專利名稱：突變型Aβ多肽刺激制備的阿爾茨海默病DC疫苗的制作方法
技術領域：
本發明是一種利用突變型β淀粉樣蛋白多肽及其珩生物刺激致敏后的樹突狀細 胞(Dendritic cell, DC)而獲得的阿爾茨海默病(Alzheimer，s disease, AD)疫苗。
背景技術：
AD是一種發病年齡早、發病率高、危害極大的中樞神經系統退行性變。多在60歲 以上發病，其發病率隨年齡增高而增高。美國阿爾茨海默病協會根據美國CDC的統計報道， 截止2008年美國AD患者已經達到520萬，全球AD患者已經接近3000萬。65歲以上老人 中有13%罹患此疾病，平均每71秒就有1名新發病例。而據估計到本世紀中期，全球的AD 患者將達到1億人，平均每33秒就將會有1名新發病例出現。隨著我國人口漸趨老齡化， AD的發病率不斷提高，尋找積極有效的預防及治療措施，對于提高老年人口的生活質量，減 輕家庭及社會的經濟和精神負擔具有非常重要的意義。AD的特征性病理變化包括由β淀粉樣蛋白(Amyloid beta, Αβ)在腦實質中沉 積形成的老年斑(Senil印laqUeS，SP)和神經細胞中高度磷酸化的τ蛋白沉積形成的神經 原纖維纏結。隨著淀粉樣蛋白學說得到多方面實驗證實并獲得大多數人認同，人們提出了 針對Αβ的各種AD治療方案。其中利用抗Αβ抗體進行免疫治療是促進機體清除已形成 的Αβ的重要手段。許多使用抗Aβ抗體的體內外實驗均證實Aβ免疫治療能夠減少Aβ 沉積，提高AD模型鼠學習和記憶功能。Αβ主動免疫治療，即AD疫苗，以其經濟、便捷、作用 維持時間長等優點而受到多數研究人員的青睞。至今AD疫苗最接近成功的是Elan公司的AD疫苗ΑΝ1792。該疫苗由Αβ1_42多 肽和QS-21佐劑構成。該疫苗在II期臨床試驗中卻因300名試驗者中有18名患者出現了 非特異性腦膜腦炎的癥狀而被FDA終止了。盡管該試驗失敗了，但其中一些接受疫苗接種 的AD患者卻表現出良好的效果。其中許多患者血清中出現了高滴度的抗Αβ抗體，其抗血 清能夠與腦病理切片中的Αβ沉積物反應。隨著隨訪時間的延長，產生了抗體的患者其認 知功能減退程度顯著低于未產生抗體者，且抗體滴度越高，差異越明顯。此外，通過對死于 腦膜腦炎并發癥患者的尸檢發現其腦內Αβ斑塊明顯少于未接種的AD患者，同時還發現有 小膠質細胞的激活和T細胞向中樞神經系統的浸潤。隨后對發生腦膜腦炎患者的分析表明 腦膜腦炎的病情與抗體反應的程度以及抗原表位的特異性并無直接關聯。而且大多數出現 抗Αβ抗體的患者并沒有出現腦膜腦炎。這些情況都提示患者出現腦膜腦炎與針對Aβ的 T細胞自身免疫反應有關，其中包括Αβ反應性ThlT細胞在外周的激活及其向Αβ斑塊的 浸潤。多數學者認為，對于ΑΝ1792實驗中的嚴重副反應，屬于自身免疫發生激活的無菌性 免疫炎癥，與疫苗所用QS21佐劑有關。該佐劑以誘導Thl型反應為主，使IFN-γ之類的致 炎因子產生，刺激T細胞產生Αβ反應性細胞毒性T細胞。而保護性抗體的產生需要Th2 型反應激活B淋巴細胞。但Αβ是正常神經元細胞結構蛋白的代謝產物，機體對其存在中樞性免疫耐受。 只有通過添加佐劑等特定手段增強其抗原性才能較穩定地誘導產生抗體，不添加佐劑增強疫苗抗原性就難以保證獲得抗體。如何避免佐劑的Thl型反應或是在不使用佐劑的情況下 誘導Th2型反應，從而安全有效地獲得A β抗體將是AD疫苗獲得成功的關鍵。許多學者采 用改良的Th2型佐劑、降低疫苗T細胞表位抗原、改變接種途徑、制備DNA或RNA疫苗等多 種方法制備不引起Thl型反應的AD疫苗。而本發明所采用的方法是利用樹突狀細胞(DC) 的抗原遞呈能力，制備能夠引起機體產生足夠抗體滴度的AD疫苗。經過我們的初步實驗， 證實這一種安全、有效、經濟且使用簡便的疫苗。
發明內容
本發明的基礎之一是發現了突變型β淀粉樣蛋白免疫原性比野生型β淀粉樣蛋 白強。經實驗證實不同的突變型β淀粉樣蛋白免疫原性有差異(多肽1 8)。從中我們 選取了其中免疫原性較強的人工合成的雙突變型多肽(多肽1)進行初步及后續實驗。實 驗還包括了不同長度多肽免疫原性的研究(多肽9 11).本發明的初步實驗證實，采用野生型β淀粉樣蛋白致敏DC不能誘機體產生抗Αβ 抗體，而采用突變型AB多肽致敏DC則能誘導機體產生高滴度的抗A β抗體。在初步實驗的基礎上，我們利用突變型β淀粉樣蛋白多肽致敏DC，對PDAPP轉基 因小鼠進行了實驗，采用液相芯片技術檢測治療前后血清及腦脊液中多種炎癥因子的變化 情況，證實了采用致敏DC疫苗的方法不會象佐劑疫苗那樣引起Thl型炎癥反應，從而避免 普通Αβ疫苗導致的腦膜腦炎等嚴重副反應。通過對轉基因小鼠治療后的行為學及病理學 檢查證實本方法所制備的DC疫苗能夠改善轉基因模型小鼠的認知和記憶能力，能夠減少 轉基因小鼠腦內的Αβ沉積。
具體實施例方式本發明從小鼠股骨和脛骨骨髓腔內收獲骨髓細胞，用重組珠小鼠白細胞介素 4(以下簡稱IL-4)和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(以下簡稱GM-CSF)各lOng/mL的 DC培養基(加入青霉素和鏈霉素至終濃度各100U/mL、終濃度0. 33%的0. 1 % 2-巰基乙醇 及終濃度10%胎牛血清的RPMI-1640培養基)進行培養，24小時后棄去培養基及其中未貼 壁的細胞，按原培養基細胞因子濃度重新加入DC培養基。培養72小時后吸棄1/3上清液， 補充已添加相同濃度細胞因子的DC培養基。同時添加選出的突變型AB多肽、野生型AB多 肽至終濃度22. 2μ g/mL共培養以致敏DC，72小時后收獲漂浮于培養中的成熟DC，用流式細 胞技術對DC進行檢測，成熟度達標后即作為DC疫苗用于免疫接種實驗。本發明所做初步實驗采用C57和BALB/C小鼠，分5組，每組10只，除用分別用突 變型和野生型乙型淀粉樣蛋白多肽致敏的DC疫苗外，還包括野生型乙型淀粉樣蛋白多肽 +佐劑疫苗(以下簡稱佐劑疫苗)、單純無多肽致敏的DC細胞疫苗以及無治療效果的磷酸 緩沖鹽溶液(以下簡稱PBQ。每只小鼠均腹腔接種0. 2ml液體。其中DC疫苗接種采用 1 X IO5DC細胞懸浮于PBS中進行接種。佐劑疫苗接種采用50 μ g野生型乙型淀粉樣蛋白多 肽溶于0. ImlPBS中，并與0. Iml氟氏佐劑混勻、乳化后接種。接種后每7天在小鼠的腮下 靜脈叢取血，用ELISA夾心法對抗A β抗體滴度進行檢測，直到接種后35天。所得各組平 均抗Aβ抗體滴度變化如附圖1所示。后續的實驗采用PDAPP轉基因小鼠進行。實驗分4組，每組12只，分組中因經濟因素取消了原初步實驗中的野生型Αβ多肽致敏的DC細胞疫苗組，其余同初步實驗一致。 接種后每10天在小鼠的腮下靜脈叢取血，用ELISA夾心法對抗Αβ抗體滴度進行檢測，用 液相芯片檢測血清中的多種炎癥因子濃度，直到接種后50天。接種60天開始進行Morris 水迷宮實驗以檢查轉基因小鼠的認知和記憶功能。完成行為學實驗后麻醉小鼠，取其腦脊 液進行炎癥因子檢測。放空靜脈血后，行心臟灌注再行病理學檢查。所得各組平均抗Αβ 抗體滴度變化如附圖2所示。各組血清平均炎癥因子濃度變化如附圖3所示。各組潛伏時 間變化如附圖4所示。各組平均穿越平臺次數如附圖5所示。各組平均目標象限停留時間 如附圖6所示。
圖1所示為C57鼠按不同方法接種后抗AB抗體滴度變化情況。圖2所示為PDAPP轉基因鼠按不同方法接種后抗AB抗體滴度變化情況。圖3所示為PDAPP轉基因鼠按不同方法接種后血清多種炎癥水平變化情況。圖4所示為PDAPP轉基因小鼠按不同方法接種后定位航行試驗逃避潛伏期變化情況。圖5所示為PDAPP轉基因小鼠按不同方法接種后空間搜索試驗中穿越平臺次數情 況。圖6所示為PDAPP轉基因小鼠按不同方法接種后空間搜索試驗中在原平臺所在目 標象限停留情況。序列表多肽1DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFGQDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
多肽2DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFGEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
多肽3DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAQDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
多肽4DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAKDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
多肽5DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAGDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
多肽6DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAffDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
多肽7DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAENVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
多肽8DAEFRRNSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
多肽9DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFGQDVGSNKGAIIGLM多肽10 :DAEFR HDSGY EVHHQ KLVFF GQDVG SNKGA IIG多肽11 :DAEFR HDSGY EVHHQ KLVFF GQDVG SNKGA
權利要求
1 一種多肽，該多肽為人工合成的突變型β淀粉樣蛋白多肽。
2.根據權利要求1所述多肽，改變其氨基酸長度所獲得的新多肽，多肽長度從25個氨 基酸到42個氨基酸不等。
3.根據權利要求2所述多肽，改變其氨基酸序列中第21、22、23及第6、7位置氨基酸所 制造的新的突變型β淀粉樣蛋白多肽及其組合。
4.根據權利要求1、權利要求2以及權利要求3所述多肽，對多肽序列的N末端及C末 端進行化學修飾所獲得的化合物。該修飾方式符合如下條件R-(P)-R’。其中P為權利要求1、權利要求2及權利要求3所述的多肽。 R為對該多肽N末端進行化學修飾的基團，這些化學修飾基團包括以下類型 氫； 鹵素；小烷基基團，包括8個碳原子以下(含8個)的脂肪族或環基團，可有或沒有官能基團， 如羧酸鹽、磺酸鹽或磷酸鹽； 芳族基團； 雜環基團；酰基基團，如烷基酰基、芳基酰基、磺酰基或磷酰基基團。R’為C末端進行取代或化學修飾的基團，這些基團包括以下類型羥基；8個碳原子以下(含8個)烷氧基，包括鏈式或環式基團；芳氧基； 酰胺基基團。
5.一種預防和/或治療受試體與阿爾茨海默病相關疾病的方法。包括使用權利要求 1、權利要求2、權利要求3及權利要求4所述的多肽，與從骨髓收獲培養或使用外周血單核 細胞轉化而獲得的樹突狀細胞進行共培養，刺激致敏。將所獲得的致敏樹突狀細胞經過分 離、純化、計數過程后定量接種于受試體。
6.根據權利要求5所述的方法，其受試體包括小鼠、大鼠、兔、狗、猴及人。
全文摘要
本發明涉及一種預防和/或治療阿爾茨海默病的疫苗，該疫苗是利用突變型β淀粉樣蛋白多肽及其洐生物刺激致敏樹突狀細胞而獲得，通過動物實驗證實該疫苗安全、有效。本發明可用于阿爾茨海默病的預防和/或治療。
文檔編號C07K14/47GK102127162SQ20091007028
公開日2011年7月20日 申請日期2010年1月17日 優先權日2010年1月17日
發明者徐新女, 曹傳海, 王金環, 羅仲秋 申請人:天津市第一中心醫院