為轉綠前突變體于野生型比較，圖3中b為突變體轉綠后與野生型的比較。利用透射電鏡觀察突變體和野生型在轉綠前后葉綠體形態，發現轉綠前突變體的葉綠體發育極不正常，呈現出類似前質體結構的囊泡狀，缺少野生型中發育良好葉綠體的類囊體和淀粉粒結構；轉綠后突變體葉綠體發育完好，與野生型葉綠體結構沒有任何差異，具體見圖4。圖4中a，c，e分別為野生型在2葉期、4葉期和成熟植株的葉綠體電鏡觀察，圖4中b，d，f為突變體在2葉期、4葉期和成熟植株的葉綠體電鏡觀察。用突變體玉兔S購自中國農業科學院作物科學研究所種質資源庫)分別與水稻品種太子玉竹(購自中國農業科學院作物科學研究所種質資源庫)、水稻品種9311(購自中國農業科學院作物科學研究所種質資源庫)、水稻品種培矮64S(購自中國農業科學院作物科學研究所種質資源庫)雜交，得到的F2群體進行遺傳分析。遺傳研究表明，以突變體玉兔S為母本分別與太子玉竹、9311、培矮64S雜交，得到的F,后代均表現為正常綠色，在其自交F2群體中正常植株與突變植株分離比接近3:1(表l)，以玉兔S為父本與培矮64S進行反交，其后代群體葉也表現類似結果，表明轉綠型白葉性狀是由一對隱性核基因控制。表1.轉綠型白葉突變體與正常植株在不同F2群體中的分離<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2、突變基因定位1)突變基因初步定位選取在水稻12條染色體上廣泛分布的SSR標記對親本玉兔S和太子玉竹進行多態篩選，隨機選取了600個SSR標記對親本太子玉竹和轉綠型白葉突變體進行多態性標記篩選，得到95個標記在親本間表現多態。有多態的標記對玉兔S和太子玉竹的F,群體和隨機選取的672個F2群體中白葉單株，等濃度混合DNA進行差異分析，結果表明，初步將突變基因定位在第3染色體上標記RM411和RM6832之間，距離分別為l.lcM和1.2cM(如圖1所示)。上述SSR標記分析的方法如下所述提取上述選取單株的總DNA作為模板，具體方法如下所述①取0.2克左右的水稻幼嫩葉片，置于2-mLEppendorf管中，管中放置一粒鋼珠，把裝好樣品的Eppendorf管在液氮中冷凍5min，置于2000型GENO/GRINDER儀器上粉碎樣品lmin。②加入660^1提取液(含lOOmMTris-Hcl(PH8.0)，20mMEDTA(PH8.0)，1.4MNaCl,0.2g/mlCTAB的溶液)，漩渦器上劇烈渦旋混勻，冰浴30min。③加入40|aI20%SDS，65。C溫浴10min，每隔兩分鐘輕輕上下顛倒混勻。加入100(il5MNaCl，溫和混勻。⑤加入100nll0XCTAB，65。C溫浴10min，間斷輕輕上下顛倒混勻。⑥加入卯Ofil氯仿，充分混勻，12000rpm離心3min。⑦轉移上清液至一1.5mLEppendorf管中，加入600pl異丙醇，混勻，12000rpm離心5min。⑧棄上清液，沉淀用70%(體積百分含量)乙醇漂洗一次，室溫涼干。⑨加入100(^11XTE(121克Tris溶于1升水中，用鹽酸調PH值至8.0得到的溶液)溶解DNA。⑩取2fil電泳檢測DNA質量，并用DU800分光光度儀測定濃度(BechmanInstrumentInc.U.SA)。將上述提取的DNA稀釋成約20ng/|il，作為模板進行PCR擴增；PCR反應體系(lOpl):DNA(20ng/ul)lul，上游引物(2pmol/ul)lul，下游引物(2pmol/ul)lul，10xBuffer(MgCl2free)lul，dNTP(10mM)0.2ul，MgCl2(25mM)0.6ul，rTaq(5u/ul)O.lul，ddH205.1ul，共10ul。PCR反應程序94.0。C變性5min;94.0。C變性30s、55。C退火30s、72。C延伸1min，共循環35次；72°C延伸7min;l(TC保存。PCR反應在MJResearchPTC-225熱循環儀中進行。SSR標記的PCR產物檢測擴增產物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。以50bp的DNALadder為對照比較擴增產物的分子量大小，銀染顯色。2)突變基因精細定位根據初步定位的結果，在突變基因所在區域附近尋找公共圖譜上的分子標記，并自行開發SSR標記。用F2群體中的白葉單株驗證，在該染色體的相關區段篩選更多標記進一步定位突變體基因。在玉兔S與太子玉竹雜交衍生的F2群體中選取2240個F2群體中的突變株表型的水稻植株)用于突變基因精細定位。利用公共圖譜上的分子標記和基于水稻基因組序列數據自行開發的SSR、CAPS、dCAPS分子標記對突變基因進行了精細定位，并根據定位結果初步確定突變基因，具體方法如下所述①SSR標記開發將公共圖譜的SSR標記與水稻基因組序列進行整合，下載突變位點附近的BAC/PAC克隆序列，用SSRHunter軟件搜索克隆中的SSR(李強等，遺傳，2005，27(5):808-810)。通過BLAST程序在線篩選在9311與Nipponbare之間表現多態的SSR，對有多態的SSR設計引物，如表2所示。根據RGP上日本晴和9311序列進行比對，開發了78對SSR標記，得到3個多態標記為3h65、3h83、3hl12(表2)，分別與突變基因的距離為0.7cM、0.3cM、0.2cM(圖2)。表2.設計用于精細定位的分子標記<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>②CAPS、dCAPS標記開發從水稻基因組計劃(RGP)的網站上選取己公布的Nipponbare相關序列搜索到北京華大基因中心提供的培矮64S序列后，再在NCBI網站上找到9311序列。通過分析尋找到9311和培矮64S之間存在的SNP，設計CAPS或dCAPS標記。通過對分離群體的兩親本進行多態性分析后，將兩親本之間不存在SNP的PCR產物切膠回收測序，找到兩親本的SNP，設計CAPS或dCAPS標記。將群體擴大至2240個具有突變表型的F2單株，找到5個多態CAPS標記(表2)，標記P50與突變基因位點共分離(圖2)，且將突變基因位點定位在BACOSJNBb0087M10上的標記D8與P45之間，物理距離為45kb。CAPS/dCAPS標記分析的PCR反應體系DNA(20ng/ul)2ul，Primerl(10pmol/ul)2ul，Primer2(10pmol/ul)2ul，10xBuffer(MgCl2free)2ul，dNTP(10mM)0.4ul，MgCl2(25mM)1.2ul，rTaq(5u/ul)0.4ul，ddH20410ul，總體積20ul。擴增反應在PTC-200(MJResearchInc.)PCR儀上進行94°C3min;94°C30see,55°C(引物不同，有所調整)45sec，72°C2.5min，35個循環；72°C5min。PCR產物純化回收按試劑盒(北京Tiangen公司)步驟進行。PCR產物酶切消化過夜后，用1-4%的瓊脂糖凝膠中電泳分離，經EB染色后于紫外燈下觀察拍照。dCAPS用8%的非變性PAGE膠分離，銀染。根據F2群體中苗期白葉單株的分子數據和表型數據，通過MAPMAKER/EXP3.0軟件進行連鎖分析，采用Kosambi函數將重組率轉換成遺傳距離cM(Centimorgan)，用"map"命令確定標記間的相對位置。結果如圖2所示，圖2中a為設計的SSR標記與突變基因連鎖圖譜。b含有突變基因的BAC重疊群，箭頭表示在BAC上設計的標記。c利用F2群體中的2240個具有突變表型單株精細定位突變基因的連鎖圖譜，橫線下方數字表示各個標記與突變基因位點間的交換個體數。3)突變基因的獲得根據定位的位點設計引物，序列如下所述primerl:5'CGCCCCGGGCCCACCTGTACTTTACTTTAGC3'(下劃線所示的序列為Smal酶識另廿位點)；primer2:5'CGCTCTAGAATCCACTCTTTGAGATTTCCC3丫下戈U線所示的序列為Xbal酶識別位點)。以primer1和primer2為引物，以培矮64S的基因組DNA為模版，進行PCR擴增獲得目的基因。擴增反應在PTC-200(MJResearchInc.)PCR儀上進行94°C3min;94。C30see,60°C45sec，72°C2.5min，35個循環；72°C5min。將PCR產物回收純化后連接入pBS-T(購買自北京Tiangen公司)測序載體，轉化DH5a感受態細胞，挑選陽性克隆后，進行測序。序列測定結果表明，PCR反應獲得的片段具有序列表中序列2所示的核苷酸序列，即為本發明的植物葉綠體發育相關基因，其編碼序列為自序列表中序列2的5'端第1-2229位核苷酸序列，編碼742個氨基酸，該氨基酸具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列，含有9個PPR(Pentatricopeptiderepeat)結構域的蛋白。將該蛋白命名為OsPPR2。將上述含有本發明的植物葉綠體發育相關基因的重組載體命名為pBS隱OsPPR2。二、植物葉綠體發育相關蛋白(OsPPR2)及其編碼基因的功能驗證1.表達載體構建將pBS-OsPPR2用Smal和Xbal雙酶切，將含OsPPR2基因的片段回收、連接到經Smal和Xbal雙酶切處理的pCAMBIA2300載體上(澳大利亞CAMBI公司)，得到重組的植物表達載體，構建好的重組載體轉化DH5a，提取質粒用于酶切和測序檢測，將檢測表明正確的含有OsPPR2基因的重組載體命名為pCAMBIA2300-OsPPR2。用電擊法將經過酶切和測序檢測pCAMBIA2300-OsPPR2轉化農桿菌LBA4404(Invitrogen公司，18313—015)菌株，得到重組菌株，提取質粒進行PCR及酶切鑒定。PCR鑒定用引物為primer35'CCCACCTGTACTTTACTTTAGC3'和primer45'ATCCACTCTTTGAGATTTCCC3';擴增產物為2.2kb艮卩為鑒定陽性。將PCR及酶切鑒定正確的重組菌株命名為EH-pCAMBIA2300-OsPPR2。2.農桿菌介導轉化利用農桿菌介導將構建好的EH-pCAMBIA2300-OsPPR2轉化白轉綠突變體玉兔s(購自中國農業科學院作物科學研究所種質資源庫)中(玉兔s是由Pai64s品種經過60Co-Y射線處理，然后經過5代自交得到的具有白轉綠特征的突變體，經分子鑒定含有突變基因C^P尸/^基因)具體方法為1)28t:培養EH-pCAMBIA2300-OsPPR216小時，收集菌體，并稀釋到含有100|Limol/L的N6液體培養基(Sigma公司購買，C.1416)，中至濃度為OD6(kf0.5，獲得菌液；2)將培養至一個月的水稻成熟胚胚性愈傷組織與上述菌液混合侵染30min，濾紙吸干菌液后轉入共培養培養基(N6固體共培養培養基，Sigma公司購買)中，24°C共培養3天；3)將上述愈傷接種在含有150mg/L潮霉素(Sigma公司購買)的N6固體篩選培養基上第一次篩選16天；4)挑取健康愈傷轉入200mg/L潮霉素的N6固體篩選培養基上第二次篩選，每15天繼代一次；5)挑取抗性愈傷轉入含有150mg/L潮霉素的分化培養基上分化；106)分化成苗的再生水稻植株即為所獲得的OsPPR2的轉pCAMBIA2300-OsPPR2植株。3.轉基因植株分子鑒定及OsPPR2基因功能驗證上述步驟2獲得的轉pCAMBIA2300-OsPPR2植株的1\代(T。代獲得的種子及種子生長得到的植株)種子(請您確認該描述是否正確)、培矮64S(野生型對照)種子和玉兔S(突變體對照)種子在人工生長箱中種植，生長箱光照為10001ux，溫度為晝28。C/夜25。C，晝夜循環為14h/10h，空氣相對濕度為55%。在苗2葉1心期鑒定表型和葉綠體電鏡觀察，同時取樣提取DNA進行PCR分子檢測。將上述步驟2獲得的轉pCAMBIA2300-OsPPR2植株進行PCR分子檢測的方法為以Primerl:GAGATGAAGAACAGTGGATGC和Primer2:TTTTCTTGCATAACCCGTCA為弓I物對進行PCR擴增，PCR反應體系DNA(20ng/ul)2ul，Primerl(10pmol/ul)2ul，Primer2(10pmol/ul)2ul，10xBuffer(MgCl2free)2ul，dNTP(10mM)0.4ul，MgCl2(25mM)1.2ul，rTaq(5u/ul)0.4ul，ddH20410ul，總體積20ul。擴增反應在PTC-200(MJResearchInc.)PCR儀上進行94°C3niin;94°C30see,55°C45see,72°C1min，35個循環；72。C5min。PCR產物純化回收按試劑盒(北京Tiangen公司)步驟進行。PCR產物用8%的非變性PAGE膠分離，銀染。結果表明獲得13株PCR檢測陽性的植株，如圖5所示，圖5的1是野生型為模板擴增出的條帶，2是突變體為模板擴增出的條帶，3—15是轉pCAMBIA2300-OsPPR2植株為模板擴增出的條帶。將上述PCR檢測陽性的植株進行表型分析，獲得互補表型的植株同時具有野生型和突變體的條帶，證明野生型基因已經轉化到突變體中。將上述PCR檢測陽性的轉pCAMBIA2300-OsPPR2植株表型鑒定結果，與野生型一樣，13株轉pCAMBIA2300-OsPPR2植株表型均為綠色(圖6中b，c)，而突變體玉兔S的表型還是白化苗(見圖6中a)。圖6中，a為突變體玉兔S，b為轉pCAMBIA2300-OsPPR2植株，c為野生型培矮64S。電鏡觀察表明，PCR檢測陽性的轉pCAMBIA2300-OsPPR2植株(圖7中b)葉綠體內囊體膜明顯比突變體玉兔S(圖7中a)增多。圖7中，a為突變體玉兔S,b為轉pCAMBIA2300-OsPPR2植株。結果表明，所有PCR鑒定陽性的轉pCAMBIA2300-OsPPR2水稻植株其表型由轉基因前的白轉綠(OsPPR2基因為隱性基因)轉變為轉基因后的正常綠色。驗證了轉基因前的白轉綠性狀是由OsPPR2基因控制的，即該OsPPR2基因為葉綠體發育相關基因。序列表<160>2〈210>1<211〉742<212>PRT<213〉稻屬水稻(ftr^g5"s。Vsvar.Lansheng)<400〉1MetProArgValCysAlaAlaProArgAlaProProProPro1CysHisValHisGlyArgLeu65lieGlu50AlaPro35GinGly20Leu5ValGlyProLeuArgAlaAlaGly40AlaArg25Gin10ProArgTrpArgGluGinLeuProAspProArgAspAspArgLysLeuValAlaGluHisSerValAsp130AspThr145LysMetPhe115LeuMet100LeuGly85ArgPhe70AlaAsp55AlaAl;aLeuArgProGlyProValGlyAlaArgGluGlyAspSerTyrlieLeuAsnValValTyrLysLeuLeu165Asn150GluGin135HisGlu120LeuHis105GlyLeu90GinGlu75AspMet60ValLeu45LeuAla30ThrCysPro15SerArgAlaLeuAsnAlaAlaTyrGluLeuMetLysValLysLeuGinGinLeuGinProLeuLeuLeuAsnSerValTyrSer170Val155GluPhe140LeuMetPhe125GlyGly110AspGlulie80ValLeu95ValVeilAspAlalieGinAlalieLysProAspValValThrPheAsnThrLeuMet12ValGluGlyAlaLysAlaGlySer160ArgGly175LeuCys<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>435AspMetGluSerLeuLys450AsnThrlielieAsp465GluGluValPheThr455Leu440GlyCysLysLysGly470GinMetAspLeuCysProArgLys445ThrlieThrTyrSer460ArglieGluGluAsp485ThrLeulieAspMet475GlylieSerArglieThrPheAsn500PheGlyLeulieGin490LeuCysLysAspAspAspAls515AsnlieThrTyrGly505GinMetlieSerAsn495LysAla480AlalieProAsn530GlyAsplieLysLys545GlyPheGluValAsn520SerlieLeuThrLys510GlyLeuGinAsn535AlaAsplieLeuGlu525TyrCysLysGinAla550ValValThrTyrCysLysArglieAlaLys595LeuAsp565ArgThrGinValHis540GluThrMetThrAla555ThrLeulieAsnGinSer610ArgGluMetAlaGlu625lieValPheArgGly580GlyMetArgProPheArgArgGly570LeuLysValLeuAla585ProLysAlaTyrGly575GlyAsn560LeuMetThr600AsnlieArgAspArg590ProValLeuAsn615GlyGluProProAsn605LeuSerLeuPheVal630LeuCysArgGlyAla620AlaLeuThrTyrGly645PheAspPheMetLeuGluMetVal660ArgMetteuAlaAsp635GlyProlieLysGly650LysGlyPhelieSerSerPhe675PheAsp665GlyLeuLeuAsnGlu655GluLys640AlaPheGlu680AspTyrPhelieArgAlalieGlulielieMetGluLysValAspLeu14Leu685LysPro670GlyMetAs690695700ArgGluSerAspValSerAlalieArgGlyTyrLeuLyslieArgLys705710715720PheTyrAspAlaLeuAlaThrPheGlyArgPheLeuGlulieAsnAsn725730735ProGinTrpSerTyrArg740<210〉2〈211>2229〈212〉DNA<213〉禾舀屬水禾舀(。iTMvax-Lansheng)<400〉2atgccccgcggtagggccgccaggagcagcctcaacgcggatccgcaagccggcggg鄉gggcagcagcggcattcaggaa肌tg犯acgttgtcacatgttctcatgcaccctgatgcaggatgUggtactgcaagcgggtUgagccatgtcggccgttttcacctactctcattgcaggttacagctctgc肌agggatgcacccaagcttggtatttgcgccgcttcggccgagtcctcaccgccgctggcgcgtcggcgcggtggcaccaggttgttcgacgacagacaccgttccttgaatxtcgaggaaMaaggat.ttgt肌atggggtgtagggagggtctgaccagatatgccctcaaacaatatcgtctgccttatgtg肌gggagttaggcgatxccggatgaagtaagcattggaccctcgggcggtggcgcgcccctgcgcgagggacgacttccggggccctcga朋ttgggctgccgtcgacggtgtacaatagtgtactcggatg^ggcggtxtagcagacg鄉aggggctcggcgacgggaggatgctcacatataacagtcatggdttgtg肌tt.gcggtggatcggcacggggdatctctccagattcatcttgcatttgttaaaaccgccgccgctcccggcacgcagccggaccgcgcccggccgacctcatgagtagtccactctgattctgacaccttctcag卿t,gggtgUgtgccgagggcgtggcgcagcatcg鄉肌ggt,gBCggcttgggtataacttttgttagtgstggttcggttgtttgccgacttgagggttt,atacttcttcgattgtactttgattggatatggagtcgtgcccgtggccctctccgccgacgcggcccgaggtctaaggtgctcgtccttcttggaatcaactccaatgttcttgtctaggggaatcacatca.ggtctgacgagacctgcactgagttaatgtttttacagca.ggaatggtctctg鄉鄉gcca已tggacagctctgacattacaagccttggattgaagagatgLCElELtctttgccactggttgccatgt:cggaggcggctggcgctccggatgcgagg卿tccgcggagatgcagctacgagaccattgtttg眺gggagccaagcctgatcaggactgcagacgtttaccggtcaaagccgatt犯tggggattgccgatcca3肌tgattgatcctgat"tgaagaggcacacat.tcaacccttgcacgtgattaacgcggaag肌C3gtctcacttgggtcctcgaagt601201802403003604204805406006607207808409009601020108011401200126013201380acaattacatataacactataattgacgggttatgcaagaaaatgagaal:ag犯gaagca1440gaagaagtttttgatcaaatggatctgcaaggcatttcgaggaatgcaatcacattcaat1500actctcatcgatggtttgtgcaaggacaaaaagattgatgatgcttttgggcttatt犯t1560caaatgataagtgaagggttgcaacctaacaatatcacttacaattctattctaactcat1620tattgcaagcaaggtgacataaaaaaggctgcggatattttagaaactatgactgcaaal1680ggatttgaagtggatgttgttacgtacggtactctgattaacggtctatgcaaggctggt1740aggacacaggttgctttgaaggtactcagaggtatgcggataaaagggatgaggcctact1800ccaaaagcttacaatcctg"tgctccagtxtctcttcagacggaataatatcagagatgcc1860ctgagtcttttcagggagatggcagaggttggtgagcctcctgatgctttgacatataag1920attgtttttxgtgggctctgtcgtggtggagggcctatta犯gaagcttttgatttcatg1980ttggagatggttgataaggggttcataccagagttctcatccttccgtatgctagctgaa2040ggtctattaaacctgggtatggatgattacttcattagagccattgaaataatcatggaa2100aaggtcgacctcagagagtctgatgtttctgcaataaggggatatctcaagatccgcaaa2160ttttatgatgcattagcaacctttggccgtttcctggagatcaacaaccctcaatggagt2220taccgatga22291權利要求1、一種植物葉綠體發育相關蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQID№.1的氨基酸殘基序列；2)將序列表中的SEQID№.1氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物葉綠體發育相關功能的由SEQID№1衍生的蛋白質。2、權利要求1所述的植物葉綠體發育相關蛋白的編碼基因。3、根據權利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述植物葉綠體發育相關蛋白的編碼基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQIDW:2的核苷酸序列；2)在嚴格條件下可與1)所述的DNA序列雜交的核苷酸序列。3)與序列表中SEQIDW:2的核苷酸序列具有80%以上的同源性的且編碼蛋白具有與植物葉綠體發育相關功能的核苷酸序列。4、含有權利要求2或3所述的植物葉綠體發育相關蛋白編碼基因的重組表達載體。5、含有權利要求2或3所述的植物葉綠體發育相關蛋白編碼基因的轉基因細胞系。6、含有權利要求2或3所述的植物葉綠體發育相關蛋白編碼基因的轉基因重組菌。7、權利要求2或3所述的植物葉綠體發育相關蛋白編碼基因在培育葉綠體發育狀況變化的轉基因植物中的應用。8、權利要求2或3所述的植物葉綠體發育相關蛋白編碼基因在培育苗期葉片白化的轉基因植物中的應用。9、根據權利要求7或8所述的應用，其特征在于所述植物為水稻。全文摘要本發明公開了一種植物葉綠體發育相關蛋白及其編碼基因與應用。該蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQID№.1的氨基酸殘基序列；2)將序列表中的SEQID№.1氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物葉綠體發育相關功能的由SEQID№1衍生的蛋白質。該水稻葉綠體發育相關蛋白的編碼基因被破壞可導致植物葉片白化，將其應用于植物遺傳改良等工作，是重要的指示基因，如可作為目的基因應用于水稻育種材料不育系當中，以改變葉片的葉色，用于水稻兩系雜交稻制種或遺傳育種。文檔編號C07K14/415GK101486757SQ200910079568公開日2009年7月22日申請日期2009年3月6日優先權日2009年3月6日發明者萬建民,欣張,杰王,王久林,程志軍,胡茂龍,寧蘇,郭秀萍,雷財林申請人:中國農業科學院作物科學研究所