一種免疫避孕的合成肽和嵌合肽及其應用的制作方法

專利名稱：一種免疫避孕的合成肽和嵌合肽及其應用的制作方法
一種免疫避孕的合成肽和嵌合肽及其應用
技術領域：
本發明涉及免疫學領域，尤其涉及一種免疫避孕的合成肽和嵌合肽及其應用。背景技術：
避孕原理，就是用科學的方法來阻止和干擾正常受孕過程中的某些環節，以避免 懷孕，防止生育。目前所采用的避孕方法很多，國內外用于免疫節育的現有技術有①抗促 性腺激素釋放激素(GnRH)、卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)疫苗；②抗卵透明帶(ZP) 蛋白疫苗；③抗人絨毛膜促性腺激素(hCG)疫苗；④抗精子表面抗原疫苗。以上避孕方法存 在內分泌平衡和性功能紊亂、引起自身免疫性疾病、節育效果差等缺點。

發明內容本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種免疫避孕的嵌合肽。本發明的再一的目的是，提供一種免疫避孕的合成肽hESP1(l3_1Q7。本發明的另一的目的是，提供一種免疫避孕的合成肽hIZUmo216_22(1。本發明的另一的目的是，提供嵌合肽，合成肽hESP1(13_1OT和合成肽Izumo216.的用 途。為實現上述目的，本發明采取的技術方案是一種免疫避孕的嵌合肽，其氨基酸序 列如序列表中SEQ ID 1所示。為實現上述第二個目的，本發明采取的技術方案是一種免疫避孕的合成肽ESP， 其氨基酸序列如序列表中SEQ ID 2所示。所述，免疫避孕的合成肽hESP1(13_112，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID :4所示。所述，免疫避孕的合成肽hESP98_112，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID :5所示。為實現上述第三個目的，本發明采取的技術方案是一種免疫避孕的合成肽 hIZumo216_22(1，其特征在于其氨基酸序列如序列表中SEQ ID 3所示所述，免疫避孕的合成肽hIZumo212_221，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID 6所示。所述，免疫避孕的合成肽hIZumo212_227，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID 7所示。為實現上述第四個目的，本發明采取的技術方案是嵌合肽，合成肽hESP1Q3_1Q7或合成肽Izum0216_22Q作為免疫避孕疫苗，在避孕中的應 用。需要說明的是，SEQID :1 序列是 NCAYKTTQANK GGG TGGFTPEIGK GGGTSIERLTETK GGG KGKEATLTKP ；SEQ ID :2 序列是 TGGFT ；SEQ ID :3 序列是 ATLTK ；SEQ ID :4 序列是 TGGFTPEIGK ；SEQ ID 5 序列是 TTTFPTGGFTPEIGK ；SEQ ID 6 序列是 KGKEATLTKP ；SEQ ID 7 序列是 KGKEATLTKPMVGPED。本發明優點在于1，發明了精子蛋白hESP與UU436蛋白之間存在交叉反應抗原；2，發明了短肽hESP1Q3_1Q7具有抗生育作用；
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3，發明了人精子蛋白hlzumo與UU474蛋白之間存在交叉反應抗原ATLTK ；4，發明了短肽hIZumo212_227具有抗生育作用，而UU474蛋白沒有明顯抗生育作用；5，本發明首次研究了由精子蛋白hESP、hlzumo和tNASP與UU的交叉反應抗原組 成的嵌合肽，免疫小鼠后可以產生較強的可逆性的抗生育效果。

圖1 十五肽ppl/pp2/pp3/pp4的原核融合表達，十五肽ppl/pp2/pp3/pp4重組融 合表達載體pTSA18-stv，通過E. coli原核表達后，經15% SDS-PAGE分離后考馬斯亮藍染 色。泳道M 蛋白markers ；泳道1 誘導前全菌裂解物；泳道2，3，4，5 依次為ppl/pp2/pp3/ PP4誘導后全菌沉淀裂解物。圖2 =Western blot 分析鑒定融合表達十五肽 ppl-stv/pp2-stv/pp3-stv/ pp4-Stv交叉反應性，泳道0 空載體pTSA18-stv誘導全菌裂解物；泳道1，2，3，4 依次 為融合肽段pp l-stv/pp2-stv/pp3-stv/pp4-stv誘導后全菌裂解物，上樣量2 μ 1/孔， 兔 anti-mESP-Pl 多抗，1 8000 ；泳道 5，6，7，8 依次為肽段 ppl-stv/pp2-stv/pp3_stv/ pp4-Stv誘導后全菌裂解物，上樣量2μ 1/孔，兔免疫前血清，1 8000。圖3 :rUU436蛋白的原核表達純化，rUU436蛋白原核表達，親和層析純化后，分段 收集各部洗脫液，經15% SDS-PAGE分離后考馬斯亮藍染色，泳道M 蛋白marker ；泳道1 最后洗脫液即蛋白樣品；泳道2-5 前段洗脫液，含較多雜蛋白。圖 4 =Western blot 分析鑒定 rUU436 蛋白與 anti-rmESP-Pl 交叉反應性，rUU436 蛋白，經15% SDS-PAGE分離后轉PVDF膜，與兔anti-mESP-Pl免疫反應，ECL顯示。泳道1， 2 兔anti-mESP-Pl多抗1 8000 ；泳道3，4 兔免疫前血清；泳道2，4 :rUU436蛋白；泳道 1，3 無抗原樣品。圖5 =ELISA檢測免疫后小鼠血清中抗合成肽hESP98_112和抗rUU436抗體，合成肽 hESP98_112及rUU436蛋白免疫小鼠抗血清及免疫前血清作為一抗，1 100稀釋，測定吸光值。圖6 =ELISA檢測合成肽hESP98_112免疫后兔兔血清中anti-p印tide抗體效價。圖 7A :ffestern-blot 驗證兔 anti-p印tide 抗體交叉反應性，泳道 1，3 :rUU436 ； 泳道2,4 :rmESP-Pl ；泳道1，2 兔anti-p印tide抗體，1 2000 ；泳道3,4 兔免疫前血清， 1 2000。圖7B :ffestern-blot驗證兔anti-p印tide抗體交叉反應性，泳道1，2 人精子蛋 白提取物；泳道3，4 小鼠精子蛋白提取物；泳道1，3 兔anti-p印tide抗體，1 2000 ；泳 道2，4 兔免疫前血清，1 2000。圖 8 :ffestern-blot 驗證兔 anti_rUU436 抗體交叉反應性，泳道 1，4 :rUU436 ；泳 道2，5 :rmESP-Pl ；泳道3，6 小鼠精子蛋白提取物；泳道1,2,3 小鼠anti_rUU436抗體， 1 2000 ；泳道4，5，6 小鼠免疫前血清，1 2000。圖9 競爭性ELISA驗證共同抗原TGGFT為BCE。圖10 間接免疫熒光技術檢測兔anti-p印tide抗體與人精子免疫反應(標尺= 5 μ m)，A，B，C:兔抗-ρ印tide免疫后血清，1 50 ;A1，Bi，Cl 兔免疫前血清；FITC標記的 羊抗兔IgG(l 500)檢測，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察；A，A1:熒光圖像；B，B1:光鏡圖像；C，Cl 熒光與光鏡復合圖。圖11 間接免疫熒光技術檢測兔anti-p印tide抗體與小鼠精子免疫反應(標尺 =54!11)^，8，(兔抗- 印衍(16免疫后血清，1 50 ;A1，Bi，Cl 兔免疫前血清；FITC標記 的羊抗兔IgG(l 500)檢測，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察；A，Al:熒光圖像；B，Bi:光鏡圖 像；C，Cl:熒光與光鏡復合圖。圖12 間接免疫熒光技術檢測小鼠anti-rUU436抗體與小鼠精子免疫反應(標 尺=5μ )，A，B，C 小鼠anti-rUU436免疫后血清，1 50 ；Al, Bi，Cl 小鼠免疫前血清，
1 50 ;FITC標記的羊抗兔IgG(l 500)檢測，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察；A，Al 熒光圖 像；B, Bl 光鏡圖像；C, Cl 熒光與光鏡復合圖。圖13 抗合成肽hESP98_112抗體及抗rUU436抗體對小鼠體外精-卵黏附影響。圖14 抗合成肽hESP98_112抗體及抗rUU436抗體對小鼠體外精-卵融合影響。圖15 兔抗合成肽抗體對小鼠體外精_卵相互作用影響，獲能小鼠精子用兔抗合 成肽抗血清(1 10)預處理后，與小鼠去透明帶卵子共孵育，經Hoechst33342(10yg/ml) 染色后；壓片，置激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，左圖熒光圖像，右圖相差圖像。圖16 兔免疫前血清對小鼠體外精-卵相互作用影響(對照)，獲能小鼠精子用兔 免疫前血清(1 10)預處理后，與小鼠去透明帶卵子共孵育，經ΗΟθ(ΛΜ33342(10μβ/πι1) 染色后；壓片，置激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，左圖熒光圖像，右圖相差圖像。圖 17 :Stv_Izumo (Izumo212_216, Izumo216_220, Izumo220_224)融合蛋白表達結果， Stv-Izumo (Izumo212_216，Izumo216_220, Izumo220_224)融合蛋白在 BL21 (DE3)細菌中獲得表達，通 過15% SDS-PAGE電泳后，經考斯亮藍染色分析。M 低分子量蛋白標準；1 Stv-Izumo220_224 ；
2:Stv-Izumo216_220 ；3 :Stv-Izumo212_216 ； 4 :Stv-3 8。圖 18 =Western blot 分析 B 細胞表位，TO =Stv-β 8 不與 anti-PB 反應；Tl Stv-Izumo220_224 與 anti-PB 有弱反應；3 Stv-Izumo216_220 與與 anti—PB 有強反應；4 Stv_Izumo212_216 與 anti-PB 有弱反應。圖19 目的基因片段 PCR 擴增結果，M =DNA 分子 ladder ；1 :UU474 (524bp)。圖20 :UU474蛋白的表達和純化結果，UU 474蛋白在BL21 (DE3)細菌中獲得表達， 通過15% SDS-PAGE電泳后，經考斯亮藍染色分析。M 低分子量蛋白標準；1 誘導前全菌； 2 誘導后全菌；3 經Ni2+-NTA His-柱純化后蛋白。圖21 抗血清效價滴度散點圖，注抗原用96孔板包被，抗血清的效價用Anthos Zenyth 1100 Multimode酶標儀檢測，Izumo212_227、UU474的抗血清在A485處吸光度的值明 顯高于免疫前血清(control)。圖22 =Western blot的方法驗證精子蛋白Izumo與UU474蛋白之間存在 交叉反應，1 :anti-Izumo212_227IgG能夠與PB蛋白發生較強的反應；2 :UU474蛋白與 anti-Izumo212_227IgG 有較弱的反應。圖 23 =Western blot 驗證 anti_UU474IgG 或 anti_Izumo212_227IgG 與人精子蛋白 的交叉反應，1 免疫前血清為一抗；2 :anti-Izumo212_227IgG為一抗；3 :anti_UU474IgG為一 抗。圖24 人精子涂片間接免疫熒光定位，(a)anti-Izumo212_227IgG熒光染色定位；(c) 為a的自然光狀態；(b)anti-⑶46IgG熒光染色定位；(d)為a和b的重疊狀態(比例尺5 μ m) ο
圖25 人精子涂片間接免疫熒光定位，(a)anti-UU474IgG熒光染色定位；(c)為a 的自然光狀態；(b) anti-CD46IgG熒光染色定位；(d)為a和b的重疊狀態(比例尺:5 μ m)。圖26 人精子涂片間接免疫熒光定位(免疫前血清)(e)免疫前血清熒光染色定 位；(g)為a的自然光狀態；(f)anti-⑶46IgG熒光染色定位；(h)為a和b的重疊狀態(比 例尺5μπι)。圖27:小鼠精卵結合與精子穿卵實驗結果，獲能的小鼠精子和用不同濃度稀釋 的抗血清IgG及免疫前血清共孵育后，與去透明帶的小鼠卵子孵育；(A)不同濃度稀釋的 anti-Izumo212_227IgG的精-卵融合實驗；⑶不同濃度稀釋的anti_UU474IgG的精-卵融 合實驗；以免疫前血清處理組為對照，精-卵融合率在共聚焦顯微鏡下觀察。Bars代表標 準誤。(N=每組卵子的數目)。 圖28 ELISA檢測免疫后不同時間小鼠血清中ant i-CP1抗體，以1 μ g/孔CP1包被 96孔聚苯乙烯板，免疫小鼠結束后1周及第5周、第8周自眼內眥靜脈取血，血清1 100 稀釋作為一抗，測450nm吸光值，設免疫前血清及對照組血清為陰性對照。圖29 =ELISA檢測免疫后兔血清抗CPl抗體，以1 μ g/孔CPl包被96孔聚苯乙烯 板，兔免疫后血清倍比稀釋，檢測兔血清中抗CPl抗體效價。圖30 =ELISA檢測CPl免疫后小鼠血清中各表位抗體，以0. 5 μ g/孔重組小鼠精子 蛋白rmESP-Pl、rmtNASP、rmIzumo包被96孔聚苯乙烯板，CPl免疫后血清作為一抗，1 500 稀釋，測450nm吸光值，設免疫前血清為對照。結果顯示CPl免疫后血清與rmESP-Pl， rmtNASP有明顯免疫反應，與rmlzumo沒有陽性反應。圖31 :ffestern-blot分析兔抗CPl抗體與原重組原蛋白交叉反應，泳道1，4 rmlzumo ；泳道 2,5 :rmESP_Pl ；泳道 3,6 rmtNASP ；泳道 1,2,3 兔 anti-CPl 免疫后血清， 1 2000 ；泳道4，5，6 兔免疫前血清，1 2000。圖32 Western-blot分析兔抗CPl抗體與精子蛋白提取物交叉反應，泳道1，3 人 精子蛋白提取物上樣60 μ g/孔；泳道2，4 小鼠精子蛋白提取物上樣50 μ g/孔；泳道1，2 兔anti-CPl血清，1 2000 ；泳道2,4 免疫前兔血清1 2000。圖33 兔抗CPl抗體對小鼠體外精_卵黏附影響，Bars代表mean士SEM ；Bars上 方的數字代表每組平均卵子數；*P < 0. 05。圖34 兔抗CPl抗體對小鼠體外精_卵融合影響，Bars代表mean士SEM ；Bars上 方的數字代表每組平均卵子數；*P < 0. 05。圖35 兔抗CPl抗體對小鼠體外精-卵相互作用影響，獲能小鼠精子用兔抗CPl抗 血清(1 10稀釋)預處理后，與超排小鼠卵子共孵育，經Hoechst 33342(10yg/ml)染色 后；壓片，置激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，左圖熒光圖像，右圖相差圖像。圖36 兔免疫前血清對小鼠體外精-卵相互作用影響(對照)，獲能小鼠精子用兔 免疫前血清(1 10稀釋)預處理后，與超排小鼠卵子共孵育，經Hoechst33342(10yg/ml) 染色后；壓片，置激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，左圖熒光圖像，右圖相差圖像。
具體實施方式
下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作詳細說明。
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實施例1ESP蛋白與溶脲脲原體交叉反應抗原對生育的影響一，材料1. 1實驗動物及標本6月齡(體重約為2. 5kg)雌性新西蘭大白兔，BALB/c小鼠(8 12W)由上海交通 大學醫學院動科部購自中科院實驗動物中心，正常人精液標本由上海交通大學醫學院附屬 仁濟醫院人類精子庫門診提供。1. 2主要試劑寡核苷酸序列及多肽由上海生工生物技術公司合成，鑰孔血藍蛋白(KLH)購自上 海生工生物技術公司。質粒PTSA18購自上海市計劃生育科學技術研究所。2. 2. 1. 3 實驗儀器 Mini Protean 3system SDS-PAGE 電泳儀和 MiniSemi-Dry Trans Blot 轉膜儀(Bio-Rad)，LSM-5IO 激光共聚焦顯微鏡((CarlZeiss LSM-510, Jena, Germany) ；Centrifuge 5415R低溫離心機(Eppendorf) ；CO2培養箱(SANYO)；全自動精液分 析儀(Hamilton-Thorn)。二，方法2. Iffestern blot 鑒定 ESP7_242 與 UU 交叉反應抗原1.化學合成寡核苷酸單鏈化學合成hESP蛋白中十五肽(包含共同五肽，下劃線標識)編碼寡核苷酸序列正 義鏈、反義鏈各 10D。ppl :QVLENLVRSVPSGEP(aa38~52)pp2 :STENDVLTNPISEET (aa84~98)pp3 :TTTFPTGGFTPEIGK(aa98-112)pp4 :NVSIVLHAEEPYIEN(aa!28~142)兩端分別加上Sail和BamHI酶切位點黏性末端。2.退火正義鏈，反義鏈各取10μ 1，終濃度5yM，95°C 5min變性，自然恢復到室溫退火。3.構建重組十五肽融合表達載體退火產物連接雙酶切過的載體pTSA18_stv。反應體系如下pTSA18-stv Ιμ ，退 火產物 5 μ 1，Ligation Solution Buffer 1. 5 μ 1，T4DNA 連接酶 1 μ 1，dd H2O 6. 5 μ L· 總 反應體系為15 μ 1。16°C孵育8h。取連接產物5 μ 1轉化Ε. coli DH5a感受態菌，取100 μ 1轉化產物均勻涂布于含 Amp的LB固體培養基平皿。37°C培養12 14h。挑出單個菌落至5mlLB培養基(含Amp) 中。將試管在搖床中以250rpm，37°C搖菌過夜。取過夜菌1. 5ml用質粒小量抽提試劑盒進 行抽提質粒，即獲得重組融合表達載體。4.誘導融合表達十五肽取1 μ 1小抽質粒轉化BL21 (DE3)感受態菌，轉化產物均勻涂布于含Amp的LB固 體培養基平皿。37°C培養12 14h。挑出單克隆菌落至已加入5ml LB培養基(含Amp)的試管中。將試管在搖床中以 250印111，371搖菌過夜。取過夜菌10(^接種到5ml LB培養基(含Amp)的試管中，280rpm， 37°C搖菌至OD值0.6 0.8，超凈臺中取出Iml菌液作為陰性對照。加入ImM IPTG 37°C繼續搖菌4h誘導表達。設空載質粒為對照。取Iml誘導后菌液及誘導前菌液離心6000g 5min，浙干培養基獲取沉淀即菌體， 加入400 μ 1 ddH20重懸細菌沉淀，取20μ 1全菌蛋白樣品加入5μ 15Χ變性蛋白上樣緩沖 液，經95°C，IOmin變性，；15% SDS-PAGE，120V恒壓電泳約2h，直到染料走到膠底。考馬斯亮藍R-250染色，脫色液脫色至條帶清晰，觀察誘導表達結果。5. Western blot分析融合表達十五肽與抗mESP-Pl抗體交叉反應性取2μ1全菌蛋白樣品進行15% SDS-PAGE，按前述實驗方法轉PVDF膜，進行 Western blot分析。以抗mESP蛋白重組片段Pl抗體(anti-mESP-Pl)為一抗，設空載質粒 誘導表達產物及誘導前全菌蛋白為陰性對照。檢測抗anti-mESP-Pl抗體與上述十五肽的 交叉反應情況。2. 2合成短肽十五肽TTTFPTGGFTPEIGK(hESP98_112)由上海生工生物技術公司合成。部分耦聯KLH 作為抗原免疫動物，少量不耦聯KLH作為抗原用于EILSA檢測抗體效價。2. 3克隆、表達rUU436蛋白取血清-8型UU培養產物，用水煮法(95°C，10min)獲得其總DNA作為模板。由于 TGGFT位于UU436蛋白aa90_94，截短蛋白片段克隆表達aa78_246 (UU43678_246)，包含TGGFT， UU43678_246 的 PCR擴增弓丨物 sense 5，GC~GGATCCattaaaaattttgttatagctgat3，，antisense 5’GC-CTCGAGttcatRcttttRtaaaaatatcat 3，，目標片段長 507bp。GGATCC 為 BamH I 酶切位 點，CTCGAG為Xho I酶切位點。克隆、構建、擴增帶有His標簽的重組表達載體pET-28a(+)。 重組表達載體pET-28a(+)轉化E. coli BL21 (DE3)，15% SDS-PAGE電泳分析確認目標蛋白 是否表達。通過Western blot分析rUU43678_246蛋白片段與anti-mESP-Pl的交叉反應性。rUU43678_246蛋白大量表達及Ni2+-NTA-His親和層析純化實驗操作步驟按Ni-NTA 柱親和層析試劑盒說明書對表達的重組目的蛋白進行純化。將菌液離心lOOOOrpmX lOmin， 收取菌體沉淀。用雙蒸水重懸沉淀，冰上超聲破菌，再次離心IOOOOrpmX lOmin，棄上清。每 克沉淀加Lysis Buffer B 5ml，將沉淀重懸于Buffer B裂解，吸出上清備用。裂解產物上 清過Ni-NTA柱，棄濾液。Wash Buffer C洗脫柱中雜蛋白，4ml X 3次，收集每次的流出液。 Elution Buffer D洗脫柱中目的蛋白，1. 5ml X 4次，收集每次的流出液。BufferE洗脫柱中 目的蛋白，1.5mlX4次，收集每次的流出液。10ml Buffer B平衡柱子，柱子放4°C保存，可 重復使用。15% SDS-PAGE鑒定流出液中是否含有目的蛋白。2. 4抗血清制備用耦聯KLH的合成肽hESP98_112作為免疫原，免疫新西蘭雌性大白兔，按前述實驗 方法進行，免疫接種三次，每次接種抗原量約0. Smg0第一次接種后第35天自頸動脈放血獲 取免疫后血清。2. 5小鼠交配實驗經過生育能力驗證的BALB/c雌、雄小鼠(10 12W)用于本實驗，隨機分組。耦聯 KLH的合成肽hESP98_112和純化的rUU436蛋白作為免疫原，免疫雌性BALB/c小鼠。每次接 種抗原量約100 μ g，共三次。具體步驟見第一章。第一次接種后第35天自眼內眥靜脈取血 獲取免疫后血清，并合籠交配，雌雄比例為2 1，合籠一周。定期稱量雌鼠體重監測懷孕情 況，計數孕鼠產仔數。
2. 6 競爭性 ELISA參考其他實驗，anti-mESP-Pl抗體1 1000稀釋，與不同濃度(0. 1 ImM)合成 肽hESP98_112共孵育，37°C lh。將吸收處理后的抗體作為一抗，與預先包被重組mESP-Pl的 96孔聚苯乙烯板反應，按前述ELISA實驗步驟操作。另設兩組對照一組同樣稀釋度但未 經處理的anti-mESP-Pl抗體作為陽性對照；另一組anti-mESP-Pl抗體以不同濃度(0. 1 ImM)的重組mESP-Pl片段同樣孵育吸收后作為一抗進行ELISA，測定吸光值。計算未被吸 收的殘余抗體百分率。2. 7Western blot 分析重組rUU436蛋白和mESP-Pl片段及精子全蛋白提取物進行SDS-PAGE，以抗合成肽 hESP98_112(anti-p印tide)血清及抗rUU436 (anti_rUU436)血清作為一抗，按前述方法進行 Western blot,分析anti-p印tide抗體及anti_rUU436抗體的特異性及交叉反應性。2. 8人和小鼠精子涂片間接免疫熒光染色將正常人精液標本37°C，30min液化后，離心(1000g，15min)棄精漿。用45 % Percoll上層離心法分離精子，lOOOg，15min。最后用PBS重懸洗滌兩次，用于制作精子涂 片。小鼠附睪尾部精子涂片制作方法如下頂體反應后精子制備10 12周齡BALB/c雄 性小鼠頸椎脫白處死，取出附睪尾部，置于預熱的M16 (含3 % BSA)中，用手術剪將組織稍 微剪切后，于37°C，5% CO2培養箱中靜置30min后(精子會從附睪尾部組織中自動游出)， 隨后加入A23187 (5 μ Μ)繼續于37°C ,5% CO2培養箱中孵育1. 5h誘導頂體反應。將上述不 同的精子即附睪尾部精子和頂體反應后精子分別涂片，室溫晾干。以anti-peptide抗體及 anti-rUU436抗體為一抗，1 50稀釋，以FITC標記羊抗兔IgG為二抗，進行人和小鼠精子 間接免疫熒光染色，以免疫前血清為陰性對照，實驗方法預冷的丙酮固定15min。PBS柔和 沖洗。用含5% BSA的PBS于室溫封閉lh。以抗P1/P2/P3兔血清為一抗，1 500稀釋， 4°C孵育過夜。兔免疫前血清作為陰性對照，不加一抗的樣品作為空白對照。PBS柔和沖洗， 以FITC標記的羊抗兔IgG為二抗，1 500稀釋，37°C孵育lh。柔和沖洗后PBS封片，激光 掃描共聚焦顯微鏡下觀察。2. 9小鼠精子體外穿卵實驗小鼠超排卵、配子準備及體外穿卵實驗步驟1.卵子獲取8 10周齡BALB/c雌性小鼠腹腔注射10IU孕馬血清(PMSG)，48h后注射等劑量 的hCG，15 16h后從輸卵管壺腹部取卵。2.精子獲取及抗體處理10 12周齡BALB/c雄性小鼠頸椎脫臼處死，取出附睪尾部，置于預熱M16 (含3 % BSA)中，用手術剪將附睪組織稍微剪切后，于37°C，5% CO2培養箱中靜置lOmin，用上游法 制備精子懸液，調精子密度為1.0X106/ml，于37°C，5% CO2培養箱中孵育lh，加入Ca2+誘 導A23187溶液，使終濃度為5ymol/L，繼續孵育20min。分別用不同稀釋濃度的anti-Pi、 anti-P2、anti-P3抗血清及免疫前血清與獲能精子共孵育30min。血清使用前用56°C， 30min滅活補體。3.小鼠精子體外穿卵實驗將去透明帶卵細胞與不同處理的精子懸液于37°C，5% 0)2培養箱中共孵育3_4h后，吸出卵細胞，去除松散地附著在卵細胞上的精子，2%多聚甲醛固定20min，PBS洗滌后 Hoechst 33342(10yg/ml)染色，37°C，15 20min ;PBS洗滌后置載玻片壓片，激光掃描共 聚焦顯微鏡觀察。倒置相差顯微鏡下計數黏附于卵膜的精子數，熒光鏡下觀察精卵融合，判 斷精卵融合的標準為卵細胞內看到膨脹的精子頭部或原核。實驗共重復3次。抗合成肽血清及抗rUU436血清56°C 30min滅活補體，以不同稀釋度1 10， 1 20,1 100與精子共孵30min。處理后精子再與去透明帶小鼠卵子共孵育37°C，5 % C02，3-4h。去除松散地附著在卵細胞上的精子，2%多聚甲醛固定20min，PBS洗滌后Hoechst 33342(10μ g/ml)染色15 20min ；PBS洗滌后置載玻片壓片，激光掃描共聚焦顯微鏡觀 察。倒置相差顯微鏡下計數黏附于卵膜的精子數，熒光鏡下觀察精卵融合，判斷精卵融合的 標準為卵細胞內看到膨脹的精子頭部或原核。實驗共重復3次。2. 10統計學分析體外實驗重復三次以上，各組結果以均數士標準誤(mean士SEM)表示。小鼠交配 實驗產仔數以均數士標準差(mean士SD)表示。實驗組與對照組差異采用團體t檢驗，運 用SAS6. 12軟件進行統計學分析，ρ < 0. 05認為有統計學意義。三，結果IhESP與UU蛋白的共同五肽及與小鼠ESP(mESP)序列同源性比較生物信息學技術搜索Swi ss-prot數據庫，分析發現hESP蛋白的N-端(aa7_243) 與UU蛋白有五個共同五肽，與對應位置的mESP序列有程度不等的同源性。hESP蛋白 aa41-45 與 UU488aal35-139 有共同五肽 ENLVR ；對應于 mESP 的 QNLIM，40% —致性，20%相 似性。hESP 的 aa87-91 與 UUO 19aal80_184有共同五肽NDVLT ；對應于mESP 的 SDVLI,60% — 致性，20%相似性。hESP的aal03-107與UU436aa90_94有共同五肽TGGFT ；對應于mESP的 TRGFT，80% —致性。hESP 的 aal23_127 與 UU301aa79_83 有共同五肽 SIKPN0 人的 CASC5 蛋 白(Cancer susceptibility candidate gene 5protein)也有五妝 SIKPN(aal582_1586), mESP為SIRPN，80 % 一致性，20 %相似性。CASC5高表達于睪丸內的精子細胞，也可在其 他組織檢測到表達，因此不適合作為免疫避孕研究。hESPaal29-133與UU513aa44_48 有共同五肽VSIVL ；對應于mESP的ISVVL，60 % —致性，40 %相似性。人PKDREJ蛋白 (Polycystic kidney disease and receptorfor egg jelly-related protein)也有五月太 VSIVL(aal077-1081)。PKDREJ蛋白只表達于睪丸，可能通過形成鈣離子通道啟動頂體反應 而在受精過程中發揮重要作用。2交叉反應抗原鑒定化學合成包含共同五肽的十五肽PPl (含ENLVR)，PP2 (含NDVLT)，PP3 (含TGGFT)， PP4(含VSIVL)的寡核苷酸鏈，變性、退火后形成雙鏈，通過酶切位點黏性末端與載體 PTSA18連接構建重組表達載體。經克隆擴增、IPTG誘導，十五肽與鏈霉親和素(stv)融合 表達表達，SDS-PAGE分析誘導前后全菌蛋白顯示近IlkDa處有新條帶(圖1)。以抗重組 mESP的Pl肽段的抗體(anti-rmESP-Pl)為一抗，以融合表達十五肽為抗原，通過Western blot分析二者的交叉反應性。結果顯示PP3與anti-rmESP-Pl抗體免疫反應最強，PP3包 含hESP的aal03-107與UU436的aa90_94之間的共同五肽TGGFT ；提示共同五肽TGGFT為 交叉反應抗原(圖2)。3UU436蛋白克隆表達
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SDS-PAGE分析UU436蛋白表達，分子量19kDa，由于重組蛋白帶有His標簽，故實 際分子量略大于理論分子量。與誘導前細菌相比，誘導后全菌裂解物在預計位置有蛋白 表達條帶，但表達量不夠高，經親和層析純化獲得目標蛋白(圖3)。Western blot分析 anti-rmESP-Pl抗體與rUU436蛋白的交叉反應性，包含TGGFT的rUU436片段出現免疫反應 條帶，誘導前菌總蛋白、免疫前血清對照無免疫反應條帶(圖4)。這個結果說明rUU436蛋 白可以與anti-rmESP-Pl抗體發生交叉反應。4合成十五肽hESP98_112及rUU436蛋白免疫后血清抗體效價檢測利用化學方法合成十五肽hESP98_112，首先要預測合成肽的親水性、抗原性及表面 可及性。為此我們用DNAstar分析軟件對hESP的N-端進行分析，顯示hESP98_112具備良好 的親水性、抗原性及表面可及性。合成肽耦聯KLH以增強免疫原性，免疫兔及小鼠后獲得 的血清抗體經ELISA測定效價。以免疫前血清作對照，以rUU436和未耦聯KLH的十五肽 hESP98_112作為抗原包被96孔ELISA板。免疫后小鼠及兔血清均產生特異性抗體，兔血清抗 體效價約1 10000 (圖5，6)。5抗合成肽hESP98_112抗體及抗rUU436抗體的交叉反應性以抗合成肽hESP98_112兔血清為一抗，以rmESP-Pl、人及小鼠精子蛋白提取物為抗 原，進行Western blot分析，在目標蛋白位置處有陽性反應條帶，rmESP_Pl、rUU436分子量 分別約為25kDa，24kDa，hESP和mESP理論分子量分別為38kDa，45kDa (圖7A，圖7B)。說明 合成肽hESP98_112產生的抗體有特異性，能識別原重組和天然蛋白mESP。以抗rUU436血清為一抗，以rUU436、rmESP-Pl及小鼠精子蛋白提取物為抗原，進 行Western blot分析，在目標蛋白位置處有陽性反應條帶，rmESP-Pl、rUU436分子量分別 約為25kDa，24kDa，mESP理論分子量為45kDa(圖8)。結果說明anti_rUU436抗體即能識 別rUU436蛋白，也與mESP具有交叉反應性。6交叉反應抗原TGGFT為BCE為了進一步驗證UU436蛋白和hESP蛋白的交叉反應抗原TGGFT是否為BCE，以 rmESP-Pl包被ELISA板作為抗原，將不同濃度的合成肽與anti-rmESP-Pl孵育吸收后作為 一抗。另一組以同樣濃度的rmESP-Pl孵育吸收抗體作為對照。測吸光值與未經吸收抗體 免疫反應的吸光值之比值計算殘余抗體百分率(圖9)。競爭性ELISA顯示合成肽能部分 中和anti-rmESP-Pl抗體，說明合成肽具有模擬表位功能，能與anti-rmESP-Pl發生免疫反 應，TGGFT為線性BCE。7間接免疫熒光檢測人射出精子和小鼠附睪尾精子涂片后，以兔anti-p印tide抗體及小鼠 anti-rUU436抗體為一抗，進行間接免疫熒光染色。結果顯示人和小鼠精子赤道段有特異性 熒光信號，分別與hESP和mESP蛋白定位一致。尾部和頭部其他區域沒有熒光信號，免疫前 血清對照結果也是陰性的(圖10，11，12)。說明合成肽hESP98_112產生的抗體能識別人和小 鼠精子內天然ESP蛋白。anti-rUU436抗體與小鼠精子蛋白ESP也具有交叉反應，但與人精 子提取物無特異性反應條帶。8抗合成肽hESP98_112抗體對小鼠精_卵相互作用影響用不同濃度稀釋anti-p印tide、anti-rUU36抗血清及免疫前血清處理獲能小鼠 精子后，與去透明帶的小鼠卵子孵育，觀察經上述處理后的精子黏附卵子的能力及穿卵能 力的變化。與免疫前血清相比，1 10稀釋的抗血清處理精子后，每個卵子的平均結合和融合精子數明顯減少。1 20稀釋的anti-p印tide抗血清也能抑制精卵融合。當稀釋度增 大時，對精子與卵子的黏附和融合無顯著影響(圖13，14，15，16)。這一結果表明抗體抑制 作用呈濃度依賴性。不同濃度稀釋的抗血清及免疫前血清處理后的精子與對照組比較，精 子活力和運動參數沒有明顯的變化，也沒有發生精子凝集現象。9合成肽hESP98_112、UU436免疫小鼠后對生育功能影響合成肽hESP98_112免疫組雌鼠33. 3% (3/9)不育，rUU436免疫組不育率為44. 4% (4/9)，而對照組均生育。免疫組的孕鼠平均產仔數也顯著低于對照組(表1)。說明合成肽 hESP98_112和rUU436蛋白免疫動物后產生了抗生育作用。表1合成肽hESP98_112及重組蛋白rUU436免疫BALB/c雌鼠后對生育影響*ρ<0·05 實施例2UU的UU474蛋白與人精子蛋白IZUMO之間交叉反應抗原的鑒定1.實驗動物及取材小鼠體內、體外生殖實驗都使用性成熟的且有生育史的雄性和雌性BALB/c小鼠 (由中科院上海實驗動物中心提供)。6月齡(體重2. 5kg左右)雄性新西蘭大白兔，購自上海交通大學醫學院動物科學 部。2.主要試劑UU液體培養基和固體培養基(上海同濟醫院鐵道部性病重點實驗室)；限制 性內切酶BamHI、Hind III、EcoR I、T4DNA連接酶、凝膠回收DNA試劑盒、逆轉錄試劑 盒、La Taq酶(大連寶生物公司)；預染低分子量標準蛋白質Marker、低分子量標準蛋 白質Marker (Fermentas) ；Agorose (Promega)；質粒小量抽提試劑盒(上海華舜公司)； Ni2+-His柱(Qiagen) ；BCA法蛋白定量試劑盒(Pierce) ；ECL熒光染色劑、PVDF膜、抗體 純化PROSEP-A Kit(Millipore)；完全福氏佐劑和不完全福氏佐劑、anti_hCD46單克隆抗 體、Rhodamine (TRITC)羊抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔IgG、FITC標記 羊抗兔IgG、孕馬血清(PMSG)、M16液、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、透明質酸酶、蛋白酶K、 Hoechst33342、A23187 (Sigma)；丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、Tween-20、TEMED, Tris, BSA、氯化 鈉、抗生素等一般化學試劑購自上海化學試劑有限公司。3.主要儀器ND-1000紫外分光光度計(NanoDrop) ,Mastercycler 印系列PCR儀(Eppendorf)， Anthos Zenyth 1100 Multimode 酶標儀(Anthos)，凝膠圖像分析系統，Mini Protean 3system SDS-PAGE 電泳儀和 Mini Semi-Dry TransBlot 轉膜儀、1000/500 型電泳儀和轉 移儀(Bio-Rad)，J2-21型高速離心機(Beckman)，LSM-510激光共聚焦正置雙光子顯微鏡(Carl Zeiss)。2. 2. 2實驗方法2. 2. 2. IUU 培養①將在-20 V凍存的UU標本在37 °C水浴鍋中復蘇。②取100 μ 1接種于pH 5. 5 6.5含有酚紅和0.1%尿素的Iml UU液體培養 基中，37°C培養16 24h，觀察顏色變化，指示劑由橘黃色變為橙紅色，并且培養基澄清，表 明UU生長。③取100 μ 1 UU懸液轉種于固體培養基中，95%空氣和5% CO2, 37°C恒溫箱內培 養36 72h后，在低倍鏡下觀察菌落呈“油煎蛋”狀。④經液體培養基37°C，16 24h培養陽性后，在液體培養基中傳代三次擴增。2. 2. 2. 2重組Izumo蛋白的Ig-Iike結構域(PB)蛋白的質譜鑒定①純化的重組PB蛋白進行SDS-PAGE電泳。②考馬斯亮藍染色，脫色。③進行MALDI-T0F/T0F 質譜鑒定(Finnigan LCQ Mass spectrometer 4700Proteomics Analyzer, Applied Biosystems, Foster City, CA)。2. 2. 2. 3用Western blot的方法鑒定Izumo與UU之間的交叉反應抗原是否是B 細胞表位①根據3 個交叉反應抗原 Izumo212_216 (KGKEA)、Izumo216_22。(ATLTK)、 Izumo220^224 (KPMVG)的肽序列設計3對互補的核苷酸基因序列，分別設計EcoRI/Hindlll的 粘性末端，3對互補的核苷酸基因序列如下Izumo212_216 (KGKEA)正義鏈aattcg-AAGGGTAAGGAGGCCTAA_ta反義鏈:agctta-TTAGGCCTCCTTACCCTT-cgIzumo216_22(l (ATLTK)正義鏈aattcg-GCCACCCTTACCAAGTAA_ta反義鏈agctta-TTACTTGGTAAGGGTGGC-cgIzumo220_224 (KPMVG)正義鏈aattcg-AAGCCAATGGTTGGTTAA_ta反義鏈agctta-TTAACCAACCATTGGCTT-cg②pTSA18_Stv 質粒雙酶切反應體系10 X Buffer M 1.5 μ 1，EcoRI 1 μ 1, Hind III 1μ 1，pTSA18_Stv質粒11. 5μ 1總反應體系為15 μ 1 ；反應程序37°C孵育2h ；酶切產 物經1. 2%瓊脂糖凝膠電泳驗證；目的片段用膠回收試劑盒回收。③合成的3對核苷酸引物退火正義鏈與反義鏈用去離子水分別稀釋成5 μ mol/ 1 ；退火反應20μ 1正義鏈引物、20 μ 1反義鏈引物，99°C孵育5min，自然降溫到室溫。④退火產物與雙酶切的pTSA18_Stv質粒連接雙酶切的pTSA18_Stv質粒1 μ 1， 退火產物 2 μ 1，Ligation Solution Buffer 1· 5 μ 1，T4DNA 連接酶 1 μ 1，dd H2O 9· 5 μ 1 ； 總反應體系為15 μ 1 ；反應程序16°C過夜。⑤轉化入E. coli DH5a感受態菌連接產物轉化DH5a感受態菌，轉化產物均勻涂 布于含Kan的LB培養板上；37°C培養12 14h ；挑出陽性克隆至5ml LB培養基(已加Kan) 中；將試管在搖床中以300rpm，37°C孵育過夜；擴增的質粒用質粒小量抽提試劑盒進行抽提。⑥轉化入E. coli BL21 (DE3)感受態菌取1 μ 1小抽質粒轉化入BL21 (DE3)感受
13態菌中，轉化產物均勻涂布于含Kan的LB培皿；37°C培養12 14h ；在超凈工作臺中，挑 出陽性單克隆菌至已加入5mlLB培養基(已加Kan)的試管中；將試管在搖床中以300rpm， 37°C孵育5h ；擴增的質粒用質粒小量抽提試劑盒進行抽提；小抽質粒經PCR驗證后，送上海 華大基因公司測序。⑦誘導表達 Stv-Izumo (Izumo212_216，Izumo216_220, Izumo220_224)融合蛋白取經測序 驗證的各菌液100 μ 1分別加入5ml LB培養基(已加Kan)的試管中；將試管在搖床中以 300rpm，37°C孵育3h，測得OD值為0. 5，在超凈工作臺中取出Iml菌液為誘導前對照；在剩 余的菌液中加入4 μ 1 IPTG，在搖床中以280rpm，37°C孵育4h后取誘導后菌液Iml ；誘導前 與誘導后菌液離心13000rpm，30sec ；離心后棄上清，加300 μ 1 dd H2O重懸；取誘導前全菌 液、誘導后全菌液各80 μ 1，加5X sample buffer 20 μ 1，95°C孵育IOmin變性，上樣，進行 SDS-PAGE電泳(120V電壓)，直到染料走到膠底；電泳結束后考馬斯亮藍R250染色，脫色液 脫色，當藍色條帶清晰后，依據蛋白分子量Marker觀察誘導效果。( ) Western blot 以 Stv-Izumo (Izumo212_216, Izumo216—220，Izumo220_224) 融合蛋白為 樣品，進行SDS-PAGE電泳；電泳后，取下凝膠，去除濃縮膠，濕轉轉膜buffer中浸泡15min ； 將PVDF膜在甲醇中浸潤15sec，ddH20漂洗兩次，浸入濕轉轉膜buffer平衡IOmin ；用濕轉 法轉膜，80V恒壓轉膜2h;用5% (W/V)脫脂奶粉在室溫封閉PVDF膜2h;以anti-PB IgG為 一抗(按比例1 2000用脫脂奶粉配)，4°C孵育過夜。用TBST洗滌3次，每次IOmin ； 二抗辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG(l 20000)，室溫孵育Ih ；用TBST洗滌3 次，每次IOmin ；ECL顯色劑顯色，曝光后自動洗片儀洗片。2. 2. 2. 4人工合成肽在上海生工合成肽Izumo212_227 (包含ATLTK)，用血藍蛋白(keyhole limpethemocyanin, KLH)偶聯增強其抗原性。2. 2. 2. 5克隆表達UU474蛋白并制備其多克隆抗血清①設計克隆UU474第465 638蛋白(包含交叉反應抗原ATLTK)，根據GenBank 中 Ureaplasma parvum serovar 3str. (gi 13357558)基因序列設計弓丨物。UU474蛋白引物序列如下UU474 蛋白正義鏈引物5，GC GGATCC AAT CGT TTG GGA ACT GCT 3，下劃線部分是BamH I酶切位點負義鏈引物5，GCAAGCTT GCT TCT GAT GCG TCA TAA AT 3，下劃線部分是Hind III酶切位點預期擴增片段為524bp ；②PCR 將UU煮沸IOmin后釋放的總DNA作為模板；PCR體系如下UUDNA 5 μ 1， 10XPCR Buffer 2. 5 μ 1，上游引物 1 μ 1，下游引物 1 μ 1，dNTPMixtrue (200mM) 0. 5 μ 1, dd H2O 14μ l，Taq酶1μ 1 ；總反應體系為25 μ 1 ；PCR反應程序94°C預變性5min ；94°C Imin, 570C lmin，72°C lmin，循環 30cycles ；72°C延伸 10min，4°C IOmin ；PCR產物經 1. 2%瓊脂糖 凝膠電泳驗證后，用凝膠回收DNA純化試劑盒回收。③克隆TA克隆連接體系pMD-18T Vector 1 μ 1，回收 DNA 4 μ 1，SolutionI 5 μ 1，總反應體系為10 μ 1，反應程序16°C孵育8h ；連接產物轉化入DH5a感受態細胞；通 過X-gal篩選和挑取陽性克隆，用質粒小量抽提試劑盒抽提質粒；質粒雙酶切10XBufferK 1. 5μ 1, BamH I 1 μ 1，HindIIIl μ 1，小抽質粒 11. 5 μ 1 (pMD_18T_UU474)，總反應體系為 15 μ 1 ；酶切目的片段膠回收產物與pET-28a(+) Vector連接，構建表達載體:pET-28a(+) Vector 1 μ 1，酶切膠回收產物 8 μ 1，Ligation Solution Buffer 1· 5 μ 1，T4DNA 連接酶 1μ 1, dd H2O 3. 5μ 1，總反應體系為15μ 1，16°C過夜；連接產物轉化入Ε. coli DH5a感受 態細胞；擴增的質粒用質粒小量抽提試劑盒進行抽提；小抽質粒經PCR驗證后，送上海華大 基因公司測序。④表達將pET-28a(+)_UU474 轉化入 E. coli BL21 (DE3)感受態細胞；用 IPTG， 在搖床中以280rpm，37°C孵育4h誘導表達目的蛋白，取誘導前全菌液、誘導后全菌液加 5 X sample buffer 20 μ 1，95°C孵育 IOmin 變性，上樣，進行 SDS-PAGE 電泳(120V 電壓)，電 泳結束后考馬斯亮藍R250染色，脫色液脫色，當藍色條帶清晰后，依據蛋白分子量Marker 觀察誘導效果；按照以上誘導表達過程，誘導250ml菌液表達目的蛋白，用Pierce公司 Ni2+-NTA柱經親和層析方法對表達的目的蛋白進行純化；純化后蛋白用BCA法定量。⑤制備多克隆抗體純化的重組UU474蛋白和合成肽Izumo212_227分別免疫一只6 月齡(體重為2. 5kg)雄性新西蘭大白兔，按每只兔子每次0. 5 1. Omg的蛋白量來確定 免疫蛋白注射體積，方法參照文獻；用ELISA法(酶聯免疫吸附法)檢測兔抗血清效價；用 PROSEP-A試劑盒進行抗體純化。2. 2. 2. 6精子蛋白Izumo與UU474蛋白之間存在交叉反應抗原的生物學驗證①以重組PB蛋白(小鼠Izumo蛋白Ig-Iike結構域)和重組UU474蛋白為樣品，進 行SDS-PAGE電泳；電泳后，取下凝膠，去除濃縮膠，濕轉轉膜buffer中浸泡15min ；將PVDF 膜在甲醇中浸潤15sec，ddH20漂洗兩次，浸入濕轉轉膜buffer平衡IOmin ；用濕轉法轉膜， 80V恒壓轉膜2h ；用5% (W/V)脫脂奶粉在室溫封閉PVDF膜Ih ；以anti-Izumo212_227IgG為 一抗(按比例1 2000用脫脂奶粉配)，4°C孵育過夜。用TBST洗滌3次，每次IOmin ； 二抗辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG(l 35000)，室溫孵育Ih ；用TBST洗滌3 次，每次IOmin ；ECL顯色劑顯色，曝光后自動洗片儀洗片。②以人精子蛋白(人精子蛋白提取方法同小鼠精子蛋白)為樣品進行SDS-PAGE 電泳，電泳后，取下凝膠，去除濃縮膠，濕轉轉膜buffer中浸泡15min ；將PVDF膜在甲醇 中浸潤15sec，ddH20漂洗兩次，浸入濕轉轉膜buffer平衡IOmin ；用濕轉法轉膜，80V恒 壓轉膜2h ；用5% (W/V)脫脂奶粉在室溫封閉PVDF膜Ih ；分另Ij以anti-Izumo212_227IgG和 anti-UU474IgG為一抗(按比例1 2000用1 %脫脂奶粉配)，4°C孵育過夜。用TBST洗 滌3次，每次IOmin ；二抗辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG (1 35000)，室溫孵育 Ih ；用TBST洗滌3次，每次IOmin ；ECL顯色劑顯色，曝光后自動洗片儀洗片。2. 2. 2. 7人精子雙標免疫熒光定位①正常人精子由仁濟醫院人類精子庫提供，按Mandal的方法通過上游法收集精子。②收集好的精子懸液置于37°C，5% CO2培養箱中孵育1. 5h獲能，然后加入5μ M 的Ca2+誘導劑Α23187繼續孵育Ih誘導精子的頂體反應。③頂體反應后的精子被點到涂了多聚賴氨酸的玻片上，自然干燥后，用PBS洗一 次。④用5 % BSA室溫封閉Ih.。
⑤anti-Izumo212_227IgG (或 anti-UU474IgG)和 anti-hCD46 分別以 1 50 的稀釋 度孵育，陰性對照用免疫前血清孵育，在4°C過夜。⑥用PBS洗三次后，分別以用1 200稀釋的FITC標記的羊抗兔IgG和 Rhodamine (TRITC)羊抗小鼠IgG在暗盒中孵育2h，再用PBS洗三次后，用50 %甘油封片，用 激光共聚焦顯微鏡觀察。2. 2. 2. 8anti-UU474IgG 與 anti_Izumo212_227IgG 的體外抗生育實驗①卵子制備8 10周齡雌性BALB/c小鼠腹腔注射IOIU孕馬血清(PMSG)，48 72h后注射等劑量的人絨毛膜促性腺激素(hCG)，12 16h后從輸卵管壺腹部取卵。卵細胞 周圍顆粒細胞層用0. 透明質酸酶消化，卵透明帶用0.6%蛋白酶K去除。②精子獲能及抗體處理10周齡以上的雄性BALB/c小鼠，頸椎脫臼處死后取出附 睪尾精子置于含0. 3% BSA的M16液中，用上游法制備精子懸液，調精子密度為1. OX IO6/ ml,于37°C，5% CO2培養箱中孵育1. 5 2h，加入Ca2+誘導劑A23187溶液，使終濃度為 5 μ mol/L,繼續孵育lh，分別用不同稀釋濃度的anti-UU474IgG或anti_Izumo212_227IgG及 免疫前血清與獲能精子共孵育30min。③受精將無透明帶卵細胞與不同處理的精子懸液于37°C，5% CO2培養箱中共孵 育3h后，吸出卵細胞，去除松散地附著于卵細胞的精子，移至載玻片上，壓片后置相差顯微 鏡下觀察。精卵的融合通過H0echst33342染色后，激光共聚焦顯微鏡觀察。判斷受精的標 準為看到雄原核或膨脹的精子頭部及相應的尾。受精實驗均包括一個實驗組和一個對照 組，共重復3次。2. 2. 2. 9抗Izumo212_227抗體對小鼠精子運動功能的影響①用50 μ g/ml純化的抗Izumo212_227IgG或純化的正常兔血清IgG與小鼠精子共孵 育lh。②取樣經精液自動分析儀檢測，精子運動參數分別選定活動精子百分率(％ Motile)、曲線速度(curvilinear velocity，VCL)、直線速度(straight-line，VSL)。2. 2. 2. 10UU474蛋白和合成肽Izumo212_227的體內抗生育實驗①選擇24只雌性BALB/c小鼠和12只雄性BALB/c小鼠，都經驗證具有生育能力。 隨機分成3組，2個是實驗組(UU474蛋白免疫組、合成肽Izumo212_227免疫組)，1個對照組。②分別在第1天、第3天、第28天免疫小鼠，每次每只小鼠免疫100 μ g的蛋白量。③在免疫第35天，實驗組與對照組的雌性和雄性小鼠合籠，兩組合籠都采用兩雌 配一雄的組合。④合籠后的第7天，第14天，第21天對兩組的雌性小鼠的體重進行稱量。觀察雌 性小鼠體重的變化，判斷雌性小鼠是否懷孕；⑤并分別計算孕鼠的產仔數。2. 3 結果2. 3. 1人與小鼠Izumo蛋白Ig-Iike結構域的序列比對與分析為了進一步研究Izumo Ig-Iike結構域的理化特性及其生物學功能，首先將人與 小鼠Izumo蛋白Ig-Iike結構域的序列通過DNAssist 2. 0軟件進行了比對和分析。人與 小鼠Izumo蛋白Ig-Iike結構域的氨基酸序列有64. 84%完全一致，有15. 38%相似，表明 Izumo蛋白Ig-Iike結構域在種屬之間的保守性是很高的。小鼠可以作為研究人精子蛋白
16Izumo與UU之間交叉反應抗原的理想動物模型。我們通過生物信息學技術發現人精子蛋白 Izumo與UU之間存在交叉反應抗原KGKEA、ATLTK、KPMVG都在human Izumo蛋白的Ig-Iike 結構域中。結果也表明小鼠Izumo蛋白Ig-Iike結構域有較強的抗原性和較好的親水性。2. 3. 2小鼠重組Izumo蛋白Ig-Iike結構域(PB)的質譜鑒定經質譜鑒定PB蛋白的確是小鼠Izumo蛋白Ig-Iike結構域2. 3. 3用Western blot的方法鑒定Izumo與UU之間的交叉反應抗原pTSA18-Stv-Izumo (Izumo212_216, Izumo216_220, Izumo220_224)融合蛋白在 IlkDa 處獲得 表達(圖17)。對照蛋白為Stv-i38融合蛋白，β8是β-hCG中的一個由12個氨基酸組成 的表位肽，在電泳中，其融合蛋白分子量較大。human Izumo 的第 212 216 氨基酸(Izumo212_216)KGKEA，對應的 mouse Izumo 氨基酸序列為KGKEP，其中A和P是相似氨基酸；human Izumo的第216 220氨基酸 (Izumo216_22Q)ATLTK，對應的mouselzumo氨基酸序列為PYLTK，其中T和Y也是相似氨基酸； human Izumo 的第 220 224 氨基酸(Izumo22Q_224)為 KPMVG，對應的 mouselzumo 氨基酸序 列為KSMVG0通過(圖18)我們發現anti-PB(小鼠Izumo蛋白Ig-Iike結構域)IgG可以 與Stv-Izumo216_22。融合蛋白很強地識別，而與Stv-Izumo22。_224和Stv_Izumo212_216融合蛋白 發生較弱的識別。因此(Izumo216,)ATLTK是一個比較強的B細胞表位。UU474蛋白的第 518 522氨基酸與人Izumo216_22(1氨基酸序列一致，皆為ATLTK。2. 3. 4克隆表達UU474蛋白并制備其多克隆抗血清UU474蛋白基因的PCR產物作1. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示出現一條特異性區 帶，位于相對分子質量(M) 500 600bp之間，與預期大小524bp相符(圖19)。在IPTG (工作濃度為200 μ g/ml)誘導下，pET_28a(+)表達質粒在具有T7RNA聚 合酶的E. coli BL21 (DE3)中經過37°C 4h的培養后，進行超聲破菌。經SDS-PAGE電泳分離 并用考馬斯亮藍染色，結果顯示誘導后全菌裂解物在23kDa (圖20)處出現與預期目的蛋白 大小一致的條帶，且該表達蛋白在超聲破菌后的沉淀里。誘導前全菌裂解物無目的蛋白表 達。用Ni2+-NTA柱對誘導后菌液進行親和層。洗脫液經SDS-PAGE電泳后，在23kDa處 出現了明顯的條帶，為純化后的UU 474蛋白(圖20)。2. 3. 5ELISA 法檢測 anti_Izumo212_227、anti_UU474 兔抗血清效價結果用ELISA法檢測獲得的抗體效價，分別以免疫前、后兔血清為一抗，辣根過氧化物 酶(HRP)標記的羊抗兔IgG為二抗，用DAB顯色反應后，終止反應，用酶標儀在A485檢測。 結果顯示anti-Izumo212_227、anti_UU474的IgG效價均大于1 25600 (表2)，表明所獲得 的抗體是高效價的(圖21)。表2抗血清效價滴度表
17 2. 3. 6精子蛋白Izumo與UU474蛋白之間存在交叉反應抗原的生物學驗證通過Western blot的方法驗證精子蛋白Izumo與UU474蛋白之間存在交叉反，合 成肽Izumo212_227的抗體能夠識別重組PB蛋白(小鼠Izumo蛋白Ig-Iike結構域)和重組 UU474 蛋白(圖 22) ；anti-UU474IgG 或 anti_Izumo212_227IgG 也都能在 37kDa 處識別人精子 Izumo 蛋白(圖 23)。2. 3. 7人精子雙標免疫熒光定位通過用純化的ant i-Izumo212_227IgG進行人精子的雙標間接免疫熒光定位分析，我 們發現免疫熒光定位在頂體反應后人精子的頂體內膜上，與陽性對照的抗體CD46單克隆 抗體的定位一致(圖24)。anti-UU474IgG也能識別人精子的頂體內膜(圖25。以免疫前 血清為一抗的對照組，在激光共聚焦顯微鏡下未見熒光反應(圖26)。2. 3. 8ant i_UU474IgG 與 anti_Izumo212_227IgG 的體外抗生育實驗用不同濃度稀釋的純化后anti_UU474IgG、anti_Izumo212_227IgG及免疫前血清 與獲能小鼠精子共孵育后，與去透明帶的小鼠卵子孵育，觀察經上述處理后的精子與卵 子融合能力的變化。經過Hoechst 33342染色并在激光共聚焦顯微鏡下觀察，結果發現 50 μ g/ml anti-IZumo212_227IgG使小鼠精-卵融合能力都有較明顯的下降；相同濃度稀釋 的anti-UU474IgG對小鼠精-卵融合能力沒有明顯影響(圖27)。然而25 μ g/ml、10 μ g/ ml濃度稀釋的anti-IZumo212_227IgG對小鼠精-卵融合能力也沒有明顯的影響。結果表明 anti-IZUmo212_227IgG在體外具有一定的抑制精-卵融合的作用。2. 3. 9抗體對小鼠精子運動功能的影響用純化的anti-IZUmo212_227IgG或純化的正常兔IgG與小鼠精子共孵育Ih后，取樣 經精液自動分析儀檢測，與對照相比，實驗組中小鼠精子活動百分率、曲線速度(VCL)及直 線速度(VSL)均無顯著性差異，表明anti-IZumo212_227IgG對小鼠精子運動功能無影響(表 3)。表3ant i_Izumo212_227IgG對小鼠精子運動的影響
2. 3. 10合成肽Izumo212_227和重組蛋白UU474體內抗生育實驗為了觀察合成肽Izumo212_227和重組蛋白UU474在體內對生殖的影響，分別用合成 肽IZUmo212_227和重組蛋白UU474免疫雌鼠，在第六周可以取得較高效價的抗體，然后與已證 實具備生育能力的雄鼠交配，抗體可以持續到第十周。合成肽Izumo212_227免疫組(表4)與 其它組比較，雌鼠的產仔數有較明顯下降。表4Izumo212_227、UU474免疫對雌鼠受精的影響 注*p < 0. 05.實施例3嵌合肽免疫避孕疫苗功能研究一，材料合成肽CPl由上海生工生物技術公司合成。完全福氏佐劑和不完全福氏佐劑、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG、FITC 標記的羊抗兔IgG、Anti-His單克隆抗體(Sigma公司)PVDF膜(Millipore)，ECL生物發光 顯色劑(Millipore)。6月齡(體重約為2. 5kg)雌性新西蘭大白兔，成熟BALB/c小鼠(8-12W)由上海交 通大學醫學院動科部購自中科院實驗動物中心。二，方法1.設計、合成嵌合肽精子蛋白Izumo，tNASP，ESP中的交叉反應抗原分別為ATLTK，IERLT, TGGFTjf 三個短肽 hESP1Q3_112(TGGFTPEIGK)、tNASP396_4(l5 (TSIERLTETK)、Izumo212^221(KGKEATLTKP)(包 含交叉反應抗原)串聯起來，在其N-端連接廣譜T細胞表位牛核糖核酸酶aa94-104 NCAYKTTQANK，用于構建抗精子的嵌合肽疫苗。嵌合肽CPl :NCAYKTTQANK GGG TGGFTPEIGK GGG TSIERLTETK GGG KGKEATLTKP。由上海生工生物技術公司應用固相化學合成法合成上 述50肽。2.重組 mlzumo，mtNASP, mESP-Pl 蛋白表達純化mESP三個片段P1/P2/P3克隆用提取的BALB/c小鼠睪丸總RNA作為模板，RT-PCR的產物作1. 0 %瓊脂糖凝 膠電泳檢測，顯示出現三條特異性區帶，分別與P1/P2/P3片段的預期大小516bp、543bp、474bp相符。目標片段與pET-28a(+)載體連接，構建重組表達載體，并再次經DNA測序。在 IPTG(工作濃度為200 μ g/ml)誘導下，pET_28a(+)表達質粒在E. coli BL21 (DE3)中經過 37°C4h的培養后，結果顯示誘導后菌液在蛋白分子量約25kDa，36kDa，21kDa處大量表達出 新的條帶，對應于P1/P2/P3. P1、P2、P3的理論分子量分別為20kDa，21kDa, 17kDa,考慮到重 組蛋白帶有載體的標簽序列，實際顯示的分子量會比理論分子量略大，故Pl和P3判斷為 目標蛋白。P2顯示分子量偏大，進一步經質譜分析驗證為目的片段.在本實驗的表達條件 下，誘導后His標簽重組蛋白以包涵體形式表達，因此用Ni-NTA柱對誘導后菌液進行親和 層析。洗脫液經SDS-PAGE電泳后，結果顯示在預計蛋白分子量處獲得了純化后目的蛋白。Izumo蛋白Ig-Iike domain與mtNASP的克隆表達與純化1 引物:Izumo基因Ig-Iike結構域(PB)上、下游引物。正義鏈引物5，GCGGATCC AAG CAG TTG CAC ATT TGT C 3，包含酶切位點 BamH I (下劃線部分)。負義鏈引物5，GCAAGCTT GTT CGG TGG TTG GTT TTC 3，包含酶切位點 Hind III(下劃線部分)。預期擴增片段為336bp ；mtNASP上、下游引物。上游引物5，GCGGATCCATGGAACTGCTAGGGCAAGA’ 3 包含酶切位點 BamH I (下劃線部 分)。下游引物5，GCAAGCTT TTTGTCTTCAGGTGCTTTCT，3 包含酶切位點 Hind III (下劃 線部分)。目的片段長339bp。2 ① PCR:PCR 體系如下小鼠睪丸 cDNA 5 μ 1，IOXPCR Buffer 2. 5 μ 1，上游引物 1 μ 1，下游引物 1 μ l，dNTP Mixtrue(200mM)0. 5μ l，dd Η2014μ l，Taq 酶 1μ 1 ；總反應體系 為 25 μ 1。②克隆ΤΑ克隆連接體系pMD_18T Vector Ιμ ，回收 DNA 4 μ 1，SolutionI 5 μ 1，總反應體系為10 μ 1，反應程序16°C孵育8h ；連接產物轉化入DH5a感受態細胞；通 過X-gal篩選和挑取陽性克隆，用質粒小量抽提試劑盒抽提質粒；質粒雙酶切=IOXBuffer K 1. 5μ 1, BamHI 1 μ 1, Hind IIIl μ 1，小抽質粒 11. 5 μ 1 (pMD_18T_DNA)，總反應體系為 15 μ 1 ；酶切目的片段膠回收產物與pET-28a(+) Vector連接，構建表達載體pET-28a(+) Vector 1 μ 1，酶切膠回收產物 8 μ 1，Ligation Solution Buffer 1· 5 μ 1，T4DNA 連接酶 1μ 1, dd H2O 3. 5 μ 1，總反應體系為15 μ 1，16°C過夜；連接產物轉化入Ε. coli DH5a感受 態細胞；擴增的質粒用質粒小量抽提試劑盒進行抽提；小抽質粒經PCR驗證后，送上海華大 基因公司測序。③表達將pET_28a(+)-DNA 轉化入 E. coli BL21 (DE3)感受態細胞；用 IPTG， 在搖床中以280rpm，37°C孵育4h誘導表達目的蛋白，取誘導前全菌液、誘導后全菌液加 5 X sample buffer 20 μ 1，95°C孵育 IOmin 變性，上樣，進行 SDS-PAGE 電泳(120V 電壓)，電 泳結束后考馬斯亮藍R250染色，脫色液脫色，當藍色條帶清晰后，依據蛋白分子量Marker 觀察誘導效果；按照以上誘導表達過程，誘導250ml菌液表達目的蛋白，用Pierce公司Ni2+-NTA柱經親和層析方法對表達的目的蛋白進行純化；純化后蛋白用BCA法定量。3.免疫接種經過生育能力驗證的BALB/c雌、雄小鼠用于本實驗。合成CPl作為免疫原，按第 一章實驗方法免疫雌性BALB/c小鼠，每次免疫抗原用量100 μ g。以PBS加佐劑按同樣方法 免疫小鼠作為對照。免疫結束后1周第一次合籠交配，第8周再次合籠交配。合籠1周后 分開，定期稱量體重判斷小鼠是否受孕，計數孕鼠產仔數。同時免疫一只雌性新西蘭大白兔 制備抗CPl抗體用于后續體外穿卵實驗。4. ELISA免疫結束后1周第一次合籠交配前自眼內眥靜脈取血，免疫結束后第5周及第8 周再次取血。用CPl包被96孔板，每孔1 μ g，按前述實驗方法進行，以免疫前血清及對照 組血清為對照，測定抗血清效價。以重組蛋白rmESP-Pl，rmtNASP, rmlzumo分別包被96孔 板，每孔0.5yg，l 100稀釋血清作為一抗，測定CPl中各組成表位的抗體反應。5.人和小鼠精子蛋白提取取4份正常人精液標本分離獲取精子樣品，取5只成年BALB/c雄鼠按前述方法獲 取附睪尾部精子樣品。提取蛋白實驗方法見第二章。6. Western blot 分析 以重組mlzumo，mtNASP, mESP-Pl蛋白及精子全蛋白提取物作為抗原進行 SDS-PAGE，以兔抗CPl抗體作為一抗，1 2000稀釋，按第一章實驗方法進行Western blot 分析CPl誘導產生的抗體與原蛋白的交叉反應。7.小鼠精子體外穿卵實驗配子制備同前，以1 10，1 20，1 100稀釋CPl免疫后兔抗血清預處理精子， 與去透明帶小鼠卵子共孵育，觀察精卵黏附、融合情況。(1)卵子獲取8 10周齡BALB/c雌性小鼠腹腔注射IOIU孕馬血清(PMSG)，48h后注射等劑量 的hCG，15 16h后從輸卵管壺腹部取卵。(2)精子獲取及抗體處理10 12周齡BALB/c雄性小鼠頸椎脫臼處死，取出附睪尾部，置于預熱M16 (含3 % BSA)中，用手術剪將附睪組織稍微剪切后，于37°C，5% CO2培養箱中靜置lOmin，用上游法 制備精子懸液，調精子密度為1.0X106/ml，于37°C，5% CO2培養箱中孵育lh，加入Ca2+誘 導A23187溶液，使終濃度為5ymol/L，繼續孵育20min。分別用不同稀釋濃度的anti-Pi、 anti-P2、anti-P3抗血清及免疫前血清與獲能精子共孵育30min。血清使用前用56°C， 30min滅活補體。(3)小鼠精子體外穿卵實驗將去透明帶卵細胞與不同處理的精子懸液于37°C，5% CO2培養箱中共孵育3_4h 后，吸出卵細胞，去除松散地附著在卵細胞上的精子，2%多聚甲醛固定20min，PBS洗滌后 Hoechst 33342(10yg/ml)染色，37°C，15 20min ;PBS洗滌后置載玻片壓片，激光掃描共 聚焦顯微鏡觀察。倒置相差顯微鏡下計數黏附于卵膜的精子數，熒光鏡下觀察精卵融合，判 斷精卵融合的標準為卵細胞內看到膨脹的精子頭部或原核。實驗共重復3次。抗合成肽血清及抗rUU436血清56°C 30min滅活補體，以不同稀釋度1 10，
211 20,1 100與精子共孵30min。處理后精子再與去透明帶小鼠卵子共孵育37°C，5 % C02，3-4h。去除松散地附著在卵細胞上的精子，2%多聚甲醛固定20min，PBS洗滌后Hoechst 33342(10μ g/ml)染色15 20min ；PBS洗滌后置載玻片壓片，激光掃描共聚焦顯微鏡觀 察。倒置相差顯微鏡下計數黏附于卵膜的精子數，熒光鏡下觀察精卵融合，判斷精卵融合的 標準為卵細胞內看到膨脹的精子頭部或原核。實驗共重復3次。8統計學分析體外實驗重復三次以上，各組結果以均數士標準誤(mean士SEM)表示。小鼠交配 實驗產仔數以均數士標準差(mean士SD)表示。實驗組與對照組差異采用團體t檢驗，運 用SAS6. 12軟件進行統計學分析，ρ < 0. 05認為有統計學意義。三，結果1化學合成肽CPl經DNAstar軟件優化排列BCE順序，分析其疏水性、抗原性及表面可及性均較 強，CPl經HPLC純化，純度大于90%，經質譜儀鑒定荷質比與理論值一致。2CP1免疫小鼠對生育功能影響CPl免疫結束后1周第一次合籠交配，81. 8% (9/11)雌鼠不育，而對照組均生育。 第8-9周第二次合籠交配，實驗組不育的雌鼠均恢復生育，孕鼠平均產仔數與對照組無顯 著差另U (P > 0. 05)(表 5)。表5CP1免疫BALB/c雌鼠對生育影響 3CP1抗體產生用ELISA測定CPl免疫小鼠的免疫前及免疫后血清吸光值，用CPl包被96孔板， 1 100小鼠稀釋血清作為一抗，顯示免疫后小鼠血清中有特異性抗體產生。免疫前血清和 對照組血清無免疫反應。免疫結束后第1周，第5周，第8周所取小鼠血清中IgG抗體的水 平差異無顯著性(圖28)。小鼠抗CPl抗體水平的個體之間差異不太大。血清抗體水平與 其生育狀態并不平行，第1和9號小鼠分別產5只和7只仔，其余小鼠不育，但第1和9號小 鼠血清抗體水平并非比其他小鼠明顯低。兔免疫后血清抗CPl抗體效價達1 10000(圖
29)。4CP1誘導產生的抗體與重組蛋白及精子中的原蛋白具有交叉反應性以重組蛋白rmESP-Pl, rmtNASP, rmlzumo分別包被包被96孔板，每孔0. 5 μ g， 1 100稀釋血清作為一抗。結果兔及所有小鼠免疫后血清與rmESP-Pl ,rmtNASP蛋白有免 疫反應，與rmlzumo無免疫反應。免疫前血清及對照組小鼠血清與上述蛋白無交叉反應(圖
30)。進一步以兔抗血清為一抗，通過Westernblot分析抗CPl抗體能否識別重組蛋白。結 果在rmESP-Pl ,rmtNASP蛋白目標分子量處見陽性條帶，分別為25kDa和18kDa，在rmlzumo 位置處沒有免疫反應條帶(圖31)。人和小鼠精子中tNASP的理論分子量分別為85kDa和83kDa,人和小鼠精子中ESP蛋白的理論分子量分別為38kDa和45kDa，人精子和小鼠附睪尾 成熟精子的蛋白提取物中顯示的免疫反應條帶位置與tNASP、ESP的理論分子量一致。免疫 前血清與上述蛋白無交叉反應(圖32)。說明組成CPl成分中的tNASP和ESP蛋白的BCE， 能誘導產生特異性抗體，識別精子中原蛋白tNASP和ESP。在人和小鼠天然Izumo蛋白及 rmlzumo的目標位置處沒有免疫反應條帶，說明抗體不能識別原蛋白或Izumo的BCE沒有誘 導產生特異性抗體。5CP1誘導產生的抗體抑制小鼠體外精_卵相互作用用不同濃度稀釋的兔抗CPl血清及免疫前血清處理獲能小鼠精子后，與去透明帶 的小鼠卵子孵育，觀察經上述處理后的精子黏附卵子的能力及穿卵能力的變化。與免疫前 血清相比，1 10稀釋的抗CPl血清處理精子后，每個卵子的平均結合和融合精子明顯減 少。當稀釋度增大到1 20時，小鼠精卵黏附及融合數與對照組比較有差異，但無統計學意 義(P > 0. 05)。當稀釋度增大到1 100時，對精子與卵子的黏附和融合無顯著影響(圖 33，34，35，36)。這一結果表明抗CPl抗體抑制作用呈濃度依賴性。不同濃度稀釋的抗CPl 抗體及免疫前血清處理后的精子與對照組比較，精子活力和運動參數沒有明顯的變化，也 沒有發生精子凝集現象。本實驗將經驗證的三個精子蛋白(hlzumo、tNASP、hESP)與UU的交叉反應抗原組 合起來，線性排列并在N-端連接廣譜T細胞表位構成嵌合肽，免疫雌性BALB/c小鼠后，免 疫組小鼠生育率下降81.8%。這三個交叉反應抗原已被驗證為線性BCE，具有足夠的抗原 性，合成表位肽耦聯KLH單獨免疫均能誘導機體產生特異性抗體識別原蛋白，并產生一定 的抗生育作用。將這三個BCE串聯起來構成一種新形式的疫苗，免疫避孕效果增強。CPl產 生的抗體能與重組和天然tNASP，ESP蛋白發生交叉反應。說明CPl組成成分中的BCE誘 導機體產生了特異性的抗體，重要的是該抗體能識別原天然蛋白。眾所周知，多肽疫苗誘導 產生的抗體必需能與原天然蛋白交叉反應才有功能意義。有觀點認為嵌合肽中同時包括幾 個抗原靶點能協同增強其中單個成分BCE的免疫效果。本實驗中多肽疫苗基于的三個精子 抗原都是精子特異性表達，與受精有關。ESP定位于精子頂體赤道段，參與受精過程中精卵 相互作用。tNASP是精子特異的核自身抗原，在受精過程中的作用不清楚，但免疫攻擊小鼠 tNASP蛋白后能導致免疫性不育。Izumo定位于頂體內膜，參與精卵融合，基因敲除后導致 完全不育，免疫后也可致部分不育。可以推測，本實驗中CPl免疫后，小鼠參與受精過程中 的兩個靶點tNASP和ESP受到免疫攻擊，這可能是其能有效誘導小鼠不育的原因。CPl組成成分中的mlzumo的BCE耦聯KLH單獨免疫時能產生特異性抗體，識別重 組和天然mlzumo，說明該表位抗原性強。本實驗中抗CPl抗體不能與mlzumo發生交叉反 應，一種可能原因是該BCE位于CPl的C-末端，易被機體內肽酶或蛋白酶水解；另一種可 能是CPl形成了新的構象，形成了二級結構或產生了新的表位不能識別原蛋白。其他實驗 中也報道串聯多個不同BCE時，有的BCE不能誘導產生相應抗體。Hardy等構建多表位疫 苗，包括PLF、SP56、ZPl和ZP3的免疫顯性BCE，免疫小鼠后可以致50%不育，但只誘導產 生與SP56和ZPl反應的抗體。將幾個表位肽簡單混合起來作為多價免疫原，抗原肽成分 往往不能激發機體產生免疫反應。設計構建多表位嵌合肽首要目的是以其為免疫原，嵌入 各BCE均能產生抗體。多價疫苗理想的狀況是疫苗中各組分都具有足夠的免疫原性，產生 識別原蛋白的抗體。目前尚不能準確預測多肽疫苗的免疫原性，即肽以何種構象能激起與原蛋白交叉反應的抗體。將多個不同表位組合起來構建線性多肽疫苗，不同表位之間嘗試 用GGG或GPSL序列分隔開，可以提高各個表位的柔韌性以利于其誘導免疫反應。最好以軟 件EpiSort優化表位間隔，以提高多肽的免疫原性。另有報道分支肽能提高免疫原性。各 BCE抗體的產生可能與BCE和TCE之間的位置有關，因為一對BCE和TCE組合的化學合成嵌 合肽研究表明，BCE安排在TCE的C-端產生抗BCE抗體，反之產生抗TCE抗體。當然，若組 合更多BCE和TCE，情況肯定復雜得多。另外，嵌入表位能否誘導抗體產生可能還與插入的 BCE肽段長短有關。由于目前化學合成多肽受序列長度限制，因此設計嵌合肽時，使之適合 生物系統表達，也是生物合成多表位多肽疫苗研究的新課題。我們也正在嘗試不同方法增 強嵌合肽的免疫原性，如變動三個BCE的位置、增加表位拷貝數、利用原核表達系統獲得多 肽，以進一步研究其各表位抗體產生情況及免疫避孕效果。與其他作者報道一樣，嵌合肽誘導產生的不育是可逆的，在最后一次免疫結束后 第8-9周再次合籠交配，所有誘導不育的雌鼠均恢復生育能力，產仔數與對照組差別無顯 著性意義。檢測免疫結束后第1周、第5周及第8周小鼠血清，IgG抗體效價并無顯著下 降。推測實驗小鼠組生育功能恢復，可能是由于生殖道局部免疫反應降低所致，血清抗體水 平與小鼠生育狀況無相關性。免疫后生殖道內的抗體水平和/或T細胞反應狀況可能與生 育狀態密切相關，但準確檢測小鼠子宮、輸卵管內的抗體水平有難度。因此若要確切評價一 個免疫避孕疫苗的避孕效果時，首先需要解決的一個問題是準確評價其在生殖道局部產生 的免疫反應。目前可以在免疫后靈長類動物輸卵管液內檢測到特異性IgA和IgG抗體。由于多肽疫苗普遍免疫原性弱，需要更好的載體與佐劑來提高免疫原性，增加免 疫反應的深度和廣度。不同來源的廣譜TCE被嘗試用于構建多肽疫苗，因此還需要可靠而 簡便的評價T細胞反應的方法。在動物實驗中常用的是福氏佐劑，本實驗中可見被免疫動 物局部硬結、脫毛明顯，說明局部副作用大，不可能適合于人類使用。如用于人體實驗除了 要設計特異的多肽免疫原，尚需探索更高效的疫苗接種方式。如將多肽抗原以生物可降解 的微粒包裹后接種，設計脂類分子內佐劑等提高免疫原性。本實驗首次研究了由精子蛋白ESP、Izumo和tNASP與UU的交叉反應抗原組成的 嵌合肽，免疫小鼠后可以產生較強的可逆性的抗生育效果，是探索新的抗精子多價免疫節 育抗原的有益嘗試。<110>上海交通大學醫學院<120> 一種免疫避孕的合成肽和嵌合肽及其應用<160>7<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>50<212>PRT<213> 智人(Homo sapiens)<400>1Asn Cys Ala Tyr Lys Thr Thr Gln15Gly Phe Thr Pro Glu lie Gly Lys
Ala Asn Lys Gly Gly Gly Thr Gly
1015
Gly Gly Gly Thr Ser lie Glu Arg
24
202530
Leu Thr Gh Thr Lys Gly Gly Gly Lys Gly Lys Gh fla Thr Leu Thr
354045
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50
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<211>5
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(400>2
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l5
<2 10)3
<211>5
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1510<210>7<211>16<212>PRT<213> 智人(Homo sapiens)<400>7Lys Gly Lys Glu Ala Thr Leu Thr Lys Pro Met Val Gly Pro Glu Asp151015
2權利要求
一種免疫避孕的嵌合肽，其特征在于其氨基酸序列如序列表中SEQID1所示。
2.一種免疫避孕的合成肽hESP1(13_1(17，其特征在于其氨基酸序列如序列表中SEQ ID 2 所示。
3.一種免疫避孕的合成肽hIZUmo216_22(1，其特征在于其氨基酸序列如序列表中SEQ ID :3所示。
4.根據權利要求2所述的免疫避孕的合成肽hESP1(l3_112，其特征在于氨基酸序列如序 列表中SEQID :4所示。
5.根據權利要求2所述的免疫避孕的合成肽hESP98_112，其特征在于氨基酸序列如序 列表中SEQID :5所示。
6.根據權利要求3所述的免疫避孕的合成肽hIZumo212_221，其特征在于氨基酸序列如 序列表中SEQ ID :6所示。
7.根據權利要求3所述的免疫避孕的合成肽hIZumo212_227，其特征在于氨基酸序列如 序列表中SEQ ID :7所示。
8.根據權利要求1所述的免疫避孕的嵌合肽用途，其特征在于用于制備避孕疫苗。
9.根據權利要求2或4或5所述的免疫避孕的合成肽hESP1(l3_1(l7用途，其特征在于用 于制備避孕疫苗。
10.根據權利要求3或6或7所述的免疫避孕的合成肽hIZUmo216_22(l用途，其特征在于 用于制備避孕疫苗。全文摘要
本發明涉及一種免疫避孕的合成肽，所述的免疫避孕的嵌合肽，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID1所示。免疫避孕的合成肽hESP103-107，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID2所示。免疫避孕的合成肽hIzumo216-220，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID3所示。本發明還提供了嵌合肽、合成肽hESP103-107或合成肽hIzumo216-220作為免疫避孕疫苗，觀察了它們在避孕中的應用。本發明首次研究了由精子蛋白hESP、hIzumo和tNASP與UU的交叉反應抗原組成的嵌合肽，免疫小鼠后可以產生較強的可逆性的抗生育效果。
文檔編號C07K19/00GK101906163SQ20091005259
公開日2010年12月8日 申請日期2009年6月5日 優先權日2009年6月5日
發明者呂正梅, 徐晨, 王旻 申請人:上海交通大學醫學院