鰻利斯頓氏菌亞單位疫苗抗原蛋白與應用的制作方法

專利名稱：鰻利斯頓氏菌亞單位疫苗抗原蛋白與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及免疫學領域，具體的說是一種鰻利斯頓氏菌亞單位疫苗 抗原蛋白與應用。
背景技術：
鰻利斯頓氏菌U&to"e〃am2gw/〃an/w)是一種革蘭氏陰性桿狀細菌， 是淡水和海水養殖魚類和野生魚類的病原菌，引起魚類的出血性敗血癥， 造成世界范圍魚類養殖的重大經濟損失。在我國，鰻利斯頓氏菌不僅是 養殖對蟲下紅腿病癥的病原，還是艫魚、牙鲆、大菱鲆、石斑魚和歐洲鰻 鱺等魚類的皮膚肌肉潰爛、出血癥病原，對我國養殖魚類的危害巨大。
VI型分泌系統(Type VI Secret System, T6SS )是最近確定的一種新 的細菌分泌系統，它參與細菌的致病作用，并已經在多個植物或動物的 病原菌中發現。目前的研究表明，革蘭氏陰性細菌的T6SS基因簇結構比 較保守， 一般由12至25個基因組成，其中包括一個基質蛋白基因/2^。 /^p基因在不同細菌中具有較高的保守性，它編碼的蛋白在T6SS的分泌 過程中具有重要作用，研究表明它可能作為T6SS的基質蛋白參與組裝分 泌通道，/zc/7基因的缺失可以阻斷T6SS的分泌。但目前還沒有關于HCP 蛋白具有免疫保護效果的文獻報道。

發明內容
本發明目的在于提供一種鰻利斯頓氏菌亞單位疫苗抗原蛋白與應用。
為實現上述目的，本發明釆用的技術方案為
鰻利斯頓氏菌亞單位疫苗抗原蛋白鰻利斯頓氏菌"力cp基因核酸 堿基序列如序列表SEQ ID N0: 1所示，其編碼的蛋白即為鰻利斯頓氏菌 亞單位疫苗抗原蛋白氨基酸序列表SEQ ID NO: 2所示。
鰻利斯頓氏菌亞單位疫苗抗原蛋白的應用所述鰻利斯頓氏菌亞單 位疫苗抗原蛋白具有激發魚體對鰻利斯頓氏菌病的免疫力。
將所述鰻利斯頓氏菌亞單位疫苗抗原蛋白與完全弗氏佐劑或不完全 弗氏佐劑，按體積1:1比例將其混合，而后以20嗎蛋白/g魚體重-0.2ing 蛋白/g魚體重的接種劑量，腹腔注射于魚體。
本發明所具有優點如下
1. /^p基因在細菌中的保守性較高，本發明以/"/zw基因的表達蛋白 制備的亞單位疫苗可以拓寬疫苗保護譜、增加疫苗的免疫協同作用，誘 導水產養殖動物的非特異性和特異性免疫應答，并提供保護效應。
2. 本發明表達蛋白可激發魚體產生特異性抗體，抵抗鰻利斯頓氏菌的感染，可用于水產魚類養殖中鰻利斯頓氏菌引起疾病的預防中。
3.本發明的抗原蛋白制備方法簡單，可應用于大規模工業化生產。


圖1為本發明鰻利斯頓氏菌/a/2C/7基因核酸電泳圖。
圖2為本發明鰻利斯頓氏菌LAHCP表達純化蛋白SDS-PAGE電泳圖。
圖3為本發明鰻利斯頓氏菌LAHCP表達純化蛋白質譜分析結果。 圖4為使用本發明疫苗免疫牙鲆后鰻利斯頓氏菌感染牙鲆死亡情況圖。
圖5為使用本發明疫苗免疫藍鰻龍后鰻利斯頓氏菌感染藍鰻龍死亡 情況圖。為使用本發明疫苗免疫后大菱鲆血清抗鰻利斯頓氏菌抗體效價 變化情況圖。
圖6為使用本發明疫苗免疫后大菱鲆血清抗LAHCP抗體效價變化情 況圖。
具體實施例方式
下面根據

和實施例對本發明作進一 步說明。 實施例1
根據鰻利斯頓氏菌T6SS基質蛋白基因^的核酸序列，以及載體 pETDuet (購自Novagen公司)的酶切圖譜設計擴增引物
lahcp國for-EcoRI: 5，-GGCGAATTCATGCCAACTGCATG-3，(下劃線 堿基序列為限制性內切酶EcoRI的識別位點)；
lahcp-rev畫SalI: 5，-ATCGGTCGACTTACGCTTCAACAG3，(下劃線 堿基序列為限制性內切酶Sail的識別位點)。
以鰻利斯頓氏菌基因組DNA為模板進行PCR擴增反應(PCR儀購 自Takara公司，型號TP600),反應體系與反應參數如下(試劑盡量用 中文表示)
PCR反應體系(25pL)
10xPCR buffer 2.5 pL
dNTP混合液 0.5pL (各0.2 mM)
MgCl2 2攀(1.5mM) 引物lahcp畫for-EcoRI 0.5jiL (0.5 pM)
引物lahcp-rev-SalI 0.5pL (0.5 pM)
鰻利斯頓氏菌基因組DNA 1 .(VL (30 ng)
Taq酶 0.25jnL(5U/VL) 滅備雙蒸水 17.75pL 反應體系 25.0jiL PCR反應參數
95 °C 3min<formula>formula see original document page 5</formula>
反應結東后，對PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得一個 519bp的DNA片段(參見圖1 )。使用PCR產物純化試劑盒(Invitrogen 公司)回收目的片斷，將目的片斷與pGMT (tiangen公司)載體連接， 連接反應體系如下
連接反應體系(10pL)
10xligation buffer 1 (iL
聚乙二醇 luL pGM-T l^L PCR產物 3pL T4連接酶 lpL 滅菌雙蒸水 3)aL 反應體系 lO)iL 反應混合物于16"C恒溫過夜。取全部連接產物轉化大腸桿菌DH5a 感受態細胞，釆用抗生素(氨芐青霉素)與a互補實驗篩選目標重組質 粒陽性大腸桿菌單菌落，提質粒，將此重組質粒命名為pGMT-lahcp,對 其進行測序(上海博亞公司)，測序結果表明獲得了序列正確的鰻利斯頓 氏菌/a/zcp基因片斷(參見序列表SEQIDNO: 1)。 SEQIDNO: 1
GAAGCGTAA a)序列特征
參長度519bp
*類型堿基序列 *鏈型單鏈 *拓撲結構線性
<image>image see original document page 5</image>(b) 分子類型雙鏈DNA
(c) 假設否
(d) 反義否
(e) 最初來源鰻利斯頓氏菌
將pGMT-lahcp用限制性內切酶EcoR和Sail ( Takara公司)進行雙 酶切，酶切體系如下
H-buffer lpL
質粒(Plasmid) lpL
Eco脆SalI 4o.5|iiL
超純水(DDw) 7pL
反應總體系 10pL 將酶切產物用T4 DNA連接酶(Takara公司)連接入載體pETDuet 的EcoRI和Sall酶切位點之間，連接反應體系如下 連接反應體系(lOpL)
10 x ligation buffer 1 fxL
PEG4000 lpL
pETDuet 1.5|aL
酶切產物 4.5pL
T4連接酶 lpL
滅菌雙蒸水 lpL
反應體系 lO)iL 反應混合物于16。C恒溫過夜。取全部連接產物轉化大腸桿菌DH5a 感受態細胞，釆用抗生素(氨芐青霉素)篩選目標重組質粒陽性大腸桿 菌單菌落，提質粒，將此重組質粒命名為pETDuet-lahcp。
將構建好的質粒pETDuet-lahcp,轉化入大腸桿菌表達工程菌 BL21(DE3)中，采用抗生素(氨節青霉素)篩選陽性大腸桿菌菌落，接種 于5mlLB液體培養基中，在37C下培養12小時，然后按照1 : 100的比 例將菌液接種于含0.1mg/L氨芐青霉素的LB液體培養基中，在37'C下 培養3-4小時至OD600達0.6-0.8，加入IPTG至終濃度為l匪ol/L,在 相同條件下繼續培養4小時。培養結東后，離心收集菌體，用PBS洗滌 兩遍，完全除去培養液，最后重懸于PBS;用超聲波裂解細菌，超聲5s 間隔10s, 200W,破菌時間為90min-120min,直至菌液澄清。
因重組蛋白N端存在6個連續的組氨酸His序列，用鎳鰲合的瓊脂 糖柱Ni-Sepharose (購自Qiagen公司)進行親合純化，純化步驟依照產品 說明書進行。首先將初步純化的蛋白溶液加到平衡好的Ni-Sepharose上， 以清洗液(50mM磷酸緩沖液，200mM氯化鈉，pH7.8)洗3 ~ 5個柱體積； 然后以含有梯度濃度咪唑的洗滌液(50mM磷酸纟i沖液，200mM氯化鈉， 10-400mM咪唑，pH7.8)各洗3個柱體積，釋放重組蛋白。進行SDS-PAGE 電泳檢測純化結果(參見圖2)。通過蛋白質質譜分析，得純化的表達蛋白LAHCP,即為鰻利斯頓氏菌亞單位疫苗抗原蛋白(參見圖3和序列表 2)。
VSMSYRKILWDHVNAGTSGSDDWRKPVEA
(a) 序列特征
*長度172氨基酸殘基 *類型氨基酸序列 鏈型單鏈 參拓撲結構線性
(b) 分子類型雙鏈DNA
(c) 假設否
(d) 反義否
(e) 最初來源鰻利斯頓氏菌
將所述鰻利斯頓氏菌亞單位疫苗抗原蛋白與完全弗氏佐劑(Sigma), 按體積1:1比例將其混合，而后以2嗎蛋白/g魚體重的接種劑量，腹腔注 射于牙鲆體內，免疫后30天仍按上述的劑量進行加強免疫，同時將上述 完全弗氏佐劑釆用不完全弗氏佐劑(Sigma)替換，仍按按體積1:1比例將 其與鰻利斯頓氏菌亞單位疫苗抗原蛋白混合，按2pg蛋白/g魚體重的接 種劑量，腹腔注射于牙鲆體內。
實施例2
將所述鰻利斯頓氏菌亞單位疫苗抗原蛋白與完全弗氏佐劑，按體積 1:1比例將其混合，而后以2嗎蛋白/g魚體重的接種劑量，腹腔注射于大 菱鲆體內。
實施例3
將所述鰻利斯頓氏菌亞單位疫苗抗原蛋白與完全弗氏佐劑，按體積 1:1比例將其混合，而后以20嗎蛋白/g魚體重的接種劑量，腹腔注射于 藍鰻龍體內。
實施例4
將所述鰻利斯頓氏菌亞單位疫苗抗原蛋白與不完全弗氏佐劑，按體 積1:1比例將其混合，而后以2jig蛋白/g魚體重的接種劑量，腹腔注射于 藍鰻龍體內。
實施例5
將所述鰻利斯頓氏菌亞單位疫苗抗原蛋白與不完全弗氏佐劑，按體 積l:l比例將其混合，而后以0.2pg蛋白/g魚體重的接種劑量，腹腔注射 于藍鰻龍體內。
應用例1
} ￡ p K
g正G E
D w s w
…，
…
化V K
M T L
7將所述鰻利斯頓氏菌亞單位疫苗抗原蛋白與完全弗氏佐劑，按體積 1:1比例將其混合，而后以2嗎蛋白/g魚體重的接種劑量，腹腔注射于牙
鲆體內，免疫后30天進行加強免疫。再將上述蛋白與不完全弗氏佐劑按 體積l:l比例將其混合，而后以蛋白注射用量2pg蛋白/g魚體重的接種 劑量，腹腔注射于牙鲆體內。
第二次免疫后第30天取免疫牙鲆，以鰻利斯頓氏菌進行注射攻毒實 驗，鰻利斯頓氏菌的感染濃度為1.28 x 107cells/mL，每尾注射O.lmL,持 續觀察8天，記錄各組死亡情況(參見圖4)。
應用例2
將所述鰻利斯頓氏菌亞單位疫苗抗原蛋白與不完全弗氏佐劑，按體 積1:1比例將其混合，而后以0.2)ig蛋白/g魚體重的接種劑量，腹腔注射 于藍鰻龍體內。免疫后第30天取免疫魚，以鰻利斯頓氏菌進行注射攻毒 實驗，鰻利斯頓氏菌的感染濃度為2.13x l04cells/mL，每尾注射O.lmL， 持續觀察8天，記錄各組死亡情況(參見圖5)。
應用例3
將所述鰻利斯頓氏菌亞單位疫苗抗原蛋白與完全弗氏佐劑，按1:1 比例將其混合，而后以2嗎蛋白/g魚體重的接種劑量，腹腔注射于大菱 鲆體內，分別于免疫后的第7、 14、 21、 28天，釆集免疫大菱鲆的血液 制備血清，通過ELISA方法檢測抗體效價(參見圖6)。<110〉 <120> <130〉
序列表.txt
SEQUENCE LISTING 中國科學院海洋研究所 鰻利斯頓氏菌亞單位疫苗抗原蛋白與應用
<160〉 〈170〉
3
Patentln version 3. 1
<210> <211> 〈212〉 <213>
1
519 DNA
鰻利斯頓氏菌
〈220〉 <221〉 <222〉 <223〉
CDS (l)..
(519)
〈400〉 atg Met 1
Pro
act Thr
gca tgt Ala Cys 5
tat Tyr
ate lie
tct Ser
ate lie
Glu 10
ggc Gly
gaa act Glu Thr
cag Gin
ggc Gly 15
ctg Leu
48
ate act get ggt get ctg tct act gat tea etc ggt g3t gcg ttc gtt lie Thr Ala Gly Ala. Leu Ser Thr Asp Ser Leu Gly Asp Ala Phe Val 20 25 30
96
gaa ggt cat gaa gac caa atg ttg gtt caet c朋ttt gac cac gtt gta Glu Gly His Glu Asp Gin Met Leu Val Gin Gin Phe Asp His Val Val 35 40 45
144
act gta ccg act gat cca caa tea ggt cag cct tct ggt caa cgt gtt Thr Val Pro Thr Asp Pro Gin Ser Gly Gin Pro Ser Gly Gin Arg Val 50 55 60
192
cac aaa cca ttt aaa ttc acc gta gcg eta aac aaa gcg gtt cct ctt His I>ys Pro Phe Lys Phe Thr Val Ala Leu Asn Lys Ala Val Pro [>eu 65 70 75 80
240
ctt tat aac gca ctg gcg tct ggc gag aag atg aaa teg gtt gag eta Leu Tyr Asn Ala Leu Ala Ser Gly Glu Lys Met Lys Ser Val Glu Leu 85 90 95
288
aaa tgg tac cgc act tct ate gaa ggt aag caa gag aac ttc ttc act Lys Trp Tyr Arg Thr Ser lie Glu Glv Lys Gin Glu Asn Phe Phe Thr 100 10^ 110
336
act aca etc gaa age gcg tct ate gtg gac att cac tgt gaa atg cca Thr Thr Leu Glu Ser Ala Ser lie Val Asp lie His Cys Glu Met Pro 115 120 125
384
cac tgc caa gat cca gcg aac ggc gac ttc aca caa aac gtt acg gtt His Cys Gin Asp Pro Ala. Asn Gly Asp Phe Thr Gin Asn Val Thr Val 130 135 140
432
tct atg tct tac cgt aaa ate ctg tgg gat cac gtg aat gcg ggt act 480 Ser Met Ser Tyr Arg Lys lie Leu Trp Asp His Val Asn Ala Gly Thr 145 150 155 160
tea ggc tct gac gac tgg cgc aag cct gtt gaa gcg taa 519 Ser Gly Ser Asp Asp Trp Arg Lys Pro Val Glu Ala 165 170
<210〉 2
<211〉 172
<212〉 PRT
<213>鰻利斯頓氏菌
<400> 2
Met Pro Thr Ala Cys Tyr lie Ser lie Glu Gly Glu Thr Gin Gly Leu10 15
lie Thr Ala Glv Ala Leu Ser Thr Asp Ser Leu Gly Asp Ala Phe Val 20 25 30
Glu Gly His Glu Asp Gin Met Leu Val Gin Gin Phe Asp His Val Val 35 40 45
Thr Val Pro Thr Asp Pro Gin Ser Gly Gin Pro Ser Gly Gin Arg Val 50 55 60
His Lys Pro Phe Lys Phe Thr Val Ala Leu Asn Lys Ala Val Pro Leu 65 70 75 80
Leu Tyr Asn Ala Leu Ala Ser Gly Glu Lys Met Lys Ser Val Glu Leu 85 90 95
Lys Trp Tyr Arg Thr Ser lie Glu Glv Lys Gin Glu Asn Phe Phe Thr 100 105 110
Thr Thr Leu Glu Ser Ala Ser lie Val Asp lie His Cys Glu Met Pro 115 120 125
His Cys Gin Asp Pro Ala Asn Glv Asp Phe Thr Gin Asn Val Thr Val 130 135 140
Ser Met Ser Tyr Arg Lys lie Leu Trp Asp His Val Asn Ala Gly Thr 145 150 155 160
Ser Gly Ser Asp Asp Trp Arg Lys Pro Val Glu Ala 165 170
<2t0〉 <211〉 <212> <213>
<220> 〈221> <222> <223>
3
172 PRT
鰻利斯頓氏菌
PRT
(l).. (172)
<400〉 3
Met Pro Thr Ala Cys Tyr lie Ser lie Glu Gly Glu Thr Gin Gly Leu 15 10 15
lie Thr Ala Gly Ala Leu Ser Thr Asp Ser Leu Gly Asp Ala Phe Val 20 25 30
Glu Gly His Glu Asp Gin Met Leu Val Gin Gin Phe Asp His Val Val 35 40 45
Thr Val Pro Thr Asp Pro Gin Ser Gly Gin Pro Ser Gly Gin Arg Val 50 55 60
His Lys Pro Phe Lys Phe Thr Val Ala Leu Asn Lys Ala Val Pro Leu 65 70 75 80Leu Tyr Asn Ala Leu Ala Ser Gly Glu Lys Met Lys Ser Val Glu Leu 85 90 95
Lys Trp Tyr Arg Thr Ser lie Glu Gly Lys Gin Glu Asn Phe Phe Thr 100 105 110
Thr Thr Leu Glu Ser Ala Ser lie Val Asp lie His Cys Glu Met Pro 115 120 125
His Cys Gin Asp Pro Ala Asn Gly Asp Phe Thr Gin Asn Val Thr Val liBO 135 140
Ser Met Ser Tyr Arg Lys lie Leu Trp Asp His Val Asn Ala Gly Thr 145 比O 155 160
Ser Gly Ser Asp Asp Trp Arg Lys Pro Val Glu Ala 165 170
1權利要求
1.一種鰻利斯頓氏菌亞單位疫苗抗原蛋白，其特征在于鰻利斯頓氏菌lahcp基因核酸堿基序列如序列表SEQ ID NO1所示，其編碼的蛋白即為鰻利斯頓氏菌亞單位疫苗抗原蛋白氨基酸序列表SEQ ID NO2所示。
2. —種按權利要求1所述的鰻利斯頓氏菌亞單位疫苗抗原蛋白的應 用，其特征在于所述鰻利斯頓氏菌亞單位疫苗抗原蛋白具有激發魚體對鰻利斯頓氏菌病的免疫力。
3. 按權利要求2所述鰻利斯頓氏菌亞單位疫苗抗原蛋白的應用，其 特征在于將所述鰻利斯頓氏菌亞單位疫苗抗原蛋白與完全弗氏佐劑或 不完全弗氏佐劑，按體積1:1比例將其混合，而后以20嗎蛋白/g魚體重~ 0.2嗎蛋白/g魚體重的接種劑量，腹腔注射于魚體。
全文摘要
本發明涉及免疫學領域，具體地說是一種鰻利斯頓氏菌亞單位疫苗抗原蛋白與應用。鰻利斯頓氏菌lahcp基因核酸堿基序列如序列表SEQ IDNO1所示，其編碼的蛋白即為鰻利斯頓氏菌亞單位疫苗抗原蛋白氨基酸序列表SEQ ID NO2所示。所述鰻利斯頓氏菌亞單位疫苗抗原蛋白具有激發魚體對鰻利斯頓氏菌病的免疫力。本發明表達蛋白可激發魚體產生特異性抗體，抵抗鰻利斯頓氏菌的感染，可用于水產魚類養殖中鰻利斯頓氏菌引起疾病的預防中。該表達蛋白制備方法簡單，可應用于大規模工業化生產。
文檔編號C07K14/195GK101525378SQ20091002008
公開日2009年9月9日 申請日期2009年3月28日 優先權日2009年3月28日
發明者杰 李, 波 王, 鵬 肖, 莫照蘭 申請人:中國科學院海洋研究所