甘蔗宿根矮化病病菌多克隆抗體的制備方法

專利名稱：：甘蔗宿根矮化病病菌多克隆抗體的制備方法
技術領域：
：本發明涉及多克隆抗體制備
技術領域：
，具體是關于甘蔗宿根矮化病病菌多克隆抗體的制備方法。
背景技術：
：甘蔗宿根矮化病USD)是甘蔗生產上最重要的一種細菌性病害，病原菌Lxx極細小，寄生于甘蔗木質部導管內。由于該病沒有明顯的外部和內部癥狀，且易與干單造成的癥狀相混，加上其主要通過帶菌種莖和砍收工具傳播，從而導致無意識的傳播，造成病害蔓延，對甘蔗生產危害極大。該病通常造成甘蔗減產12—37%,在干單的情況下減產高達60y。，宿根性減弱，即使是無病的健康種苗在生產上使用5年后也是100%感病。由于該病原菌難分離培養，使RSD診斷很困難。傳統上該病通常釆用剖莖檢視和相差顯微鏡觀察病原菌的診斷方法。但前者的準確性極差，后者的操作繁雜，檢測的靈敏度也不高。隨著免疫學技術在生物醫學及動植物病原菌的檢測上的廣泛應用，將該技術用于甘蔗RSD的診斷已成為可能。該法具有可檢測樣品數多，操作簡單,準確性高等特點，但受到需要特異性抗體的限制。目前，還尚未見有該抗體制備的報道，因此，迫切需要制備該病原菌的抗體，以滿足在甘蔗科研及生產上對RSD病原診斷的需要。
發明內容本發明的目的在于提供一種甘蔗宿根矮化病病菌多克隆抗體的制備方法。該制備方法簡單、成本低廉，用本方法制備的甘蔗多克隆抗體具有特異性高，純度及效價高，可長期保存的優點，該抗體可以應用于甘蔗宿根矮化病病菌的檢測。本發明的目的可通過下述技術方案來實現一種甘蔗宿根矮化病病菌多克隆抗體的制備方法，包括如下步驟(1)病原菌的分離培養，獲取抗原；(2)取(l)的抗原與等量的弗氏完全佐劑混合，乳化，取混合液皮下多點免疫健康家兔；(3)2~3周后，取(1)的抗原與等量的弗氏不完全佐劑混合，乳化，取混合液對(2)的免疫家兔按(2)的相同劑量及方式進行再免疫，此步驟中，重復多次免疫，每次間隔為1~3周，測定效價達到要求后，心臟釆血，分離抗血清；(4)抗血清純化、得到目標多克隆抗體；其中，步驟(1)的病原菌為甘蔗宿根矮化病病菌。步驟(1)中的病原菌的分離培養步驟為(1.1)蔗汁的獲得砍取感病品種的成熟蔗莖，將其表面清洗干凈；選取近基部的若干節提取帶菌的蔗汁，將蔗汁盛于離心管中；(1.2)蔗汁的過濾及低速離心用濾紙過濾蔗汁，將獲得的蔗汁分裝至離心管里，低速離心后，將上清液轉到新的離心管中，重復上述離心步驟一次；(1.3)病原菌的培養在無菌條件下，菌液經細菌過濾器過濾后用PBS緩沖液進行梯度稀釋，再將各個梯度濃度的菌液點滴在SC培養基上，用封口膜對培養皿進行封口，倒置于263(TC恒溫箱中進行培養；(1.4)病原菌的繼代純化在無菌條件下，挑取上述長出的單菌落到SC培養基上進行純化培養；(1.5)擴大培養病原菌制備抗原在無菌條件下，挑取經純化后的單菌落到SC液體培養基培養，待培養基變混濁時，收集菌液，高速離心，棄上清，用PBS緩沖液懸浮沉淀，獲得抗原。步驟(4)中的抗血清純化、獲得目標多克隆抗體步驟為(4.l)取適量抗血清，加入等體積生理鹽水后，再逐滴加入飽和硫酸銨溶液若干亳升，邊加邊攪拌，充分混合后，靜置30minlh;(4.2)離心棄去沉淀，以除去雜蛋白，在上清液中再加飽和硫酸銨溶液，充分混勻后靜置30minlh;(4.3)離心，棄上清，以生理鹽水溶解沉淀后，再用飽和硫酸銨溶液進行沉淀；(4.4)離心，棄上清，按照(4.2)(4.3)步驟重復若干次，用生理鹽水溶解沉淀，裝入透析袋透析除鹽；(4.5)最后以BaCl2檢查透析液中的3042一或以納氏試劑檢查冊4+,直至無S042-或NH/出現為止;(4.6)離心去沉淀，上清液即為純化的多克隆抗體IgG。本發明的突出的實質性特點和顯著的進步在于本發明首次提出了甘蔗宿根矮化病病菌多克隆抗體的制備方法，在本發明中，甘蔗宿根矮化病病菌分離自甘蔗蔗汁，因而是蔗汁環境樣品中甘蔗宿根矮化病病菌的代表菌群類型，基于此得到的多克隆抗體可特異性識別蔗汁中的甘蔗宿根矮化病病菌。此外，該制備方法還有簡單、成本低廉的優點。用本發明制備的甘蔗多克隆抗體具有特異性高，純度及效價高(大于10000)，可長期保存的優點，將其用于甘蔗科研及生產領域中甘蔗宿根矮化病病菌的免疫檢測中，將具有精確性、靈敏度高等優勢，應用前景廣闊。具體實施例方式通過以下實施例對本發明作進一步的詳細說明。實施例一一種甘蔗宿根矮化病病菌多克隆抗體的制備方法，按如下步驟進行(i)病原菌的分離培養，獲取抗原；(i.i)蔗汁的獲得于11一12月份，晴朗天氣，砍取感病品種的成熟蔗莖,6去除表面雜質后，用洗潔劑將其表面清洗干凈，晾干，用70%酒精擦拭表面進行消毒；把蔗莖切成510cm長后，縱向剖開，用鉗子直接鉗取蔗汁，蔗汁盛于50ml的離心管中。U.2)蔗汁的過濾及低速離心用濾紙過濾蔗汁，將過濾后的蔗汁轉到新的離心管里，低速(2000rpm)離心5分鐘，將上清液轉到新的離心管中，重復上述離心步驟一次。(i.3)病原菌的培養在無菌條件下，菌液經0.45pm細菌過濾器過濾后用0.01M的PBS緩沖液進行梯度稀釋，再將各個梯度濃度的菌液點滴到SC培養基，待菌液完全被培養基吸干后，用封口膜對培養皿進行封口，倒置于26~3(TC恒溫箱中進行培養約20~35天，出現無色、圓形、點狀大小，邊緣整齊中間隆起的菌落，菌落直徑約為0.1-0.5mm。(i.4)病原菌的繼代純化在無菌條件下，挑取上述長出的單菌落到SC培養基上進行純化培養。(i.5)擴大培養病原菌制備抗原在無菌條件下，挑取經繼代純化后的單菌落，轉入SC液體培養基，振蕩培養約1020天。待培養基變混濁時，收集菌液，高速離心(12000rpin)10分鐘，棄上清，用PBS緩沖液懸浮沉淀，獲得抗原。(2)取抗原與等量的弗氏完全佐劑混合，乳化；取(1)的懸浮菌液(抗原)與等體積的弗氏完全佐劑(sigma公司，貨號F5881)混合均勻，乳化后，選擇健康家兔，取混合液按照lmL/kg體重以皮下多點注射的方式進行免疫。(3)2周后，取(1)的懸浮菌液(抗原)與等體積的弗氏不完全佐劑(sigma公司，貨號F5506)混合均勻，乳化后，取混合液對(2)的免疫家兔按照lmL/kg體重以皮下多點注射的方式進行再免疫；在此步驟中，重復進行多次免疫，每次免疫間隔為2周，第5次免疫10天后，耳緣靜脈釆集1-2mL血液，靜置分離出血清后測定效價，具體步7a)酶標板的包被將菌液以PBS(0.01M,pH7.2~7.4)稀釋至1:100、1:500、1:1000、1:3000，取100pL加入酶標板孔。37°C孵育4h6h進行包被。b)洗板孵育完畢后甩掉板孔中液體，以250pL/孔的PBS—T(PBS含0.05%Tween—20)洗滌3次，每次靜置10~20s,完畢后用吸水紙拍干。c)封閉向酶標板孔中加入碳酸鹽緩沖液(O.02M，pH9.0)150)iL/孔，37°C孵育lh。完畢后，甩掉孔中液體，按照步驟(b)進行洗板。d)加樣將血清以PBS按照1:500、1:1000、1:3000、1:5000進行稀釋后，以50nL/孔的量加入酶標板。e)反應37。C孵育lh后，進行洗板。f)加酶標二抗每孔加入用PBS3000倍稀釋的酶標二抗lOOjaL,37°C反應30min后進行洗板。g)顯色每孔加入顯色液(sigma公司，貨號T0440)IOO)liL，37。C顯色反應15min。h)測定每孔加終止液(0.5M鹽酸)50|liL終止反應，用酶標儀于450nm/630nm波長處測定OD值。表1是其中一次的測定數據。表1抗血清效價(OD值)測定數據示例<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>i)測定血清效價合格(血清稀釋比例大于1:10000，OD值高于l.O)后，心臟采血，收集并分離血清。(4)抗血清純化，獲取目標多克隆抗體(4.1)取步驟(3)獲得的血清20mL，加生理鹽水20mL,再逐滴加入飽和硫酸銨溶液lGmL，邊加邊攪拌，充分混合后，靜置30min。(4.2)3000rpm離心20min，棄去沉淀，以除去纖維蛋白。在上清液中再加飽和硫酸銨溶液30mL,充分混勾后靜置30min。(4.3)3000rpm離心20min,棄上清，于沉淀中加20ml生理鹽水，使之溶解，再加飽和硫酸銨溶液10mL,充分混勻后靜置30min。(4.4)3000rpm離心20min，棄上清。重復步驟(4.3)2~3次后，用10mL生理鹽水溶解沉淀，裝入透析袋，在去離子水中透析過夜。然后于生理鹽水中4'C透析24h，中間換液數次。(4.5)以1。/。BaCl2檢查透析液中的S042—或以納氏試劑檢查NH4+(取3一4mL透析液，加試劑1~2滴,出現磚紅色即認為有NH/存在)，直至無S042—或冊4+出現為止。(4.6)離心去沉淀，上清液即為純化的多克隆抗體IgG。斑點酶標免疫試驗(DB—EIA)壓板取10~15張吸水紙，剪成與硝化纖維膜一樣大小(硝化纖維膜的長度與寬度略小于壓板的長寬度)，硝化纖維膜用蒸鎦水浸泡23min,將硝化纖維膜附到一塊帶孔的壓板上(注意膜與板上的孔對齊)，然后與吸水紙一起用壓板壓好,上緊螺絲。上樣用微量移液器吸取100~130nL蔗汁樣品點于板孔中，每孔點一個樣。晾干將點好樣的板，置于室溫、通風的地方，待孔中的樣液全部被硝化纖維膜和吸水紙吸干(l~2h)，用螺絲刀解開壓板，取出硝化纖維膜。干燥將晾干后的硝化纖維膜，置于8(TC的恒溫鼓風干燥箱中lh。封閉將硝化纖維膜置于3。/。的脫脂奶粉水溶液中，在搖床上搖動30min。洗膜取出硝化纖維膜，用蒸鎦水沖洗3次。加入RSD兔抗體(一抗)將RSD兔抗體溶于PBST中，將沖洗干凈的硝化纖維膜置于加入RSD兔抗體的PBST溶液中，并在搖床上溫育l~2h。洗膜取出硝化纖維膜，用蒸鎦水沖洗3次。加入羊抗兔堿性磷酸酶標記抗體(二抗)將堿性磷酸酶標記抗體溶于PBST中，將沖洗干凈的硝化纖維膜置于加入堿性磷酸酶標記抗體的PBST溶液中，并在搖床上溫育l2h。洗膜取出硝化纖維膜，用蒸鎦水沖洗3次。加入底物顯色將固藍BB鹽加入到底物工作液中，將硝化纖維膜在加入固藍BB鹽的底物工作液中溫育，并在搖床上搖動l2h(置于黑暗處)。洗膜取出硝化纖維膜，用蒸鎦水沖洗3次。漂白將沖洗后的硝化纖維膜在10%雙氧水中漂白20min。晾干、拍照、記錄結果(蘭褐色為陽性)。實施例二一種甘蔗宿根矮化病病菌多克隆抗體的制備方法，其步驟與實施例一相同，主要區別在于步驟(l)中的(l.3)病原菌的培養步驟和(1.4)病原菌的繼代純化步驟中所用到的SC培養基為改良的SC培養基cornmealagar(15—18)g/L+Bacto—agar(3_5)g/L+Bacto—peptone(6—9)g/L+Bovineheminchloride15mg/L+MgSO4*7H2O(0.l—O.2)g/L+K2HP0413ml(0.1M儲存液)/L十KH2P0487ml(O.IM儲存液)/L;Glucose(0.5—2)g/L+Cysteine(1—2)g/L+Bovineserumalbumin2g/L，PH6.5—8.0;步驟(l)中的(1.5)擴大培養病原菌制備抗原步驟中所用到的液體SC培養基為改良的液體SC培養基Bacto—peptone(6—9)g/L+Bovineheminchloride15mg/L+MgS04*7H20(0.1—0.2)g/L+K2HPO413ml(0.1M儲存液)/1>KH2P0487ml(0.1M儲存液)/L;Glucose(0.5—2)g/L+Cysteine(l—2)g/L+Bovineserumalbumin2g/L,PH6.5—8.0。采用上述改良的sc培養基和改良的液體SC培養基進行病原菌的分離培養，能更快獲取抗原。其它步驟和檢測方法與實施例l相同。權利要求1.一種甘蔗宿根矮化病病菌多克隆抗體的制備方法，包括如下步驟(1)病原菌的分離培養，獲取抗原；(2)取抗原與等量的弗氏完全佐劑混合，乳化，取混合液皮下多點免疫健康家兔；(3)2～3周后，取(1)的抗原與等量的弗氏不完全佐劑混合，乳化，取混合液對(2)的免疫家兔按(2)的相同劑量及方式進行再免疫，重復多次免疫，每次間隔1～3周，測定效價達到要求后，心臟采血，分離抗血清；(4)將(2)的抗血清純化、獲得目標多克隆抗體；其特征在于步驟(1)的病原菌為甘蔗宿根矮化病病菌。2.如權利要求1所述的甘蔗宿根矮化病病菌多克隆抗體的制備方法，其特征在于步驟(1)中的病原菌的分離培養步驟(1.1)蔗汁的獲得砍取感病品種的成熟蔗莖，將其表面清洗干凈，選取近基部的若干節提取帶菌的蔗汁，將蔗汁盛于離心管中；(1.2)蔗汁的過濾及低速離心用濾紙過濾蔗汁，將獲得的蔗汁分裝至離心管里，低速離心后，將上清液轉到新的離心管中，重復上述離心步驟一次；(1.3)病原菌的培養在無菌條件下，菌液經細菌過濾器過濾后用PBS緩沖液進行梯度稀釋，再將各個梯度濃度的菌液點滴在SC培養基上，用封口膜對培養皿進行封口，倒置于263(TC恒溫箱中進行培養；(1.4)病原菌的繼代純化在無菌條件下，挑取上述長出的單菌落到SC培養基上進行純化培養；(1.5)擴大培養病原菌制備抗原在無菌條件下，挑取經純化后的單菌落到SC液體培養基振蕩培養，待培養基變混濁時，收集菌液，高速離心，棄上清，用PBS緩沖液懸浮沉淀，獲得抗原。3.如權利要求2所述的甘蔗宿根矮化病病菌多克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的SC培養基為改良的SC培養基cornmealagar(15—18)g/L+Bacto—agar(3—5)g/L+Bacto—peptone(6—9)g/L+Bovineheminchloride15mg/L+MgSCWH20(0.1—0.2)g/L+K2HP0413ml(0.IM儲存液)/L+K跳87ml(0.1M儲存液)/L;Glucose(0.5—2)g/L+Cysteine(1—2)g/L+Bovineserumalbumin2g/L;PH6.5—8.0;所述的SC液體培養基為改良的SC液體培養基Bacto~peptone(6—9)g/L+Bovineheminchloride15mg/L+MgS04*7H20(0.1—0.2)g/L+K2HP0413ml(0.lM儲存液)/L+KH2P0487ml(0.1M儲存液)/L;Glucose(0.5—2)g/L+Cysteine(1—2)g/L+Bovineserumalbumin2g/L;PH6.5—8.0。4.如權利要求1或2或3所述的甘蔗宿根矮化病病菌多克隆抗體的制備方法，其特征在于步驟(4)的抗血清純化、獲得目標多克隆抗體步驟如下(4.l)取適量抗血清，加入等體積生理鹽水后，再逐滴加入飽和硫酸銨溶液若干亳升，邊加邊攪拌，充分混合后，靜置30minlh;(4.2)離心棄去沉淀，以除去雜蛋白，在上清液中再加飽和硫酸銨溶液，充分混勻后靜置30minlh;(4.3)離心，棄上清，以生理鹽水溶解沉淀后，再用飽和硫酸銨溶液進行沉淀；(4.4)離心，棄上清，按照(4.2)(4.3)步驟重復若千次，用生理鹽水溶解沉淀，裝入透析袋透析除鹽；(4.5)最后以BaCl2檢查透析液中的S042—或以納氏試劑檢查NH/，直至無S0/一或冊4+出現為止；(4.6)離心去沉淀，上清液即為純化的多克隆抗體IgG。全文摘要本發明涉及甘蔗宿根矮化病的防治
技術領域：
，提出甘蔗宿根矮化病病菌多克隆抗體的制備方法，其步驟包括(1)病原菌的分離培養，獲取抗原；(2)取抗原與等量的弗氏完全佐劑混合，乳化，免疫家兔；(3)取抗原與等量的弗氏不完全佐劑混合，乳化，再免疫家兔，重復免疫多次，測定效價達到要求后，心臟采血，分離抗血清；(4)抗血清純化、獲得目標多克隆抗體。在本發明中，甘蔗宿根矮化病病菌分離自甘蔗蔗汁，基于此得到的多克隆抗體可特異性識別蔗汁中的甘蔗宿根矮化病病菌。用本發明制備的甘蔗宿根矮化病病菌多克隆抗體，具有特異性高，純度及效價高，可長期保存的優點，這對今后在甘蔗科研及生產上用免疫學方法檢測病原菌進行甘蔗宿根矮化病(RSD)診斷具有重要的現實意義。文檔編號C07K16/12GK101560256SQ20091003984公開日2009年10月21日申請日期2009年5月27日優先權日2009年5月27日發明者萬宇平,何方洋,余厚美,睿劉,楊湛端,沈萬寬,潘永保,鄧海華,陳健文,齊永文申請人:廣州甘蔗糖業研究所