一組含γ-核心模序的新型未環化抗菌肽及其制備方法和應用的制作方法

專利名稱：一組含γ-核心模序的新型未環化抗菌肽及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一組含Y-核心模序的新型未環化抗菌肽及其制備方法和治療多重耐藥菌感染的應用。
背景技術：
病原微生物抗生素耐藥菌株的不斷出現，已經使得感染再次成為人類健康的巨大威脅。許多原本可以 治愈的感染性疾病，正在成為難以治愈的疾病。目前抗生素耐藥菌株的出現速度已經遠遠超過了抗生素研 發的速度，并且現有的抗生素開發策略多局限于既有的抗生素類別，難以有實質上的突破， 一種新的抗生 素出現不久就會有病原菌對其產生耐藥，我們正面臨著可選擇的抗生素愈來愈少的局面。抗感染形勢的嚴 峻性對人們尋找與現有抗生素抗菌機理完全不同的新型抗生素提出了前所未有的緊迫要求。
抗微生物肽的分子量小，合成速度快，通過對非宿主微生物的特異性識別來完成免疫反應，屬于天然 免疫，因此抗微生物肽被認為是機體理想的第一道防線。抗微生物肽的抗菌譜極廣，不僅可拮抗革蘭氏陽 性、陰性菌、病毒和真菌，甚至對多種原蟲都有作用。最值得關注的是，抗微生物肽被公認為是不可能產 生完全耐藥性的。因為它主要是通過物理滲透作用于細菌胞膜，微生物很難改變自身的胞膜(磷脂雙分子層) 結構，從而使微生物不易對其產生耐藥性。另外，抗微生物肽在微生物體內有多個作用靶點，減少胞內任 何一個作用靶點，都不會使其耐藥性增加很多。同時，抗微生物肽和其它的抗微生物肽或傳統的抗生素聯 合應用，不易發生交叉耐藥。抗微生物肽不易產生耐藥性的優越性質，為人們尋找理想的抗菌藥物提供了 新的研究領域，為人類戰勝耐藥微生物帶來了新的契機，抗微生物肽也因此具有巨大的研發和應用的潛力。
盡管自然界發現的天然抗微生物肽和人工改造、設計合成的抗微生物肽種類繁多，但是抗微生物肽應
用于臨床的成功率卻很低。其主要原因是抗微生物肽在研發中還存在一些亟待解決的問題①毒性問題 抗微生物肽主要通過破壞細菌細胞膜而發揮殺菌作用，選擇性不高，易使紅細胞膜破裂溶血。②穩定性問 題抗微生物肽是小分子量的蛋白質，易被蛋白酶水解，體內半衰期短。③體內外活性差異大盡管許多 抗微生物肽在體外顯示出明顯的抗菌活性，但在生理鹽濃度和血漿條件下，許多抗微生物肽的活性喪失。 ④生產成本高天然提取資源有限，分離純化工藝復雜；化學合成成本太高，產業化困難；基因工程表達 則抗菌活性差，表達產量不高。
最近在含半胱氨酸穩定的抗微生物多肽、毒素、毒液、kinocidins和宿主防御肽等許多多肽中發現了一 個結構模序^y-核心模序。它是一個具有遺傳進化標志的保守三維結構模序，是由特定氨基酸序列組成 的雙向定向結構。Thanatin是目前發現的具有Y-核心模序的最簡單的抗菌肽。對革蘭氏陰性菌具有較強的抗 菌活性，毒性低，穩定性好。本發明通過截短、替換和移位對thanatin序列進行改造，得到具有不同抗菌譜、 低毒、穩定的含Y-核心模序的新型未環化抗菌肽。

發明內容
本發明需要解決的技術問題之一是提供一組新型抗菌肽。 本發明需要解決的技術問題之二是提供一組新型抗菌肽的制備方法。 本發明需要解決的技術問題之三是公開所述抗菌肽的應用。
本發明的設計思路如下保持thanatin的遺傳進化標志(y-核心模序)，用6條天然存在的含y-核心模 序抗菌肽P隆起部位的氨基酸序列替換thanatin的相應部位序列，得到一系列新的序列；截掉這些序列N-末端的8個氨基酸，又得到一系列新的序列；在此基礎上再截掉這些序列C-末端的1個氨基酸，又得到僅 保留Y-核心的一系列新的序列，上述所有多肽鏈的C-末端均進行酰胺化。經過改造后篩選到以下37條序 列具有不同的抗菌活性，而溶血毒性基本沒有變化，有希望用于治療細菌感染的新藥的開發。
本發明提供的抗菌肽是在對天然抗菌肽的序列、結構分析的基礎上設計合成的，它們的這一系列序列 被命名為US，序列如下表所示。
所述的含Y-核心模序的新型未環化抗菌肽為12、 13和21個氨基酸，羧基末端全部酰胺化修飾。
本發明提供的一組抗菌肽，其制備方法是固相化學合成。先用MALDI-TOF質譜儀測定多肽粗品的分 子量；再用RP-HPLC色譜儀對多肽粗品進行分離純化；最后用ESI質譜儀測定多肽純品的分子量，并用 RP-HPLC色譜儀對多肽純品進行純度分析。, Gly-ser-Lys-Lys-pro-val-pro-lle-Ile-Tyr-門ys-Asn-ATg-Arg-Thr-Gly-Lys-門ys-Gln-ATg-Met
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采用試管法檢測多肽的殺菌曲線，以抗生素氨芐西林為對照，進行殺菌活性的檢測。結果表明本發明
US1的殺菌活性強于抗生素氨節西林的殺菌活性，且序列相同的環化抗菌肽與為環化抗菌肽在體外具有相同的抗菌活性，均對陰性多重耐藥菌產超廣譜p內酰胺酶大腸桿菌(ESBLs-EC)有明顯的殺菌作用，隨著作用時間的延長，細菌數逐漸降低至接近零。
采用試管法檢測不同濃度多肽的劑量效應曲線，以抗生素氨芐西林為對照，進行殺菌活性的檢測。濃度效應關系結果顯示，不同劑量的抗菌肽對ESBLs-EC有顯著的殺滅作用，且具有濃度依賴效應。
抗菌肽在高效殺菌的同時也有可能作用于高等有機體包括人體細胞，因為抗菌肽的作用方式都是在細胞膜上穿孔使得細胞發生滲漏死亡。所以把抗菌肽能否使紅細胞發生滲漏作為其是否有毒性的一個標準，如果抗菌肽能使紅細胞中的血紅蛋白發生滲漏，就可以通過檢測ODs4。值確定毒性的大小。因此本發明還檢測了抗菌肽對人體紅細胞的溶血活性，實驗表明在128 ng/ml時，抗菌肽的溶血率值仍為零，證實本發明抗茵肽的溶血毒性極小，它們？的半效溶血濃度(HC5C1)遠高于陽性對照Melittin。
為了明確多肽在血漿中的穩定性，我們進行了 50%血漿穩定性實驗，結果表明抗菌肽與50%血漿孵育0、 3、 6h后，MIC不變或明顯降低，推測抗菌肽在血漿中穩定或代謝成活性更強的物質，而對照抗菌肽S4(l-16)的MIC值明顯增高，說明它在血漿中被嚴重降解。
耐藥性實驗結果證明，ESBLs-EC與環丙沙星、四環素和亞胺培南等抗生素相互作用15代后，對這些抗生素均產生了嚴重的耐藥，ESBLs-EC與本發明所制備的抗菌肽相互作用15代后，均沒有出現明顯耐藥性。


現結合附圖和實施例對本發明的內容作進一步說明。圖1是抗菌肽US1粗品的MALDI-TOF質譜圖；圖2是抗菌肽US1純品的ESI-MS質譜圖；圖3是抗菌肽US1純品的RP-HPLC色譜圖；圖4是抗菌fifcUS1的殺菌曲線；
圖5是不同劑量US1作用后平板克隆形成實驗結果的統計圖6是抗菌肽US1的溶血曲線；
圖7是抗菌肽US1的耐藥性實驗；
圖8是抗菌肽US1的50%血漿穩定性實驗。
具體實施例方式
下面以US1為例，進一步詳述本發明具體實施過程。實施例1抗菌肽的制備及分離純化。
在本實施例中，按上述序列制備US1到US37,同時制備Melittin和K4-S4(l-16)作為對照。本實施例以HOBt/DIC為縮合劑，在Rink樹脂上，采用Fmoc保護a氨基酸，從C-端(羧基端)向N-端(氨基端)手動固相合成C-末端酰胺化的多肽鏈。合成的多肽經過髙濃度TFA剪切后，先用MALDI-TOF質譜儀測定多肽粗品的分子量；再用RP-HPLC色譜儀對多肽粗品進行分離純化；最后用ESI質譜儀測定多肽純品的分子量，并用RP-HPLC色譜儀對多肽純品進行純度分析。
Melittin的序列
Gly-ne-Gly-Ala-Val-Leu-lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-He-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-NH2。
K4-S4(l-16)的序列
Ala-Leu-Trp-Lys-Thr-Leu-Leu-Lys-Lys-Val-Leu-Lys-Ala-Ala-Ala-Lys-NH2。
具體試驗步驟如下。
第一步，抗菌肽的固相合成(以l號樣品為例)。制備的多肽從C端到N端逐個進行。首先稱量0.5gRinkAmide-AM樹脂裝柱，力Q 2.5 ml 二氯甲烷(CHC12)，使其溶脹，20%哌啶/二甲基甲酰胺(DMF)溶液脫保護，DMF清洗。9-笏甲氧羰基(Fmoc)保護的第一個氨基酸、羥基苯并三唑(HOBt)和二異丙基碳二亞胺(DIC)溶解于適量DMF，活化后與脫保護后的樹脂在柱上循環偶合反應30min 2h， DMF洗滌。以后連接的氨基酸重復以上活化、縮合、脫保護和洗滌的過程，直到制備結束。
第二步，抗菌肽的剪切(以1號樣品為例)。取下反應后的樹脂，加入切割液(90%三氟乙酸，5%苯甲硫醚，3%苯甲醚，2%乙二硫醇)，室溫反應3-4小時，過濾，濾出液中加入IO倍體積的預冷無水乙醚，3500轉/分鐘離心5分鐘，收集沉淀并室溫干燥。
第三步，抗菌肽的MALDI-TOF質譜鑒定(以1號樣品為例)。取0.5 pl多肽樣品溶液的氧化鐵分散液點于MALDI靶板上，冉點上0.5nL的有機基質溶液，待靶板上的點樣液干燥、結晶后，將靶板放進質譜儀，進行質譜測定。結果如圖l所示，制備的US 1經過MALDI-TOF分析，在質譜圖中顯示的分子量測定值(2435.0 KD)與多肽序列計算出的理論值(2434.9 KD)—致，說明制備的多肽即為設計的抗微生物肽。
第四步，抗菌肽的RP-HPLC純化(以1號樣品為例)。稱量一定量干燥后的多肽，溶于0.1%三氟乙酸，樣品處理后經反向柱梯度分離(洗脫液為含0.1%三氟乙酸的20%-80%的乙腈)，收集洗脫峰。
第五步，抗菌肽的ESI-MS質譜鑒定(以l號樣品為例)。稱量一定量干燥后的多肽，溶于甲醇，樣品處理后以電噴霧電離負離子、多反應監測方式檢測。結果如圖2所示，純化后的US1經過ESI-MS鑒定，在質譜圖中顯示的分子量測定值(2435.6KD)與多肽序列計算出的理論值(2434.9 KD)—致，說明純化后的多肽即為US1。
第六步，抗菌肽的RP-HPLC分析(以1號樣品為例)。稱量一定量干燥后的多肽，溶于0.1%三氟乙酸，樣品處理后經反向色譜柱梯度分析(洗脫液為含0.1%三氟乙酸的20%-80%的乙腈)，計算多肽純品的純度。結果如圖3所示，純化后的US1經過RP-HPLC分析，在色譜圖中顯示其純度為97.34%,明顯達到95%以上。
實施例2抗菌肽殺菌曲線的測定。
第一步，取無菌錐形瓶4個，分別標記為"生長對照管、藥物l、藥物2和藥物3(陽性對照藥)"。每瓶分別加入6ml營養肉湯。
第二步，在各錐形瓶中分別加入定量的測試藥物，其含量為6MIC濃度，生長對照組加同等體積的去離子水。
第三步，在各錐形瓶中加入60^1濃度為0.5麥氏比濁標準的待測菌液，各管菌液的最終濃度約為106CFU/ml。
第四步，加菌后立即將4個錐形瓶均勻渦旋15s, 10倍比連續稀釋1000倍后，分別取0.1ml菌液接種于M-H瓊脂平板上(各接種兩份)，用L型玻棒均勻涂布接種，35'C孵育過夜后做菌落計數，并取其平均數。
第五步，37'C分別培養0.5， 1， 2， 4， 6h后，將4個錐形瓶均勻渦旋15s，同上法10倍比連續稀釋10" l(f倍后，分別取O.lml菌液接種于M-H瓊脂平板上(各接種三份)，35'C孵育過夜后，取菌落數在30-300之間的平板計數，并取其平均數。
第六步，CFU=三塊板的菌落平均數X稀釋倍數，即為原液屮每毫升菌液屮的活菌數。肉眼計數不同 時間點的菌落，并求其平均值，從而在對數坐標紙繪制不同時間點的殺菌曲線圖。
結果如圖4所示，可以看出，與對照組相比，US1和DS1作用后的ESBLS-ES的生長受到明顯的抑制。 作用lh后，細菌數就接近于零，即<50 CFU/ml。而氨芐西林組ESBLS-ES的生長與空白對照組相比沒有 明顯的差異。說明US1和DS1對ESBLS-ES有快速、明顯的殺滅作用，而ESBLS-ES對氨芐西林都產生 了嚴重的耐藥。
實施例3抗菌肽濃度效應關系的測定。
第一步，取無菌試管5個，分別標記為"生長對照管、高濃度藥物、屮濃度藥物、低濃度藥物和氨節 西林組"。
第二步，在各錐形瓶中分別加入lml的不同濃度的藥物，生長對照組加同等體積的去離子水。 第三步，在各錐形瓶中加入1ml濃度為0.5麥氏比濁標準的待測菌液，各管菌液的最終濃度約為5X 107CFU/ml。
第四步，37'C培養m后，將5個試管均勻渦旋15s, 10倍比連續稀釋10^1(f倍后，分別取0.1ml菌 液接種于M-H瓊脂平板上(各接種二份)，35'C孵育過夜后，取菌落數在30-300之間的平板計數，并取其 平均數。
第五步，CFU=三塊板的菌落平均數X稀釋倍數，即為原液中每亳升菌液中的活菌數。肉眼計數不同 濃度組的菌落，并求其平均值，從而在對數坐標紙上繪制不同藥物濃度的效應曲線。
結果如圖5所示，可以看出，US1三個劑量組(4、 12和24 ng/ml) ESBLs-EC的CFU都減少了二到七 個數量級，減少率都高達95。/。以上(PO.01);隨著US1濃度的增加，ESBLs-EC的CFU減少越明顯。高劑 暈組ESBLs-EC的CFU接近于零，即<50 CFU/ml。而氨節西林組ESBLs-EC的CFU與空白對照組相比無 顯著性的減少(PX).05)，沒有統計學差異。實驗結果表明USl對ESBLs-EC有明顯的殺滅作用，且具有劑 量依賴關系；而氨芐西林對ESBLs-EC沒有殺滅作用。
實施例4抗菌肽的溶血毒性的測定。
第一步，取抗凝的新鮮人外周血，3000r/min離心10min，分層后吸取下層的血細胞，加入0.01MPBS 緩沖液重懸、洗滌以去除血漿和棕黃色血膜層，重復3次，最后重懸于不同體積的0.01M PBS中，得到 4%和20%的紅細胞懸液。
第二步，取100nl重懸的紅細胞和100nl 二倍梯度稀釋的抗菌肽(紅細胞終濃度為2%和10%),在37 'C的孵箱中孵育。
第三步，lh后，將反應液離心，540nm處測其光密度值。
第四步，紅細胞懸液與等體積0.01MPBS孵育的ODs4o作為0%溶血，與等體積Triton-100(終濃度1%) 孵育的OD54q100。/。対照。以抗菌肽濃度為橫坐標，AOD。/。為縱坐標繪制曲線，求得50%溶血的抗菌肽濃度 HC50。
結果如圖6所示，可以看出，抗菌肽US1和Melittin與人紅細胞懸液(終濃度為2%和10%)共孵育1、 3、 6h后，US1在128 ng/ml時均沒有發生溶血，而Mdittin在2.5 pg/ml時(人紅細胞懸液終濃度為2%), 就發生明顯的溶血反應。US1的HC5。遠高于陽性對照抗菌肽Melittin。
實施例5抗菌肽的50%血漿穩定性測定。
第一步，取抗凝的新鮮人外周血，3000r/min離心10min,分層后吸取上層血漿，凍于-20'C。試驗前 用0.01MPBS稀釋為50%的血漿。
第二步，抗菌藥物與0.5ml50。/。血漿在37'C分別孵育0、 3、 6h，抗菌藥物的濃度為64MIC。
第三步，檢測與血漿共孵育的藥物的MIC。與生長對照孔中細菌生長特性相比較，無肉眼可見生長的 最低藥物濃度為測定藥物對檢測菌的MIC。
1)抗菌藥物的梯度稀釋方法稱取2mg抗菌藥物加入lml稀釋液中混勻，藥物原液濃度為2mg/ml。 原液稀釋好以后用過濾法除菌，小量分裝備用。原液在-2(TC以下可保存3個月，但在4'C下只能保存一周。 512nl原液加入488 nlM-H肉湯培養基中，混合后抗菌藥物的最高濃度為2048 pg/ml。吸取100 nl最高濃度的藥物加入每排第1號孔內，1號孔經混合后吸出100 pl，加入2號內，依次倍比稀釋至10號后，吸出 100nl棄去，這樣藥物的梯度濃度依次為1024、 512、 256、 128、 64、 32、 16、 8、 4、 2 ng/ml。
2) 檢測菌和標準菌的準備取凍存于-20'C的檢測菌，劃線接種于M-H瓊脂培養基，在孵箱(35i2'C) 中孵育20 24h。次日挑取單克隆菌落，接種于2ml營養肉湯中，180rpm、 37'C搖菌過夜。處于對數生長 期的細菌菌液，用M-H肉湯培養基校正濃度至0.5麥氏比濁標準，再用M-H肉湯1:100稀釋(含菌量約106 CFU/ml)。稀釋后的菌液應在15 min內接種。標準菌大腸埃希菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC29213 的準備過程同上。
3) 檢測菌和標準菌的接種用微量加樣器取100pl稀釋后的菌液依次加到96孔板中，最終接種細菌 濃度為每孔5Xl()5/ml。這時從第1孔到第IO孔藥物的濃度依次為512、 256、 128、 64、 32、 16、 8、 4、 2、 1 ^g/ml。將96孔板置微型振蕩器上振蕩1 min，使各孔內菌液混勻，微孔板加蓋以減少孵育過程中的蒸發， 并置濕盒內35'C孵育16 20 h。同時每組設無藥生長對照孔(即第11孔內只加100 pi M-H肉湯和100 pl 復蘇后的菌液，不加藥物)和無菌對照孔(即第12孔內只加200 pl M-H肉湯)。
4) 結果判斷無菌對照孔在整個試驗過程中應始終保持清亮，表明整個實驗是無菌操作。與生長對照 孔中細菌生長特性(如微孔內肉湯呈混濁狀，孔底出現沉淀等)相比較進行判斷，無肉眼可見生長的最低藥 物濃度為測定藥物對檢測菌的MIC。
結果如圖7所示，可以看出，US1與50%血漿孵育后，MIC值不變，表明US1在血漿中穩定；S4(l-16) 與血漿孵育后MIC明顯增高，說明它在血漿中被降解。
實施例6抗菌肽的耐藥性測定。
第一步，測定抗菌藥物對ESBLS-ES的MIC值，方法同上。
第二步，稀釋上面1/2MIC孔內的細菌，使其濃度為5X10SCFU/ml，此為次代培養的細菌。再次測定 抗菌藥物對ESBLS-ES的MIC值，方法同上。
第三步，連續15天，每天測定一次抗菌藥物對ESBLS-ES的MIC值，方法如上。 第四步，計算抗菌藥物對15代培養細菌的MIC與第1代培養細菌的MIC的相對值。 結果如圖8所示，可以看出，ESBLS-ES與抗菌藥物Erythromycin (紅霉素)、Ceftriaxone (頭孢曲松)、 苯唑西林(Oxacillin)和US1共孵育，連續15代培養的MIC與第1代培養的MIC的相對值分別是100、 10、 10和1。表明ESBLS-ES容易對抗生素產生耐藥性，不容易對US1產生耐藥性。
權利要求
1.一組含γ-核心模序的新型未環化抗菌肽(US01～US37)，其特征在于，其氨基酸序列為US01Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Asn-Arg-Arg-Thr-Gly-Lys-Cys-Gln-Arg-Met-NH2US02Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Asn-Arg-Arg-Gly-Val-Lys-Cys-Gln-Arg-Met-NH2US03Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Asn-Tyr-Arg-Gly-Ile-Lys-Cys-Gln-Arg-Met-NH2US04Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Asn-Arg-Arg-Arg-Phe-Lys-Cys-Gln-Arg-Met-NH2US05Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Asn-Lys-Gln-Gly-Arg-Lys-Cys-Gln-Arg-Met-NH2US06Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Asn-Lys-Asn-Gly-Arg-Lys-Cys-Gln-Arg-Met-NH2US07Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Asn-Met-Asn-Lys-Lys-Lys-Cys-Gln-Arg-Met-NH2US08Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Asn-Cys-Arg-Arg-Gly-Val-Cys-Lys-Gln-Arg-Met-NH2US09Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Asn-Cys-Tyr-Arg-Gly-Ile-Cys-Lys-Gln-Arg-Met-NH2US10Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Asn-Cys-Arg-Arg-Arg-Phe-Cys-Lys-Gln-Arg-Met-NH2US11Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Asn-Cys-Lys-Gln-Gly-Arg-Cys-Lys-Gln-Arg-Met-NH2US12Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Asn-Cys-Lys-Asn-Gly-Arg-Cys-Lys-Gln-Arg-Met-NH2US13Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Asn-Cys-Met-Asn-Lys-Lys-Cys-Lys-Gln-Arg-Met-NH2US14 Ile-Tyr-Cys-Asn-Arg-Arg-Gly-Val-Lys-Cys-Gln-Arg-Met-NH2US15 Ile-Tyr-Cys-Asn-Tyr-Arg-Gly-Ile-Lys-Cys-Gln-Arg-Met-NH2US16 Ile-Tyr-Cys-Asn-Arg-Arg-Arg-Phe-Lys-Cys-Gln-Arg-Met-NH2US17 Ile-Tyr-Cys-Asn-Lys-Gln-Gly-Arg-Lys-Cys-Gln-Arg-Met-NH2US18 Ile-Tyr-Cys-Asn-Lys-Asn-Gly-Arg-Lys-Cys-Gln-Arg-Met-NH2US19 Ile-Tyr-Cys-Asn-Met-Asn-Lys-Lys-Lys-Cys-Gln-Arg-Met-NH2US20 Ile-Tyr-Asn-Cys-Arg-Arg-Gly-Val-Cys-Lys-Gln-Arg-Met-NH2US21 Ile-Tyr-Asn-Cys-Tyr-Arg-Gly-Ile-Cys-Lys-Gln-Arg-Met-NH2US22 Ile-Tyr-Asn-Cys-Arg-Arg-Arg-Phe-Cys-Lys-Gln-Arg-Met-NH2US23 Ile-Tyr-Asn-Cys-Lys-Gln-Gly-Arg-Cys-Lys-Gln-Arg-Met-NH2US24 Ile-Tyr-Asn-Cys-Lys-Asn-Gly-Arg-Cys-Lys-Gln-Arg-Met-NH2US25 Ile-Tyr-Asn-Cys-Met-Asn-Lys-Lys-Cys-Lys-Gln-Arg-Met-NH2US26 Ile-Tyr-Cys-Asn-Arg-Arg-Gly-Val-Lys-Cys-Gln-Arg-NH2US27 Ile-Tyr-Cys-Asn-Tyr-Arg-Gly-Ile-Lys-Cys-Gln-Arg-NH2US28 Ile-Tyr-Cys-Asn-Arg-Arg-Arg-Phe-Lys-Cys-Gln-Arg-NH2US29 Ile-Tyr-Cys-Asn-Lys-Gln-Gly-Arg-Lys-Cys-Gln-Arg-NH2US30 Ile-Tyr-Cys-Asn-Lys-Asn-Gly-Arg-Lys-Cys-Gln-Arg-NH2US31 Ile-Tyr-Cys-Asn-Met-Asn-Lys-Lys-Lys-Cys-Gln-Arg-NH2US32Ile-Tyr-Asn-Cys-Arg-Arg-Gly-Val-Cys-Lys-Gln-Arg-NH2US33Ile-Tyr-Asn-Cys-Tyr-Arg-Gly-Ile-Cys-Lys-Gln-Arg-NH2US34Ile-Tyr-Asn-Cys-Arg-Arg-Arg-Phe-Cys-Lys-Gln-Arg-NH2US35Ile-Tyr-Asn-Cys-Lys-Gln-Gly-Arg-Cys-Lys-Gln-Arg-NH2US36Ile-Tyr-Asn-Cys-Lys-Asn-Gly-Arg-Cys-Lys-Gln-Arg-NH2US37Ile-Tyr-Asn-Cys-Met-Asn-Lys-Lys-Cys-Lys-Gln-Arg-NH2式中英文縮寫表示Arg精氨酸，Asn天冬酰胺，Cys半胱氨酸，Gln谷氨酰胺，Gly甘氨酸，Ile異亮氨酸，Lys賴氨酸，Met蛋氨酸，Phe苯丙氨酸，Pro脯氨酸，Ser絲氨酸，Thr蘇氨酸，Tyr酪氨酸，Val纈氨酸
2. 根據權利要求I所述的多肽，其特征在于US02 US07是對US01的替換設計，即用6條天然含y-核心模序抗菌肽中間的4個氨基酸替換US1多肽序列相應部位的氨基酸。
3. 根據權利要求2所述的多肽，其特征在于US08 US13是分別對US02 US07的移位設計，即以 US02 US07多肽序列為模板，使序列兩側的半胱氨酸分別向中間移動一位。
4. 根據權利要求1所述的多肽，其特征在于US14~US19是對US01的截短并替換設計，即截去US01 N-末端的前S個氨基酸，使其長度由21個氨基酸縮短至13個氨基酸，并用6條天然含Y-核心模序抗菌肽 中間的4個氨基酸替換US1多肽序列相應部位的氨基酸。
5. 根據權利要求4所述的多肽，其特征在于US20~ US25是分別對US14 US19的移位設計，即以 US14 US19多肽序列為模板，使序列兩側的半胱氨酸分別向中間移動一位。
6. 根據權利要求1所述的多肽，其特征在于US26-US31是對US01的截短并替換設計，即截去US01 N-末端的前8個氨基酸和C-末端的蛋氨酸，使其長度由21個氨基酸縮短至12個氨基酸，并用6條天然含 ，核心模序抗菌肽中間的4個氨基酸替換US1多肽序列相應部位的氨基酸。
7. 根據權利要求6所述的多肽，其特征在于US32~ US37是分別對US26 US31的移位設計，即以 US26 US31多肽序列為模板，使序列兩側的半胱氨酸分別向中間移動一位。
8. 根據權利要求2、 4、 6所述的抗菌肽，應包括用所有含，核心模序抗菌肽中的Y-核心模序組成氨基 酸對其它天然抗菌肽進行的序列替換、取代而得到的功能等同物多肽。根據權利要求3、 5、 7所述的抗菌 肽，應包括其它氨基酸截短和移位方式而，到的功能等同物多肽。
9. 根據權利要求1中任何一項的多肽，其中所涉及的多肽是以固相化學合成方法產生的，其羧基末端 均進行酰胺化。
10. 根據權利要求書1所述的抗多重耐藥菌的抗菌肽，其特征在于所述的抗菌肽序列用于制備抗多 重耐藥菌藥物的用途。
全文摘要
本發明提供了一組含γ-核心模序的新型未環化抗菌肽，這些抗菌肽含有遺傳進化標志，具有抗菌效果好、毒性低、穩定性好以及不易耐藥的優點。本發明還公開了該組抗菌肽的固相化學制備的方法。本發明合成的抗菌肽可用于制備抗多重耐藥菌感染的藥物。
文檔編號C07K14/00GK101624419SQ20091002303
公開日2010年1月13日 申請日期2009年6月24日 優先權日2009年6月24日
發明者征 侯, 軍 呂, 穎 周, 孟靜茹, 卉 白, 羅曉星, 薛小燕 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學