專利名稱：采用多孔表面基底促進蛋白質晶體異相形核的方法
技術領域：
本發明涉及一種促進蛋白質異相形核的方法，特別是采用多孔表面基底促進蛋白質晶體 異相形核的方法，用于蛋白質結晶可重復性研究以及結晶條件的篩選。
背景技術：
三維結構的解析對于研究生物大分子的功能具有深遠的意義。特別是作為藥物的靶標， 這些研究也有利于更加合理的設計藥物以及理解藥物的作用機制。獲取高質量及合適尺寸的 蛋白質晶體是完成結構解析的瓶頸，而促進蛋白質異相形核有利于獲得高質量的晶體。
文獻 1 " B.Segelke.(2001) Efficiency analysis of sampling protocols used in protein crystallization screening [J]. J Cryst Growth, ， 232(1-4): 553-562"研究表明蛋白質結晶條件篩選 成功率很低，大多數蛋白質篩選成功率僅為2%。
文獻2 "Johanna M. Kallio, Nina Hakulinen, Juha P. Kallio， Merja H. Niemi, Juha Rouvinen (2009) The Contribution of Polystyrene Nanospheres towards the Crystallization of Proteins. PLoS ONE4(l):e4198."添加聚苯乙烯作為形核劑，用于篩選蛋白質結晶條件，并且發現晶體質量 提高。但文獻2中是一種添加形核劑的方法，沒有涉及結晶時表面基底的處理。
文獻公開的獲取蛋白質晶體的第一步通常是利用結晶篩選試劑，篩選合適的結晶條件。 懸滴法結晶廣泛的應用在蛋白質篩選中。蛋白質結晶條件篩選普遍存在的問題是篩選成功率 比較低。
發明內容
為了克服現有技術蛋白質結晶條件篩選成功率低的不足，本發明提供一種促進蛋白質異
相形核的方法，在不改變蛋白質基本結晶方法的前提下，采用多孔表面基底，進行了蛋白質
結晶可重復性實驗以及結晶條件篩選實驗，實驗結果證明，采用多孔表面基底，可以明顯提
高蛋白質結晶條件篩選成功率。
本發明解決其技術問題所采用的技術方案
(a) 用體積比為70%， 60%， 50%, 40%的氫氟酸溶液處理蓋玻片表面，依次得到四種 不同形貌的多孔表面基底材料；
(b) 用原子力顯微鏡掃描上述四種多孔表面基底材料形貌，得出四種表面粗糙度；
(c) 蛋白質溶液在經過上述步驟處理的多孔表面的蓋玻片上形核以及生長；
(d) 在20"C溫控箱中放置2天后取出，在顯微鏡下觀察，統計出現蛋白質晶體在多孔 表面基底生長的的條件數目。本發明的有益效果是由于用多孔表面作為形核基底，蛋白質結晶篩選成功率由背景技 術的2%提高到46 76%。
下面結合實施例對本發明作詳細說明。
具體實施例方式
實施例l:多孔表面基底用于溶菌酶蛋白可重復性實驗。
第一步配置體積比為70%， 60%， 50%, 40%的氫氟酸溶液，不同塑料器皿分裝。用竹 鑷將18cm X18cm的蓋玻片放入準備好的溶液中浸泡10秒鐘，再放入飽和氫氧化鈉溶液中浸 泡半小時后，取出加入少許清洗劑超聲清洗l小時，用自來水沖洗5遍。放入控溫為6CTC的烘 箱烘干1天。硅化液硅化后，取出再次加入少量清洗劑超聲清洗l小時，用自來水沖洗10遍， 超純水沖洗3遍。得到四種不同表面形貌的多孔表面基底。
第二步用型號為Pico ScanTM 2500原子力顯微鏡掃描四種不同表面形貌的多孔表面基 底以及作為對照的未經處理的普通蓋玻片，得到三維表面形貌，再由原子力顯微鏡配置的相 關軟件PicoScan5.3.3 Pclink計算出蓋玻片表面的粗糙度。得到的均方根粗糙度分別為198.00、 166.49、 120.57、 80.81、 69.82，平均粗糙度分別為162.54、 130.14、 96.16 、 64.80、 60.17。
第三步將經過六次重結晶的日本Seikagaku公司的貨號為100940的溶菌酶，溶于pH為 4.60， 0.1 mol/L的醋酸鈉緩沖液中，使其終濃度為IO mg/ml 、 13 mg/ml 、 15 mg/ml、 17 mg/ml、 20 mg/ml。將氯化鈉溶于溶于pH為4.60， 0.1 mol/L的醋酸鈉緩沖液中，使其終濃度為20 mg/ml 、 25mg/ml 、 30mg/ml、 40mg/ml。用0.22 (xm的濾膜濾去雜質。
第四步將上步的蛋白質溶液和氯化鈉溶液分別在四種不同粗糙度的多空表面基底以及 作為對照的未經處理的普通蓋玻片上進行晶體生長。
第五步樣品在溫控箱中放置2天后，在顯微鏡下觀察統計出現溶菌酶晶體的數目，并 統計出現蛋白質晶體在多孔表面基底生長的的成功率以及對照組的結晶成功率的數目。
經過統計得到如下結果體積比為70%的氫氟酸處理的蓋玻片多孔基底表面得到的晶體
的成功率提高52%，體積比為60%的氫氟酸處理的蓋玻片多孔基底表面得到的晶體的成功率 提高46%，體積比為50%的氫氟酸處理的蓋玻片多孔基底表面得到的晶體的成功率提高54%， 體積比為40%的氫氟酸處理的蓋玻片多孔基底表面得到的晶體的成功率提高54%。 實施例2:多孔表面基底用于蛋白酶K的結晶條件篩選實驗。
第一步配置體積比為70%， 60%， 50%， 40%的氫氟酸溶液，不同塑料器皿分裝。用竹 鑷將18cmxl8cm的蓋玻片放入準備好的溶液中浸泡10秒鐘，再放入飽和氫氧化鈉溶液中浸 泡半小時后，取出加入少許清洗劑超聲清洗1小時，用自來水沖洗5遍。放入控溫為60'C的 烘箱烘干1天。硅化液硅化后，取出再次加入少量清洗劑超聲清洗1小時，用自來水沖洗IO遍，超純水沖洗3遍。得到四種不同表面形貌的多孔表面基底。
第二步用型號為Pico ScanTM 2500原子力顯微鏡掃描四種不同表面形貌的多孔表面基 底以及作為對照的未經處理的普通蓋玻片，得到三維表面形貌，再由原子力顯微鏡配置的相 關軟件PicoScan5.3.3 Pclink計算出蓋玻片表面的粗糙度。得到的均方根粗糙度分別為198.00、 166.49、 120.57、 80.81、 69.82，平均粗糙度分別為162.54、 130.14、 96.16 、 64.80、 60.17。
第三步將美國Sigma公司的貨號為P6556的蛋白酶K，溶于pH為4.60， 0.1 mol/L的 HEPES鈉緩沖液中，使其終濃度為20 mg/ml。用0.22 pm的濾膜濾去雜質。本實施例用Hampton 公司貨號為HR2-110的Crystal Screen試劑盒的50種結晶緩沖液對蛋白酶K的結晶條件進行 篩選。
第四步將上步的蛋白質溶液和氯化鈉溶液分別在四種不同粗糙度的多空表面基底以及 作為對照的未經處理的普通蓋玻片上進行晶體生長。
第五步樣品在溫控箱中放置2天后，在顯微鏡下觀察統計出現溶菌酶晶體的數目， 并統計出現蛋白質晶體在多孔表面基底生長的的結晶條件的個數以及對照組的結晶條件 的個數。
經過統計得到如下結果體積比為70%的氫氟酸處理的蓋玻片多孔基底表面得到的晶體 的成功率為71%，體積比為60%的氫氟酸處理的蓋玻片多孔基底表面得到的晶體的成功率
76%，體積比為50%的氫氟酸處理的蓋玻片多孔基底表面得到的晶體的成功率67%，體積比 為40%的氫氟酸處理的蓋玻片多孔基底表面得到的晶體的成功率60%,相對于文獻1中大多 數蛋白質篩選成功率為2%有明顯提高。
除上述的實施例外，還進行了多孔表面基底用于溶菌酶蛋白結晶條件篩選，結晶篩選成 功率也得到了明顯的提高。
權利要求
1、一種促進蛋白質異相形核的方法，其特征在于包括以下步驟(a)用體積比為70％，60％，50％，40％的氫氟酸溶液處理蓋玻片表面，依次得到四種不同形貌的多孔表面基底材料；(b)用原子力顯微鏡掃描上述四種多孔表面基底材料形貌，得出四種表面粗糙度；(c)蛋白質溶液在經過上述步驟處理的多孔表面的蓋玻片上形核以及生長；(d)在20℃溫控箱中放置2天后取出，在顯微鏡下觀察，統計出現蛋白質晶體在多孔表面基底生長的的條件數目。
全文摘要
本發明公開了一種促進蛋白質異相形核的方法，首先用體積比為70％，60％，50％，40％的氫氟酸溶液處理蓋玻片表面，依次得到四種不同形貌的多孔表面基底材料；蛋白質溶液在經過上述步驟處理的多孔表面的蓋玻片上形核以及生長；在20℃溫控箱中放置2天后取出，在顯微鏡下觀察，統計出現蛋白質晶體在多孔表面基底生長的條件數目。由于用多孔表面作為形核基底，蛋白質結晶篩選成功率由背景技術的2％提高到46～76％。
文檔編號C07K1/00GK101602788SQ20091002329
公開日2009年12月16日 申請日期2009年7月10日 優先權日2009年7月10日
發明者君 劉, 尹大川, 王璽凱, 郭云珠, 鹿芹芹 申請人:西北工業大學