專利名稱：二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥半抗原及其制備方法
技術領域：
本發明屬于免疫學技術領域，具體涉及一種二乙氧基^l代磷酸酯 類有機磷農藥半抗原及其制備方法。
背景技術：
農藥殘留問題嚴重危害著人民群眾的身體健康。近年來，因不合 理使用農藥而引起的群體性中毒和農產品農殘超標事件屢有發生。農 藥殘留問題也嚴重影響了我國農產品的國際競爭力，農藥殘留標準成 為貿易技術壁壘的主要內容，近年來我國的蔬菜、茶葉等農產品和食 品因農藥殘留等問題被進口國拒絕、扣留、退貨、索賠和終止合同的
事件時有發生。2003年種植業農產品所受損失的金額高達41.1億美 元。
有機磷類農藥由于高效，廉價而在農業和種植業上廣泛使用，但 是有機磷農藥作為神經毒物，會引起神經功能紊亂、震顫、精神錯亂、 語言失常等癥狀。在2002年中華人民共和國公布的第199號公告上 明令禁止在蔬菜、果樹、茶葉、中草藥材上不得使用和限制使用的農 藥共有19種，其中有機磷農藥占了 17種，而含二乙氧基硫代磷酸酯 共有結構的農藥就有8種。根據農業部第194號、第199號和第274 號公告等規定，我國己經限制甲胺磷等19種高毒農藥的使用，決定 對甲胺磷、對硫磷、甲基對硫磷、久效磷和磷胺等五種有機磷高毒農 藥的使用進行削減，方案為2004年1月1日起禁止在除棉花以外的農作物使用，2007年1月1日起全面禁止在農業上使用。
加強農殘檢測、提高分析檢測水平是控制農藥殘留的重要手段之 一。研究和完善農藥殘留的分析檢測技術，尤其是免疫快速檢測技術， 對于加強農藥殘留的監控管理、保障人民生命安全和農產品質量安 全、提高農產品在國際市場的競爭力、滿足我國人民物質生活水平日 益提高的要求、促進我國經濟發展具有重要意義。
目前國內外的農藥殘留免疫檢測研究，基本上都集中于單組分特 異性檢測及相應試劑盒的研制，但是實際生產中，食物中殘留的農藥 種類較多，單組分試劑盒很難實現快速高通量的檢測，雖然儀器多殘 留檢測已經可以實現越來越多組分的多殘留檢測，但所需儀器復雜昂 貴，而且樣品前處理繁瑣費時，操作需專業人員、檢測費用高，很難 適應許多場合快速檢測的需要。因此，實現農藥多殘留快速檢測，已 經是國內外殘留分析的一種新趨勢。
目前農藥多殘留免疫檢測國內研究成果比較少，國外僅有少量用 多克隆抗體和單克隆抗體進行有機磷農藥多殘留免疫檢測的研究報
道。Sudi， Johnson, Banks, Alcocer等相繼研究了有機磷農藥的共有 結構，設計出能夠識別相似結構的"簇抗原"，利用交叉反應，制備 出"簇多克隆抗體"，并研究了該抗體對幾種有機磷農藥的選擇性和 親和力，其中有的"簇多克隆抗體"已經應用于有機磷農藥多殘留的 檢測中，但有的抗體檢測限較高，親和力不夠。2002年，Mi Soon Jang 報道了用其設計的兩種半抗原免疫動物后制備的單克隆抗體實現了
一類有機磷農藥的多殘留檢測。該抗體對部分有機磷農藥檢測的IC5C)為0.1 0.3 pg/mL，但設計的半抗原只有兩種，不能通過構效關系篩 選更理想的半抗原用于制備單克隆抗體。2005年，劉金賢等公開了"用 于檢測有機磷農藥殘留的免疫抗體及其應用"。該發明以二乙基膦酸 乙酸為半抗原，不需要進行結構改造即可與蛋白質偶聯用于免疫動 物，從而制備的抗體可以檢測多種有機磷農藥，但可以檢測的農藥沒 有針對性，檢測限差異很大。可見本領域作為半抗原設計這個關鍵課 題還沒有很好解決。
由于大多數藥物、毒素、環境污染物分子質量比較小，屬于僅有 反應原性而無免疫原性的半抗原，因此大部分小分子需要與大分子蛋 白質偶聯后才能產生免疫原性。目前制備小分子半抗原抗體的常規方 法是選擇具有毒理學意義的原形藥物作為待測物，設計合成保留待測 物分子結構特征或類似結構特征并帶有活性基團的半抗原，通過共價 鍵使半抗原與大分子蛋白質載體偶聯，制備人工免疫原，經動物免疫 程序制備針對半抗原的特異性抗體。而半抗原的提供是免疫化學分析 中最為關鍵的步驟，合理的半抗原設計和制備將大大提高抗體的質
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一系列可通用于一 類有機磷農藥檢測的半抗原，所述半抗原偶連載體蛋白后能使機體產 生效價高，能識別該類有機磷農藥共有結構的特異抗體。
本發明的另一個目的是提供所述半抗原的制備方法。
本發明還有一個目的是提供所述半抗原的應用。本發明所指的一類有機磷農藥共有結構是二乙氧基硫代磷酸酯。 本發明的技術方案是
提供一類半抗原，是二乙氧基硫代磷酰氯與帶羧基的苯酚衍生物 或氨基酸親核取代后的產物。
上述帶羧基的苯酚衍生物或氨基酸優選具有式(A》、式(A )、 式(Am)、式(Aiv)、式(Av)、式(人vi)、式(Avn)、式(A )、式(A K)所示結構式的物質，(A!) (A )式中n為0 9的整數，(Aix) 式中n為3 7的整數
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采用上述結構式(A》 (A!x)所示的帶羧基的苯酚衍生物或氨基 酸與二乙氧基硫代磷酰氯親核取代得到的半抗原(OP)的結構式分別 對應為(式(A,)對應式(B!)，依此類推)
<formula>formula see original document page 11</formula><formula>formula see original document page 12</formula>(Bix)
其中(B!) (B )式中n為0 9的整數，(BK)式中n為3 7的整數。
本發明同時提供了所述半抗原的制備方法是將二乙氧基硫代磷 酰氯和帶羧基的苯酚衍生物手臂在0°C 60°C、縛酸劑存在的條件下， 于有機溶劑中進行反應，生成目標半抗原(OP)。
所述帶羧基的苯酚衍生物手臂可選用帶羧基的苯酚衍生物、氨基 酸，或者通過羥基苯甲醛和丙二酸或氨基苯酚和酸酐合成得到。
所述縛酸劑優選氫氧化鉀、氫氧化鈉、碳酸鈉、金屬鈉、甲醇鈉、 乙醇鈉、吡啶或三乙胺的任意一種。
所述有機溶劑優選甲醇、乙醇、四氫呋喃、二氧六環、丙酮或二 氯甲垸的任意一種或兩種以上任意比例的混合物。
本發明提供的半抗原偶連載體蛋白后，能使機體產生效價高，特 異性好的針對含二乙氧基硫代磷酸酯共有結構有機磷農藥的抗體。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果
本發明針對一類有機磷農藥的共有結構一二乙氧基硫代磷酸酯 提供一系列半抗原，半抗原在分子結構，立體化學和電子分布上與含 二乙氧基硫代磷酸酯共有結構有機磷農藥對應體相似。半抗原結構中 引入苯環平面，使之與蛋白質偶聯后的全抗原更易于暴露在蛋白質載 體外面，因而更易于產生理想的抗體。所述半抗原的連接臂不易于誘導產生"臂抗體"，并且使用了一定長度的飽和或不飽和碳鏈，使機 體更易于識別。本發明所述半抗原分子具有便于與蛋白載體偶聯的活 性基團，且活性基團的存在對待測物分子的電子分布沒有影響。此半 抗原偶連載體蛋白后能使機體產生效價高，特異性好的針對含二乙氧 基硫代磷酸酯共有結構有機磷農藥的抗體，所述抗體可以檢測絕大部 分含二乙氧基硫代磷酸酯共有結構有機磷農藥，對17種限制使用的 有機磷農藥中的對硫磷、甲拌磷、特丁硫磷、治螟磷、內吸磷、硫環 磷、蠅毒磷、氯唑磷有很好的檢測效果，對噠嗪硫磷，三唑磷等高效 低毒農藥也具有較好的檢測效果。
具體實施例方式
下面結合具體實施例來進一步詳細說明本發明。 實施例1半抗原B ! (11=0)的制備方法
(TC下，取0.884g (6.4mmo1)對羥基苯甲酸，0.898g (16mmo1) KOH溶解于50mL甲醇中。攪拌下逐滴加入1.81g (9.6mmo1) 二乙氧 基硫代磷酰氯，升溫至65"C，攪拌反應18h。反應結束，反應旋轉蒸 發濃縮，得到的粗產物，溶解于乙酸乙酯中，用50mL2MNaOH溶液 萃取，水層用6M鹽酸酸化，析出沉淀，用水洗，得到產物1.05g，產 率為56.4% 。 ESI-MS analysis (negative) m/z 289 [M-H]-; 1H-NMR (400 MHz, CDC13 and TMS): S 1.36(t, /=7.1Hz， 6H， CH3); 4.24(qd, J尸7.1Hz, J2=7.1Hz, J3=7.1Hz, /4=10.0Hz, 4H, CH2); 7.26(d， 《/=8.1， 2H, ArH); 8.09(d, /=8.5,2H，ArH). 實施例2半抗原B！ (11=0)制備方法0。C下，取0.884g (6.4mmo1)間羥基苯甲酸，0.898g (16mmo1) KOH溶解于50mL甲醇中。攪拌下逐滴加入1.81g (9.6mmo1) 二乙氧 基硫代磷酰氯，升溫至65'C，攪拌反應18h。反應結束，反應旋轉蒸 發濃縮，得到的粗產物，用乙酸乙酯溶解，溶液濃縮，氯仿甲醇= 8: l過硅膠柱，得到黃色固體0.5g，產率為27.0%。 ESI-MS analysis (negative) m/z 289 [M隱H]-; 1H-NMR (400 MHz, CDC13 and TMS): S 1.37(t, J二7.0Hz, 6H， CH3); 4.25(qd， J產7.1Hz, J^7.1Hz, J3=7.1Hz, /4=9.6Hz, 4H, CH2); 7.45(d,聲4.7， 2H， ArH); 7.89(s， 1H, ArH); 7.94(d, 7=4.6, lH,ArH).
實施例3半抗原Bm 0=0)制備方法
取4.8848g (0.04moL)對羥基苯甲醛溶于吡啶中，加入催化劑量 DMAP，用干燥管保護，水浴85°C，攪拌。往上述溶液滴加3.746 (0.036moL)丙二酸，反應3h。反應結束，混合液傾入飽和碳酸氫鈉 溶液中，攪拌15min，用乙酸乙酯萃取，水層用4M鹽酸調pH至3， 析出白色固體2.32g，產率為78.6% 。ESI-MS analysis (negative) m/z 163 [M-H]國；1H-NMR (400 MHz, d6-Acetone and TMS): S 6.33(d, /=16.0Hz, 1H, CH=CH); 6.89(d， /=8.6Hz, 2H, ArH); 7.54(d, /=8.6Hz， 2H, ArH); 7.60(d, J^6.0Hz， 1H, CH=CH); 8.86(s, 1H, OH); 10.77(s, 1H, COO巧.
稱取0.7 (0.0125moL) KOH溶于無水甲醇中，稱取0.821g (0.005moL)上述固體，OT:攪拌下溶于上述溶液中，攪拌30min。滴 加1.415g (0.0075moL) 二乙氧基硫代磷酰氯，0。C反應過夜。反應結 束，過濾，上清液旋轉蒸發濃縮，用乙酸乙酯溶解，過濾，濾液選裝
14蒸發濃縮，加入適量飽和碳酸氫鈉溶液，攪拌25min，用乙酸乙酯萃 取，有機相濃縮析出結晶，用石油醚洗，得到產物0.75g，產率為11.9 %。 ESI畫MS analysis (negative) m/z 315 [M-H]-; 1H-NMR (400固z, CDC13 and TMS): S 1.36(t, J產7.0Hz, /2=7.0Hz, 6H, CH3); 4.23(qd, J產7.1Hz, /2=7,lHz, /產7.1Hz，力^9.6Hz, 4H, CH2); 6.37(d， /=16.0Hz, m, CH=CH); 7.21(d, /=8.4Hz, 2H， ArH); 7.52(d， /二8.5Hz， 2H, ArH); 7.74(d， >/=16.0 Hz, 1H， CH=CH). 實施例4半抗原Biv (『0)制備方法
取9.77g (0.08moL)間羥基苯甲醛溶于吡啶中，加入催化劑量 DMAP，用干燥管保護，水浴85°C，攪拌。往上述溶液滴加7.492 (0.072moL)丙二酸，反應3h。反應結束，混合液傾入飽和碳酸氫鈉 溶液中，攪拌15min，用乙酸乙酯萃取，水層用4M鹽酸調pH至3， 析出白色固體11.82g，產率為75.2%。 ESI-MS analysis (negative) m/z 163 [M-H]-; 1H畫NMR (400固z， d6-Acetone and TMS): 5 6.45(d, / =16.0Hz, 1H， CH=CH); 6.卯(dd， J產2.1Hz, J^7.8Hz， 1H, ArH); 7.13(dd, ^:4.8Hz, J2=11.9Hz, 2H， ArH); 7.25(t, /=7.8Hz, 1H, ArH); 7.60(d, /=16.0Hz, 1H, CH=CH); 8.54(s, 1H, OH); 10.77(s, 1H, COOH).
稱取4.48g (0.08moL) KOH溶于無水甲醇中，稱取3.283g (0.02moL)上述固體，0。C攪拌下溶于上述溶液中，攪拌30min。滴 加5.658g (0.03moL) 二乙氧基硫代磷酰氯，0。C反應過夜。反應結束， 過濾，上清液旋轉蒸發濃縮，用乙酸乙酯溶解，過濾，濾液選裝蒸發 濃縮，加入適量飽和碳酸氫鈉溶液，攪拌15min，用乙酸乙酯萃取，水層用6M鹽酸調pH至3，析出沉淀，用水洗，得到產物1.25g，產 率為19.8% 。 ESI-MS analysis (negative) m/z 315 [M-H]-; 1H-NMR(400 MHz, CDC13 and TMS): S l.36(t,風lHz, 6H, CH3); 4.23(qd, J產7.1Hz, /2=7.1Hz, J3二7.1Hz, /產10.0Hz, 4H， CH2); 6.43(d, J=16.0 Hz， 1H, CH=CH); 7.22-7.23(m, 1H， ArH); 7.36(d,聲5.4Hz， 3H, ArH); 7.74(d, 7=16.0 Hz， 1H, ArH); 7.73(d,聲16.0， 1H, CH=CH). 實施例5 半抗原Bv (11=1)制備方法
分別取5.46g (0.05moL)對氨基苯酚和5g (0.05moL) 丁二酸酐 溶于無水吡啶中，后者滴加入前者，室溫攪拌反應30min。加入適量 飽和碳酸鉀溶液，用乙酸乙酯萃取，水層用6M鹽酸調pH至2，析出 灰紫色固體，用蒸餾水洗，干燥得到產物3.5g，產率33.5%。 ESI-MS analysis (negative) m/z 208 [M-H]-; 1H-NMR (400 MHz, d6- Acetone and TMS): S 2.61畫2.67(m， 4H, CH2); 6.74-6.77(m， 2H， ArH); 7.45-7.47(m, 2H, ArH); 8.10(s, IH,麗)；8.98(s, 1H, OH); 10.712(s, 1H, COOH).
稱取l.Olg (0.018moL) KOH溶于無水甲醇中，稱取1.31g (0.006moL)上述固體，O-C攪拌下溶于上述溶液中，攪拌30min。滴 加1.1317g (0.006moL) 二乙氧基硫代磷酰氯，(TC反應12h。反應結 束旋干，用氯仿洗，過濾，上清濃縮后過(氯仿甲醇=6: 1)硅膠 柱，得0.60g，產率27.6%。 ESI-MS analysis (negative) m/z 360 [M誦H]-; 1H-NMR (400 MHz, CDC13 and TMS): S 1.32(t, /=7.1Hz, 6H, CH3); 2.58(s, 2H, CH2); 2.69(s, 2H, CH2); 4.15畫4.23(m, 4H， CH2); 7.06(d, /=7.9 Hz, 2H, ArH); 7.42(d, /=8.6 Hz, 2H, ArH); 8.11(s, 1H, NH).實施例6半抗原Bvi (11=1)制備方法
分別取5.46g (0.05moL) 3-氨基苯酚和5.0g (0.05moL) 丁二酸 酐溶于無水吡啶中，后者滴加入前者，室溫攪拌反應30min。加入適 量飽和碳酸鈉溶液，用乙酸乙酯萃取，水層用6M鹽酸調pH至2，析 出白色或淡黃色固體，用蒸餾水洗，干燥得到產物2.5g，產率23.9%。 ESI-MS analysis (negative) m/z 208 [M-H]-; 1H-NMR (400 MHz, d6-Acetone and TMS): S 2.64(s, 4H, CH2); 6.51(ddd， J產0.9Hz, /2=2.2Hz， J3=7.8Hz， 1H， ArH); 7.00(d， J:8.5Hz, 1H, ArH); 7.06(t, /=8.0Hz, 1H, ArH); 7.34(s, 1H, ArH); 8.24(s， 1H,NH); 9.09(s, 1H, OH).
稱取1.68g( 0.03moL )KOH溶于無水甲醇中，稱取2.09g( 0.01 moL ) 上述固體，0。C攪拌下溶于上述溶液中，攪拌30min。滴加0.15g (0.008moL) 二乙氧基硫代磷酰氯，0。C反應12h。反應結束旋干，用 氯仿洗，過濾，上清濃縮后過(氯仿甲醇=6: 1)硅膠柱，得0.80g， 產率27.5%。 ESI陽MS analysis (negative) m/z 360 [M-H]國；1H-NMR (400 MHz, CDC13 and TMS): S 1.32(t, /產7.0 Hz, /2=7.0Hz， 6H, CH3); 2.60(t, /=6.3Hz， 2H, CH2); 2.69(t, J二6.2Hz, 2H, CH2); 4.19(dqd， J「0.6Hz, /產7.0Hz /3=6.9Hz， /4=6.9Hz, /5=9.6Hz, 4H, CH2); 6.87(d， J二7.5Hz， 1H, ArH); 7.19(td, /產8.0Hz, J2=8.0Hz， J3=15.9Hz， 2H, ArH); 7.48(s, 1H, ArH); 8.16(s， IH，皿). 實施例7半抗原Bv (11=2)制備方法
分別取5.46g (0.05moL)對氨基苯酚和5.7g (0.05moL)戊二酸 酐溶于無水吡啶中，后者滴加入前者，室溫攪拌反應30min。加入適
17量飽和碳酸鉀溶液，用乙酸乙酯萃取，水層用6M鹽酸調pH至2，析 出灰紫色固體，用蒸餾水洗，干燥得到產物7.034g，產率63.1%。ESI-MS analysis (negative) m/z 222 [M-H]畫；1H-NMR (400 MHz, d6誦DMS0 and TMS): S l.77(p， /=7.4Hz, 2H, CH2); 2.26(dd, J產7.6Hz, J"^15.6Hz, 4H, CH2); 6.67(d, J=8.8Hz， 2H， ArH); 7.34(dd, J尸1.9Hz, /2=8.7他，2H, ArH); 9.15(s, 1H, NH); 9.61(s， 1H, OH).
稱取1.68g (0.018moL) KOH溶于無水甲醇中，稱取2.23g (0.01moL)上述固體，0。C攪拌下溶于上述溶液中，攪拌30min。滴 加1.5g (0.008moL) 二乙氧基硫代磷酰氯，O"C反應12h。反應結束旋 干，用氯仿洗，過濾，上清濃縮后過(氯仿甲醇=6: 1)硅膠柱， 得0.60g，產率19.8%。 ESI-MS analysis (negative) m/z 374 [M-H]-; 1H-NMR (400 MHz, CDC13 and TMS): S l'30(t, J^7.1Hz, 6H， CH3); 1.87(s, 1H， CH2); 2.27(s， 4H, CH2); 4.13-4.20(m, 4H, CH2); 7.02(d, /=8.1Hz, 2H， ArH); 7.46(d, 7=7.7Hz, 2H， ArH); 8.62(s, 1H,麗). 實施例8半抗原Bvi (n-2)制備方法
分別取5.46g (0.05moL) 3-氨基苯酚和5.8g (0.05moL)戊二酸 酐溶于無水吡啶中，后者滴加入前者，室溫攪拌反應30min。加入適 量飽和碳酸鈉溶液，用乙酸乙酯萃取，水層用6M鹽酸調pH至2，析 出灰紫色固體，用蒸餾水洗，干燥得到產物6.7g，產率60.03%。ESI-MS analysis (negative) m/z 222 [M隱H]-; 1H-NMR (400 MHz, d6-Acetone and TMS): S 1.93(p， ".4Hz, 2H， CH2); 2.39(td， J產7.4Hz, ^7.4Hz, /3=12.8Hz, 4H, CH2); 6.51(ddd, /產l.lHz, ^-2.3Hz, /3=7.9Hz, 1H, ArH);
187.01(dd,/產1.2Hz， J2=8.1Hz, 1H， ArH); 7.06(t, ^^8.0Hz, 1H， ArH); 7.36(t /=1.9Hz, 1H， ArH); 8.30(s, 1H, NH); 9.05(s, 1H， OH).
稱取1.68g (0.018moL) KOH溶于無水甲醇中，稱取2.23g (O.OlmoL)上述固體，0。C攪拌下溶于上述溶液中，攪拌30min。滴 加1.5g (0.008moL) 二乙氧基硫代磷酰氯，O匸反應12h。反應結束旋 干，用氯仿洗，過濾，上清濃縮后過(氯仿甲醇=6: 1)硅膠柱， 得0.72g，產率24.0°/。。 ESI-MS analysis (negative) m/z 374 [M-H]-; 1H畫NMR (400 MHz, CDC13 and TMS): S 1.34(dt, J產0.6Hz， J^7.0Hz, j3=7.0Hz, 6H, CH3); 2.02(p， /^7.1Hz, 2H, CH2); 2.44(td, /產7.1Hz, j2=7.1Hz, /3=11.4Hz, 4H, CH2); 4.21(qd, J產7.1Hz, J2=7.1Hz， Js=7.0Hz, /廣9.8Hz, 4H, CH2); 6.90(d, J=7.2Hz， 1H, ArH); 7.24(q, J尸8.2Hz, 力二8.2Hz, ^二8.1Hz， 2H， ArH); 7.49(s， 1H， ArH); 7.67(s, 1H， NH). 實施例9半抗原Bvb (n-O)制備方法
分別取5.46g (0.05moL)對氨基苯酚禾口 4.903g (0.05moL)順丁 烯二酸酐溶于無水吡啶中，后者滴加入前者，室溫攪拌反應30min。 加入適量飽和碳酸鉀溶液，用乙酸乙酯萃取，水層用6M鹽酸調pH 至2，析出草綠色固體，用蒸餾水洗，干燥得到產物5.546g，產率53.5%。 ESI-MS analysis (negative) m/z 206 [M誦H]-; 1H-NMR (400 MHz, d6畫Acetone and TMS): S 6.33(d， /=12.8Hz, 1H, CH=CH); 6.67(d, 7=12.8Hz， 1H， CH=CH); 6.84-6.88(m， 2H, ArH); 7.54(td, J尸2.5Hz, /2=2.5Hz, /產10.1Hz， 2H, ArH); 8.51(s, 1H, NH); 10.26(s, 1H, OH); 15.22(s, 1H, COOH).稱取1.68g (0.018moL) KOH溶于無水甲醇中，稱取2.072g (O.OlmoL)上述固體，0。C攪拌下溶于上述溶液中，攪拌30min。滴 加1.5g (0.008moL) 二乙氧基硫代磷酰氯，(TC反應12h。反應結束旋 干，用氯仿洗，過濾，上清濃縮后過(氯仿甲醇=6: 1)硅膠柱， 得1.2g，產率42.0%。 ESI-MS analysis (negative) m/z 358 [M-H]-; 1H-NMR (400畫z, CDC13 and TMS): S L33(t， /=7.0Hz， 6H, CH3); 4.17-4.24(m, 4H， CH2); 6.37(d,/=12.1Hz, IH, CH=CH); 6.71(d，《/=9.5Hz, IH, CH=CH); 7.15(d,聲7.2Hz， 2H, ArH); 7.66(d, /=7.8Hz, 2H， ArH); 10.03(s， IH,NH).
實施例10半抗原Bvi (11=0)制備方法
分別取5.46g (0.05moL) 3-氨基苯酚和4.9g (0.05moL)順丁烯 二酸酐溶于無水吡啶中，后者滴加入前者，室溫攪拌反應30min。加 入適量飽和碳酸鈉溶液，用乙酸乙酯萃取，水層用6M鹽酸調pH至2， 析出灰紫色固體，用蒸餾水洗，干燥得到產物7.544g，產率72.93%。 ESI-MS analysis (negative) m/z 206 [M-H]-; 1H-NMR (400 MHz, d6-DMSO and TMS): S 6.50(ddd， J產0.8Hz， J尸2.3Hz， /3=8.0Hz, 1H, CH=CH); 6.64(d, /=15.4Hz, IH, CH=CH); 7.04(d, /=8.1Hz, IH, ArH); 7.12(dd, J產11.8Hz, /2=20.4, 2H， ArH); 7.26(t， /=2.1Hz, IH, ArH); 9.46(s, IH, NH); 10.36(s, 1H， OH); 12.97(s, IH, COOH).
稱取1.68g (0.018moL) KOH溶于無水甲醇中，稱取2.072g (O.OlmoL)上述固體，0。C攪拌下溶于上述溶液中，攪拌30min。滴 加1.5g (0.008moL) 二乙氧基硫代磷酰氯，O"反應12h。反應結束旋干，用氯仿洗，過濾，上清濃縮后過(氯仿甲醇=6: 1)硅膠柱，
得0.9g，產率31.5%。 ESI-MS analysis (negative) m/z 358 [M-H]-; 1H-NMR (400固z, CDC13 and TMS): S l.36(t, /=7.0Hz, 6H, CH3); 4.24(qd, /產7.1Hz, J2=7.1Hz, /3=7.1Hz, J4=14.2Hz, 4H, CH2); 6.42(d, /=12.0Hz, 1H, CH=CH); 6.50(d, /=7.0Hz， 1H, CH=CH); 7.33(dd, J尸7.4Hz， J尸15.5Hz， 2H, ArH); 7.63(s, 1H, ArH); 8.81(s， 1H, NH). 實施例11 半抗原Bk (11=3)制備方法
稱取1.68g (0.018moL) KOH溶于無水甲醇中，稱取l.OOg (0.01moL)氨基丁酸，0。C攪拌下溶于上述溶液中，攪拌30min。滴 加1.5g (0.008moL) 二乙氧基硫代磷酰氯，0。C反應12h。反應結束旋 干，用氯仿洗，過濾，上清濃縮后過(氯仿甲醇=3: 1)硅膠柱， 得1.14g,產率56.0%。 ESI-MS analysis (negative) m/z 254 [M-H]-; 1H-NMR (400 MHz, CDC13 and TMS): S 1.27(t, /=7.0Hz， 6H, CH3); 1.77(p, /=6.9Hz, 2H, CH2); 2.39(t, /=7.3Hz, 2H, CH2); 2.98(td, J產6.8Hz, 72=6.8Hz, j3=6.8Hz, J4=ll.lHz， 2H， CH2); 4.01 (ddd, J尸1.4Hz, /2=7.3Hz, 73=15.9Hz, 4H, CH2). 實施例12半抗原Bix (11=5)制備方法
稱取1.68g (0.018moL) KOH溶于無水甲醇中，稱取1.31g (O.OlmoL)氨基己酸，0。C攪拌下溶于上述溶液中，攪拌30min。滴 加1.5g (0.008moL) 二乙氧基硫代磷酰氯，O"C反應12h。反應結束旋 干，用氯仿洗，過濾，上清濃縮后過(氯仿甲醇=3: 1)硅膠柱， 得1.36g，產率60.0%。 ESI-MS analysis (negative) m/z 282 [M-H]隱;1H畫NMR (400 MHz, CDC13 and TMS): S l.26(t,聲7.1Hz, 6H, CH3); 1.33(dt， J尸4.5Hz, J2:8.6Hz, J^8.8Hz, 2H， CH2); 1.45(td, J產7.2Hz, /2=7.2Hz, /3=14.3Hz, 2H, CH2); L55-1.63(m, 2H， CH2); 2.3 l(t， /=7.4Hz, 2H, CH2); 2.89(tdJ產7.0Hz,J尸7.0Hz,Jfl 0.5Hz, 2H, CH2); 3.96-4.03(m: 4H， CH2).
實施例13免疫原OP-BSA的制備方法
取半抗原(OP)0.12mmo1溶于2mlDMF中，攪拌加入DCC29.7mg 和NHS16.6mg。 4。C下磁力攪拌反應過夜，離心后上清夜為A液，稱 取BSA136mg溶于10ml濃度為0.1mol/L的PBS(PH8.0)中，攪拌溶解 制備B液。磁力攪拌下，A液逐漸滴入B液中，4'C下反應12h。離 心后，取上清夜，fC下用生理鹽水透析3d，每天更換4次透析液。 得到的免疫原OP-BSA以lmg/ml的濃度分裝于0.5ml離心管中。凍 存于-2(TC冰箱中，供免疫用。
免疫原鑒定對載體蛋白BSA，半抗原OP和免疫原OP-BSA進 行紫外掃描測定(200 400nm)，發現免疫原OP-BSA與BSA和半抗 原OP相比，吸收曲線有明顯改變，說明半抗原OP與BSA偶連成功。 實施例14包被原OP-OVA的制備方法
取半抗原(OP)0.12mmo1溶于2mlDMF中，攪拌加入DCC29.7mg 和NHS16.6mg。 4。C下磁力攪拌反應過夜，離心后上清夜為A液，稱 取BSA136mg溶于10ml濃度為0.1mol/L的PBS(PH8.0)中，攪拌溶解 制備B液。磁力攪拌下，A液逐漸滴入B液中，4'C下反應12h。離 心后，取上清夜，4"C下用生理鹽水透析3d，每天更換4次透析液。得到的包被原OP-OVA以lmg/ml的濃度分裝于0.5ml離心管中。凍 存于-2(TC冰箱中，供免疫用。
包被原鑒定對載體蛋白OVA，半抗原OP和包被原OP-OVA進 行紫外掃描測定(200 400nm)，發包被原OP-OVA與載體蛋白OVA 及半抗原OP相比，吸收曲線有明顯改變，說明半抗原OP與載體蛋 白OVA偶連成功。
實施例15多克隆抗體的制備方法及抗體效價測定
多克隆抗體的制備將免疫原解凍，然后加入等劑量的佐劑(第1 次免疫用弗氏完全佐劑，以后加強免疫均用弗氏不完全佐劑)用攪拌 器乳化。完全乳化后，采用背部皮下、各部位皮下、腿部肌肉和耳緣 靜脈多種注射方式免疫6只體重為2.5 3kg的健康新西蘭大白兔。 第一次免疫隔一個月后每兩周加強免疫一次。第4次加強免疫后l周 耳緣靜脈采血，并利用間接ELISA測定血清效價。當效價不再上升時， 采用耳緣靜脈加強免疫。1周后心臟采血，室溫靜置0.5 lh,于4'C 冰箱過夜后吸取上層析出的血清。抗血清采用硫酸銨沉淀法純化得到 多克隆抗體，透析后冷凍干燥成粉末，于-2(TC下保存備用。
抗體效價的檢測間接競爭ELISA測定抗體陽性滴度以2.1倍于 陰性血清的測定值為準，測得抗體的陽性滴度為1:512000以上。 實施例16抗體親和性及特異性試驗
將不同濃度的有機磷標準品與抗體一起進行間接競爭ELISA反 應，測定其抑制率，以確定抗體對多種有機磷標準品的親和性。各 種有機磷的抑制中濃度ICso見表1。以上實驗結果說明由所設計半抗原制備的免疫原免疫產生的抗 體能夠檢測大多數含二乙氧基硫代磷酸酯的有機磷農藥，具有靈敏度 高，檢測方便等優點。
表1不同有機磷農藥對抗體的抑制效果
競爭藥物IC50 (ng/mL)
對硫磷Parathion0.140
辛硫磷Phoxim0.310
毒死蜱Chlorpyrifos2.069
二嗪磷Diazinon7.074
蟲竜毒憐Coumaphos0.013
除線磷Dichlofenthion0.247
乙基溴硫磷Bromophos ethyl1.580
瞎嗪硫磷Pyridaphenthione0.863
喹硫磷Quinalphos0.021
三唑磷Triazophos0.035
硫環磷Phosfolan0.487
氯唑磷Isazofhos14.102
治螟磷Sulfotepp3.840
內吸磷Systox0.567
特丁硫磷Terbufos1.521
甲拌磷Phorate0.67權利要求
1、一種二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥半抗原，其特征在于所述半抗原為二乙氧基硫代磷酰氯與帶羧基的苯酚衍生物或氨基酸親核取代后的產物。
2、 根據權利要求1所述的半抗原，其特征在于所述帶羧基的苯 酚衍生物具有式(AO所示結構，所述半抗原具有式(B》所示結構其中n為0 9的整數； 或者所述帶羧基的苯酚衍生物具有式(An)所示結構，所述半 抗原具有式(B )所示結構(A》;(A0;(Bn);其中n為0 9的整數；或者所述帶羧基的苯酚衍生物具有式(Am)所示結構，所述半抗原具有式(Bni)所示結構(Am);(Bm);其中n為0 9的整數；或者所述帶羧基的苯酚衍生物具有式(Aw)所示結構，所述半抗原具有式(Brv)所示結構:/=<n(H2C)、 HO~</〉 OS i/=\ OH (Bjv);其中n為0 9的整數；或者所述帶羧基的苯酚衍生物具有式(Av)所示結構，所述半 抗原具有式(Bv)所示結構<formula>formula see original document page 4</formula>其中n為0 9的整數；或者所述帶羧基的苯酚衍生物具有式(Avi)所示結構，所述半抗原具有式(B一所示結構:<formula>formula see original document page 4</formula>其中n為0 9的整數；或者所述帶羧基的苯酚衍生物具有式(Avn)所示結構，所述半 抗原具有式(B )所示結構<formula>formula see original document page 4</formula><formula>formula see original document page 5</formula>其中n為0 9的整數;或者所述帶羧基的苯酚衍生物具有式(A )所示結構，所述半抗原具有式(B )所示結構<formula>formula see original document page 5</formula>其中n為0 9的整數；或者所述帶羧基的苯酚衍生物具有式(AK)所示結構，所述半 抗原具有式(BK)所示結構<formula>formula see original document page 5</formula><formula>formula see original document page 6</formula>其中n為3 7的整數。
3、 一種權利要求1所述半抗原的制備方法，其特征在于是將二 乙氧基硫代磷酰氯和帶羧基的苯酚衍生物手臂在0°C 60°C、縛酸劑 存在的條件下，于有機溶劑中進行反應，生成目標半抗原。
4、 根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于所述帶羧基的 苯酚衍生物手臂為帶羧基的苯酚衍生物或者氨基酸。
5、 根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于所述帶羧基的 苯酚衍生物手臂為羥基苯甲醛和丙二酸或氨基苯酚和酸酐合成產物。
6、 根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于所述縛酸劑為 氫氧化鉀、氫氧化鈉、碳酸鈉、金屬鈉、甲醇鈉、乙醇鈉、吡啶或三 乙胺的任意一種。
7、 根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于所述有機溶劑 為甲醇、乙醇、四氫呋喃、二氧六環、丙酮或二氯甲烷的任意一種或 兩種以上的混合物。
全文摘要
本發明公開了一種二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥半抗原及其制備方法。所述半抗原為二乙氧基硫代磷酰氯與帶羧基的苯酚衍生物或氨基酸親核取代后的產物。本發明針對一類有機磷農藥的共有結構-二乙氧基硫代磷酸酯提供了一系列半抗原，所述半抗原在分子結構、立體化學和電子分布上與含二乙氧基硫代磷酸酯共有結構有機磷農藥對應體相似，在二乙氧基硫代磷酰酯氧原子上分別引入了長短不同的帶有羧基的苯酚衍生物手臂，便于連接載體蛋白，本發明為抗二乙氧基硫代磷酸酯類有機磷農藥抗體制備和快速檢測產品開發提供了技術基礎。
文檔編號C07F9/00GK101475587SQ20091003652
公開日2009年7月8日 申請日期2009年1月9日 優先權日2009年1月9日
發明者孫遠明, 徐振林, 楊金易, 沈玉棟, 弘 王, 謝桂勉, 雷紅濤 申請人:華南農業大學