專利名稱：氯霉素乙酰轉移酶(cat)-缺陷型促生長素抑制素融合蛋白及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及基于嵌合促生長素抑制素的多肽、用于編碼該多肽的多核苷酸、分離 和產生該多肽的方法、及其用途。本發明還涉及用于增強例如本發明基于嵌合促生長素抑 制素的多肽的免疫原性的新型佐劑和免疫組合物，以及涉及其他類似抗原。
背景技術：
促生長素抑制素(亦稱為生長激素抑制激素或GHIH)是在下丘腦以及消化系統的 某些部分產生的肽激素。促生長素抑制素通常通過與G蛋白偶聯促生長素抑制素受體的相 互作用來參與內分泌系統的調節。這種基于促生長素抑制素的信號級聯放大導致許多作用 遍布整個身體。與本發明的方面有關，已知促生長素抑制素抑制來自垂體前葉的生長激素和促甲 #1 : 白勺#方文。(Patel YC and Srikant CB5 Somatostatin and itsreceptors Adv Mol Cell Endocrinol, 1999. 3 43-73)。促生長素抑制素所抑制的其他激素包括胰島素、 胰高血糖素、促胰液素，促胃液素、胃蛋白酶、maletin等等。(Patel YC and Srikant CB Somatostatin and its receptors Adv Mol CellEndocrinol, 1999. 3 43-73)。促生長素 抑制素調節如此多生長和食物利用所必需的因子/激素的能力使得促生長素抑制素成為 畜牧業領域中控制動物生長的主要目標，即抑制促生長素抑制素導致目標動物中存在水平 增加的生長激素，從而導致動物具有增強的產生乳汁的能力，以提供更多量的肉，等等。尤其是，動物對促生長素抑制素的免疫已經被公認為是中和目標動物中的促生長 素抑制素從而去除促生長素抑制素對動物生產力(例如奶牛的牛奶生產)各方面的正常 抑制作用的方法。Reichlin S.，ed.，1987，Somatostatin，Basic and Clinical Status， Plenum Press, New York(pp 3-50，121-136，146-156，169-182，221-228，267-274)Spencer G.S. ，1985， Hormonalsystems regulating growth, review, Livestock Production kience，12，31-46。重要地是，這些基于促生長素抑制素的免疫步驟避免了合成代謝激素 (例如生長激素等等)在動物中的直接使用，并允許內源合成代謝因子濃度的小變化，從而 可有生態上純的食物產品。已知促生長素抑制素在血液中具有相對較短的半衰期。為了增強促生長素抑制素 的免疫作用，已經開發出免疫方案通過將促生長素抑制素與目標載體蛋白綴合以增強蛋白 半衰期。這些綴合的促生長素抑制素蛋白被設計成在血液中具有增加的半衰期和增加的抗 原性并因此提供增強的益處(特別是制備促生長素抑制素的成本)。例如，嵌合促生長素抑 制素蛋白公開于美國專利號6，316，004(和相應歐洲專利EP0645454)，其中與其他常規免 疫或基于合成代謝激素的方法相比，各種含綴合的促生長素抑制素的蛋白示出在農畜的生 產力方面具有提高的抗原性和功能。但是，需要基于較低劑量、較高抗原性的免疫組合物和方法以提高畜牧業領域中 總的生產力和適時性(timeliness)。本發明目的在于提供這些基于抗原性和功能活性更高 的促生長素抑制素的免疫化合物、組合物和方法。
在此背景下提供下列內容。發明概述本發明提 供具有增強的促生長素抑制素免疫原性的新型多肽和編碼它們的多核 苷酸。本發明的多肽包括通過功能優化接頭與基本上失活的氯霉素乙酰轉移酶蛋白融合的 促生長素抑制素-14。如下文更詳細地描述的那樣，本發明的嵌合多肽提供用于畜牧業領域 的高效和低成本材料。本發明的實施方案包括如SEQ ID NO: 1-14定義的氨基酸和核酸序 列。本發明還提供生產和純化方法以制備無內毒素和高功能狀態的本發明的嵌合多 肽。不含內毒素的多肽為用于一些目標動物提供了實質和出乎意料的優勢，所述動物中少 量的內毒素通常認為有利于引發免疫原性應答，而事實上導致顯著的功能性劣勢。當本發 明的多肽用于免疫美國繁殖和飼養的奶牛時尤其是這種情況。此外，因為與常規材料相比 本發明的嵌合多肽顯示增強的功能，所以使用更小和更低數目的劑量來免疫目標動物。這 種所需量的降低還提供了本發明疫苗中內毒素的相應降低。本發明嵌合多肽的無內毒素分 離以及更小的使用劑量的組合允許本發明中使用基本上不含內毒素的疫苗。本發明還提供與常規佐劑材料相比具有增強的功能和安全性的佐劑組合物。本 文的佐劑不包含動物來源的材料并且不含大部分已知的化學致癌物，例如苯及其他類似材 料。本文的佐劑組合物已被證明當與目標抗原組合時在引發免疫應答方面出乎意料地有 效。本發明進一步提供包含本發明嵌合多肽以及本發明佐劑組合物的疫苗。本文的疫 苗用于在經過疫苗接種的哺乳動物和禽類(例如目標農畜)中誘導免疫應答。用于本文的 示例性農畜包括奶牛、豬、綿羊、山羊、火雞、兔、和公牛犢。在一些方面，制備并純化具有低 量或沒有連帶的內毒素的本發明多肽。這些疫苗已經被優化以在目標動物中引發安全和增 強的免疫原性反應。本發明進一步包括利用本發明的疫苗接種目標哺乳動物和禽類的方法。提供了示 例性的方法用于以安全(對于動物和最終用戶)、有成本效益且高度有用的方式來接種奶 牛以增強牛奶生產。其他示例性的方法包括對小豬、綿羊、火雞、山羊、兔或公牛犢的疫苗接 種以便以安全和有成本效益的方式提高目標動物的肉(尤其是瘦肉)生產。通過閱讀下列詳細描述并瀏覽所附權利要求，本發明的這些以及各種其他特征和 優點將是顯而易見的。附圖簡述
圖1是依照本發明實施方案的pET30b CatSom質粒的示意圖。該質粒包括全部依 照本發明實施方案的卡那霉素抗性標記、Lac操縱基因、T7啟動子、CAT編碼序列，還包括依 照本發明的接頭區以及依照本發明的促生長素抑制素編碼區。圖2是示例性的經染色的SDS-PAGE，顯示的28KD條帶對應于本發明經密碼子優化 的、CAT缺陷型促生長素抑制素多肽的預測大小。泳道1是LB+IPTG，還原的，泳道2是LB， 還原的，泳道3是LB+IPTG及泳道4是LB。圖3A和3B是顯示經疫苗接種的(利用如實施例描述的疫苗)和對照奶牛(BSY) 每天以升為單位的牛奶生產的表格。每頭奶牛都具有特定的數字標識，如每個表格中所示。序列的鑒定和序列標識符
SEQ ID NO 1 AGCKNFFWKTFTSCSEQ ID NO la GCTGGCTGCAAGAATTTCTTCTGGAAGACTTTCACATCCTGTSEQ ID NO :2 (Hisl92_ > Gly，Hisl93_ > Gly)Atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgag gcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaa gaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggaattccgta tggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaa acgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtg ttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtga gtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattat acgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttggtggtgccgtttgtgatggcttccatgtcggccg tatgcttaatgaactgcagcag
SEQ ID NO 3 (Hisl92_ > Gly, Hisl93_ > Gly)Mekkitgyttvdisqwhrkehfeafqsvaqctynqtvqlditaflktvkknkhkfypafihilarlmna hpefrmamkdgelviwdsvhpcytvfheqtetfsslwseyhddfrqflhiysqdvacygenlayfpkgfienmffvs anpwvsftsfdlnvanmdnffapvftmgkyytqgdkvlmplaiqvggavcdgfhvgrmlneIqqSEQ ID NO :4(His 193- > Gly)Atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgag gcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaa gaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggaattccgta tggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaa acgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtg ttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtga gtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattat acgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatggtgccgtttgtgatggcttccatgtcggccg tatgcttaatgaactgcagcagSEQ ID NO 5(1 Hisl93_ > Ala)Atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgag gcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaa gaaaaataagcacaagtttttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggaattccgt atggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactga aacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgt gttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtg agtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatatta tacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatgctgccgtttgtgatggcttccatgtcggcc gtatgcttaatgaactgcagcagSEQ ID NO 6(1 His+CAT wt)Atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgag gcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggccttttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggaattccgt atggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactga aacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgt gttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctggggt gagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatatt atacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatggtgccgtttgtgatggcttccatgtcggc agaatgcttaatgaactgcagcagSEQ ID NO :7 (1 個 H- > G)Mekkitgyttvdisqwhrkehfeafqsvaqctynqtvqlditaflktvkknkhkfypafihilarlmna hpefrmamkdgelviwdsvhpcytvfheqtetfsslwseyhddfrqflhiysqdvacygenlayfpkgfienmffvs anpwvsftsfdlnvanmdnffapvftmgkyytqgdkvlmplaiqvhgavcdgfhvgrmlneIqqSEQ ID NO :8 (H- > A)Mekkitgyttvdisqwhrkehfeafqsvaqctynqtvqlditaflktvkknkhkfypafihilarlmna hpefrmamkdgelviwdsvhpcytvfheqtetfsslwseyhddfrqflhiysqdvacygenlayfpkgfienmffvs anpwvsftsfdlnvanmdnffapvftmgkyytqgdkvlmplaiqvhaavcdgfhvgrmlneIqqSEQ ID NO :9tgggaactgcaccgttctggtccacgcccgcgccctcgcccacgtccggaattcatgSEQ ID NO :10welhrsgprprprprpefmSEQ ID NO :11welhrsgp (rp) nefm 其中 η > 1SEQ ID NO :12Atggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgag gcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaa gaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggaattccgta tggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaa acgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtg ttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtga gtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattat acgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttggtggtgccgtttgtgatggcttccatgtcggccg tatgcttaatgaactgcagcagtgggaactgcaccgttctggtccacgcccgcgccctcgcccacgtccggaattca tggccggctgcaagaacttcttttggaaaacctttacgagctgcSEQ ID NO :13mekkitgyttvdisqwhrkehfeafqsvaqctynqtvqlditaflktvkknkhkfypafihilarlmna hpefrmamkdgelviwdsvhpcytvfheqtetfsslwseyhddfrqflhiysqdvacygenlayfpkgfienmffvs anpwvsftsfdlnvanmdnffapvftmgkyytqgdkvlmplaiqvggavcdgfhvgrmlnelqqweIhrsgprprpr prpefmagcknffwktftscSEQ ID NO :14mekkitgyttvdisqwhrkehfeafqsvaqctynqtvqlditaflktvkknkhkfypafihiIarImna
6hpefrmamkdgelviwdsvhpcytvfheqtetfsslwseyhddfrqflhiysqdvacygenlayfpkgfienmffvs anpwvsftsfdlnvanmdnffapvftmgkyytqgdkvlmplaiqvhhavcdgfhvgrmlnelqqwelhrsgprprpr prpefmagcknffwktftsc發明詳述本發明的實 施方案提供具有增強的促生長素抑制素免疫原性的嵌合多肽，以及編 碼其的核酸構建體。本文的實施方案包括用于制備該嵌合蛋白的方法以及使用該嵌合蛋白 增加目標農畜的某些生產力的方法，特別是用于增加奶牛的牛奶生產以及牛、豬、綿羊、兔、 山羊、公牛犢等的肉生產。 本發明的實施方案還包括與本發明嵌合蛋白一起使用的新型佐劑，用于增強目標 動物中的免疫原性、增強對被疫苗接種的目標動物的安全性和增強對目標動物的用戶即經 疫苗接種動物的消費者或對來自疫苗接種動物的產品的消費者的安全性。在一個方面，本發明提供設計用于增強促生長素抑制素的免疫原性的嵌合促生長 素抑制素蛋白。嵌合促生長素抑制素蛋白實施方案包括通過接頭序列與基本上失活的氯霉 素乙酰轉移酶(CAT)截短蛋白連接的促生長素抑制素-14的氨基酸序列。在一些情況下， 接頭(在本文也稱為間隔區)已被優化以增強嵌合多肽在目標宿主細胞中的產生。在其它 情況下，提供用于產生和分離這些增加了量的基本上無內毒素狀態的嵌合蛋白的方法。在另一個方面，本發明提供摻入了本發明嵌合促生長素抑制素蛋白的新型佐劑組 合物(其不包含任何動物來源的蛋白質或化學物如苯)和疫苗。實施方案包括出乎意料有 效的佐劑/嵌合促生長素抑制素蛋白(通常基本上不含內毒素)，即用于在經疫苗接種的目 標農畜中誘導抗原性的新型疫苗、組合物。在一些實施方案中，該目標農畜是奶牛、公牛犢、 豬、山羊等。注意雖然本發明的佐劑與本文的嵌合促生長素抑制素蛋白結合在一起進行描 述，但是可預見本發明的佐劑可以與其他疫苗以及在各種目標動物(例如人、豬、狗、貓等) 中使用。在其他方面，提供使用低至一劑量的這種新型疫苗來接種目標農畜的方法，以獲 得增強的生產力，特別是在奶牛和其他類似農畜中獲得增強的奶生產。這些改進的劑量方 法(更少的疫苗接種次數和更低的嵌合促生長素抑制素濃度)提供時間效率和更低的成 本，當拓展至乳品工業時其代表農畜生產力的顯著進步。此外，本文的方法避免使用重組生 長激素療法，這是保健行業的顧慮，即對于目標農畜、最終用戶和環境的顧慮，其中重組生 長激素的排泄釋放入地下水供應。定義提供下列定義以促進對本文頻繁使用的一些術語的理解，不是為了限制當前公開 內容的范圍。術語“氨基酸”是指20種天然存在的氨基酸中的任意氨基酸以及任何經修飾的氨 基酸序列。修飾可以包括自然過程諸如翻譯后加工，或者可以包括本領域已知的化學修飾。 修飾包括但不限于磷酸化、泛素化、乙酰化、酰胺化、糖基化、黃素共價附著、ADP-核糖基 化、交聯、碘化、甲基化等。術語“嵌合多肽”或融合蛋白是指已經連接第二異源多肽的第一多肽，從而該第一 和第二多肽在框架中表達。通常該兩個多肽可以通過接頭或間隔區區段連接以優化本發明 嵌合多肽的表達與功能。
術語“內毒素”是指結合在革蘭氏陰性菌細胞壁中的毒素。一些情況下，該毒素是 革蘭氏陰性菌細胞壁外膜的細菌膜組成的脂多糖成分。術語“宿主細胞”是指在離體(ex vivo)培養中建立的細胞。本文描述的宿主細 胞的特性是它們能夠表達本發明的嵌合蛋白。可用于本發明方面的合適宿主細胞的實例 包括但不限于細菌、酵母、昆蟲和哺乳動物細胞。這類細胞的具體實例包括SF9昆蟲細胞 (Summers and Smith,1987,TexasAgriculture Experiment Station Bulletin,pl555)、大 腸桿菌(Ε. coli)細胞(BL21(DE3), Novagen)、酵母(Pichia Pastoris, Invitrogen)和人 肝細胞(Hep G2 (ATCC HB8065)。術語“核酸序列”是指沿著脫氧核糖核酸鏈的脫氧核糖核苷酸的序列順序。這些 脫氧核糖核苷酸的順序決定了沿著多肽鏈的氨基酸順序。所述脫氧核糖核苷酸序列編碼所 述氨基酸序列。術語“蛋白”，“肽”和“多肽”可互換使用來表示氨基酸聚合物或一組兩個或多個 相互作用的或結合的氨基酸聚合物。術語“基本上”是指“很大程度上”例如基本上去除表示至少75%、更典型至少 80%、85%、90%、95%和最典型96%、97%、98%、99%的目標材料被去除；基本上失活 表示至少75%、更典型80%、85%、90%、95%和最典型96 %、97 %、98 %、99 %的酶被失 活。因此，基本上失活的CAT酶是其活性被去除75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98^^99%或100%的酶。(CAT活性可以使用已知的功能性測定法來確定，例如η-丁酰輔 酶A與放射性標記的氯霉素的結合及隨后通過液體閃爍計數(LCQ測量；通過由薄層層 析法確定從[wC乙酰輔酶A轉移到氯霉素的放射性標記的量(參見Molecular Cloning A Laboratory Model,3rd ed. , J Sambrook and DWRussell,2001. Cold Spring Harbor Press]或其它已知或類似的測定法。術語“載體”用于表示將DNA區段從一個細胞轉移到另一個細胞的核酸分子。術語 “運載體(vehicle)”有時可以與載體互換使用。兩種常見類型的載體是質粒和病毒載體。促生長素抑制素大量研究顯示用促生長素抑制素免疫的動物具有10-20%的平均日增重，食欲降 低9%以及食物利用效率增加11%。用促生長素抑制素免疫的動物還有它們的后代具有 正確的比例并且動物重量在肌肉、骨和脂肪之間的分布與對照動物相同(參見Reichlin， 1987)。因此，促生長素抑制素免疫提供了增強目標動物的生產力的有效且安全的方法。當 與重組生長激素的使用相比時尤其是這種情況，所述重組生長激素的使用引起了對經處理 的動物的奶或肉中激素的擔憂或者對動物自身的安全性的擔憂或者對生態系統特別是地 下水供應中激素積累的擔憂。促生長素抑制素-14是在下丘腦和胃腸道中產生的具生物活性的十四肽。該 十四肽的氨基酸序列是AGCKNFFWKTFTSC(SEQ ID NO :1)。促生長素抑制素_14的序列 nf IL ζ iItl Φ ^ 1 it 1 ^ W (Lin Xff et al. Evolutionof neuroendocrine peptide systems gonadotropin- releasing hormone andsomatostatin. Comp Biochem Physiol C Pharmacol Toxicol Endocrinol. 1998119(3) :375-88)。該十四肽由核酸序列 GCTGGCTGCA AGAATTTCTTCTGGAAGACTTTCACATCCTGT(SEQ ID NO :1a)編碼(注意其他核酸序列可用于編 碼SEQ ID NO :1，而提供SEQ ID NO Ia是為了說明目的)。
已知促生長素抑制素-14對參與動物的生長和食物利用的大量激素具有強抑制 作用。如先前在美國專利號6，316，004(對所有用途在本文援引加入)中所述，促生長素抑 制素-14和促生長素抑制素的嵌合形式可用于動物的免疫以增加每天重量，以及合適情況 下增加奶的生產。這些免疫方法利用常規佐劑來進行且未使用本發明的基于促生長素抑制 素的材料。注意利用抗促生長素抑制素抗體處理目標動物已被證明是過分昂貴并且功能不 顯著，從而由于不實用而放棄了直接抗體處理。Muromtsev G. S.，et al. , 1990, Basics of agricultural biotechnology, Agropromizdat, Moscow, pp 102-106。本發明的一個方面 基于以下概念由本文描述的組合物和方法所形成的抗促生長素抑制素抗體減弱但不完全 消除目標動物中促生長素抑制素的大部分抑制作用。此方法在經免疫的目標動物中產生生 長和生產力的天然和成比例增長。因此，本發明的方面通過提供用于免疫目標動物的高免疫原性材料來促進基于促 生長素抑制素的免疫。這些基于促生長素抑制素的免疫化合物已經對表達和抗原性進行了 優化。在一些實施方案中，促生長素抑制素-14被表達為密碼子優化的、CAT缺陷型促生長 素抑制素嵌合多肽。這些材料提供了超過其它基于免疫的疫苗的出乎意料的改進。新型密碼子優化的、CAT缺陷型促生長素抑制素構建體本發明的一個方面提供分離的核酸分子，其編碼具有優化的促生長素抑制素免疫 原性活性的嵌合蛋白。特別是，本發明的實施方案包括新型核酸構建體，其編碼具有促生長 素抑制素的免疫原性活性的CAT融合蛋白。已經對這些多肽在免疫步驟中的最佳功能活性 進行了鑒定。在一個實施方案中，提供具有如圖1所示簡圖的構建體以編碼本發明的嵌合多 肽。本發明的核酸構建體通常編碼不具有10個C末端氨基酸的失活CAT酶并且包括一或 兩個組氨酸置換的氨基酸。CAT的基本上失活避免了經注射的目標動物中對CAT的不良反 應(從而避免了 CAT抗性)。注意氯霉素是牛類產業中常用抗生素，牛類中對氯霉素的抗性 將會對使用本發明材料疫苗接種的動物的安全性不利。因此，具有失活的CAT的構建體在 經疫苗接種的動物中具有CAT的免疫原性但沒有抗性的不良副作用(對于動物是成問題的 安全性議題)。通過去除Hisl93的咪唑基(規范CAT111變體中的His 195，參見下文的Lewendon et.al.)來使CAT酶失活。在另一個實施方案中，通過去除His 193和鄰近的Hisl92 二 者的咪唑基(對于CATm分別是Hisl95和Hisl94)而使CAT酶失活。從CAT的活性位 點去除重要的Hisl93 (CATm中是Hisl95)咪唑基并用丙氨酸、甘氨酸或其他類似氨基酸 置換導致 CAT 酶的基本上失活(Lewendon A et al. (1994)Replacement of catalytic histidine-195 ofchloramphenicol acetyl transferase :evidence for a general base role forglutamate. Biochemistry. 33(7) :1944-50)。最后，本文的實施方案還可以包括通 過單獨去除Hisl92(對于CAT111來說是His 194)的咪唑基使CAT酶失活。至于Hisl93，可 以用丙氨酸、甘氨酸或其他類似氨基酸進行置換。在一些方面，一或多個被置換的組氨酸氨基酸由位于SEQ ID NO :2的位置號 574-576和577-579(對應于SEQ ID NO 3中氨基酸編號192和193)的核酸編碼。在一些 實施方案中，本發明的核酸序列包括SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6。包括本 文中組氨酸置換構建體的本發明嵌合蛋白提供幾乎或完全沒有CAT活性的高免疫原性蛋白，是對現有技術的顯著改進。基本上失活的CAT酶實施方案與本發明的促生長素抑制素 多肽附著。這種附著直接完成或利用接頭完成(下文將更完整地描述)。靶位點(Hisl92和/或Hisl93)的失活可以通過本領域技術人員已知的任何數目 的方法實現，包括位點定向誘變和合成基因組裝(synthetic geneassembly) 0在一個實施 方案中，編碼組氨酸193的核酸序列被修改為編碼丙氨酸、甘氨酸或其他類似氨基酸。在另 一個實施方案中，編碼組氨酸192的核酸序列被修改為編碼丙氨酸、甘氨酸或其他類似氨 基酸。對于192和193嵌合多肽的典型組合置換包括丙氨酸，丙氨酸；丙氨酸，甘氨酸；甘 氨酸，丙氨酸；和甘氨酸，甘氨酸。本發明的實施方案還包括本發明CAT缺陷型多肽的氨基酸序列，包括具有SEQ ID NO :7、8和3的氨基酸序列(對應于193位的his- > gly，193位的his- > ala，以及192 和 193 位的 his- > gly)。如圖1所示，可以通過長度可變間隔區將基本上無活性的CAT酶與促生長素抑制 素-14連接。要求所述間隔區確保編碼的促生長素抑制素呈現在球形表面。本文的間隔區 實施方案提供最佳蛋白酶抗性和最佳表位暴露并且包括在本發明的嵌合多肽中顯示相對 于沒有本發明接頭序列的構建體的出乎意料的改進。因此，間隔區實施方案已經在長度和組成上被優化以確保在各種微生物尤其是大 腸桿菌中CAT缺陷型促生長素抑制素的表達。如美國專利號6，316，004描述的原始構建 體包括具有罕用大腸桿菌密碼子的間隔區且需要來自第二或輔助質粒的罕用 tRNA的共表 達。本文的間隔區實施方案去除這些罕用大腸桿菌密碼子，從而去除對第二輔助質粒的需 要，是對先前技術的改進。在典型實施方案中，所述間隔區具有核酸序列tgggaactgcaccgttctggtccacgcccg cgccctcgcccacgtccggaattcatg(SEQ ID NO :9)。本發明間隔區的一個實例具有氨基酸序列 welhrsgprprprprpefm(SEQ ID N0:10)。本發明間隔區的典型氨基酸序列是welhrsgp (rp) nefm，其中n> 1(SEQ ID N0:11)。如上所述，這些新型間隔序列提供增強的蛋白酶抗性 (從而允許與美國專利號6，316，004公開的構建體相比增加的產量)和最佳促生長素抑制 素-14暴露。當用來免疫目標動物以增強生產力時，通過最佳配置的接頭與基本上失活的 CAT酶(組氨酸置換構建體)附著的促生長素抑制素-14的組合顯示超過其他常規材料的 出乎意料和令人驚訝的改進。盡管在功能上不是最佳的，可變長度的其他接頭序列也可用于將促生長素抑制 素-14附著到基本上無活性的CAT酶。此外，預期促生長素抑制素-14與基本上無活性的 CAT酶的直接融合也可在本文中使用，被認為屬于本發明的范圍內。載體和宿主細胞本發明還涉及包括本發明多核苷酸分子的載體，以及用這類載體轉化的宿主細 胞。可以將本發明的任意多核苷酸分子與用于感興趣增殖宿主的載體相連，該載體通常包 括選擇性標記物和復制起點。宿主細胞被遺傳改造以包括這些載體，從而表達本發明的多 肽。通常，本文的載體包括與合適的轉錄或翻譯調節序列(如用于微生物或病毒宿主細胞 的那些)可操縱地連接的本發明多核苷酸分子。調節序列的實例包括轉錄啟動子、操縱基 因、或增強子、mRNA核糖體結合位點、以及控制轉錄和翻譯的適當序列。當本文的調節序列 功能性地涉及本發明的嵌合多肽編碼多核苷酸時，核苷酸序列是可操縱地連接的。
典型的運載體包括質粒、酵母穿梭載體、桿狀病毒、失活的腺病毒等。在一個實施 方案中，運載體是經修飾的pET30b CatSom質粒(參見圖1)。用于本文的目標宿主細胞包 括細菌宿主例如大腸桿菌，酵母，SF-9昆蟲細胞，哺乳動物細胞，植物細胞等。在一個實施方案中，調節序列包括用于在大腸桿菌或其他類似微生物中表達本發 明嵌合多肽的T71aC、CAT、Trp、或T5啟動子。這些調節序列是本領域已知的并在合適和已 知條件下使用。當經過遺產修飾的綠色植物細胞用于表達時，可以使用由PlanetBiotechnology 及其他開發的系統。已經構建了本發明的各種質粒以通過使用目標調節序列來表達本發明的嵌合多 肽。示例性的質粒可包括T71ac啟動子(參見圖1)。用于表達目標嵌合多肽的宿主細胞包括原核生物、酵母和高等真核細胞。示例 性的原核宿主包括埃希氏菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、和沙門氏菌屬 (Salmonella)以及假單胞菌屬(Pseudomonas)和鏈霉菌屬(Streptomyces)的細菌。在典 型實施方案中，宿主細胞是埃希氏菌屬的，可以是大腸桿菌。如下文實施例所示，本發明的構建體提供在各種條件下最佳的CAT缺陷型促生 長素抑制素表達。這些構建體在原核宿主尤其是埃希氏菌屬的細菌中表達特別有效。還 要注意各種植物表達系統也可以用于本發明中，通常使用根瘤土壤桿菌(Agrobacterium trameficies) 0無內毒素的融合蛋白純化本發明的方面包括使用無內毒素的、經密碼子優化的、CAT缺陷型促生長素抑制 素用于動物尤其是農畜(一些情況下是美國繁育的奶牛)疫苗接種的用途。無內毒素的 材料對于美國的牛繁育和飼養尤其重要(參見例如Drackley，JK 2004. Physiological adaptations in transition dairy cows, pp 74_87in Proc. Minnesota Dairy Herd Health Conf. , St Paul, MN. University ofMinnesota, St.Paul)。 在一個實施方案中，通過用合適的含促生長素抑制素的運載體轉化目標細胞來制 備本發明的嵌合免疫原性的含促生長素抑制素的蛋白質。如上所述，用于本文的運載體包 括適于在選定的目標細胞中表達的已知質粒和載體系統。在本發明的一個方面，在目標宿主細胞中表達嵌合免疫原性的含促生長素抑制素 的蛋白質。利用目標調節序列進行嵌合蛋白表達。在一些方面，已經將所述嵌合多肽優化 (特別是關于本文公開的間隔區序列)以在大腸桿菌中表達。然后可以根據已知的蛋白純化技術包括例如溶菌酶裂解，內涵體差速離心，篩層析(sieve chromatography)等來純化嵌合蛋白。重折疊方法可以在堿性pH于氯化胍和尿 素中進行，然后進行透析和凍干。在一個實施方案中，利用密碼子優化的含CAT缺陷型促生長素抑制素的質 粒-pET30b CatSom來轉化大腸桿菌細胞；該pET30b CatSom具有用于表達的合適的大腸桿 菌基礎調節序列(base regulatory sequence) 0 一些情況下，大約十升這些細胞的發酵提 供至少500克總生物量，一些情況下提供600克總生物量，產生約4-6克的總蛋白質。從銀 和考馬斯藍染色估算多達一半的蛋白質可能是嵌合蛋白(參見實施例2和圖2)。在本文一些實施方案中，從經轉化的宿主細胞中純化基本上不含內毒素狀態的本發明嵌合蛋白。認識到在一些動物尤其是奶牛中，內毒素尤其是多次與內毒素的接觸導致 實質上受損的(compromised)動物(在美國繁育和飼養的奶牛中的乳腺炎和內毒素休克) 是本發明人獲得的出乎意料和令人驚訝的結果。這一認識導致了嘗試去除或降低奶牛疫苗 接種中內毒素劑量或暴露次數。注意這種基于內毒素的效應在俄羅斯和其他國家繁育和 飼養的奶牛中很少被意識到，因為所述奶牛是不同牛品系的后代。HolsteinAssociation， 1 Holstein Place, Brattleboro, Vermont 05302-0808。在美國奶牛中的這一發現通常 與以下預期相反即疫苗應當包括低量的一些內毒素以幫助最大化動物的免疫應答，就 如在一些其他歐洲市場用促生長素抑制素疫苗接種奶牛的情況一樣(參見美國專利號 6，316，004)。因此，本文的一些實施方案在于產生用于疫苗(特別是用于牛類產業的疫苗和用 于美國范圍內的牛類產業的疫苗)的基本上不含內毒素的嵌合蛋白。在一些實施方案中， 內毒素水平是或低于lEU/ml，在其他實施方案中，內毒素水平被基本上消除，即本發明的嵌 合多肽基本上不含內毒素。在一個實施方案中，將從裂解的宿主細胞回收的IB用不含內毒素的洗滌液(即無 內毒素的水或溶液)洗滌多次。可將所回收的IP沉淀任選洗滌至內毒素水平低于大約IEU/ ml (內毒素檢測可以使用一或多種已知測定法進行，包括來自MP Biochemicals, Charles River等的商業可得檢測試劑盒)。在一些實施方案中，所述洗滌液不含內毒素且包括一或 多種蛋白酶解蛋白抑制劑，例如苯甲基磺酰氟(PMSF)，4-(2-氨乙基)-苯磺酰氟(AEBSF) 等。在一些實施方案中，所述洗滌液是磷酸緩沖鹽水(PBS)，其具有抑制有效量的PMSF、 AEBSF或PMSF和AEBSF 二者的組合。在一些方面，基本上不含內毒素的沉淀可以用pH 12. 5的含尿素的蛋白解折疊溶 液處理并在含降低了的摩爾濃度的尿素及精氨酸、甘油和/或蔗糖的蛋白重折疊溶液中重 折疊。將純化的嵌合蛋白濃度調整為1到:3mg/ml之間，且典型大約是1. 4到1. 8mg/ml。一 些情況下，以約1. 5到5mg/2ml的劑量及更典型地2. 0到3. 5mg/2ml的劑量向疫苗配方提 供基本上不含內毒素的嵌合蛋白。其他內毒素去除方法被預期屬于本發明的范圍之內，包括例如商業可得的離子交 換內毒素去除柱、疏水柱等(參見例如Mustang E或G Columns (Millipore))。增強的免疫應答佐劑本發明的實施方案提供用于增強體液免疫誘導的新佐劑。相比誘導體液免疫的常 規材料，這些佐劑提供顯著的改進。本文的佐劑可以與許多疫苗一起使用，但在實施例中顯 示與本發明的多肽一起使用用于對奶牛、豬或公牛犢進行疫苗接種。重要地是，本文佐劑的所有成分為非動物來源，從而消除了經疫苗接種的動物被 潛在污染的佐劑成分的潛在交叉污染。例如，本文的實施方案可以利用不含動物來源的 Tween 80。當目標動物是奶牛時這尤其重要，這是由于對牛海綿狀腦病(BSE)或其他類似 牛疾病的顧慮。注意這些顧慮同樣適用于人類治療，其中非動物來源的佐劑提供顯著的安 全益處。此外，本文的佐劑實施方案不含苯和其他類似致癌化合物。這些實施方案提供大 部分常規佐劑化合物中所沒有的安全益處。例如，本文實施方案可以利用Carbopol 974P 或不含苯的多環酸。在一個實施方案中，免疫佐劑包括與在乳劑預混合液內混合的所選抗原相組合的水包油乳劑。用于本文的示例性水包油乳劑包括礦物油、Tween 80,Span 85和目標聚合物(不 含苯的聚丙烯酸)的組合。在一些情況下，所述目標聚合物選自由Carbomer Homopolymer Type B組成的組。典型的油-水乳劑包括約8-10%礦物油(ν/ν)、0. 003到0. 004% Tween 80 (ν/ν)、0· 007 到 0. 008 Span 85 (ν/ν)和 0. 04 到 0. 06% 聚合物(w/v)。示例性的本發明乳劑預混合液由高分子量聚合物、表面活性劑和大約為50% 油-水基(oil-aqueous base)的乳化劑組成。用于本文的高分子量聚合物包括與季戊四 醇的烯丙基醚交聯的丙烯酸。在一些情況下，該高分子量聚合物具有約29，000和40，000 之間的 Brookfield RVT 粘度，例如，Carbopol (R)974P(Noveon，Inc)。用于在奶牛或其他目標農畜中獲得優化的免疫應答的方法根據本發明的組合物和方法，本文描述的免疫原性組合物(不含內毒素、密碼子 優化的、CAT缺陷型促生長素抑制素構建體)與如上所述的新佐劑組合，提供本發明的疫 苗。在一個實施方案中，施用總劑量為2. 98mg/2ml (其中5%到25%是佐劑(ν/ν)，更典型 10%到20%是佐劑，最典型約20%是佐劑)的不含內毒素的、密碼子優化的CAT缺陷型促 生長素抑制素構建體。注意其它常規佐劑被預期在本發明的范圍內且可以與本發明的密碼 子優化的CAT缺陷型促生長素抑制素構建體一起使用，但是當以此容量使用本文的新型佐 劑時顯示最佳結果。 新型促生長素抑制素構建體和佐劑的目的是增加目標動物(典型是農畜，更典型 是奶牛、公牛犢、綿羊、豬、或山羊)的生產力。將制劑肌內或皮下注射，優選少于12次，更優選少于6次，在一些情況下少至只 有一次。當在目標動物中需要超過一次注射時，在下次注射前典型間隔14到28天。如上 所述，本文實施方案避免對目標動物使用重組激素處理，這是在畜牧業領域中的主要益處 (重組生長激素已被與女孩出現性早熟和各種環境顧慮(即來自經處理的牛的糞肥可有害 地影響表面和地下水環境)聯系在一起。本發明的無菌組合物可以通過皮下或肌內途徑施用。在典型情況下，施用部位是 目標動物的頸或尾，盡管也可以利用其他部位。注意使用部位不應引起阻礙動物移動、進 食、飲水等能力的不良反應。如上所述，本文的疫苗，典型無內毒素狀態的疫苗使用本文描述的新型佐劑在奶 牛、牛、豬等的肉和奶的生產方面提供顯著改進。但是這些處理不伴隨飼料消耗的增加。
實施例提供下列實施例只是為了說明目的，而不是意圖限制本發明的范圍。實施例1 :CAT缺陷型促生長素抑制素融合蛋白的構建本實施例說明了根據本發明實施方案的CAT缺陷型促生長素抑制素融合蛋白的 產生。在質粒pET30b-Cat-SOm上進行位點定向誘變以便用甘氨酸殘基置換Hisl92和 Hisl93 (修飾后:Glyl92和Glyl93)。Hisl93 (和Hisl92)殘基的失活消除了 CAT酶接受質 子的能力，從而提供CAT的完全失活。為了在缺乏共表達的tRNA分子的情況下由大腸桿菌表達而對相同的 pET30b-Cat-Som(具有所述His置換)中的間隔區進行了密碼子優化。
修飾的CAT缺陷型促生長素抑制素核酸構建體如SEQ ID N0:12所示。CAT缺陷 型促生長素抑制素融合蛋白序列如SEQ ID NO :13所示，與未修飾的CAT促生長素抑制素融 合蛋白(SEQ ID NO 14)相比較。實施例2 =CAT缺陷型促生長素抑制素融合蛋白可以高水平表達如實施例1所述的密碼子優化的CAT缺陷型促生長素抑制素構建體被用于在 BL21(DE3)細胞中表達融合蛋白。經轉化的細胞在LB中生長并用0. 4mM的IPTG誘導大約 3小時。將來自密度為OD 0.7的培養物的1毫升細胞沉淀并在ΙΟΟμΙ的SDS樣品緩沖液 中于70°C加熱十分鐘。在每條泳道上樣40 μ 1的細胞提取物樣品進行SDS PAGE。如圖2所示，在用IPTG誘導后，在泳道1(LB+IPTG，還原的)和3(LB+IPTG)觀察到 28KD的條帶，其對應于密碼子優化的CAT缺陷型促生長素抑制素融合蛋白的預測大小。在 對照泳道2(LB，還原的)和4(LB)中沒有看到表達。如所預期，當在標準或還原條件下電泳 時融合蛋白的大小不存在差異。實施例3 含無內毒素的密碼子優化的CAT缺陷型促生長素抑制素的疫苗根據本 發明的示例性疫苗
a. JH 14(佐劑)24ml礦物油-50%(ν/ν)Tween 80-0. 1694% (ν/ν)Span 85-0. 1915% (ν/ν)Carbopol 974ΝΡ—0. 125% (w/v)b.本發明的重折疊蛋白95.6ml(2. 96mg/ml)-見實施例 2c.磷酸緩沖鹽水35.6mld.抗細菌劑/抗真菌劑0. 36mo120ml實施例4 無內毒素的嵌合肽/佐劑提供增加的奶生產鑒定了奶牛的隨機集合(pool) (Holstein Crosses-US繁育并飼養)，每頭均是產 犢后31到65天到5th泌乳期)。由獸醫檢查每頭奶牛并確定處于最佳健康狀態。本研究中平均牛體重為約1，000到l，2001bs。用JH14中的1. 96mg/嵌合蛋白 /2ml劑量處理6頭泌乳牛。或者，向9頭泌乳牛提供常規rBST處理。在大規模、密集的 (intense)牛奶生產場進行處理和牛奶生產研究。疫苗接種在第0天進行。在第4周檢測Anti-SST血清抗體和IGF-1血清水平。按 照定期方案進行產奶及對動物綜合健康狀態進行鑒定。用本文所述的創造性組合物疫苗接種的6頭奶牛具有正常表現，沒有內毒素反應 或食物戒除(food withdrawal) 0所有6頭奶牛對SST都有陽性血清學應答，平均效價為 1 14。該6頭奶牛的牛奶生產只利用一次疫苗接種而得到(參見圖3A)，顯示出平均產量 增加23. 7%0第0和14天使用常規rBST注射處理的9頭奶牛的牛奶生產力的總體平均值增加 2% (參見圖3B)。此實施例的數據顯示在奶牛中組合使用無內毒素的構建體和創造性的佐劑在有
14效性方面有顯著改進。與不接受兩次rBST的奶牛相比，這些結果對于動物的健康狀況和生 產力方面有顯著改進。實施例5 無內毒素嵌合肽/佐劑在經處理母豬的小豬中提供增加的肉生產鑒定母豬的隨機集合，每只均是產崽前至少35-36天。由獸醫檢查每只母豬并確 定處于最佳健康狀態。使用本發明的疫苗(見實施例幻免疫懷孕的母豬兩次，一次在分娩 前35-36天，一次在分娩前8天。將保留對照組懷孕母豬用于比較目的(沒有疫苗接種或 用無菌鹽水疫苗接種)。來自疫苗接種組的分娩的小豬具有更強的生存性并且具有更大的平均大小。小 豬大小的增加增強了百分比生存性，因為較大的小豬較少會被從母豬的奶頭推開。在第21 天、第30天和第75天稱重經處理的和對照小豬。在75天期間的過程中本發明的疫苗接種 將小豬每日體重增加平均35%。重要地是，小豬生存性和重量是通過使用沒有重組生長激素的本發明的疫苗來增 加的。這是相對重組激素療法的顯著改進。實施例6 無內毒素嵌合肽/佐劑在經處理的公牛犢中提供增加的肉生產鑒定公牛犢的隨機集合(1到3月齡)并注射本發明的組合物。將在大約10個月 期間內監測重量增加并與對照組比較，對照組在各種意義上均與注射組采用相同處理，除 了本發明的疫苗注射之外。處理的過程中由獸醫檢查每只公牛犢并決定處于最佳健康狀 態。在第0周、第4周和第8周進行對于疫苗接種組的本文注射(總共3次疫苗接種)。 利用18-21號(gauge) cc針頭皮下或肌內疫苗接種至頸部。還提供加強注射G次加強、3 次加強或無加強)。疫苗接種注射包括ang/2ml所述嵌合多肽。按照本文描述制備該嵌合 多肽，具有本發明的CAT中全部兩個被甘氨酸氨基酸置換的組氨酸殘基和優化接頭，如SEQ ID NO 3 所示。稱重經疫苗接種的公牛犢和對照牛犢以獲得初始重量。預期本文疫苗接種的動物 將顯示相對于對照動物15到40%的重量增加。經處理的公牛犢平均體重的這種增加顯示 相對未經處理的顯著優勢。重要地是，從處理的公牛犢獲得的肉不包含重組生長激素。盡管已經依照很多實施方案具體顯示并描述了本發明，本領域技術人員應理解可 以對本文公開的各種實施方案在形式和細節上做出變化而不脫離本發明的精神和范圍，本 文公開的各種實施方案不是旨在用作對權利要求范圍的限制。
權利要求
1.一種具有促生長素抑制素的免疫原性的嵌合多肽，包括與基本上無活性且截短的 氯霉素乙酰轉移酶多肽連接的促生長素抑制素-14的氨基酸序列，其中該促生長素抑制 素-14通過間隔區與該無活性的氯霉素乙酰轉移酶連接，為了嵌合多肽在目標宿主細胞中 的最佳表達而對所述間隔區進行優化并且其中該無活性的氯霉素至少有組氨酸殘基193 被丙氨酸、甘氨酸或其他類似氨基酸所置換。
2.權利要求1的嵌合多肽，其中所述間隔區具有SEQID N0:10或SEQ ID N0:11的氨 基酸序列。
3.權利要求1的嵌合多肽，其中所述基本上無活性且截短的氯霉素乙酰轉移酶多肽具 有 SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :7 或 SEQ ID NO 8 的氨基酸序列。
4.權利要求1的嵌合多肽，具有與SEQID NO 12的氨基酸序列至少有99%序列相同 性的氨基酸序列。
5.權利要求1的嵌合多肽，具有SEQID NO 12的氨基酸序列。
6.一種免疫原性組合物，包括有效引發免疫應答的量的權利要求1的嵌合多肽以及藥 學上合適的佐劑。
7.一種免疫佐劑，包括與乳劑預混合液混合的水包油乳劑，其中所述水包油乳劑包括 礦物油、Tween 80、Span 85以及一或多種聚合物。
8.權利要求7的佐劑，其中所述乳劑預混合液包括高分子量的聚合物、表面活性劑、以 及油-水基乳化劑。
9.權利要求7的佐劑，還包括預先選擇的抗原，其中所述抗原是天然的、重組的或合成 的多肽、多糖和糖蛋白。
10.一種免疫原性組合物，包括權利要求1的嵌合多肽以及權利要求8的佐劑。
11.一種增加奶牛中牛奶生產的方法，包括用一或多個劑量的權利要求6的組合物對奶牛進行疫苗接種；以及允許至少十天期間奶牛的牛奶生產與沒有所述疫苗接種的相同奶牛的牛奶生產相比 將增加。
12.權利要求11的方法，其中只給奶牛進行一個劑量的權利要求6的組合物的疫苗接種。
13.一種用于增加奶牛中牛奶生產的方法，包括用一或多個劑量的權利要求10的組合物對奶牛進行疫苗接種；以及允許至少十天期間奶牛的牛奶生產與沒有所述疫苗接種的相同奶牛的牛奶生產相比 將增加。
14.一種增加農場牲畜的瘦肉生產的方法，包括對所述農場牲畜進行疫苗接種。
全文摘要
提供基于嵌合促生長素抑制素的多肽、用于編碼所述多肽的多核苷酸，分離和產生所述多肽的方法、及其用途。此外，提供用于增強免疫原性應答的低成本佐劑。包括基于嵌合促生長素抑制素的多肽和新型佐劑的疫苗接種也包括在內，用于促進農畜的生產力。
文檔編號C07K14/655GK102105163SQ200880130533
公開日2011年6月22日 申請日期2008年6月25日 優先權日2008年6月25日
發明者A·R·門德爾松, J·拉里克, K·N·哈費爾 申請人:布拉施生物技術有限責任公司