專利名稱：一種殼聚糖-二氧化硅復合空心微球的制法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及有機無機復合納米材料的制備以及藥物釋放應用領域，具體涉及一種 具有大孔、介孔殼聚糖-二氧化硅復合納米空心微球的制備方法和作為藥物釋放的載 體、分子篩方面的應用。 技術背景
從20世紀60年代以來，藥物的控制釋放和在人體內的耙向性給藥研究一直是化 學、醫學和藥物學領域的一項研究熱點。與傳統的給藥模式相比，藥物的控制釋放具 有很多優點，比如(1)藥物釋放到環境中的濃度比較穩定；(2)能十分有效的利用 藥物，使其有很高的利用率；(3)能夠使得藥物的釋放盡可能的接近病灶部位，提高 了藥效，避免發生全身性的副作用；(4)可以適當減少用藥次數，對患者更安全。因 此，鑒于上述種種優點，藥物控制釋放的研究對臨床醫學具有很廣泛的應用價值。
藥物控制釋放技術的關鍵在于制備性能良好的藥物載體。在眾多的高分子材料 中，天然多糖材料以其較好的生物相容性和細胞親和性得到了研究人員的廣泛關注。 目前，作為藥物載體的天然生物可降解高分子主要有殼聚糖、海藻酸、瓊脂、纖維 蛋白和膠原蛋白等。其中，殼聚糖以其無毒性、生物相容性和可降解性，己經在藥學 和生物學領域得到了廣泛的應用。(Biometerial, 1993, (20)， 7-16; J Control Rel, 1998， (52), 109-18)。在本發明中，正是利用具有良好生物性能的殼聚糖空心微球作為模板， 制備復合的殼聚糖-二氧化硅的空心微球。
國內外很多課題組致力于殼聚糖微球的制備和研究，迄今為止，制備殼聚糖微球 的方法主要有交聯法、凝聚法、乳化-溶劑蒸發法、噴霧干燥法等。以上幾種方法制 備過程相對復雜，而且有時不免要用到對人體有害的有機溶劑。在本發明中，我們所 用的模板殼聚糖-聚丙烯酸的空心微球，制備過程簡單，且完全在水相中進行，因此 十分環保(Advanced Materials, 2004， (16)， 933-936.)。在進一步制備殼聚糖-二氧化硅 復合微球的過程中，聚丙烯酸分子在處理過程中被自然的去除。
有序介孔二氧化硅微球具有較大的比表面積，孔徑和體積大小可調，生物惰性及 生物相容性，因此它是作為藥物載體的較好的無機材料。但是，未改性的二氧化硅微 球不能對包裹的藥物進行可控的釋放，因此如果能將殼聚糖和二氧化硅兩者的優點結 合起來，那將是一項十分有意義的工作，因為介孔二氧化硅大的比表面積可以使其具 有較大的載藥量，而殼聚糖鏈段上具有多種官能團(氨基、羥基)，通過調控官能團 和藥物之間的化學作用力，可以達到對藥物控制釋放的目的。本發明正是體現了這一 特色。
發明內容
本發明的目的在于提供一種可生物降解的、具有生物相容性的殼聚糖-二氧化硅 復合納米微球。本發明的另一目的在于提供一種具有大孔、介孔的殼聚糖-二氧化硅復合納米空 心微球的制備方法。本發明采用模板法，以殼聚糖-聚丙烯酸中空微球為模板，以正 硅酸乙酯為二氧化硅前驅物，在醋酸或氨水催化劑作用下，正硅酸乙酯經水解、縮聚 沉積在殼聚糖-聚丙烯酸微球的表面，最終得到具有大孔、介孔兩種孔結構的殼聚糖-二氧化硅復合空心微球。
本發明的技術方案如下殼聚糖-二氧化硅的復合空心微球，采用正硅酸乙酯經 水解、縮聚沉積在殼聚糖-聚丙烯酸微球的表面的方法，最終得到具有大孔、介孔兩
種孔結構的殼聚糖-二氧化硅復合空心微球，平均粒徑為50-200nm,其中殼聚糖的分 子量為10000-200000,脫乙酰度為70~95%。
制備殼聚糖-二氧化硅的復合空心微球的方法，將殼聚糖-聚丙烯酸空心微球溶解 在堿性蒸餾水中，將其在攪拌條件下加入到正硅酸乙酯的乙醇溶液中，水解完全后即 得殼聚糖-二氧化硅的復合空心微球。室溫攪拌12-24小時后，再在5(TC條件下靜置 12-24小時，過濾、離心即得殼聚糖-二氧化硅的復合空心微球。
尤其是殼聚糖-聚丙烯酸乳液與等體積的l-2M的氨水混合，靜置48小時，并將 正硅酸乙酯溶于乙醇中，將堿性的殼聚糖-聚丙烯酸乳液緩慢滴加到正硅酸乙酯的乙 醇溶液中，室溫攪拌12-24小時，之后放在5(TC條件下靜置12-24小時，經過濾、離 心即得殼聚糖-二氧化硅復合空心微球。
另一方法是將殼聚糖-聚丙烯酸空心微球溶解在酸性蒸餾水中，將其在攪拌條件 下加入到正硅酸乙酯的乙醇溶液中，水解完全后即得殼聚糖-二氧化硅的復合空心微 球。在室溫攪拌條件下，將酸性的殼聚糖-聚丙烯酸空心微球乳液加入到正硅酸乙酯 的乙醇溶液中，室溫攪拌24小時后，再在5(TC條件下靜置24小時，過濾、離心即 得殼聚糖-二氧化硅的復合空心微球。所述的納米微球的用途，作為藥物、蛋白的載 體，還可以作為分子篩來分離蛋白質。負載具有廣譜性的抗腫瘤藥物鹽酸阿霉素。殼 聚糖-二氧化硅微球具有較大的空腔，因此可以大大提高其載藥量，而且通過改變外 界環境的某些條件，達到對藥物控釋的目的。酸性和堿性蒸餾水對應pH值可在 pH4-pH10的范圍內。
本發明還涉及采用上述方法制備的殼聚糖-二氧化硅復合納米微球作為分子篩， 分離具有不同分子量和等電點的蛋白質。而且通過改變外界環境的某些條件，達到對
蛋白質的分離。
作為藥物的載體，它可以在本發明的殼聚糖-二氧化硅復合微球的溶液中加入要 負載的藥物，經常溫攪拌24-48小時后離心，即可得到包裹有藥物的殼聚糖-二氧化硅 復合空心微球
作為分子篩，它可以在本發明的殼聚糖-二氧化硅復合微球的溶液中加入細胞色 素C和牛血清蛋白，經常溫攪拌48小時以上，通過離心分離出上層清液。將下層包 裹蛋白的復合微球溶于一定pH值的溶液中，常溫攪拌48小時以上，離心，即可將兩 種蛋白質分離。本發明提供了一種平均粒徑為50-200nm的殼聚糖-二氧化硅復合納米空心微球， 它是親水性的，在廣泛的pH范圍內具有較好的穩定性，生物相容性。實驗過程完全 在水相體系中進行，沒有使用任何有機溶劑和表面活性劑。微球表面規則，外殼二氧 化硅壁上有很多孔道，為藥物的吸附和釋放提供了通道，而且二氧化硅殼層的機械強 度高，不易變形。因此，該微球作為一種載體，在性能上符合生物醫學和生物化學工 程領域的應用需要。
圖1為殼聚糖-二氧化硅復合空心微球的模型圖1為殼聚糖，2為二氧化硅。
圖2為殼聚糖-二氧化硅復合空心微球的透射電鏡圖(放大5萬倍) 圖3為負載鹽酸阿霉素的殼聚糖-二氧化硅復合空心微球在緩沖溶液pH4和pH7.4 交替變換條件下測試的釋放曲線
圖4為負載鹽酸阿霉素的二氧化硅空心微球在pH4和pH7.4條件下的釋放曲線。
具體實施例方式
實施例1:
首先制備殼聚糖-聚丙烯酸的空心微球。將0.25g的殼聚糖和0.12g的丙烯酸溶于 25mL的蒸餾水中，待其完全溶解后，升溫至8(TC，加入0.05g的過硫酸鉀引發丙烯 酸聚合。當體系出現乳白色時，將體系冷卻至室溫，之后加入O.lmL的戊二醛來選擇 性的交聯殼聚糖，即得到殼聚糖-聚丙烯酸空心微球的乳液，可參考本申請人的在先 中請。
取新制備的殼聚糖-聚丙烯酸乳液2.5mL與等體積的2M的氨水混合，靜置48小 時。將520微升的正硅酸乙酯溶于2mL乙醇中。將堿性的殼聚糖-聚丙烯酸乳液緩慢 滴加到正硅酸乙酯的乙醇溶液中。室溫攪拌24小時，之后放在50'C條件下靜置24 小時，經過濾、離心即得殼聚糖-二氧化硅復合空心微球。
上述體系中的殼聚糖-二氧化硅復合空心微球，用透射電鏡觀察納米粒子為較規 則的球形結構，而且外層的二氧化硅和殼聚糖-聚丙烯酸模板界限很明顯，平均粒徑 為120nm，在廣泛的pH值范圍內可以穩定存在。
實施例2:
取新制備的殼聚糖-聚丙烯酸乳液2.5mL，用2M的醋酸將乳液調至pH3，靜置 48小時。將520微升正硅酸乙酯溶于2mL乙醇中。將酸性的殼聚糖-聚丙烯酸乳液緩 慢滴加到正硅酸乙酯的乙醇溶液中。室溫攪拌24小時，之后放在50'C條件下靜置24 小時，經過濾、離心即得殼聚糖-二氧化硅復合空心微球。
上述體系中的殼聚糖-二氧化硅復合空心微球，用透射電鏡觀察納米粒子為較規 則的球形結構，平均粒徑為110nm，在廣泛的pH值范圍內可以穩定存在。
實施例3:
取新制備的殼聚糖-聚丙烯酸乳液2.5mL與等體積的2M的氨水混合，靜置48小 時。將520微升正硅酸乙酯溶于2mL乙醇中。將堿性的殼聚糖-聚丙烯酸乳液緩慢滴加到正硅酸乙酯的乙醇溶液中。室溫攪拌24小時，之后放在50。C條件下靜置24小 時，經過濾、離心即得殼聚糖-二氧化硅復合空心微球。將此產品多次洗滌后分散在 蒸餾水中，冷凍結冰，之后在凍干機中將其凍干。取凍干的殼聚糖-二氧化硅復合空 心微球粉末15mg與一定質量的鹽酸阿霉素混合于蒸餾水中，室溫攪拌48小時，離 心、洗滌三次，除去上層液體即得負載鹽酸阿霉素的殼聚糖-二氧化硅復合微球。
上述復合微球中，當加入鹽酸阿霉素的質量為1.5mg時，粒子的載藥量為8.9%， 載藥效率為97.5%。藥物釋放實驗表明當釋放媒介溶液為pH4和7.4的緩沖溶液交 替變換時，所釋放的鹽酸阿霉素的質量呈現脈沖式；也就是說，在外界溶液的pH值 為4時，大量的藥物被釋放出來，在外界溶液的pH值為7.4時，只有少量的藥物被 釋放出來。
實施例4.
取新制備的殼聚糖-聚丙烯酸乳液2.5mL與等體積的2M的氨水混合，靜置48小 時。將520微升正硅酸乙酯溶于2mL乙醇中。將堿性的殼聚糖-聚丙烯酸乳液緩慢滴 加到正硅酸乙酯的乙醇溶液中。室溫攪拌24小時，之后放在50'C條件下靜置24小 時，經過濾、離心即得殼聚糖-二氧化硅復合空心微球。將此產品多次洗滌后分散在 蒸餾水中，冷凍結冰，之后在凍干機中將其凍干。將凍干的粉末在馬弗爐中55(TC的 條件下煅燒4小時得到二氧化硅納米空心微球。取煅燒后的二氧化硅空心微球粉末 15mg與一定質量的鹽酸阿霉素混合于蒸餾水中，室溫攪拌48小時，離心、洗滌三 次，除去上層液體即得負載鹽酸阿霉素的殼聚糖-二氧化硅復合空心微球。
上述復合微球中，當加入鹽酸阿霉素的質量為1.5mg時，粒子的載藥量為4.2%， 載藥效率為43.5%。藥物釋放實驗表明當外界溶液的pH值為4時，大量的藥物被 釋放出來，在外界溶液的pH值為7.4時，只有少量的藥物被釋放出來。
實施例5
取新制備的殼聚糖-聚丙烯酸乳液2.5mL與等體積的2M的氨水混合，靜置48小 時。將520微升正硅酸乙酯溶于2mL乙醇中。將堿性的殼聚糖-聚丙烯酸乳液緩慢滴 加到正硅酸乙酯的乙醇溶液中。室溫攪拌24小時，之后放在5CTC條件下靜置24小 時，經過濾、離心即得殼聚糖-二氧化硅復合空心微球。將此產品多次洗滌后分散在 蒸餾水中，冷凍結冰，之后在凍干機中將其凍干。取凍干的樣品15mg，細胞色素C 5mg， 溶于2mLpH7.4的PBS緩沖溶液中常溫攪拌96小時。之后，將此溶液離心，分離出 上層溶液進行測試，即得得到被包裹的細胞色素C的質量。
實施例6
取新制備的殼聚糖-聚丙烯酸乳液2.5mL與等體積的2M的氨水混合，靜置48小 時。將520微升正硅酸乙酯溶于2mL乙醇中。將堿性的殼聚糖-聚丙烯酸乳液緩慢滴 加到正硅酸乙酯的乙醇溶液中。室溫攪拌24小時，之后放在5(TC條件下靜置24小 時，經過濾、離心即得殼聚糖-二氧化硅復合空心微球。將此產品多次洗滌后分散在 蒸餾水中，冷凍結冰，之后在凍干機中將其凍干。取凍干的樣品15mg，牛血清蛋白5mg，溶于2mLpH7.4的PBS緩沖溶液中常溫攪拌96小時。之后，將此溶液離心， 分離出上層溶液進行測試，即得得到被包裹的牛血清蛋白的質量。 實施例7
取新制備的殼聚糖-聚丙烯酸乳液2.5mL與等體積的2M的氨水混合，靜置48小 時。將520微升正硅酸乙酯溶于2mL乙醇中。將堿性的殼聚糖-聚丙烯酸乳液緩慢滴 加到正硅酸乙酯的乙醇溶液中。室溫攪拌24小時，之后放在5(TC條件下靜置24小 時，經過濾、離心即得殼聚糖-二氧化硅復合空心微球。將此產品多次洗滌后分散在 蒸餾水中，冷凍結冰，之后在凍干機中將其凍干。取凍干的樣品15mg,牛血清蛋白 5mg，細胞色素C5mg，溶于2mL pH7.4的PBS緩沖溶液中常溫攪拌96小時。之后， 將此溶液離心，分離出上層溶液。將下層沉淀溶于pH10的緩沖溶液中，常溫攪拌48 小時。將此溶液離心，即可將兩種蛋白質進行分離。
權利要求
1.一種殼聚糖-二氧化硅的復合空心微球，其特征是正硅酸乙酯經水解、縮聚沉積在殼聚糖-聚丙烯酸微球的表面，最終得到具有大孔、介孔兩種孔結構的殼聚糖-二氧化硅復合空心微球，平均粒徑為50-200nm，其中殼聚糖的分子量為10000-200000，脫乙酰度為70～95％。
2. —種制備殼聚糖-二氧化硅的復合空心微球的方法，其特征是將殼聚糖-聚丙烯酸空 心微球溶解在堿性蒸餾水或氨水中，靜置48小時，并將正硅酸乙酯溶于乙醇中， 將堿性的殼聚糖-聚丙烯酸乳液緩慢滴加到正硅酸乙酯的乙醇溶液中，室溫攪拌 12-24小時，之后放在50'C條件下靜置12-24小時，經過濾、離心即得殼聚糖-二 氧化硅復合空心微球。將其在攪拌條件下加入到正硅酸乙酯的乙醇溶液中(正硅 酸乙酯/乙醇的體積比約為1: 4)，水解完全后即得殼聚糖-二氧化硅的復合空心微 球。
3. —種制備權利要求1所述的納米微球的方法，其特征是將殼聚糖-聚丙烯酸空心微 球溶解在酸性蒸餾水中，將其在攪拌條件下加入到正硅酸乙酯的乙醇溶液中，水 解完全后即得殼聚糖-二氧化硅的復合空心微球。
4. 一種制備權利要求2所述的納米微球的方法，其特征是在室溫攪拌條件下，將堿 性的殼聚糖-聚丙烯酸空心微球乳液加入到正硅酸乙酯的乙醇溶液中，室溫攪拌24 土8小時后，再在50土1(TC條件下靜置24±16小時，過濾、離心即得殼聚糖-二 氧化硅的復合空心微球。
5. —種制備權利要求3所述的納米微球的方法，其特征是在室溫攪拌條件下，將酸 性的殼聚糖-聚丙烯酸空心微球乳液加入到正硅酸乙酯的乙醇溶液中，室溫攪拌24 土8小時后，再在50土1(TC條件下靜置24土16小時，過濾、離心即得殼聚糖-二氧 化硅的復合空心微球。
6. 根據權利要求1所述的納米微球的用途，其特征是作為藥物、蛋白的載體，作為 分子篩來分離蛋白質。首先在殼聚糖-二氧化硅復合微球的溶液中加入細胞色素C 和牛血清蛋白，然后經常溫攪拌48小時以上，再通過離心分離出上層清液，然后 將下層包裹蛋白的復合微球分散于一定pH值的溶液中，常溫攪拌48小時以上，再 經離心，即可將兩種蛋白質分離。
全文摘要
一種殼聚糖-二氧化硅的復合空心微球，正硅酸乙酯經水解、縮聚沉積在殼聚糖-聚丙烯酸微球的表面，最終得到具有大孔、介孔兩種孔結構的殼聚糖-二氧化硅復合空心微球，平均粒徑為50-200nm，其中殼聚糖的分子量為10000-200000，脫乙酰度為70～95％。
文檔編號C07K14/435GK101601986SQ20091003214
公開日2009年12月16日 申請日期2009年7月9日 優先權日2009年7月9日
發明者寅 丁, 雪 王, 勇 胡, 蔣錫群, 閆爾云 申請人:南京大學