專利名稱：：一種特異性識別細胞表面整合素α3β1的小分子肽的制作方法
技術領域：
：本發明涉及有機化學領域，具體涉及一種肽，特別是含5-11個氨基酸的肽。
背景技術：
：整合素是細胞膜表面糖蛋白受體,族的成員之一，是介導細胞與細胞及細胞與細胞外基質(ECM)的粘附分子。整合素分子是由a和P二個亞單位通過非共價鍵連接構成的異二聚體分子，參與細胞與細胞之間、細胞與細胞外基質之間的雙向信號轉導，對細胞的生存、增殖、分化、移動及癌細胞的侵襲、粘附和轉移等產生重要調控作用。整合素分子的體內分布很廣泛，不同類型的細胞表達整合素分子的種類是不同的，整合素分子的表達具有明顯的細胞類型特性，如整合素a3pi在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、膠質細胞瘤等中出現表達異常。因此，整合素可作為腫瘤分子診斷和耙向治療的重要靶點。本發明人曾利用"一個珠子一個化合物"的組合化學肽庫篩選得到一個氨基酸序列為cNGQGEQc的小分子肽，該小分子肽可通過識別整合素a3特異性結合肺癌細胞A549，并發現該肽中對特異性粘附A549作出主要貢獻的結構是-NGXG-以及六肽長度(郭琳瑯等.一種特異性識別非小細胞肺癌A549細胞的小分子肽.生物化學與生物物理進展，2007，34(10):1080~1085)。但上述小分子肽粘附癌細胞A549的能力較弱，且不能作為熒光素的載體將熒光素運輸到腫瘤中。
發明內容本發明要解決的問題是提供一種可將熒光素運輸到整合素a3pl陽性表達的腫瘤中的小分子肽。本發明解決上述問題的技術方案是一種特異性識別細胞表面整合素a3pl的小分子肽，該小分子肽的氨基酸序列為cdGLGHypNc;其中，c表示D型半胱氨酸，d表示D型天冬氨酸，G表示L型甘氨酸，L表示L型亮氨酸，Hyp表示L型4-羥脯氨酸，N表示L型天冬酰胺。本發明小分子肽可用常規的固相合成法(LamKS，SalmonSE，HershEM，HrubyVJ，KazmierskiWM，KnappRJ.Atow1991,35《82)制備，具體方法如下(1)取表面具有NH2活性基團的樹脂珠子，先用二甲基酰胺洗滌，然后浸泡在二甲基酰胺中使所述樹脂珠子充分腫脹，接著按照所述小分子肽的氨基酸序列依次將相應的氨基酸偶聯到所述樹脂珠子上并形成肽鏈；(2)用無水氟化氫將肽鏈從樹脂珠子上切下，同時脫除所有側鏈保護基；(3)用30%乙酸稀釋后，用碘作氧化劑使分子內2個半胱氨酸氧化形成二硫鍵；(4)依次經Sephadex-G-15柱層析、透析和高效液相層析分離純化。本發明所述小分子肽可特異性識別細胞表面整合素a3pi，不僅通過識別a3pl粘附到腫瘤細胞表面，還可以在攜帶熒光素的情況下粘附到腫瘤細胞表面，因此可作為影像造影劑如熒光素的靶向載體，將熒光素運輸到高表達a3pi的癌細胞表面，通過熒光素掃描儀器，實現腫瘤的分子影像診斷。本發明所述小分子肽還有一個重要的潛在用途是作為抗腫瘤藥物載體，為實現靶向治療提供物質基礎。圖l是4株肺癌細胞的PCR產物經內切酶AvalI消化后的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，其中M表示分子量標準物，A表示A549，C表示Calu-l，H表示H1650，D表示DMS-53，l表示a5片段(104bp)，2表示a3片段(69bp)，3表示a4片段(45bp)。圖2是4株肺癌細胞的PCR產物經內切酶Bsp1286I消化后的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，其中M表示分子量標準物，A表示A549，C表示Calu-l，H表示H1650，D表示DMS-53,l表示Pl片段(128bp)。圖3是不同濃度抗整合素ot3抗體阻斷A549細胞與小分子肽結合的阻斷率柱形圖。圖4是注入了連接了熒光素Alexa的小分子肽的荷瘤小鼠的熒光掃描圖，其中1所指部位是注射點，2所指部位是腎臟，3所指部位是A549腫瘤。圖5是注入了連接了熒光素Alexa的小分子肽的荷瘤小鼠各器官的熒光掃描圖。具體實施例方式為了更好地理解本發明，下面將通過實施例以及效果實驗進一步闡明本發明所具有的技術效果。1、本發明小分子肽的制備(1)稱取lg表面具有NH2活性基團的樹脂珠子，用二甲基酰胺洗滌3次，然后在二甲基酰胺浸泡至珠子充分腫脹；(2)加入半胱氨酸和N,N'-二異丙基碳二亞胺，室溫下反應2小時后，用DMF洗滌珠子5次，接著加入20%的哌啶，在室溫下反應5min，再加入20%的DMF，反應15min，完全脫去Fmoc保護基；(3)按步驟(2)方法依次偶聯天冬氨酸、甘氨酸、亮氨酸、甘氨酸、羥脯氨酸、天冬酰胺和半胱氨酸；(4)將連接完最后一個氨基酸的珠子經25%的三氟乙酸洗滌一次，蒸餾水洗滌3次；(5)用無水氟化氫將小分子肽從樹脂珠子上切下，同時脫除所有側鏈保護基。還原產物在30%乙酸高度稀釋下用碘作氧化劑，使分子內2個半胱氨酸氧化形成二硫鍵。經Sephadex-G-15柱層析，透析和高效液相層析分離純化，獲得在反相高效液相層析(分析柱)為單一峰的高純度產物。2、分析癌細胞表面整合素a3卩l的表達(1)基因表達限制性分析①RNA提取和RNA逆轉錄為cDNA:培養細胞，收獲細胞3xl07，移入1.5ml離心管，加入lmlTrizol，混勻，室溫靜置5min;加入0.2ml氯仿，振蕩15sec,室溫靜置2min。4'C離心，12000gxl5min，取上清；加入0.5ml異丙醇，將管中的液體輕輕混勻，室溫靜置IOmin;4°C離心，12000gxi0min，棄上清；加入lml75。/o乙醇，輕輕洗滌后沉淀；4。C離心，7500gx5min，棄上清；晾干，加入適量DEPCH20溶解；260nm波長分光度測定總RNA濃度，并根據OD260/OD280的比值計算純度。將樣品RNA逆轉錄為cDNA，50(al的混合反應液包含25嗎fRNA、1mMdNTP和10個單位的AMV(禽成髓性白血病病毒)逆轉錄酶，反應條件為25。C，10min，然后42。C2hr，最后75。C5min。②引物設計根據整合素a和p亞單位基因序列，用MacVector公司ClustalW軟件設計引物，引物長度為25-26個堿基，整合素a的擴增片段約250-330堿基對，整合素(3的擴增片段約231-249堿基對。同時用MacVector公司的限制性酶切分析軟件預測不同限制性酶消化擴增片段后的長度(見表1和2)。表l限制性內切酶消化整合素a預測得到不同長度的基因片段<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>ctL4451604433ctM7523/8473aV24612925037aX50752373'表2限制性內切酶消化整合素p預測得到不同t〈度的基因片段RestrictionEnzymesIntrgeinsAluIHinflBap1286IBslIFragmentSize(Basepairs)pi61196128208P26687P363P46645P516182(36116mP7116.52140p823866112③PCR:PCR反應體系總體積為5(HU，包括25nCi的Y"P標記的正向引物，400nM反向引物，200nMdNTP及25ngcDNA。cDNA變性，94°C，10min，PCR反應條件:前5個循環，94°C，40sec;50°C，90sec;72°C，15sec;后19個循環94。C，45sec;58°C，90sec;72°C,20sec。PCR產物經2.4。/。的瓊脂糖純化，QIACEXII試劑盒抽提。限制性酶切分別用酶消化PCR產物，對整合素a各亞單位，采用的內切酶有AccI、AvaII、Bsll、BstNI、Hinfl、TaqI及AluI,對整合素卩各亞單位采用的酶有AIuI、Hinfl、Bspl2861及BslI(NewEnglandBiolabs，Inc)。酶切產物用7。/。的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。結果經AvaII酶切后，非小細胞肺癌細胞A549、Calu-l及H1650出現整合素oc3(69bp),而DMS-53缺少a3(見圖l)。經Bspl2861酶切后，所有細胞均出現(31(128bp)(見圖2)。(2)流式細胞儀分析①將lxl(^的培養細胞用2.5g/L胰蛋白酶消化，培養基終止消化，離心棄細胞培養基；②PBS洗滌3次，50mg/mL多聚甲醛固定15min，制成單細胞懸液5X106/ml。③每個樣本分別取lOOpl細胞懸液加入2個EP管中，實驗組加入第一抗體鼠抗人整合素a3、a4、a5及卩l單克隆抗體，稀釋度均為1:100，對照組加入PBS，室溫孵育1hr。④洗滌液洗滌2次，離心棄上清。⑤每個EP管加入FITC標記羊抗鼠IgG抗體，稀釋度為1:50，室溫避光孵育30min。⑥應用美國BectonDickson公司的FAC-Sort型流式細胞儀分析蛋白表達陽性率，每種蛋白重復測定三次，分析結果。結果顯示非小細胞肺癌細胞A549、Calu-l及H1650出現整合素a3，四種細胞均有整合素Pl表達。3、確定本發明小分子肽與癌細胞表面整合素a3(31特異性結合①篩選小分子肽與A549細胞的結合位點利用特異性抗細胞表面粘附分子整合素的單克隆抗體，阻斷小分子肽cdGLGHypNc與A549細胞表面相關受體結合，確定小分子肽與A549細胞的結合位點。阻斷抗體有整合素al-6，v和(31-5(Chemicon公司，USA)，在96孔細胞培養板的A1-7孔中分別加入濃度為1.5mg/L的抗al、a2、a3、a4、a5、a6、av抗體，Bl-5孔中分別加入抗pl、(32、卩3、卩4、(35抗體，因此，在AlBl孔中含有抗al和pl兩種抗體，A1B2孔中含有抗al和p2兩種抗體，依次類推，不同孔中即含有抗a和p兩種抗體的不同組合。然后加入A549細胞懸液，搖動培養板，使兩者充分混合，置細胞培養箱中孵育IOmin，加入小分子肽珠子。混合細胞和珠子，37QC,5%0)2的培養箱中培養，分別于24hr和48hr后計數表面粘附A549細胞的陽性珠子數。②進一步確定小分子肽與A549細胞的結合位點根據上述(1)的實驗結果，在48孔細胞培養板中分別加入不同濃度的阻斷抗體(0，0.125，0.25，0.5，1，2，5mg/L)，其余歩驟同上，分別于24hr和48hr后記數有細胞粘附的珠子的百分率，以此判定抗體對細胞與小分子肽結合的阻斷百分率。結果用抗整合素(od-6，v.和pi-5)抗體(1.5yg/ml)阻斷A549細胞與小分子肽的結合實驗，結果顯示抗整合素a3抗體與抗p亞單位抗體的任何組合如a3pl、a鄧2、ct3(33、a鄧4、a3p5均可阻斷A549細胞與cdGLGHypNc的結合，而a其它亞單位與p亞單位的組合如od(31、a2pi、a4pi、a2pl、a2p2等對A549細胞與cdGLGHypNc的結合均無明顯的阻斷作用。抗整合素a3抗體對A549細胞與小分子肽結合的阻斷作用隨其濃度增加而增強，當a3抗體的濃度為0.5pg/ml時，其抑制作用可達95%以上(見表3和圖3)表3抗整合素a3抗體阻斷A549細胞與小分子肽結合實驗結果integrina3(嗎/tnl)_%inhibitionofcellattachment000.12500.257.70.595.11.01002.01005.01004、本發明小分子肽作為特異性識別整合素a3pl的靶向載體(1)用熒光素Alexat示記試劑盒(invitrogen公司)標記小分子肽cdGLGHypNc;(2)于裸鼠背部皮下接種4~6乂106細胞(肺腺癌細胞A549)，3周后測量瘤體達lcm，成功建立高表達整合素a3pl的荷瘤小鼠模型；(3)從裸鼠尾靜脈將連接了熒光素Alexa的小分子肽(lOO)il)注入荷瘤小鼠模型體內，2小時后在熒光掃描儀下7見察標記熒光素的小分子肽在荷瘤小鼠體內腫瘤及肝臟、脾臟、肺臟等臟器的分布情況。圖中顯示在荷瘤小鼠的腎臟和瘤體中出現熒光素聚集，而肝臟、脾臟、肺臟等臟器中未見明顯熒光素聚集(見下圖4);取出瘤體和腎臟、肝臟等臟器，再次用熒光掃描儀掃描，成像結果與fls內顯像一致(見下圖5)，瘤體良好成像表明小分子肽成功將熒光素Alexa運送到高表達整合素a3pl的癌組織，腎臟中出現熒光素聚集提示小分子肽能通過腎臟經尿液排泄。5、本發明小分子肽與先期公開的小分子肽cNGQGEQc生物特性比較(1)本發明小分子月太與cNGQGEQc的體外粘附特性比較①吸取20pl(約1500個)的小分子肽珠子，PBS緩沖液和70M酒精各洗3次，然后細胞培養液洗2次。轉移小分子肽珠子至48孔細胞培養板(約150個珠子/L)。A549細胞株分別與小分子肽珠子cdGLGHypNc和cNGQGEQ混合培養(37°C，5%C02)，計算并比較培養24和48hr后兩種小分子肽與細胞的結合百分率，以此評價小分子肽與細胞粘附結合力的強弱。結果培養24hr后，cdGLGHypNc與A549細胞的結合百分率為71.3%，明顯高于cNGQGEQ與A549細胞的結合百分率55.8%;培養48hr后，兩種小分子肽與細胞的結合百分率大致相同，分別為96.1°/。和95.6%。②將100pl的avidin(抗生物素蛋白，20嗎/mlinPBS)滴加在玻璃片上，37GC孵育1hr，甩去avidin，PBS洗1次，除去未與玻片結合的avidin，在玻片上分別滴加100pl(0.1pM)聯接有生物素的游離小分子肽cdGLGHypNc和cNGQGEQc，僅包被avidin或小分子肽作為對照，無任何包被的玻片作為陰性對照。在玻片上加上lOOplA549細胞懸液，孵育1hr，Gimsa染色，觀察比較各玻片上的粘附細胞數量。結果顯示載有cdGLGHypNc的玻片上粘附的A549細胞數為53個，而載有cNGQGEQc的玻片上粘附的A549細胞為35個，僅載有avidin或無任何載物的玻片上見個別細胞或無任何細胞粘附。上述實驗①和②的結果表明小分子肽cdGLGHypNc與A549的結合力高于cNGQGEQc。(2)本發明小分子肽與cNGQGEQc的體內靶向載體比較從裸鼠尾靜脈將連接了熒光素Alexa的小分子肽cdGLGHypNc和cNGQGEQc(lOOpil)注入荷瘤小鼠模型體內，2小時后在熒光掃描儀下觀察標記熒光素的小分子肽在荷瘤小鼠體內腫瘤及肝臟、脾臟、肺臟等臟器的分布情況。結果顯示熒光素AIexa-cdGLGHypNc在荷瘤小鼠的腎臟和瘤體中出現熒光素聚集(見圖4)，而肝臟、脾臟、肺臟等臟器中未見明顯熒光素聚集，取出瘤體和腎臟、肝臟等臟器，再次用熒光掃描儀掃描，熒光素Alexa-cdGLGHypNc在荷瘤小鼠的腎臟和瘤體成像結果與體內顯像一致(見圖5);而熒光素Alexa-cNGQGEQc在荷瘤小鼠的瘤體中未見熒光素聚集。結果表明小分子肽cdGLGHypNc能成功將熒光素Alexa運送到A549細胞。9序列表<110>南方醫科大學<120>—種特異性識別細胞表面整合素a301的小分子肽<160>1<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>8<212>PRT<213>人工序列<400>1CysAspGlyLeuGly4-HypAsnCys1權利要求1、一種特異性識別細胞表面整合素α3β1的小分子肽，該小分子肽的氨基酸序列為cdGLGHypNc；其中，c表示D型半胱氨酸，d表示D型天冬氨酸，G表示L型甘氨酸，L表示L型亮氨酸，Hyp表示L型4-羥脯氨酸，N表示L型天冬酰胺。2、權利要求1所述小分子肽的制備方法，該方法由以下步驟組成(1)取表面具有NH2活性基團的樹脂珠子，先用二甲基酰胺洗滌，然后浸泡在二甲基酰胺中使所述樹脂珠子充分腫脹，接著按照所述小分子肽的氨基酸序列依次將相應的氨基酸偶聯到所述樹脂珠子上并形成肽鏈；(2)用無水氟化氫將肽鏈從樹脂珠子上切下，同時脫除所有側鏈保護基；(3)用30%乙酸稀釋后，用碘作氧化劑使分子內2個半胱氨酸氧化形成二硫鍵；(4)依次經Sephadex-G-15柱層析、透析和高效液相層析分離純化。全文摘要本發明提供了一種特異性識別細胞表面整合素α3β1的小分子肽，該小分子肽的氨基酸序列為cdGLGHypNc；其中，c表示D型半胱氨酸，d表示D型天冬氨酸，G表示L型甘氨酸，L表示L型亮氨酸，Hyp表示L型4-羥脯氨酸，N表示L型天冬酰胺。本發明所述小分子肽可通過常規的固相合成法合成得到，能特異性識別細胞表面整合素α3β1，因此可作為影像造影劑如熒光素的靶向載體，將熒光素運輸到高表達α3β1的癌細胞表面，通過熒光素掃描儀器，實現腫瘤的分子影像診斷。文檔編號C07K7/00GK101638429SQ20091004228公開日2010年2月3日申請日期2009年8月28日優先權日2009年8月28日發明者帆張,李貴平,穎郭,郭琳瑯申請人:南方醫科大學