與免疫抗體相結合的多肽及其應用的制作方法

專利名稱：與免疫抗體相結合的多肽及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及與免疫抗體結合的多肽，尤其涉及與類風濕關節炎免疫抗體相結合的多肽，更具體的是涉及一種有三個精氨酸被修飾的與類風濕關節炎自身免疫抗體相結合的 多肽。
背景技術：
臨床上自身免疫疾病主要有系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎、干燥綜合征、皮肌 炎、多發性肌炎、系統(多發)性硬化癥、硬皮病等，這些疾病曾被命名為“結締組織病”，后 來國外和國內均將它們歸為風濕性疾病。類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種較常見的以慢性多關節炎癥為 主要表現的系統性自身免疫疾病，其病程長，多反復，且會造成組織不可逆的損傷，而給患 者造成很大痛苦。該病的發病率在世界范圍內為0.5-1%，中國的發病率約為0.36%。患 者發病年齡多在20 50歲，女性多于男性，男女之比為1 3。最近流行病學統計，類風濕 關節炎有逐年增加的趨勢，其突出的早期臨床表現為對稱性關節紅腫熱痛、常見四肢小關 節、指間近端關節腫脹、掌指、腕、肘和踝等關節腫痛及活動困難、晨間關節僵硬、午后逐漸 減輕、關節外癥狀約有20%患者可出現皮下結節；長久不愈的晚期癥狀則有不同程度的關 節畸形和強直，以及關節功能喪失等現象，還會損傷臟器和多組織器官，造成骨頭缺血性壞 死，對人體消耗大，致殘率高。類風濕關節炎的病因至今尚不十分清楚，且早期臨床表現也不典型。在國 內外臨床實踐中，該疾病的常用診斷工具是美國風濕學學會(American College of Rheumatology, ACR)在 1987 年制定的類風濕分類標準(Arthritis Rheum 1988，31， 315-24)，該標準更依賴于類風濕關節炎所表現出的臨床病癥。但是，在該疾病早期，這些臨 床指標通常是不易操作的。因此，目前普遍認為這一標準不能較好適應于早期類風濕關節 炎的診斷(Arthritis Rheum 2001，44，2485-91 ；Neth J Med 2002，60，383-8)。而目前使用 的治療類風濕關節炎的方法主要是采用消炎方法，這種方法雖能使得關節腫脹(swelling) 和侵蝕(erosive)的程度得以減慢，卻無法使疾病得到治愈。當前人們共同的觀點認為， 在該疾病早期采用多種方法治療能得到最佳的治療效果(Autoimmunity Reviews 2006，6， 37-41)。由此，具有高專一性(Specificity)和高靈敏度(Sensitivity)的血清學檢測標 記對于類風濕關節炎在骨關節遭受損傷之前的早期診斷就顯得尤為必要(Clin Applied Immunol Rev 2004，4，239—62)。研究發現一些自身免疫抗體雖然與類風濕關節炎疾病相聯系，如抗 calpastatin 抗體(Proc Natl Acad Sci USA 1995，92，7267-71)、抗中性粒細胞胞質抗體 (anti-neutrophil cytoplasmic antibodies, ANCA)(IntArch Allergy Immunol 1996, 109，201-6)、核抗原抗體(anti-nuclearantigens，ANA) (Scand J Rheumatol 1986,15， 185-92)、抗 II 型膠原抗體(anti-collagen type II) (J Immunol Methods 2001,247, 191-203)和抗葡萄糖 6 磷酸異構酶(anti-glucose-6-phosphate isomerase, anti-GPI)(Nat Immunol2001, 2, 746-53)等也都能在患有其它自身免疫疾病的病人中，甚至于在健康個體中檢測出來(Clin Applied Immunol Rev 2004，4，239-62)。其中的某些抗體雖然能應 用于風濕性疾病的識別，而且篩選這些抗體也有助于疾病監測和預測，但由于其對類風濕 關節炎缺乏專一性，這些抗體中的絕大多數都很少應用于類風濕關節炎早期診斷(Clinica Chimica Acta 2004，350，17—34)。對于類風濕關節炎早期診斷的理想標記(Marker)應當至少滿足4個標準(1)高 靈敏度，能檢測的病人達到高百分比；(2)高專一性，盡可能地限制錯誤陽性結果的發生； (3)能適用于早期診斷；(4)能預見到某些病人會發展成侵蝕性疾病(erosive disease) (AutoimmunityReviews 2006，6，37-41 ；MEDICINE 2006，34，441-4)。類風濕因子(rheumatoid factor，RF)抗體作為血清學檢測方法應用于ACR標 準中，被公認為是IgG分子上Fc結構域的直接抗體。雖然其檢測靈敏度范圍可以達到 60-80%，但其對于類風濕關節炎的專一性也比較一般，為60%。此外，RF同樣可以在其 它患有自身免疫疾病的病人中、患有感染性疾病的病人中以及3-5 %健康人群中(其中 10-30% 的老年人)檢測到(Ann Rheum Dis 2003，62，261-3)。抗BiP(p68)抗體，抗Sa抗體和抗環狀胍氨酸化蛋白抗體(APF、AKA、抗fiIaggrin 和抗CCP)則對類風濕關節炎有更高的專一性。64%的類風濕關節炎病人能產生直接針對 BiP的抗體，還有報道稱其對該疾病具有高度的專一性，但目前沒有數據支持BiP在預測類 風濕關節炎方面具有作用，而且這些報道的BiP抗體還需要等待進一步通過獨立的臨床研 究加以確認(Clinica Chimica Acta 2004，350，17-34)。抗Sa抗體是源自于人脾臟和胎盤 的提取物當中，分子量為50kDa的蛋白(Internal Medicine 2005，44，1122-6)。另有研究 揭示Sa抗原對于類風濕關節炎的專一性可以高達92-99 %，但其靈敏度則顯得一般，僅為 30-40% (J Rheumatol 1994，21，1027-33 ;J Rheumatol 1999，26，7-13)。抗核周因子(antiperinuclear factor, APF)首次披露于1964年。經研究這些自 身免疫抗體對類風濕關節炎具有專一性，并能通過以人頰粘膜細胞為抗原底物的免疫熒光 法間接測得(Ann Rheum Dis 1964，23，302-5)。1979年研究者描述了一種類風濕關節炎專一性角質蛋白抗體，它能直接抑制 角質層上皮細胞角質化，并將這類抗體的名稱暫定為抗角質蛋白抗體(anti-keratin andtibody，AKA) (BMJ 1979,2,97-9)。之后的研究證實，雖然AKA和APF的發現是互相 獨立的，但是兩者所直接對應的抗原是一致的(J.Clin. Invest 1995，95，2672-9)。許多 研究進一步表明AKA和APF具有許多共同的特性，它們均對于RA患者表現出高度的專一 性(Internal Medicine 2005，44，1122-6)。Filaggrin(filamentaggregating protein) 是一種互相交聯的角蛋白絲狀體，作用是形成非常堅固的細胞骨架結構，其也是AKA和 APF 的常見抗原(Clin AppliedImmunol Rev 2004，4，239-62)。其中，APF 的目標抗原為 profilaggrin，而 AKA 的抗原為 filaggrin(J Clin Invest 1995，95，2672-9)。雖然AKA和APF對于類風濕關節炎具有專一性，但其缺陷也很突出。這兩種抗體 的檢測靈敏度嚴重依賴于filaggrin的純化方法。實踐中，由于難以分離得到純的且胍基 含量具有可重復性的抗原，再加上其檢測手段不簡便，以及熒光免疫檢測過程需要耗費較 大的工作量，從而使得實驗室間難以形成標準化，導致AKA和APF沒有成為類風濕關節炎檢 測的主流方法(Clin Applied Immunol Rev 2004，4，239-62)。
基于filaggrin和profiIaggrin是AKA和APF抗體靶點的知識，人們合成了 含有瓜氨酸的多肽以檢測類風濕關節炎血清中AKA和APF抗體的活性。由于瓜氨酸不 是基本氨基酸而無法在蛋白質翻譯中加入，因此通常的方法是通過肽精氨酸脫亞胺酶 (peptidylargnine deiminine, PAD, EC3. 5. 3. 15)催化精氨酸殘基脫氨基得到。根據這 些事實，一些從filaggrin序列中衍生出來的精氨酸側鏈經修飾的，尤其是含有瓜氨酸的 多肽被合成出來，并用于類風濕關節炎抗體的體外檢測(US6，858，438)。在用酶聯免疫吸 附(Enzyme-Linked immunosorbent Assay, ELISA)方法檢測實驗中，這一方法合成的含有 瓜氨酸直線性多肽能從類風濕關節炎患者血清中檢測出抗瓜氨酸肽抗體，在保持高專一性 (大于90%)的情況下，還大大提高了檢測的靈敏度(達到63%)。實驗還證明，只有含 瓜氨酸的多肽才能實現該反應，若將多肽中的瓜氨酸用其它氨基酸代替則完全沒有反應發 生。這些結果表明，瓜氨酸部分是決定能被AKA和APF抗體識別的抗原決定因子(J Clin Invest 1998，101，273-81)。其它研究者發現將含有瓜氨酸的直線性多肽通過二硫鍵(S-S鍵)形成環形結 構的方式能模擬類似轉角結構，從而模仿最初抗原決定簇的轉角結構，并可增 加多肽-抗體的親和力(FASEB J 1995,9,37-42 ；Mol Immunol 1985，22，1255-64)。由 此，一種環狀肽被人工合成出來，其將filaggrin主要表位上的兩個絲氨酸換成半胱 氨酸后，再由二硫鍵環化形成，即第一代環瓜氨酸肽(the first generation cyclic citrullinatedpeptide, CCP1) (Internal Medicine 2005，44，1122-6)。研究者將一條由 19個氨基酸殘基組成的瓜氨酸肽中兩個絲氨酸替換為半胱氨酸形成與β -轉角具有相似 結構的二硫鍵，得到人工合成CCP，并將CCPl與直線肽的檢測結果作了比較。結果顯示， 采用CCPl為抗原的多肽用ELISA法檢測RA患者的抗CCP抗體，靈敏度較用直線性瓜氨酸 肽為抗原有顯著提高，分別為68%和49%，二者專一性相似(Arthritis Rheum 2000,43, 155-63)。穆榮等人在266例RA患者和186例對照者血清中檢測RF和AKA抗體、APF和抗 CCP抗體的方式，評估了抗聚絲蛋白抗體群(anti-filaggrin antibodies,AFAs)與RF聯合 檢測的意義。由于AKA和APF的敏感性太低，臨床上以RF和抗CCP抗體的聯合測定更為實 用(北京大學學報(醫學版)2005，37，894)。研究還發現，通過檢測抗CCP抗體還能作為類 風濕關節炎早期病人一項重要指標，為這類人群的早期防治提供參考(J India Rheumatol Assoc 2004，12，143-6)，其還能預測侵蝕性疾病(Clin Applied Immunol Rev 2004,4, 239-62)。在含有不同瓜氨酸多肽的反應模式中，類風濕關節炎血清檢測表現出巨大的可變性。類風濕關節炎患者的血清/血漿中除了 filaggrin精氨酸殘基被瓜氨酸化外，Sa抗原、 膠原蛋白(I和II型)、組蛋白、髓磷脂堿蛋白、纖維連接蛋白等也出現瓜氨酸化，并產生抗 CCP抗體。深入研究表明，瓜氨酸化的自身抗原中并非所有精氨酸脫氨基轉化為瓜氨酸；已 瓜氨酸化的瓜氨酸也不完全參與形成抗原表位，即產生抗CCP抗體。綜上，抗瓜氨酸抗體 的產生與瓜氨酸密切相關，并且瓜氨酸的側翼序列對抗瓜氨酸抗體的產生起重要作用，這 一事實暗示著瓜氨酸殘基的周邊氨基酸對于抗原表位(antigen episode)具有重要作用， 以及抗瓜氨酸化蛋白(如AKA和APF抗體)活性是多克隆反應(J Clin Invest 1998， 101，273-81)。基于filaggrin的屬性，它被認為是模擬瓜氨酸抗原表位的天然庫藏(Clin Applied Immunol Rev 2004，4，239—62)。
第二代CCP(CCP2)檢測方法產生于2002年，通過將含有瓜氨酸的多肽庫與類風濕關節炎血清篩選得到與filaggrin無關的第二代CCP，其具有更有利于抗體檢測的表位 (Report on the 5th Dresden symposium onautoantibodies. Lengerich, Germany :Pabst Science Publishers ；2000. p. 140-5)。將CCPl和CCP2經同一組病人測試后表明，CCP2不僅 保持了較高專一性(96% )，而且其分析靈敏度也有顯著的提高(Arm. Rheum. Dis. 2005，64， 1510-2)。許多研究者在最近5年的研究證明，抗含瓜氨酸多肽的測試的靈敏度具有較高的 可變性，范圍在 40% -94% (Clin. ExpRheumatol. 2005, 23 (Suppl39), 569-76 ；Ann. Rheum. Dis. 2006，65，845-51)。CCP2在類風濕關節炎自身免疫抗體體外檢測中得到應用說明了在 該領域的檢測抗原的篩選并不需要僅僅依賴filaggrin，也說明與filaggrin不同的結合 表位能更有利于體外檢測。Bizzaro N 等人(Clin Chem 2007，53，1527-33)和 Lutteri L 等人(Clinica Chimica Acta 2007，386，76-81)分別針對現在市場上使用的第二代和第三代CCP試劑盒 (Kit)進行了比較，結果發現，伊諾瓦診斷(InovaDiagnostics)公司開發的三種檢測方法 中，其CCP3試劑盒與使用CCP2為抗原的方法相比僅僅略有改善，各自的靈敏度分別為67 % 和64%。相反地，用于抗IgG的CCP3. 0與即能檢測IgG又能檢測IgA的CCP3. 1的檢測方 法相比后發現，兩者竟然沒有絲毫差別。可見，同時檢測IgG和IgA抗體的方法并沒有象看 上去那樣有顯著改進。他們的結論是由于測試的診斷試劑盒靈敏度可能與胍基化精氨酸殘 基的位置和數量有關，而專一性則可能受到蛋白質或雜多肽序列的影響，因此，對此二者而 言，抗原的種類顯得更為重要。兩者綜合考慮，實驗數據表明抗原的制備是決定測定方法優 劣的最重要的可變因素。Lutteri L等人(Clinica Chimica Acta 2007，386，76-81)的研究還發現了抗CCP 的另一個價值，他們指出，IgM-RF是最靈敏的標記，能在77. 9%的類風濕關節炎患者中發 現。必須注意的是，作為ACR標準中的RF，其類風濕關節炎診斷中靈敏度不能直接與那些沒 有包括在診斷標準中的其它方法相比較。IgM-RF被認為在疾病專一性方面略有欠缺。使用 IgM-RF檢測類風濕關節炎患者，其中有13-19%的人為RF陰性，與之相比，當這些患者使用 抗CCP方法檢測時均為陽性。類風濕關節炎的遺傳因素會影響瓜氨酸化蛋白的出現和產生，也會影響針對 這些修飾蛋白的抗體產物(Clinica Chimica Acta 2004，350，17-34)。一系列相關研 究表明，類風濕關節炎與某些HLA-DR等位基因有密切聯系，尤其是HLA-DRB1*0401和 HLA-DRB 1*0404 (Cell 1996，85，307-10)。與相應的含有精氨酸的多肽相比，將多肽瓜氨 酸化就能與HLA-DRB 1*0401和HLA_DRB1*0404兩種“袋形”抗原更好地結合(J India Rheumatol Assoc 2004,12,143-6) 在不同地區的人群中，這些等位基因也略有不同。 DRB1*0401主要出現在北歐和北美地區的人群中，有證據表明該基因與類風濕關節炎 所導致的“特大關節”表征(extraarticular manifestations)有聯系，在 DRB1*0401/ DRB1*0404 雜合基因型中尤為突出。DRB1*0403、DRB1*0406 和 DRB1*0407 與 DRB1*0401、 *0404或*0101基因組合后會增加類風濕關節炎病情的發展可能。DRB1*0404與DRB1*0408 只要存在于白色人種中。DRB1*0405很少在北歐人群中，但在亞洲和環地中海沿岸國家 的人群中極其普遍。DRB1*0101主要存在于北歐和北美人群中。美洲印第安人群中則為 DRB1*1402和*1406(Hum Immuno 2000，61，1254-1261)。雖然這些與類風濕關節炎相關的基因在各地區人群中各有不同，但研究發現在DRBl的第三高度可變區(HV3)具有共享表位 (shared epitope, SE)，在 70-74 位氨基酸殘基都為 QKRAA、QRRAA 或RRRAA (ClinicaChimica Acta 2004，350，17-34)。將一群有幾個共享表位基因型的類風濕關節炎患者與具有抗CCP2抗體的患 者比較研究表明，一種共享表位等位基因與抗CCP2抗體的產生具有密切的內在聯系 (Arthritis Rheum 2000,50,2113-21 ；Arthritis ResTher 2004，6，R303-8)。經證實，這一 關聯是由于MHC分子共享表位β鏈的70-74位氨基酸殘基(Q/R，K/R，R，A，A)形成第4個 錨定袋(P4)，其與電中性或負電荷氨基酸具有高度親和性(J Immuno 2003，171，538-541)。 當帶正電荷精氨酸在PAD酶作用下轉換成電中性的瓜氨酸后，得到的翻譯后修飾蛋白/多 肽親和力遠遠大于精氨酸與P4的親和力，并能夠激活⑶4+T細胞，這些“瓜氨酸特異T細 胞”可有助于抗瓜氨酸蛋白(多肽)抗體的產生(J Immuno 2003，171，538-541 ；Arthritis Rheuml987,30,1205-13 ；Rheum Dis Clin North Am 1992,18,741-59 ；ArthritisRheum 2005，52，1063-68)。這些結果表明具有共享表位的DBRl等位基因能激活類風濕關節炎患 者自身免疫反應。綜合目前的研究結果，抗CCP抗體對RA具有較高的專一性，能將RA與其它與RA相 似的疾病相區分，這類抗體存在于絕大多數的病人體內，在疾病的早期就能檢測到，有助于 對疾病的預測，能通過簡單的方式加以檢測(J India Rheumatol Assoc 2004，12，143-6)。

發明內容
本發明的一個目的在于提供一種與免疫抗體相結合的多肽。本發明的另一個目的在于提供一種與類風濕關節炎自身免疫抗體相結合的多肽。本發明的又一個目的在于提供一種既能與類風濕關節炎自身免疫抗體相結合，同 時還能與HLA-DR具有高親和力的多肽。本發明的再一個目的在于提供一種用于類風濕關節炎自身免疫抗體體外檢測的 多肽。本發明所述的與類風濕關節炎免疫抗體相結合的多肽，其包含有如下氨基酸序 列His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal0-Xa alI-Cys-Gly,其中，Xaal為 His 或 Ala ；Xaa2 為 Gln 或 Arg ；Xaa3 為 Arg 或 Gln ；Xaa4 為 Phe 或 Met ；Xaa5 為 Arg ；Xaa6 為 Arg ；Xaa7 為 Arg ；Xaa8 為 Ser 或 Arg ；Xaa9 為 Arg 或 Leu ；XaalO 為Ala或Ile ；Xaall為Ala或Arg，其中有三個精氨酸被修飾。另一種與類風濕關節炎免疫抗體相結合的多肽，其包含有如下氨基酸序列His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal0-Xa alI-Cys-Gly,其中，Xaal為 His 或 Ala ；Xaa2 為 Gln 或 Arg ；Xaa3 為 Arg 或 Gln ；Xaa4 為 Phe 或 Met ；Xaa5 為修飾的 Arg ；Xaa6 為修飾的 Arg ；Xaa7 為修飾的 Arg ；Xaa8 為 Ser 或 Arg ；Xaa9 為 Arg 或 Leu ；XaalO 為 Ala 或 Ile ；Xaall 為 Ala 或 Arg0另一種與類風濕關節炎免疫抗體相結合的多肽，其包含有如下氨基酸序列
His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Xaal-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Cys-Gly,其中，Xaal為Arg或Gln ；Xaa2為Phe或Met ；Xaa3為修飾的Arg ；Xaa4為修飾的Arg ；Xaa5 為修飾的 Arg ；Xaa6 為 Ser 或 Arg ；Xaa7 為 Arg 或 Leu ；Xaa8 為 Ala 或 Ile ；Xaa9 為 Ala 或 Arg0另一種與類風濕關節炎免疫抗體相結合的多肽，其包含有如下氨基酸序列His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Xaal-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Ala-Ala-Cy s-Gly,其中，Xaal為Arg或Gln ；Xaa2為Phe或Met ；Xaa3為修飾的Arg ；Xaa4為修飾的 Arg ；Xaa5 為修飾的 Arg ；Xaa6 為 Ser 或 Arg ；Xaa7 為 Arg 或 Leu0另一種與類風濕關節炎免疫抗體相結合的多肽，其包含有如下氨基酸序列His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Arg-Phe-Xaal-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Ala-Ala-Cys-Gly,其中，Xaal為修飾的Arg ；Xaa2為修飾的Arg ；Xaa3為修飾的Arg ；Xaa4為Ser或 Arg ； Xaa5 為 Arg 或 Leu0上述與類風濕關節炎免疫抗體相結合的多肽，所述修飾的Arg為側鏈修飾的Arg， 其側鏈具有通式(I)所述的結構。Gi式 I<formula>formula see original document page 8</formula>其中Gl 為 0、NH 或 CH2 ；G2 為 NH2, CH3> NHCH3 或 N(CH3) 2 ；G3 為 0、NH、NHCH3> NHCH3 ； η為2、3或4 ；其中當Gl為NH，G2為NH2時，G3不為ΝΗ。另一種與類風濕關節炎免疫抗體相結合的多肽，其包含有如下氨基酸序列His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal0-Xa alI-Cys-Gly,其中，Xaal為 His 或 Ala ；Xaa2 為 Gln 或 Arg ；Xaa3 為 Arg 或 Gln ；Xaa4 為 Phe 或 Met ；Xaa5 為修飾的 Arg ；Xaa6 為修飾的 Arg ；Xaa7 為修飾的 Arg ；Xaa8 為 Ser 或 Arg ；Xaa9 為 Arg 或 Leu ；XaalO 為 Ala 或 Ile ；Xaall 為 Ala 或 Arg0所述的修飾的Arg為瓜氨酸(Cit)，即當Gl為NH，G2為NH2, G3為0，及η為3。另一種與類風濕關節炎免疫抗體相結合的多肽，其包含有如下氨基酸序列His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Xaal-Xaa2-Cit-Cit-Cit-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Cys -Gly,其中，Xaal為 Arg 或 Gln ；Xaa2 為 Phe 或 Met ；Xaa3 為 Ser 或 Arg ；Xaa4 為 Arg 或 Leu ；Xaa5 為 Ala 或 Ile ；Xaa6 為 Ala 或 Arg0另一種與類風濕關節炎免疫抗體相結合的多肽，其包含有如下氨基酸序列His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Xaal-Xaa2-Cit-Cit-Cit-Xaa3-Xaa4-Ala-Ala-Cys-GIy，其中，Xaal為 Arg 或 Gln ；Xaa2 為 Phe 或 Met ；Xaa3 為 Ser 或 Arg ；Xaa4 為 Arg 或 Leu0上述與類風濕關節炎免疫抗體相結合的多肽能與自身免疫抗體相結合，形成抗原_抗體復合物(Complex)。上述多肽能與HLA-DR分子具有高親和力，與HLA-DR相結合形成HLA-DR-多肽復 合物。多肽通過序列中不相鄰的兩個Cys之間形成二硫鍵。所形成的二硫鍵能使該多肽 具有環狀結構并能模擬β “轉角結構，使得該多肽不僅具有與HLA-DR分子的高親和力，與 HLA-DR相結合形成HLA-DR-多肽復合物；還能與抗CCP抗體高效結合，形成抗原-抗體復 合物。另一種與類風濕關節炎免疫抗體相結合的多肽，其包含有如下氨基酸序列，該序 列中第三位的Cys與第十六位的Cys之間形成二硫鍵His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal0-Xa alI-Cys-Gly,其中，Xaal為 His 或 Ala ；Xaa2 為 Gln 或 Arg ；Xaa3 為 Arg 或 Gln ；Xaa4 為 Phe 或 Met ；Xaa5 為 Cit ；Xaa6 為 Cit ；Xaa7 為 Cit ；Xaa8 為 Ser Arg ；Xaa9 為 Arg Leu ；XaalO 為 Ala 或 Ile ；Xaall 為 Ala 或 Arg0另一種與類風濕關節炎免疫抗體相結合的多肽，其包含有如下氨基酸序列，該序 列中第三位的Cys與第十六位的Cys之間形成二硫鍵His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Xaal-Xaa2-Cit-Cit-Cit-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Cys -Gly,其中，Xaal為 Arg 或 Gln ；Xaa2 為 Phe 或 Met ；Xaa3 為 Ser 或 Arg ；Xaa4 為 Arg 或 Leu ；Xaa5 為 Ala 或 Ile ；Xaa6 為 Ala 或 Arg0另一種與類風濕關節炎免疫抗體相結合的多肽，其包含有如下氨基酸序列，該序 列中第三位的Cys與第十六位的Cys之間形成二硫鍵His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Xaal-Xaa2-Cit-Cit-Cit-Xaa3-Xaa4-Ala-Ala-Cys-G ly，其中，Xaal為 Arg 或 Gln ；Xaa2 為 Phe 或 Met ；Xaa3 為 Ser 或 Arg ；Xaa4 為 Arg 或 Leu0另一種與類風濕關節炎免疫抗體相結合的多肽，其包含的氨基酸序列為His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Arg-Phe-Cit-Cit-Cit-Ser-Arg-Ala-Ala-Cys-Gly (SEQ ID No :1)，其第 三位Cys與第十六位Cys之間形成二硫鍵。上述與類風濕關節炎免疫抗體相結合的多肽，其包含的氨基酸序列如SEQ ID No 2-178所示。其序列第三位Cys與第十六位Cys之間形成二硫鍵。上述多肽的制備方法為多肽的化學方法直接合成，或者先由化學合成或基因工程 方法合成，即將從表達載體(J.薩姆布魯克、E. F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯，分子克隆[M]，科 學出版社，1994)中分離純化得到的的多肽再經過修飾精氨酸側鏈的步驟得到。上述多肽的一種制備方法為通過化學方法直接合成。
上述多肽的另一種制備方法為先通過化學方法合成后，再由PAD酶修飾精氨酸側鏈得到。本發明所述的多肽能與類風濕關節炎自身免疫抗體相結合。一種與類風濕關節炎自身免疫抗體相結合的專一性大于90%的多肽，其氨基酸系列如下:His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal0-Xaa 1I-Cys-Gly,其中，Xaal為 His 或 Ala ；Xaa2 為 Gln 或 Arg ；Xaa3 為 Arg 或 Gln ；Xaa4 為 Phe 或 Met ；Xaa5 為 Cit ；Xaa6 為 Cit ；Xaa7 為 Cit ；Xaa8 為 Ser Arg ；Xaa9 為 Arg Leu ；XaalO 為 Ala 或 Ile ；Xaall 為 Ala 或 Arg0另一種與類風濕關節炎自身免疫抗體相結合的專一性大于95%的多肽，其氨基酸 系列如下:His-Gln-Cys-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal0-X aalI-Cys-Gly,其中，Xaal為 His 或 Ala ；Xaa2 為 Gln 或 Arg ；Xaa3 為 Arg 或 Gln ；Xaa4 為 Phe 或 Met ；Xaa5 為 Cit ；Xaa6 為 Cit ；Xaa7 為 Cit ；Xaa8 為 Ser Arg ；Xaa9 為 Arg Leu ；XaalO 為Ala或Ile ；Xaall為Ala或Arg，該序列中第三位的Cys與第十六位的Cys之間形成二 硫鍵。另一種與類風濕關節炎自身免疫抗體相結合的專一性大于95%的多肽，其氨基酸 系列如下His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Arg-Phe-Cit-Cit-Cit-Ser-Arg-Ala-Ala-Cys-Gly, 其第三位Cys與第十六位Cys之間形成二硫鍵。另一種與類風濕關節炎自身免疫抗體相結合的專一性大于95%的多肽，其氨基酸 系列如SEQ ID No 2-178所示，多肽的第三位Cys與第十六位Cys之間形成二硫鍵。—種與類風濕關節炎自身免疫抗體檢測靈敏度大于70%的多肽，其氨基酸系列如 T" :His-Gln-CyS-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal0-XaalI-C ys-Gly,其中，Xaal為 His 或 Ala ；Xaa2 為 Gln 或 Arg ；Xaa3 為 Arg 或 Gln ；Xaa4 為 Phe 或 Met ；Xaa5 為 Cit ；Xaa6 為 Cit ；Xaa7 為 Cit ；Xaa8 為 Ser Arg ；Xaa9 為 Arg Leu ；XaalO 為 Ala 或 Ile ；Xaall 為 Ala 或 Arg0另一種與類風濕關節炎自身免疫抗體測靈敏度大于75%的多肽，其氨基酸系列如 T" :His-Gln-CyS-Xaal-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal0-XaalI-C ys-Gly,其中，Xaal為 His 或 Ala ；Xaa2 為 Gln 或 Arg ；Xaa3 為 Arg 或 Gln ；Xaa4 為 Phe 或 Met ；Xaa5 為 Cit ；Xaa6 為 Cit ；Xaa7 為 Cit ；Xaa8 為 Ser Arg ；Xaa9 為 Arg Leu ；XaalO 為Ala或Ile ；Xaall為Ala或Arg，該序列中第三位的Cys與第十六位的Cys之間形成二 硫鍵。另一種與類風濕關節炎自身免疫抗體測靈敏度大于75%的多肽，其氨基酸系列如 下His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Arg-Phe-Cit-Cit-Cit-Ser-Arg-Ala-Ala-Cys-Gly, 其第三位Cys與第十六位Cys之間形成二硫鍵。
另一種與類風濕關節炎自身免疫抗體測靈敏度大于75%的多肽，其氨基酸系列如 SEQ ID No 2-178所示，多肽的第三位Cys與第十六位Cys之間形成二硫鍵。上述多肽對HLA-DR具有高親和力，與HLA-DR相結合形成HLA-DR-多肽復合物。上述多肽還包括在其氨基酸序列骨架上進行化學修飾或生物修飾后所得的產 物。用于修飾的分子選自于高分子聚合物或有機小分子。其修飾修飾方式包括聚乙二醇化 (PEGylation)(Adv. Drug deliv. Rev. 28,275-299 ；Adv. Drug deliv. Rev. 54,453-609 ；Adv. Drug deliv. Rev. 60，1-88)、酰基化(Acylation) (J. Pharma. Sci. 86，768—773 ;J. Pharma. Sci.86，1365-1368)、糖基化(Glycosylation)(J. Pharma. Sci. 87，326-332 ；Adv. Drug deliv. Rev. 6，103-131 ；Adv. Drug deliv. Rev. 13，251-267)和有機小分子修飾等。用以修飾多肽的分子與多肽氨基酸骨架之間通常以酰胺鍵(amidebond)或尿鍵 (urine bond)連接。所述多肽經過上述修飾能顯著增加多肽的化學穩定性(如抗酶解) 和物理穩定性(如抗凝聚(aggregation)、抗熱變性和抗機械力等)，還能增強與抗體的免 疫應答。
高分子聚合物是指分子量大于2，000Da的化合物，分子間由結構單位 (structural unit)或單體經由共價鍵相互連接在一起。所述聚合物具體選自于聚乙二醇、 聚氨基酸、聚核苷酸、聚乳酸、聚賴氨酸、聚亞胺和10個以上單糖通過糖苷鍵形成的多聚糖 (polysaccharide)，如淀粉及其水解產物、纖維素、甲殼素或葡聚糖。有機小分子具體選自于各類氨基酸、各類單糖、各類維生素(Vitamin)、由兩個單 糖單元通過糖苷鍵形成的二糖(disaccharide)(如蔗糖、乳糖或麥芽糖)、由2_10單糖通 過糖苷鍵形成的寡聚糖(oligosaccharide)(如低聚異麥芽糖、低聚木糖或低聚半乳糖) 和分子量在20-2，OOODa的聚合物。聚乙二醇化修飾所用的聚乙二醇為一端封閉的聚乙二醇，封閉基團可以為 C1-C30的烷基，C1-C30的脂肪酸或糖基。聚乙二醇為分子量2，000-100, OOODa，一般選擇 2，000-50, OOODa，優先選擇 5，000-50, OOODa0 烷基與聚乙二醇一端通常形成醚鍵，也可以由酯鍵相連接。鏈長可以選擇Cl-ClO 的烷基，優先選擇甲基、乙基或丙基。脂肪酸與聚乙二醇一端通常形成酯鍵，脂肪酸鏈長一般選擇C1-C18的脂肪酸，優 先選擇鏈長為C10、C12、C16和C18的脂肪酸。酰基化使用C1-C30的脂肪酸，優先選擇C1-C18的脂肪酸。有機小分子指具有C、H、0或C、H、0、N、P、S等幾種元素組成的分子量小于2，OOODa 的有機小分子。具體地指各類氨基酸、各類單糖或多糖、各類維生素(Vitamin)、生物素和分 子量在20-2，OOODa的聚合物，如聚乙二醇、多肽、寡聚糖和多聚糖(葡聚糖、淀粉和甲殼素 等)和核苷等。上述多肽能應用于類風濕關節炎自身免疫抗體的體外檢測。所述的類風濕關節炎自身免疫抗體的體外檢測的應用，其一般方法為將待測血清 (serums)與包含有上述的多肽(即抗原)試劑混合，檢測所述多肽與血清中抗體所形成的 復合物。檢測結果呈陽性表明，該血清中具有類風濕關節炎疾病自身免疫抗體。—種類風濕關節炎自身免疫抗體的體外檢測的方法ELISA檢測，其具體的實驗步 驟可以參見US6，858，438中的相應部分。
其基本原理是多肽(抗原)包被在酶標板表面，將稀釋后的待檢血清/血漿和對 照物加入反應板孔中，如果被檢血清/血漿中存在抗CCP抗體，經溫育后，則血清/血漿中 特異性抗體與反應板孔中的CCP抗原多肽結合，形成固相抗原-抗體復合物，洗去未結合的 血清/血漿中其它成分，加入酶標記的抗人IgG抗體，溫育，固相CCP抗原(多肽)結合的 抗CCP抗體再與酶標記的抗人IgG抗體結合，洗去未結合的酶標記抗體成分，加入酶底物， 并被催化成為有色產物，最后加入終止液終止反應。根據試劑盒內的對照物，可對抗CCP抗 體進行定量或定性測定。所述的抗人IgG抗體為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標記的 抗人IgG抗體。一種具體配制方式為，取20 μ 1儲存液，加800ml抗體稀釋液作1 40000稀釋，混勻，分裝標準小瓶，每瓶15ml，2 8°C下保存。其中HRP標記的抗人IgG抗體底物A配制方式為稱取檸檬酸17. 9g和 Na2HPO4 · 1220 4. 67g溶解于400ml去離子水中，然后緩慢加入30 % Η202330 μ L，攪拌均勻 后，加水至500ml，2 8°C下保存。其中HRP標記的抗人IgG抗體底物B配制方式為稱取四甲基聯苯氨 (tetramethyl benzidine, TMB) 0. Ig 于 IOOml 去離子水中，加入二甲基亞砜(DMSO) 2. 5ml, 在攪拌的同時，緩慢加入0.5ml 6M HC1，直至完全溶解，最后加水至500ml，2 8°C下保存。其中HRP標記的抗人IgG抗體底物反應終止液的配制方式分別量取55ml 98% H2SO4和去離子水445ml，然后將濃硫酸緩慢加入到去離子水中，混勻，2 8°C下保存。酶標儀測定波長設定在450nm，30分鐘內測定各孔OD45tl值。另一種應用于類風濕關節炎自身免疫抗體的ELISA體外檢測方法，將上述多肽先 經生物素(Biotin)標記，其能與親和素或鏈霉親和素非共價結合。然后再使用上述ELISA 體外檢測方法。所述的親和素(Avidin)是一種相對分子質量為68，OOODa, pi為10. 5的一種堿性
糖蛋白，又稱卵白素，在雞蛋清中含量比較豐富，一般從蛋白清中提取。所述的鏈霉親和素 (Streptavidin)是一種從鏈霉菌(Str印tomycesavidinii)培養物中提取的蛋白質，相對 分子質量60，OOODa,不具有糖鏈。其特性與親和素一樣，也具有4個生物素結合位點，與生 物素具有高親和力。所述的多肽與生物素標記相結合的方法可以通過先由固相合成或基因工程表達 并純化，所得多肽再與生物素連接并純化(如申請號為200310108264. 0中國發明專利所 公開的技術方案)。所述的多肽與生物素標記相結合的方法還可以在多肽的固相合成過程中先與生 物素連接再純化的方式(P印t. Res. 1989，2，189-194)。具體地說，所述的結合有生物素的多肽，其上生物素與多肽的N末端相結合。本發明技術方案實現的有益效果本發明所述的多肽，其上序列有三個精氨酸側鏈經修飾后呈現電中性或電負性， 并優先選擇瓜氨酸。這些多肽序列上兩個不相鄰的半胱氨酸側鏈巰基形成二硫鍵而成環 狀。這類多肽不僅能與類風濕關節炎自身免疫抗體相結合，同時還能對HLA-DR具有高親和 力。經過實驗驗證，該類多肽與類風濕關節炎自身免疫抗體相結合的專一性大于95%，對類風濕關節炎自身免疫抗體的檢測靈敏度大于75%。與市場上銷售的同類產品相比，其靈敏 度得到顯著提高，更有利于類風濕關節炎自身免疫抗體的體外檢測。所述多肽經生物素標記后能進一步提高與類風濕關節炎自身免疫抗體相結合的 專一性和靈敏度。本發明所涉及的術語與其一般概念相同。所述的“C1-C30烷基”和“C1-C10烷基”指直鏈或支鏈烷基，數字表示基團所含的
碳原子數。所述的“聚乙二醇”指直線型(Linear)或分叉型(Branched)或多臂型 (Multi-arm)結構，聚合物分叉數量或多臂數量不能限制本發明。所述的“C1-C18的脂肪酸”、“C10脂肪酸”、“C12脂肪酸”、“C16脂肪酸”和“C18脂
肪酸”指直鏈或支鏈的飽和或不飽和脂肪酸，數字表示碳原子數。
具體實施例方式以下詳細描述本發明的技術方案。本發明實施例僅用以說明本發明的技術方案而 非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解， 可以對發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍， 其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍中。本發明所用的試劑若未明確指明，則均購自西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich)。實施例1多肽的制備多肽采用Fmoc化學方法，通過固相合成技術合成。該方法的具體步驟參見Eur. J. Immunol. 1994，24，3188-3193 J. Org. Chem. 1972，37，3404-3409 ；黃惟德，陳常慶多肽合 成[M]，北京科學出版社，1985。二硫鍵的形成方法及其步驟可以參見文獻黃惟德，陳常慶多肽合成[M]，北京
1985, ρ85 ；Michael W. Pennington PeptideSynthesis Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press,1994, p91_169通過上述步驟，合成多肽的具體序列為多肽=His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Arg-Phe-Cit-Cit-Cit-Ser-Arg-Ala-Ala-Cys-Gly (SEQ ID No :1)，其上第三位和第十六位Cys通過巰基形成二硫鍵，并使多肽形成環狀結 構，并能模擬轉角結構。先將蛋白質或多肽末端的保護基在二甲基酰胺(DMF)溶劑中脫保護，中和。再 用氟化氫將多肽從合成樹脂上切下，得到的粗產物經過反相色譜C18或C8柱(如5μπι， 250X4. 6mm)，以流動相A(0. 1% (ν/ν)三氟乙酸乙腈溶液)和流動相B (0. 1% (ν/ν)三氟 乙酸水溶液)為梯度洗脫溶劑。在45分鐘內，流動相A占Α、Β兩相總體積0% (ν/ν)變化 至IJ100% (ν/ν)收集得到目標多肽，通過脫鹽色譜柱(GE Healthcare)或旋轉蒸發去除有機 溶劑后，得到目標多肽。(參見中國分析化學2002，30，1126-9)得到的多肽通過反相色譜(RP-HPLC)測定，其具體方法為4. 6 X 250mm 5ym C18 分析柱(Kromasil)；流動相 A 為三氟乙酸(trifluoroacetic, TFA)加入 100% 乙腈(acetonitrile, ACN)中，使得TFA濃度為0. 1 % (ν/ν)；
流動相B為TFA加入100%水中，使得TFA濃度為0. 1% (ν/ν)；流速為 1. Oml/min ；檢測波長為220nm;洗脫梯度以流動相A占A、B兩相總體積10% (ν/ν)的比例平衡，進樣后，采用線 性梯度洗脫(Gradient Elution)，在25分鐘內流動相A占A、B兩相總體積從10% (ν/ν) 改變至35% (ν/ν)的比例，之后以100% (ν/ν)流動相A平衡5分鐘。多肽的保留時間(Retention Time)為9. 32，其純度大于95%。通過ESI質譜測定多肽分子量，其具體條件為質譜(Probe)ESI質譜電壓(Probe bias)+4. 5kv噴霧器流速(NebulizerGas Flow)1. 5L/min檢測器(Detector)1. 5kv樣品電離化裝置(CDL)-20. Ov流動相流速(Τ.Flow)0. 2ml/minCDL 溫度(CDL Temp)250 °C緩沖液濃度(B.conc)50% H2O, 50% ACN加熱塊溫度(BlockTemp)200°C多肽分子量為2017. 26Da。實施例2生物素標記的多肽的制備生物素-多肽(SEQ ID No 1)采用在固相合成過程中先與生物素連接再純化的 方式分別進行，其具體方式參見 Deibel，M.R.，Jr. ,Lobl, Τ. J. and Yem, Α. W.，A technique for rapid purification of low yield products :B iotinylation ofchemically synthesized proteins on-resin. Pept. Res. 1989,2,189-194。當生物素通過縮合劑在多肽合成時直接縮合后，使用Kaiser test檢測縮合反 應是否完全。該反應的詳細說明請參見Sigma-Aldrich 60017產品說明(60017 Data Sheet)，該方法可不僅應用于定性(Analytical Biochemistryl970, 34，595)，還能進行定 量(Analytical Biochemistry 1981，117，147)檢測。在樹脂上進行生物素標記。首先，蛋白質或多肽末端在二甲基酰胺(DMF)溶劑中 脫保護，中和；然后與N-羥基琥珀酰亞胺生物素反應(即生物素化)，反應條件為45°C 24 小時；再用氟化氫將標記有生物素的多肽切下，得到的粗產物經過親和素偶聯瓊脂的親和 層析柱(GEHealthcare)，用磷酸鹽緩沖液洗滌，去除未結合的成分，最后用0. IM的甘氨酸 溶液(PH2. 0)洗脫，得到生物素化的蛋白質或多肽。通過實施例1公開的二硫鍵形成方法，在多肽第三位和第十六位Cys通過巰基形成二硫鍵，并使多肽形成環狀結構。得到的的環形生物素_多肽通過反相色譜(RP-HPLC)測定，其具體方法為4. 6 X 250mm 5ym C18 分析柱(Kromasil)；流動相 A 為三氟乙酸(trifluoroacetic, TFA)加入 100% 乙腈(acetonitrile, ACN)中，使得TFA濃度為0. 1% (ν/ν)；流動相B為TFA加入100%水中，使得TFA濃度為0. 1% (ν/ν)；
流速為 1. Oml/min ；檢測波長為220nm;洗脫梯度以流動相A占A、B兩相總體積15% (ν/ν)的比例平衡，進樣后，采用線 性梯度洗脫(Gradient Elution)，在25分鐘內流動相A占A、B兩相總體積從15% (ν/ν) 改變至40% (ν/ν)的比例，之后以100% (ν/ν)流動相A平衡5分鐘。生物素-環形多肽的保留時間(Retention Time)為17. 76，其純度大于95%。通過ESI質譜分別測定多肽的分子量，其具體條件為
質譜(Probe)ESI質譜電壓(Probe bias)+4. 5kv噴霧器流速(NebulizerGas Flow) 1. 5L/min檢測器(Detector)1. 5kv樣品電離化裝置(CDL)-20. Ov流動相流速(Τ.Flow)0. 2ml/minCDL 溫度(CDL Temp)250 °C緩沖液濃度(B.conc)50 % H2O, 50 % ACN加熱塊溫度(BlockTemp)200°C所得生物素-環形多肽分子量為2243. 57Da。實施例3類風濕關節炎抗體的體外檢測使用ELISA方法檢測類風濕關節炎患者的血清中自身免疫抗體，具體的實驗步驟 可以參見US6，858，438中關于ELISA檢測的相應部分。其基本原理是多肽(抗原)包被在酶標板表面，將稀釋后的待檢血清/血漿和對 照物加入反應板孔中，如果被檢血清/血漿中存在抗CCP抗體，經溫育后，則血清/血漿中 特異性抗體與反應板孔中的CCP抗原多肽結合，形成固相抗原-抗體復合物，洗去未結合的 血清/血漿中其它成分，加入酶標記的抗人IgG抗體，溫育，固相CCP抗原(多肽)結合的 抗CCP抗體再與酶標記的抗人IgG抗體結合，洗去未結合的酶標記抗體成分，加入酶底物， 并被催化成為有色產物，最后加入終止液終止反應。根據試劑盒內的對照物，可對抗CCP抗 體進行定量或定性測定。抗人IgG抗體為HRP標記的兔抗人IgG抗體采購于武漢博士德生物工程有限公司 (貨號BA1070)。其具體配制方式為，取20 μ L儲存液，加800ml抗體稀釋液作1 40000 稀釋，混勻，分裝標準小瓶，每瓶15ml，2 8°C下保存。抗體稀釋液購自Pierce公司(貨 號=37552)。HRP標記的抗人IgG抗體底物A配制稱取檸檬酸17. 9g和Na2HPO4 · 1220 4. 67g 溶解于400ml去離子水中，然后緩慢加入30% Η202330 μ L，攪拌均勻后，加水至500ml，2 8°C下保存。HRP標記的抗人IgG抗體底物B配制稱取四甲基聯苯氨(tetramethylbenzidine， TMB) 0. Ig于100ml去離子水中，加入二甲基亞砜(DMSO) 2. 5ml，在攪拌的同時，緩慢加入 0.5ml 6M HC1，直至完全溶解，最后加水至500ml，2 8°C下保存。HRP標記的抗人IgG抗體底物反應終止液的配制分別量取55ml98% H2SO4和去離 子水445ml，然后將濃硫酸緩慢加入到去離子水中，混勻，2 8°C下保存。
酶標儀測定波長設定在450nm，30分鐘內測定各孔OD450值。將實施例1中合成的環形多肽分別與類風濕關節炎患者血清進行驗。
多肽(SEQ IDNo 1)
假陰性72
合計256多肽靈敏度=真陽性/(真陽性+假陰性)=184/256 = 71.88%將實施例1中合成的環形多肽分別與非類風濕關節炎患者血清進行實驗。
多肽(SEQ ID No 1)假陽性11
真陰性245
合計256_多肽專一性=真陰性/(真陰性+假陽性)=245/256 = 95. 70%實施例4生物素標記多肽用于類風濕關節炎抗體的體外檢測加有0. 05% (v/v) Tween-20的pH7. 4磷酸緩沖鹽溶液(PBST)稀釋鏈霉親和素，使 其濃度為5μ g/ml。然后加入到酶標板各孔中，4°C過夜，取出酶標板，去除包被液，用pH7. 4 的PBST溶液洗2次，然后加入PBST稀釋的生物素標記的多肽，室溫孵育1小時(在脫色搖 床上混勻)，洗板，備用。將稀釋后的待檢血清/血漿和對照物加入反應板孔中，如果被檢血清/血漿中存 在抗CCP抗體，經溫育后，則血清/血漿中特異性抗體與反應板孔中的CCP抗原多肽結合， 形成固相抗原-抗體復合物，洗去未結合的血清/血漿中其它成分，加入酶標記的抗人IgG 抗體，溫育，固相CCP抗原(多肽)結合的抗CCP抗體再與酶標記的抗人IgG抗體結合，洗 去未結合的酶標記抗體成分，加入酶底物，并被催化成為有色產物，最后加入終止液終止反 應。根據試劑盒內的對照物，可對抗CCP抗體進行定量或定性測定。后續操作及所用試劑與實施例3記載相一致。合成的環形生物素_多肽類風濕關節炎患者血清進行實驗。
生物素—多肽(SEQ ID No 1) Γ 真陽性202
假陰性54
合計256多肽靈敏度=真陽性/(真陽性+假陰性)=202/256 = 78. 9%將合成的環形生物素_多肽分別與非類風濕關節炎患者血清進行實驗。生物素—多肽(SEQ ID Nol)假陽性5
真陰性251 合計_256_多肽專一性=真陰性/(真陰性+假陽性)=251/256 = 98. 05%序列表<110>上海榮盛生物藥業有限公司<120>與免疫抗體相結合的多肽及其應用<130)0911089<160>178<170>PatentIn version 3.3<210>SEQ ID No 1<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>1His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 2<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>2His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 3<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>3His Gln Cys His Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015
Gly<210>SEQ ID No 4<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>4His Gln Cys His Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 5<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>5His Gln Cys His Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 6<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>6His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 7<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>7His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 8<211>17
<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>8His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 9<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>9His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 10<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>10His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 11<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>11His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 12<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa為瓜氨酸
<400>12His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 13<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>13His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 14<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>14His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 15<211>17<212>PRT<213>入工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>15His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 16<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>16His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Cys151015
Gly<210>SEQ ID No 17<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>17His Gln Cys Ala Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 18<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>18His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 19<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>19His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 20<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa為瓜氨酸<400>20His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 21<211>17
<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>21His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 22<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>22His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 23<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>23His Gln Cys Ala Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 24<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>24His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 25<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸.
<400>25His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 26<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>26His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu Ala Ala Cys15 1015Gly<210>SEQ ID No 27<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>27His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Ala Cys15 1015Gly<210>SEQ ID No 28<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>28His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Cys15 1015Gly<210>SEQ ID No 29<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>29His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015
Gly<210>SEQ ID No 30<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>30His Gln Cys His Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Ala Cys15 1015Gly<210>SEQ ID No 31<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>31His Gln Cys His Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 32<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>32His Gln Cys His Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Ala Cys15 1015Gly<210>SEQ ID No 33<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>33His Gln Cys His Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Cys15 1015Gly<210>SEQ ID No 34
<211>17
<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>34His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 35<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>35His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Ser Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 36<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>36His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 37<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>37His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 38<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸
<400>38His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 39<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>39His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 40<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>40His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 41<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>41His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 42<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>42His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg lie Ala Cys151015
Gly<210>SEQ ID No 43<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>43His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 44<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>44His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 45<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>45His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 46<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>46His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 47<211>17
<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>47His Gln Cys Ala Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 48<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>48His Gln Cys His Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 49<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>49His Gln Cys His Arg Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 50<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>50His Gln Cys His Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 51<211>17<212>PRT<213>人工合成.
<223>Xaa 為瓜氨酸
<400>51His Gln Cys His Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 52<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>52His Gln Cys His Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 53<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>53His Gln Cys His Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 54<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>54His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 55<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>55His Gln Cys His Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Ala Cys151015.
Gly<210>SEQ ID No 56<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>56His Gln Cys His Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 57<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>57His Gln Cys His Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 58<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>58His Gln Cys His Arg Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 59<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>59His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 60<211>17
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<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>61His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 62<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>62His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 63<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>63His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 64<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸
<400>64His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 65<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>65His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 66<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>66His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 67<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>67His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 68<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>68His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Arg Ala Cys151015
Gly<210>SEQ ID No 69<211>17
<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>69His Gln Cys His Arg Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Arg Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 70<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>70His Gln Cys His Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 71<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>71His Gln Cys His Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 72<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>72His Gln Cys His Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 73<211>17
<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>73His Gln Cys His Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Ala Cys151015Gly
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<210>SEQ ID No 78<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>78His Gln Cys His Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg Ala Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 79<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>79His Gln Cys His Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu Ala Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 80<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>80His Gln Cys His Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 81<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>81His Gln Cys His Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Arg Ala Arg Cys151015
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Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 159<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>159His Gln Cys His Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Arg Cys151015[1628]Gly<210>SEQ ID No 160<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>160His Gln Cys His Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 161<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>161His Gln Cys His Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Arg lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 162<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>162His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Arg lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 163<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>163His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 164<211>17[1667]<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>164His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 165<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>165His Gln Cys His Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 166<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>166His Gln Cys Ala Arg Phe Gln Met Arg His Xaa Ser Leu lie Ala Cys151015Gly<210>SEQ ID No 167<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>167His Gln Cys His Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 168<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸[1706]<400>168His Gln Cys His Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Ser Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 169<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>169His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 170<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸 [1724]<400>170His Gln Cys His Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 171<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>171His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 172<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>172His Gln Cys His Arg Phe Arg Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015[1745]Gly<210>SEQ ID No 173<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>173His Gln Cys His Gln Phe Gln Phe Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 174<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>174His Gln Cys His Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 175<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>175His Gln Cys Ala Gln Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ IDNo 176<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>176His Gln Cys His Arg Phe Arg Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 177<211>17[1784]<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>177His Gln Cys His Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015Gly<210>SEQ ID No 178<211>17<212>PRT<213>人工合成<223>Xaa 為瓜氨酸<400>178His Gln Cys Ala Gln Phe Gln Met Xaa Xaa Xaa Arg Leu lie Arg Cys151015 [1799]Gly
權利要求
一種與免疫抗體相結合的多肽包含有如下氨基酸序列His-Gln-Cys-Xaa1-Xaa2-Phe-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Cys-Gly，其中，Xaa1為His或Ala；Xaa2為Gln或Arg；Xaa3為Arg或Gln；Xaa4為Phe或Met；Xaa5為修飾的Arg；Xaa6為修飾的Arg；Xaa7為修飾的Arg；Xaa8為Ser或Arg；Xaa9為Arg或Leu；Xaa10為Ala或Ile；Xaa11為Ala或Arg。
2.根據權利要求1所述的與免疫抗體相結合的多肽，其特征在于所述修飾的Arg為側 鏈修飾，側鏈具有通式(I)所述的結構 <formula>formula see original document page 2</formula>其中 Gl 為 O、NH 或 CH2 ；G2 為 NH2、CH3、NHCH3 或 N(CH3) 2 ；G3 為 O、NH、NHCH3> NHCH3 ；η 為 2、3或4 ；當Gl為NH，G2為NH2時，G3不為ΝΗ。
3.根據權利要求2所述的與免疫抗體相結合的多肽，其特征在于所述的多肽包含如下 氨基酸序列:His-Gln-Cys-His-Gln-Phe-Arg-Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Ser-Arg-Ala-Ala-Cys-Gl y，其中Xaa為瓜氨酸。
4.根據權利要求2所述的與免疫抗體相結合的多肽，其特征在于所述多肽包含的具體 氨基酸序列為SEQ ID No 2-178。
5.根據權利要求1-4之一所述的與免疫抗體相結合的多肽，其特征在于所述的多肽結 合有生物素標記。
6.根據權利要求5所述的與免疫抗體相結合的多肽，其特征在于所述的多肽N末端結 合有生物素標記。
7.根據權利要求6所述的與免疫抗體相結合的多肽，其特征在于所述的標記有生物素 的多肽與親和素或鏈霉親和素非共價結合。
8.根據權利要求1-4之一所述的多肽，其特征在于多肽在第三位Cys與第十六位Cys 之間形成二硫鍵。
9.根據權利要求1所述的多肽，其特征在于所述多肽在類風濕關節炎自身免疫抗體體 外檢測中的應用。
10.根據權利要求8所述的多肽，其特征在于所述多肽在類風濕關節炎自身免疫抗體 體外ELISA檢測中的應用。
全文摘要
一種與免疫抗體相結合的多肽，其序列中有三個精氨酸側鏈被修飾為電中性或電負性氨基酸。這些多肽序列上兩個不相鄰的半胱氨酸側鏈巰基形成二硫鍵而成環狀。這類多肽不僅能與類風濕關節炎自身免疫抗體相結合，同時還能對HLA-DR具有高親和力。經過實驗驗證，該類多肽與類風濕關節炎自身免疫抗體相結合的專一性大于95％，對類風濕關節炎自身免疫抗體的檢測靈敏度大于75％。與市場上銷售的同類產品相比，其靈敏度得到顯著提高，更有利于類風濕關節炎自身免疫抗體的體外檢測。
文檔編號C07K7/08GK101812119SQ20091004664
公開日2010年8月25日 申請日期2009年2月25日 優先權日2009年2月25日
發明者朱紹榮 申請人:上海榮盛生物藥業有限公司