專利名稱：一種杜仲葉中提取綠原酸的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種杜仲葉中提取綠原酸的方法，本發(fā)明還公開了一種綠 原酸在魚病防治物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
杜仲(五wcommz'aw/mo/cfes)在我國是一種具有2000多年歷史的中藥材， 其功效為補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，安胎等；同時杜仲對治療高血壓癥有特效。綠原 酸為杜仲葉主要有效成分之一，具有顯著的生理活性。綠原酸為咖啡?？?酸衍生物，具有利膽、抗菌、抗病毒、降壓、升高白細(xì)胞及興奮中樞神經(jīng)系 統(tǒng)等多種藥理作用，是保健食品、藥品、化妝品等工業(yè)的重要原料。綠原酸 多從植物中提取，以往國內(nèi)外提取綠原酸主要從生咖啡豆和金銀花中獲得。
杜仲葉為杜仲科落葉喬木杜仲的葉子，其綠原酸含量為1% 5.5%， 一 直以來人們都是以杜仲皮入藥，而葉子往往被廢棄?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)了杜 仲葉與皮的化學(xué)成分基本一致，具有同等功效，可以以葉代皮。我國杜仲資 源儲備豐富，廣泛分布于長江、黃河中上游地區(qū)，干葉年產(chǎn)量相當(dāng)大，完全 能夠滿足魚飼料中添加的要求。以杜仲葉為原料提取綠原酸具有廣闊的開發(fā) 前景。
在馬希漢等所撰寫的"從杜仲葉中提取綠原酸純品的研究"(參見《西北 林學(xué)院學(xué)報》1996， 11 (2): 58-60)，采用氯仿脫脂、化學(xué)萃取、無機(jī)鹽析， 此工藝方法未能有效的去除杜仲葉中的雜質(zhì)(如蛋白質(zhì)、膠質(zhì)、纖維素)，使 綠原酸很難溶出，且只適用于實(shí)驗(yàn)室小劑量制備。在王洪武等所撰寫的"杜 仲葉中綠原酸類物質(zhì)的提取研究"(參見《江西師范大學(xué)學(xué)報》)(自然科學(xué)版) 1977， 21 (4): 339-341)中，采用的是溶劑提取、堿性Pb (OAc)和KOAc 沉淀，再溶解萃取重結(jié)晶制得，但鉛會在綠原酸產(chǎn)品中存有殘留，含鉛提取 液會對環(huán)境造成不良影響，因此，該方法不適宜工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。在戚向 陽等撰寫的《杜仲葉綠原酸的提取、分離和鑒定》(參見《植物資源與環(huán)境》 1998， 7 (1): 61-62)中，采用水浸提、101樹脂分離、有機(jī)溶劑萃取純化， 其綠原酸的含量僅為24.33%。以上工藝技術(shù)未對綠原酸提取、純化過程中的 各種影響因素沒有給以綜合考慮和解決，且要求達(dá)到99%以上的含量，生產(chǎn) 成本大和有的并未達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的規(guī)模。專利98112603.0 "—種魚杜仲飼料的生產(chǎn)方法"是將杜仲葉直接粉碎后添加詞料中，且添加量在5-8%，添加 量過大，不僅影響了飼料的營養(yǎng)配比，而且還在一定程度上影響了詞料產(chǎn)品 外觀和適口性(呂武興"杜仲飼料添加劑應(yīng)用研究現(xiàn)狀與展望"(參見《飼料 世界》2004年4期)。專利200410045040.4 "杜仲飼料添加劑"主要是以杜 仲葉的提取物為全部添加，而2000年王紀(jì)亭等在"杜仲葉對肉雞生產(chǎn)性能影 響的研究" 一文中表明在肉仔雞日糧中添加杜仲提取物，對肉仔雞全期生長 并無顯著影響。這可能是由于杜仲有效成分中的黃酮類化合物，對許多酶的 活性有抑制作用(參見《國外醫(yī)藥》1998彭芳"黃酮類化合物的生物活性") 能抑制動物的生長，降低其飼料的利用率。本發(fā)明主要以杜仲葉中綠原酸活 性成分為添加物。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種工藝操作簡 便、成本低、無有害溶劑、得率高、適用于工業(yè)化生產(chǎn)的杜仲葉中提取綠原 酸的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種綠原酸在魚病防治物中的應(yīng)用。 按照本發(fā)明提供的技術(shù)方案，所述杜仲葉中提取綠原酸的方法包括如下
1.1.1粉碎將新鮮或干燥的杜仲葉粉碎，過80目篩，得到杜仲葉粉末； l丄2酶處理在杜仲葉粉末中添加活力為500~1000U/g的植物纖維素酶 并放入密閉容器中，植物纖維素酶的添加量為杜仲葉粉末重量的0.4% 0.6% 倍，再在密閉容器中加入pH4 5的去離子水并攪拌均勻，去離子水的加入量 為杜仲葉粉末重量的8~12倍，控制混合物的溫度為35~50°C，恒溫浸泡20 小時以上；
l丄3超聲波處理將酶處理后的混合物在常溫、超聲波頻率為 20-100KHz條件下波處理20 40min;
l丄4過濾將超聲波處理后的混合物用高速離心機(jī)過濾或者用板框壓濾
機(jī)在0.1~0.4Mpa的壓力范圍內(nèi)壓濾出濾液；
l丄5提取過濾后的濾渣用濾渣重量8 12倍的、50 8(TC的去離子水強(qiáng) 制回流0.5 1小時，重復(fù)提取1 3次得到提取液；
l丄6濃縮合并步驟1.14的濾液和步驟1.15的提取液，在-0.085 0.1Mpa 的真空度條件下濃縮，濃縮液中加入濃縮液重量0.5%~2%倍的殼聚糖，攪拌， 絮凝，使混合物在40 6(TC條件下避光靜置40 60min，然后過濾，濾液用濾液重量1%~3%倍的活性炭脫色，得到脫色后的濃縮液；
l丄7純化脫色后的濃縮液上強(qiáng)極性大孔型大孔樹脂柱進(jìn)行飽和吸附， 吸附后用體積百分含量為20%~30%的乙醇水洗脫，收集洗脫液濃縮、干燥后 制得綠原酸粗品，將粗品用2~6倍去離子水重結(jié)晶得到綠原酸成品。
上述方法提取的綠原酸在魚病防治物中的應(yīng)用，具體為每公斤魚飼料中 添加1.3 2.1g的綠原酸成品，制成飼料顆粒；或者，每畝水域潑灑500~800g 的綠原酸。
本發(fā)明的方法具有工藝操作簡便、成本低、無有害溶劑、得率高、適用 于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1
杜仲葉中提取綠原酸的方法包括如下步驟
l丄l粉碎采集7~10月份的杜仲葉，烘干，干燥后的含水量《10%， 將干燥的杜仲葉粉碎，過80目篩，得到1000g杜仲葉粉末；
l丄2酶處理在杜仲葉粉末中添加活力為500~1000U/g的植物纖維素酶 5g并放入密閉容器中，再在密閉容器中加入pH4.5的去離子水10Kg并攪拌 均勻，控制混合物的溫度為4(TC，恒溫浸泡20小時以上；
l丄3超聲波處理將酶處理后的混合物在常溫、超聲波頻率為50KHz 條件下波處理30min;
l丄4過濾將超聲波處理后的混合物用高速離心機(jī)過濾出濾液，得到 1480克濾渣；
l丄5提取過濾后的濾渣用濾渣重量IO倍的(合14.8kg) 、 6(TC的去 離子水強(qiáng)制回流45分鐘，重復(fù)提取2次得到提取液；
l丄6濃縮合并步驟1.14的濾液和步驟1.15的提取液，在-0.09Mpa的 真空度條件下濃縮，得到5公斤濃縮液，濃縮液中加入濃縮液重量1%倍的 殼聚糖，攪拌，絮凝，使混合物在5(TC條件下避光靜置50min，然后過濾、 洗滌，得到4.9公斤濾液，濾液用濾液重量2%倍的活性炭脫色，得到脫色后 的濃縮液；
l丄7純化脫色后的濃縮液上強(qiáng)極性大孔型大孔樹脂柱進(jìn)行飽和吸附， 吸附后用體積百分含量為25%的乙醇水洗脫，收集洗脫液濃縮、干燥后制得 綠原酸粗品，將粗品用4倍去離子水重結(jié)晶得到綠原酸成品，得到24.1克綠原酸成品，綠原酸成品的得率為2.41%，含量95.1%。 實(shí)施例2
生產(chǎn)工藝如實(shí)施例l所述，所不同的是用新鮮的杜仲葉，獲得綠原酸的 含量為90.5%。 實(shí)施例3
生產(chǎn)工藝如實(shí)例1所述，所不同的是纖維素酶為1%,獲得綠原酸是含 量為92.7%。 實(shí)施例4
生產(chǎn)工藝如實(shí)例3所述，所不同的是纖維素酶解溫度為5(TC，獲得綠原 酸是含量為94.2%。 實(shí)施例5
生產(chǎn)工藝如實(shí)例l所述，所不同的是超聲波處理時間是1小時，獲得綠 原酸是含量為90.1%。 實(shí)施例6
生產(chǎn)工藝如實(shí)例3所述，所不同的是殼聚糖絮凝是在室溫下進(jìn)行，獲得 綠原酸是含量為91.7%。 實(shí)施例7
生產(chǎn)工藝如實(shí)例1所述，所不同的是用40X的乙醇溶液進(jìn)行NKA-9大 孔樹脂柱洗脫劑，獲得綠原酸是含量為93.7%。 實(shí)施例8
l丄l粉碎采集7~10月份的杜仲葉，烘干，干燥后的含水量《10%， 將干燥的杜仲葉粉碎，過80目篩，得到1000g杜仲葉粉末；
l丄2酶處理在杜仲葉粉末中添加活力為500 1000U/g的植物纖維素酶 4g并放入密閉容器中，再在密閉容器中加入8Kg的pH4的去離子水并攪拌 均勻，控制混合物的溫度為35°C，恒溫浸泡20小時以上；
l丄3超聲波處理將酶處理后的混合物在常溫、超聲波頻率為20KHz 條件下波處理20min;
l丄4過濾將超聲波處理后的混合物用板框壓濾機(jī)在O.lMpa的壓力范 圍內(nèi)壓濾出濾液，得到1620克濾渣；
l丄5提取過濾后的濾渣用濾渣重量8倍的(合計(jì)12.96公斤)、50°C
的去離子水強(qiáng)制回流1小時，重復(fù)提取1次得到提取液；
l丄6濃縮合并步驟1.14的濾液和步驟1.15的提取液，在-0.085Mpa的真空度條件下濃縮，得到4千克濃縮液，濃縮液中加入濃縮液重量0.5%倍 的殼聚糖，攪拌，絮凝，使混合物在4(TC條件下避光靜置40min，然后過濾， 得到3.9千克濾液，濾液用濾液重量1%倍的活性炭脫色，得到脫色后的濃縮 液；
l丄7純化脫色后的濃縮液上強(qiáng)極性大孔型大孔樹脂柱進(jìn)行飽和吸附， 吸附后用體積百分含量為20%的乙醇水洗脫，收集洗脫液濃縮、干燥后制得 綠原酸粗品，將粗品用2倍去離子水重結(jié)晶得到綠原酸成品，得到23.6克綠 原酸成品，綠原酸成品的得率為2.36%，純度90.0%。
實(shí)施例9
l丄l粉碎采集7~10月份的杜仲葉，烘干，干燥后的含水量《10%， 將干燥的杜仲葉粉碎，過80目篩，得到1000g杜仲葉粉末；
l丄2酶處理在杜仲葉粉末中添加活力為500~1000U/g的植物纖維素酶 6g并放入密閉容器中，再在密閉容器中加入12千克的pH5的去離子水并攪 拌均勻，控制混合物的溫度為50°C，恒溫浸泡20小時以上；
l丄3超聲波處理將酶處理后的混合物在常溫、超聲波頻率為lOOKHz 條件下波處理20min;
l丄4過濾將超聲波處理后的混合物用高速離心機(jī)過濾出濾液；得到 1410克濾渣；
l丄5提取過濾后的濾渣用濾渣重量12倍的(合計(jì)16.92kg) 、 50~80 t的去離子水強(qiáng)制回流1小時，重復(fù)提取3次得到提取液；
l丄6濃縮合并步驟1.14的濾液和步驟1.15的提取液，在-0.1Mpa的真 空度條件下濃縮，得到7.8千克濃縮液，濃縮液中加入濃縮液重量2%倍的殼 聚糖，攪拌，絮凝，使混合物在6(TC條件下避光靜置60min，然后過濾，得 到7.0千克濾液，濾液用濾液重量3%倍的活性炭脫色，得到脫色后的濃縮液；
l丄7純化脫色后的濃縮液上強(qiáng)極性大孔型大孔樹脂柱進(jìn)行飽和吸附， 吸附后用體積百分含量為30%的乙醇水洗脫，收集洗脫液濃縮、干燥后制得 綠原酸粗品，將粗品用6倍去離子水重結(jié)晶得到綠原酸成品，得到2.54克綠 原酸成品，綠原酸成品的得率為2.54%，純度96.1%。
通過對杜仲葉主要提取物綠原酸對水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見病原菌嗜水氣單胞 菌體外和體內(nèi)抑菌實(shí)驗(yàn)研究表明，綠原酸對水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的病原菌具有良
好的抑菌效果，對嗜水氣單胞菌的抑菌效果與抗生素類抗菌藥物相當(dāng)，能夠 增強(qiáng)機(jī)體免疫力，對細(xì)菌性疾病具有較強(qiáng)的預(yù)防作用。
權(quán)利要求
1、一種杜仲葉中提取綠原酸的方法，其特征是該方法包括如下步驟(1)、粉碎將新鮮或干燥的杜仲葉粉碎，過80目篩，得到杜仲葉粉末；(2)、酶處理在杜仲葉粉末中添加活力為500～1000U/g的植物纖維素酶并放入密閉容器中，植物纖維素酶的添加量為杜仲葉粉末重量的0.4％～0.6％倍，再在密閉容器中加入pH4～5的去離子水并攪拌均勻，去離子水的加入量為杜仲葉粉末重量的8～12倍，控制混合物的溫度為35～50℃，恒溫浸泡20小時以上；(3)、超聲波處理將酶處理后的混合物在常溫、超聲波頻率為20～100KHz條件下波處理20～40min；(4)、過濾將超聲波處理后的混合物用高速離心機(jī)過濾或者用板框壓濾機(jī)在0.1～0.4Mpa的壓力范圍內(nèi)壓濾出濾液；(5)、提取過濾后的濾渣用濾渣重量8～12倍的、50～80℃的去離子水強(qiáng)制回流0.5～1小時，重復(fù)提取1～3次得到提取液；(6)、濃縮合并過濾步驟和提取步驟中的提取液，在-0.085～-0.1Mpa的真空度條件下濃縮，濃縮液中加入濃縮液重量0.5％～2％倍的殼聚糖，攪拌，絮凝，使混合物在40～60℃條件下避光靜置40～60min，然后過濾，濾液用濾液重量1％～3％倍的活性炭脫色，得到脫色后的濃縮液；(7)、純化脫色后的濃縮液上強(qiáng)極性大孔型大孔樹脂柱進(jìn)行飽和吸附，吸附后用體積百分含量為20％～30％的乙醇水洗脫，收集洗脫液濃縮、干燥后制得綠原酸粗品，將粗品用2～6倍去離子水重結(jié)晶得到綠原酸成品。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種杜仲葉中提取綠原酸的方法，其特征在于 所述提取的綠原酸在魚病防治物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種杜仲葉中提取綠原酸的方法，本發(fā)明還公開了一種綠原酸在魚病防治物中的應(yīng)用，該方法包括粉碎、酶處理、超聲波處理、過濾、提取、濃縮與純化等步驟，本發(fā)明的方法具有工藝操作簡便、成本低、無有害溶劑、得率高、適用于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，而且綠原酸對水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的病原菌具有良好的抑菌效果，對嗜水氣單胞菌的抑菌效果與抗生素類抗菌藥物相當(dāng)，能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力，對細(xì)菌性疾病具有較強(qiáng)的預(yù)防作用。
文檔編號C07C69/732GK101486651SQ20091002453
公開日2009年7月22日 申請日期2009年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月10日
發(fā)明者周群蘭, 張東升, 張凌裳, 杜郭君, 王紅連, 秦海萍, 蔡建榮, 蔡正森, 俊 謝, 趙春城, 趙曉聯(lián), 燕 龔 申請人:江蘇省蘇微微生物研究有限公司