專利名稱：：一種高特異性的抗腫瘤單克隆抗體的制作方法一種高特異性的抗腫瘤單克隆抗體
技術領域：
：本發明涉及腫瘤學和醫學領域。本發明尤其涉及抗人腫瘤的特異性單克隆抗體及其應用。
背景技術：
：腫瘤是僅次于心血管病的人類第二大殺手，腫瘤的早期診斷和治療是生命科學領域面臨的一個重要課題。HAAH是細胞內的一種酶，僅見于胚胎和腫瘤，在正常人體內，HAAH基因的表達處于關閉狀態，所以不產生HAAH。腫瘤細胞中HAAH的表達明顯上調。由于HAAH與腫瘤的發生和發展都有密切的聯系，因此HAAH是腫瘤早期診斷的一個重要標志，也是腫瘤治療的一個重要靶標。對腫瘤的免疫診斷和免疫治療一直是人們關注的重點，但突破性的進展并不多。人們在不斷尋找腫瘤特異性抗原的同時，越來越重視對腫瘤相關抗原的研究和應用。HAAH是一種特殊的癌胚抗原，其特殊性是(1)與幾乎所有的腫瘤相關，已知與十二種以上的腫瘤相關，是一種廣譜的癌胚抗原。(2)HAAH與腫瘤有著密切的相關性，檢測HAAH對腫瘤的診斷具有很高的特異性，所以具有確診的意義。(3)針對HAAH抗原的特異性抗體具有介導NK細胞的ADCC作用，發揮特異性殺傷腫瘤細胞作用。抗體依賴的細胞介導的細胞毒(antibody-d印endentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC)作用是體內免疫系統特異性清除腫瘤和病毒感染細胞的重要途徑之一。NK細胞、巨噬細胞等膜表面表達有IgGFc受體，通過與結合在病毒感染細胞或腫瘤細胞等靶細胞表面的IgG抗體的Fc段結合，發揮殺傷靶細胞的作用。NK細胞是發揮ADCC作用的主要細胞。在抗體介導的ADCC作用的發生過程中，抗體首先與靶細胞上的相應抗原表位特異性結合，NK細胞繼而殺傷已與抗體結合的靶細胞，具有特異的導向殺傷作用。腫瘤清除的效果與ADCC作用的強弱密切相關，而ADCC作用的強弱則與抗體-抗原作用的特點密切相關。并非所有的抗體都具有介導ADCC作用，針4對同一個抗原不同表位的抗體也有各自不同的親和力和不同的介導ADCC活性。因此，篩選具有強介導ADCC作用的特異性單克隆抗體，對于腫瘤的治療具有重要意義，在腫瘤的特異性診斷上自然也具有重要的應用價值。基于腫瘤診斷與治療的這一應用需要，本發明從大量的融合的淋巴細胞雜交瘤中篩選出了一株具有很強介導NK細胞ADCC作用的單克隆抗體，在體內與體外的實驗中，能使NK細胞對腫瘤的殺傷活性提高50。/f80%。抗體應用于腫瘤的診斷上也有很高的特異性，病理切片的免疫組化結果顯示，與常規病理切片的診斷結果比較，其陽性符合率為100%。
發明內容本發明的目的提供一種特異性抗腫瘤標志性抗原的單克隆抗體。一種高特異性的抗腫瘤單克隆抗體，該抗體的輕鏈可變區由105個氨基酸組成，其序列如下GlnPheValLeuThrGluSerGlyAlalieMetSerThrAlaMetGlyGlyArgValThrlieAlaCysAlaThrSerGlyGlySerAspThrArgAsnLeuHisTrpTyrAlaThrValThrArgLeuProGlyArgValThrSerLysArgProSerPheAlaCysLeuGluSerArgThrAsnGlyAspAlaL>ysValLeuProGlyPhePheAsnGlyGinThrPheAlaSerProPheValAlaThrProAsnAlaHisValProAlaAspGlyLeuLeuGlyHisAlaGlySerLysAlaPheGlySer重鏈可變區由lll個氨基酸組成，其序列如下AlaValSerProAsnGlyLysTyrLysGlyAsnSerArgProThrCysProAspCysPheProAlaThrSerLeuGluGlyLeuPheLeuGluLeuSerArgArgAlaLysCysPheProThrValValArgGlyPheGluHisThrCysAsnThrArgGluLeuProAspLeuGlyArglieHisSerlieLysAlaGlylieHisArgAsnGlyGlylieGinPhelieThrPheGlyLeuCysGlyAspArgliePheProGluValAspAsnArgValLysPheThrCysSerAsnAspSerValAsnGlySerAlaPhelieArgCys在本發明的一個實施例中，上述抗體與抗原HAAH(Humanasparaginylbeta-hydroxylase，人天冬酰胺羥化酶)發生特異性結合。在本發明的另一個實施例中，該抗體的恒定區為鼠IgG2a亞類。在本發明的第二方面，提供了上述單克隆抗體在制備治療腫瘤藥物中的應用。在本發明的另一個實施例中，上述單克隆抗體在制備治療肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、子宮頸癌、卵巢癌、結腸癌、前列前癌、腎癌、食道癌、膀胱癌藥物中的應用。本發明的單克隆抗體能顯著提高NK細胞的ADCC活性，使NK細胞對腫瘤的殺傷率提高至少50%。更為重要的是其可變區的氨基酸序列具有其自身的唯一性，它的可變區氨基酸序列與其它已報道的抗HAAH單克隆抗體完全不同，這是區分不同抗體特性的根本。具體實施方式一、HAAH基因的重組表達來源于臨床切除的人乳腺癌組織，采用RNA提取液從研磨的腫瘤組織中提取總RNA，oligo(dt)引物逆轉錄獲得HAAH基因的cDNA。隨后采用PCR方法擴增出用于克隆的HAAHcDNA。擴增的HAAHcDNA測序確認后克隆在pPIC9k酵母表達載體上，轉化GS115酵母菌后，篩選3mg/mlG418抗性的轉化酵母菌。利用甲醇對酵母進行發酵和表達誘導，從發酵液上清中純化表達產物，最終獲得純度為95%的HMH重組表達蛋白。實施過程如下1.HAAHcDNA的克隆首先合成下列引物上游弓l物5，atgaattcatggtgattgcattgctgggc3，下游弓I物5，atgcggccgcctaaattgctggaaggetgcgtc3，上游引物引入了EcoRI酶切位點gaattc,下游引物引入NotI限制性內切酶位點；克隆的具體過程如下抽提腫瘤組織中的總RNA:取臨床上經病理確診的乳腺癌組織約0.1克，凍融-勻漿后加入lml的TrizolRNA提取液(Invitrogen公司產品)、氯仿200ul抽提，12000rpm離心5分鐘，吸取水相500ul，加入異丙醇500ul，12000rpm離心15分鐘，獲得RNA沉淀，75%乙醇洗沉淀一遍。沉淀的總RNA在超凈臺中吹干，溶解在50u1DEPC處理過的水中。取5u1總RNA，以OligodT16作為逆轉錄引物，AMV為逆轉錄酶獲得HAAH的第一鏈cDNA。以8pl逆轉錄產物為模板，以上述的上下游引物為擴增引物，用PCR方法中擴增HAAH基因。擴增條件為94。C2min，94°C50s-55°C50s_72°Clmin30s共30個循環。擴增產物經1%瓊脂糖電泳后，在約2.3kb大小處有一清晰的擴增條帶。從瓊脂糖凝膠中回收該DNA條帶，隨后與T載體連接。連接產物轉化DH5a大腸桿菌(感受態)，在含IPTG與X-gal的青霉素平板上挑選8個白色菌落，分別提取質粒，用EcoRI和NotI進行雙酶切鑒定，結果5個克隆的質粒都能切出2.3kb大小的片段。取其中的一個克隆送交測序公司測序，結果表明所克隆的基因與公布的HAAHcDNA序列完全一致。'2.構建表達HAAH的表達載體用EcoRI和NotI雙酶切T載體后，回收2.3kb的HAAH基因，與同樣雙酶切的pPIC9K載體連接，轉化DH5a感受態菌，取4個克隆用EcoRI和NotI雙酶切鑒定，結果都能切出兩個片段(一個片段為9.3kb的載體，另一個為2.3kb的HAAH基因)，取其中一個克隆進行序列測定，證實為HAAH基因克隆在pPIC9K載體中。確認的克隆提取質粒，Sall酶切成線性后，純化回收。線性化的克隆質粒約0.1iig(在0.2y1純水中)與50p1的感受態GS115畢赤酵母菌混合，在25uF，2.5kV條件下電穿孔，將克隆質粒轉入畢赤酵母菌中。電穿后的GS115畢赤酵母菌涂布在MD平板上。3(TC培養5d后，收集所有畢赤酵母菌落，混合均勻后再涂布在含3mg/mlG418的YNB平板上，30。C培養5d后，獲得2個抗4mg/mlG418的酵母工程菌克隆。取其中一個克隆進行小規模的誘導表達實驗在BMGY培養基中擴菌后，在含甲醇的B醒Y培養基中進行誘導表達，表達上清，經SDS-PAGE電泳確定在90kd處可看到有明顯表達的蛋白。采用兔抗HAAH多克隆抗體(來源見下述)對其進行western-blot染色，證明90kd處的蛋白為HAAH。這個結果表明已成功構建出表達HAAH的酵母工程菌。3.制備兔抗HAAH的多克隆抗體為了對重組表達的HAAH蛋白進行鑒定，我們在此之前依據HAAH中第86位至110位的氨基酸序列，化學合成了一條25個氨基酸的短肽，合成的短肽與完全佐劑混合后免疫家兔，獲得了兔抗HAAH的多克隆抗體。4.HAAH在酵母中發酵、表達與純化(1)酵母工程菌的發酵與誘導表達HAAH的酵母工程菌10ml，在500mlBMGY培養基中培養48小時，轉到含15L基礎培養液的30L發酵罐中。溫度、溶氧度和pH值分別設定在30。C、60%、5.0。用甘油進行分批補料培養72小時。停止甘油流加后，開始流加甲醇進行誘導表達，誘導時間為72h。(2)發酵液的分離收集發酵罐中的發酵液共30L，離心收集上清液20L。取少量上清用SDS-PAGE電泳法對表達產物進行鑒定。結果表明，在約90kd處有一明顯的蛋白表達，與0.5mg/ml的標準含量人白蛋白比較，初步確定本工程菌的HAAH蛋白表達量可達0.5mg/ml。(3)HAAH蛋白的純化發酵誘導表達的上清液用50K的超濾板進行超濾濃縮，獲得超濾濃縮液1L。超濾濃縮液首先通過s印hadexG50去除其中的鹽離子，隨后采用離子交換層析的方法純化其中的目的蛋白。HAAH的等電點為4.8，所以采用DEAE-s印harose-FF陰離子交換層析柱，在0.1-2M濃度剃度NaCl的PBS(pH7.0)洗脫下，純化HAAH蛋白。純化后的HAAH蛋白經SDS-PAGE電泳及灰度掃描，證實純化后蛋白的純度可達到99%。純化后最終獲得HAAH蛋白3g。二、抗HAAH單克隆抗體制備純化的重組HAAH與不完全佐劑混合研磨后免疫BALB/c小鼠，小鼠免疫的劑量為每只小鼠每次皮下免疫0.5mg的HAAH,共免疫4次，每次間隔10天。取免疫小鼠的脾臟，篩網研磨后與sp2/0骨髓瘤細胞融合，制備淋巴細胞雜交瘤。從融合生長的雜交瘤細胞中篩選具有分泌結合HAAH抗體的單克隆雜交瘤，制備含單克隆抗體的小鼠腹水。共獲得3株能與HAAH結合的單克隆抗體，分別命名為2C6、2D5、2H8。具體實施過程如下1.免疫Balb/c小鼠重組表達的HAAH蛋白0.5ml(含1.5mgHAAH蛋白)與lml的完全佐劑(sigma公司產品)混勻，每只小鼠脊背皮下3點、腹股溝2點進行免疫注射，每點注射0.lml，共免疫3只BALB/c小鼠(BALB/c小鼠購自第四軍醫大學實驗動物中心)。IO天后進行第二次免疫，腹腔注射0.5mg的重組HAAH蛋白。第20天進行第三次免疫，免疫劑量與免疫途徑同第二次。第三次免疫后一周從尾靜脈采少量的血進行效價測定。ELISA間接法結果證實，小鼠血清的抗HAAH抗體效價達到了1:10000。第30天小鼠腹腔加強免疫注射lmgHAAH蛋白，第35天取小鼠脾臟，用于制備淋巴細胞雜交瘤。2、淋巴細胞雜交瘤的融合(1)主要試劑淋巴細胞雜交瘤技術中使用的細胞培養基是RPMI-1640(GibcoBRL)。以RPMI-1640為基礎培養液，在雜交瘤融合制備過程中根據添加的成分不同，用于不同的目的。不完全RPMI-1640培養基每100ml含RPMI-1640培養基原液96ml、100X谷氨酰胺溶液lml(0.2mol/L)、雙抗溶液lml(含青霉素1萬單位/ml、鏈霉素10mg/ml)、7.5。/oNaHC03溶液2ml、HEPES溶液lml(lmol/L)。上述液體均已通過過濾除菌。完全RPMI-1640培養基每100ml含不完全RPMI-1640培養基80ml、胎牛血清20ml。完全1640用于骨髓瘤細胞SP2/0和建株后的雜交瘤細胞的培養。HT培養基完全RPMI-1640培養基99ml、lml次黃嘌呤和胸腺嘧喊核苷(HT)。HAT培養基:完全RPMI-1640培養基98ml、lmlHT、lml氨基喋呤(A)。(2)骨髓瘤細胞與脾細胞的融合骨髓瘤細胞融合前收集對數生長的骨髓瘤細胞(SP2/0)，懸浮于不完全培養基中。脾淋巴細胞取上述已經免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球放血并處死后在75%酒精中浸泡1分鐘，在超凈臺中用無菌手術剪剪開腹膜，取出脾臟置于平9皿中，分別用20ml不完全培養基洗滌2次。剝去脾臟周圍結締組織后，將脾臟移入200目銅網上(置于平皿中)，用lml玻璃注射器針芯輕輕擠壓研磨脾臟，用10ml不完全培養基沖洗篩網。收獲脾細胞懸液，1000rpm離心10分鐘，不完全培養基離心洗滌3次，最后將細胞重懸于10ml不完全培養基。飼養細胞的制備取一只正常BALB/c小鼠(未經過免疫)，按照與制備脾淋巴細胞相同的方法制備伺養細胞。96孔細胞培養板，每孔加入0.1ml含106個飼養細胞備用。骨髓瘤細胞與脾淋巴細胞的融合-將1X108個脾細胞與1X107個骨髓瘤細胞SP2/0混合后，1000rpm離心5分鐘，吸凈上清。手指輕輕彈擊融合管底，使沉淀細胞松散均勻，置37。C預熱。1分鐘內加入37。C預熱的PEG(sigma)lml，邊加邊輕輕攪拌。90秒內加入20ml預熱的不完全培養基，靜置10分鐘。1000rpm離心5分鐘，棄去上清。加入5mlHAT培養基，輕輕吹吸沉淀細胞，使其懸浮并混勻，然后補加HAT培養基至50ml。上述含飼養細胞的96孔細胞培養板，每孔0.lml，培養板置37。C，5%0)2培養箱內培養。5天后用HAT培養基換出1/2培養基。IO天后用HT培養基換出HAT培養基；經常觀察雜交瘤細胞生長情況，待其長至孔底面積1/10以上時吸出上清檢測抗體。(3)雜交瘤篩選純化的重組HAAH蛋白包被ELISA板，20ug/孔。取有雜交瘤生長孔的培養上清0.lml，加入已包被好的ELISA板中，陰性對照孔加入0.lml完全1640培養基，37'C1個小時。洗板后加入羊抗鼠酶標抗體O.lml，37'C1個小時后洗板，加入OPD底物顯色。陽性較強孔對應的雜交瘤細胞轉至24孔板中繼續培養，并進行三次的克隆化。本次融合獲得了三株陽性克隆。分別命名為2C6、2D5、2H8。這三株單抗經抗體亞類檢測證實均為IgG2a。(4)單克隆抗體腹水制備BALB/c小鼠15只，每只腹腔注射液體石蠟0.2ml，7天后腹腔注射上述篩選出的三株雜交瘤細胞。每種雜交瘤各注射5只BALB/c小鼠，每只注射106個雜交瘤細胞。13天后抽取腹水，離心收集后-2(TC保存備用。三、抗HAAH單克隆抗體介導NK細胞的ADCC活性以A549肺癌細胞、7721肝癌細胞、MCF乳腺癌細胞為靶細胞，磁珠分離獲得的人NK細胞為效應細胞，兩種細胞混合后在96孔板中培養，效應細胞與靶細胞數量的比例為5:1。對照組只有腫瘤細胞與NK細胞混合培養，實驗組除了腫瘤細胞和NK細胞外還加入10P1的單克隆抗體腹水。為了計算殺傷率的需要，還另設了只有單獨NK細胞和只有單獨腫瘤細胞的對照孔。各組細胞在同一塊96孔培養板上，37。C培養4小時后，分別用CellCountingkit-8試劑盒測定活細胞的量，計算殺傷率。殺傷率(％)=〔l一(Ae+t—Ae)/At〕X100%;Ae:單純效應細胞孔即NK細胞孔的A值(吸光值)；At:單純靶細胞孔即K562細胞孔的A值；Ae+t:效應細胞加靶細胞孔的A值。各組的殺傷率結果如下表表l.3株單克隆抗體介導ADCC作用結果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>從上表的實驗結果可以看出2D5這一株單克隆抗體具有明顯的介導NK細胞ADCC作用，另外兩株單克隆抗體2C6與2H8只有很弱或沒有ADCC作用。四、2D5單克隆抗體亞類以及重、輕鏈可變區氨基酸序列的確定分泌2D5單克隆抗體的雜交瘤細胞培養上清，采用小鼠抗體類別鑒定試劑盒進行鑒定。證實2D5單克隆抗體屬于小鼠IgG2a亞類。提取2D5雜交瘤細胞的總RNA，采用小鼠可變區cDNA基因擴增的5組引物，分別對重、輕鏈可變區基因進行擴增。結果，各有一對引物分別擴增出了重鏈可變區cDNA和輕鏈可變區cDNA。重、輕鏈可變區cDNA分別克隆到T載體后進行基因序列測定，在基因庫中進行序列比對，未發現與本序列相同的基因。以本基因序列推導的氨基酸序列經過序列比對證實2D5單克隆抗體可變區的結構具有鼠抗體典型的骨架結構特征，可變區中高變區的氨基酸序列也具有獨特的結構，現有的抗體可變區氨基酸序列沒有與其有重復的序列。根據2D2單克隆抗體輕鏈可變區cDNA序列推導出的相應氨基酸序列如下GlnPheValLeuThrGluSerGlyAlalieMetSerThrAlaMetGlyGlyArgValThrlieAlaCysAlaThrSerGlyGlySerAspThrArgAsnLeuHisTrpTyrAlaThrValThrArgLeuProGlyArgValThrSerLysArgProSerPheAlaCysLeuGluSerArgThrAsnGlyAspAlaLysValLeuProGlyPhePheAsnGlyGinThrPheAlaSerProPheValAlaThrProAsnAlaHisValProAlaAspGlyLeuLeuGlyHisAlaGlySerLysAlaPheGlySer根據2D2單克隆抗體重鏈可變區cDNA序列推導出的相應氨基酸序列如下AlaValSerProAsnGlyLysTyrLysGlyAsnSerArgProThrCysProAspCysPheProAlaThrSerLeuGluGlyLeuPheLeuGluLeuSerArgArgAlaLysCysPheProThrValValArgGlyPheGluHisThrCysAsnThrArgGluLeuProAspLeuGlyArglieHisSerlieLysAlaGlylieHisArgAsnGlyGlylieGinPhelieThrPheGlyLeuCysGlyAspArgliePheProGluValAspAsnArgValLysPheThrCysSerAsnAspSerValAsnGlySerAlaPhelieArgCys五、2D5單克隆抗體在SCID-Hu小鼠腫瘤動物模型上的抗腫瘤實驗以SCID小鼠(T細胞核B細胞聯合免疫缺陷小鼠)為原型，引入人外周血單個核細胞后構建的具有人免疫應答特征的嵌合型小鼠作為腫瘤動物模型，分別建立A549肺癌細胞、7721肝癌細胞、MCF乳腺癌細胞的實體瘤模型。36只荷瘤小鼠，分為9組，每組4只。對照組荷瘤小鼠不注射NK細胞和2D5單克隆抗體。荷瘤小鼠+NK組，每只荷瘤小鼠注射107人NK細胞。荷瘤小鼠+NK組+2D5單克隆抗體組，每只荷瘤小鼠注射107人NK細胞和lmg純化的2D5單克隆抗體。平行實驗，比較各組之間瘤體的大小。結果見表2。表.22D5單克隆抗體對SCID-Hu荷瘤小鼠的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>從上表的體內實驗結果可以看出，2D5單克隆抗體對這三種腫瘤都具有很強的提高NK細胞殺傷，能夠明顯提高NK細胞在體內的抗腫瘤活性。六、抗HAAH單克隆抗體用于腫瘤組織切片的免疫組化染色2D5單克隆抗體腹水，1:500稀釋后用于腫瘤病理切片的免疫組化染色。11張已確診的腫瘤組織切片，11張對應器官的正常組織切片分別與2D5單克隆抗體結合，再用羊抗鼠酶標二抗及底物顯色。結果表明這11張已經確診的腫瘤組織切片均為陽性。而11張相應器官的正常組織切片均為陰性。顯示了2D5單克隆抗體良好的特異性。ll張已確診的腫瘤病理切片分別是肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、子宮頸癌、卵巢癌、結腸癌、前列前癌、腎癌、食道癌、膀胱癌。陰性對照切片為ll種對應器官的正常組織切片。序列表<110>廣州羅森生物科技有限公司<120>—種高特異性的抗腫瘤單克隆抗體<160>4<210>1<211>105<212>PRT<213>人工序列<400>1GinPheValLeuThrGluSerQlyAlalieMetSerThrAlaMet151015GlyGlyArgValThrlieAlaCysAlaThrSerGlyGlySerAsp202530ThrArgAsnLeuHisTipTyrAlaThrValThrArgLeuProGly354045ArgValThrSerLysArgProSerPheAlaCysLeuGluSerArg505560ThrAsnGlyAspAlaLysValLeuProGlyPhePheAsnGlyGin657075ThrPheAlaSerProPheValAlaThrProAsnAlaHisValPro808590AlaAspGlyLeuLeuGlyHisAlaGlySerLysAlaPheGlySer95100105<210>2<2">1"<212>PRT<213>人工序列<400>2AlaValSerProAsnGlyLysTyrLysGlyAsnSerArgProThr151015CysProAspCysPheProAlaThrSerLeuGluGlyLeuPheLeu202530GluLeuSerArgArgAlaLysCysPheProThrValValArgGly354045PheGluHisThrCysAsnThrArgGluLeuProAspLeuGlyArg505560lieHisSerlieLysAlaGlylieHisArgAsnGlyGlylieGin657075PhelieThrPheGlyLeuCysGlyAspArgliePheProGluVal808590AspAsnArgValLysPheThrCysSerAsnAspSerValAsnGly95100105SerAlaPhelieArgCys110<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>3atgaattcatggtgattgcattgctgggc29<210>3<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>4atgcggccgcctaaattgctggaaggctgcgtc3權利要求1、一種高特異性的抗腫瘤單克隆抗體，其特征在于該抗體的輕鏈可變區由105個氨基酸組成，其序列如下GlnPheValLeuThrGluSerGlyAlaIleMetSerThrAlaMetGlyGlyArgValThrIleAlaCysAlaThrSerGlyGlySerAspThrArgAsnLeuHisTrpTyrAlaThrValThrArgLeuProGlyArgValThrSerLysArgProSerPheAlaCysLeuGluSerArgThrAsnGlyAspAlaLysValLeuProGlyPhePheAsnGlyGlnThrPheAlaSerProPheValAlaThrProAsnAlaHisValProAlaAspGlyLeuLeuGlyHisAlaGlySerLysAlaPheGlySer重鏈可變區由111個氨基酸組成，其序列如下AlaValSerProAsnGlyLysTyrLysGlyAsnSerArgProThrCysProAspCysPheProAlaThrSerLeuGluGlyLeuPheLeuGluLeuSerArgArgAlaLysCysPheProThrValValArgGlyPheGluHisThrCysAsnThrArgGluLeuProAspLeuGlyArgIleHisSerIleLysAlaGlyIleHisArgAsnGlyGlyIleGlnPheIleThrPheGlyLeuCysGlyAspArgIlePheProGluValAspAsnArgValLysPheThrCysSerAsnAspSerValAsnGlySerAlaPheIleArgCys。2、如權利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于其與抗原HAAH發生特異性妙入^口口o3、如權利要求1或2所述的單克隆抗體，其特征在于該抗體的恒定區為鼠IgG2a亞類。4、如權利要求1所述的單克隆抗體在制備治療腫瘤藥物中的應用。5、如權利要求1所述的單克隆抗體在制備治療肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、子宮頸癌、卵巢癌、結腸癌、前列前癌、腎癌、食道癌、膀胱癌藥物中的應用。全文摘要本發明所述的一種高特異性的抗腫瘤單克隆抗體涉及腫瘤學和醫學領域。本發明尤其涉及抗人腫瘤的特異性單克隆抗體及其應用。該抗體的輕鏈可變區由105個氨基酸組成，重鏈可變區由111個氨基酸組成。本發明的單克隆抗體能顯著提高NK細胞的ADCC活性，使NK細胞對腫瘤的殺傷率提高至少50％。更為重要的是其可變區的氨基酸序列具有其自身的唯一性，它的可變區氨基酸序列與其它已報道的抗HAAH單克隆抗體完全不同，這是區分不同抗體特性的根本。文檔編號C07K16/40GK101654482SQ20091004141公開日2010年2月24日申請日期2009年7月27日優先權日2009年7月27日發明者張明杰申請人:廣州羅森生物科技有限公司