炔烴以及炔烴與1,3-偶極-官能化合物反應的方法

專利名稱：炔烴以及炔烴與1,3-偶極-官能化合物反應的方法
炔烴以及炔烴與1，3-偶極-官能化合物反應的方法本申請要求2007年11月21日提交的美國臨時申請No. 61/004，021、2007年12 月4日提交的美國臨時申請No. 61/007，674以及2008年7月25日提交的美國臨時申請 No. 61/137, 061的權益，通過引用將所有這些申請整體并入本文。政府資助本發明是由政府支持在美國國立衛生研究院生物醫學復合碳水化合物研究資 源中心(Research Resource Center for Biomedical Complex Carbohydrates of the National Institutes of Health)的資助下作出的(資助號P41-RR-5351)。政府對本發 明享有某些權利。背景生物正交反應(Bioorthogonal reaction)是各材料彼此間的反應，其中每一種材 料與體內存在的官能團具有有限的反應性或基本上沒有反應性。在疊氮化物和末端炔烴之 間的有效反應(即，最廣泛研究的“點擊(click)”化學的例子)稱為生物正交反應的有用 例子。尤其，已將提供穩定的三唑類的Cu(I)催化的疊氮化物與末端炔烴的1，3-偶極環化 反應(例如 Binder 等人，Macromol. Rapid Commun. 2008,29 :952_981)用于標記各種生物 分子，包括蛋白、核酸、脂質和糖類。該環化加成(cycloaddition)還已經用于基于活性的 蛋白譜、酶活性的監測以及微陣列的化學合成和小分子文庫。將疊氮化物安裝入生物分子中的有吸引力的方法以代謝標記為基礎，其中使用細 胞的生物合成手段將含有疊氮化物的生物合成前體引入到生物分子中。該方法已經用于通 過各種反應性探針來標記活體系統的蛋白、聚糖和脂質。這些探針能夠促進糖選擇性糖蛋 白的定位(mapping)和鑒定糖基化部位。炔烴探針還已經用于疊氮化物修飾的生物分子的 細胞表面成像，且一種特別有吸引力的方法包括通過[3+2]環化加成，從無熒光前體產生 熒光探針。盡管使疊氮化物與末端炔烴反應具有明顯實用性，但使用該反應在生物系統中的 應用實際上已經受到包括存在不合需要的銅催化劑在內的因素的限制。因此，對于新的生 物正交反應存在著持續的、尚未滿足的需求。概述在一個方面，本發明提供炔烴以及制備炔烴的方法。在一個實施方案中，該炔烴具 有下式
RiR1
式I, 其中各R1獨立地選自氫、鹵素、羥基、烷氧基、硝酸根、亞硝酸根、硫酸根和
9Cl-ClO有機基團；各R2獨立地選自氫、鹵素、羥基、烷氧基、硝酸根、亞硝酸根、硫酸根和 Cl-ClO 有機基團；X 表示 C = 0、C = N-OR3、C = N-NR3R4、CHOR3 或 CHNHR3 ；且各 R3 和 R4 獨 立地表示氫或有機基團(例如，其可包含可裂解連接基(cleavable linker))。還提供某些 炔烴與聚合物或共聚物的共混物，其可任選形成共聚物膠束，該共混物如本文所述可例如 用于控制藥物的傳遞。在另一個實施方案中，炔烴包括包括至少兩個末端(end)的可裂解連接基片段； 連接于可裂解連接基片段的第一末端的炔烴片段；以及連接于可裂解連接基片段的第二末 端的生物素化片段。在優選實施方案中，該炔烴片段包括有張力(strained)的環狀炔烴片 段。在某些實施方案中，該炔烴進一步包括至少一種重質同位素。任選地，該炔烴進一步包 括至少一種可檢測標記，例如熒光標記。諸如上文所述炔烴之類的炔烴可以與至少一種1，3_偶極官能化合物(例如疊氮 官能(azide-fimctional)化合物、氧化腈官能化合物、硝酮官能化合物和氧化偶氮官能 (azoxy-functional)化合物和/或酰基重氮官能(acyl diazo-functional)化合物)在環 化反應中反應，以形成雜環化合物，該反應優選基本上不存在添加的催化劑(例如Cu(I))。 任選地，可以在活細胞內或活細胞的表面上發生該反應。在某些實施方案中，至少一種1， 3-偶極_官能化合物包括1，3_偶極-官能生物分子，例如肽、蛋白、糖蛋白、核酸、脂質、糖 類、寡糖和/或多糖。任選地，1,3-偶極-官能生物分子包括可檢測標記，如親合標記標記 親合標記。本文還公開了通過炔烴與至少一種1，3-偶極-官能化合物(的反應)所形成 的雜環化合物。在某些實施方案中，可以在活細胞內或活細胞的表面上發生炔烴與至少一 種1，3-偶極-官能化合物之間的反應。對于其中雜環化合物包括生物素化片段的實施方案，雜環化合物可以與結合生物 素的化合物(例如抗生物素蛋白和/或鏈霉抗生物素蛋白)結合。在另一個方面，本發明提供在其表面上具有如本文所述的炔烴的基材。該基材可 以為樹脂、凝膠、納米顆粒或它們的組合的形式。任選地，該基材是三維基質。在優選的實 施方案中，式I的炔烴的X基團表示與基材表面的連接點。此類基材可以用于固定生物分 子，如肽、蛋白、糖蛋白、核酸、脂質、糖類、寡糖和/或多糖。本文還公開包含固定的生物分 子(例如固定在三維基質上的蛋白)的制品。相對于本領域已知的生物正交反應，本文所公開的組合物和方法可提供優點。參 見例如Baskin等人，QSAR Comb. Sci. 2007,26 :1211_1219。例如，令人驚奇地發現，如本文 所述的式I的炔烴(例如其中X表示C = 0、C = N-OR3X = N-NR3R4XHOR3或CHNHR3 ；且各 R3和R4獨立地表示氫或有機基團)比其他有張力的環狀炔烴(例如其中X表示CH2)具有 更高的對1，3-偶極官能化合物的反應性。參見例如Codelli等人，J. Am. Chem. Soc. 2008， 130 11486-11493 Johnson 等人，Chem. Commun. 2008,3064-3066 ；Sletten 等人，Organic Letters 2008，10 :3097_3099 ；以及 Laughlin 等人，Science 2008，320 :664_667。此外，本 文公開了具有制備各種式I的炔烴的靈活性的便利方法。另外，式I的炔烴具有不僅與疊 氮化物反應，而且與各種其他1，3-偶極-官能化合物反應的能力。定義術語“包含”及其變化在這些術語出現在說明書和權利要求書之處不具有限制性 含義。
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本文所使用的“一個”、“一種”、“該”、“至少一種”和“一種或多種”可互換使用。本文所使用的術語“或”一般在意義上包括“和/或”，除非該用法的上下文另有清
楚規定。另外本文中，用端點描述的數值范圍包括包含在該范圍內的所有數值(例如1-5 包括 1、1· 5、2、2· 75,3,3. 80、4、5 等)。以上概述無意描述本發明的每一個公開的實施方案或每一種執行 (implementation)。以下的描述更具體地舉例說明示例性實施方案。在貫穿本申請中的幾 處，通過實例名單來提供指導，所述實施例可以各種組合使用。在每一種情況下，所描述的 名單僅僅用作一個代表性組，而不應解釋為排他性名單。附圖簡述

圖1示出了用于標記疊氮官能生物分子的示例性試劑。圖2示出了方案1 示例性的試劑和條件a)TBSCl，吡啶；b)Br2, CHCl3 ；c)LDA,四 氫呋喃；d)氯甲酸4-硝基苯酯，吡啶，CH2Cl2 ；e)N, N-二甲基甲酰胺(DMF)，三乙胺(TEA)。 LDA = 二異丙基酰胺鋰，TBS =叔丁基二甲基甲硅烷基。圖3示出了方案2 示例性的試劑和條件a)甲醇中的化合物3。圖4示出了化合物3與疊氮官能氨基酸和糖類的示例性的無金屬環化加成。Boc =叔丁氧羰基，TDS = 2，3-二甲基-2-丁基二甲基甲硅烷基(thexyldimethylsilyl)。圖5示出了方案3 示例性反應條件a) 1，三乙胺，DMF，室溫，78% ；b) 20%三氟乙 酸(TFA)，室溫，95% ；c) 2，TEA，DMF，室溫，68%。圖6示出了用化合物2和9標記的細胞表面的實施方案。將不存在或存在 Ac4ManNAz (25微摩爾)條件下生長3天的Jurkat細胞a)用化合物2和9 (30微摩爾)孵 育0-180分鐘，或者b)用化合物2和9(0-100微摩爾)在室溫下孵育1小時。接著，將所 述細胞用抗生物素蛋白-FITC在4°C下孵育15分鐘，此后，評價細胞溶解產物的熒光強度。 樣品如下標明用2(〇)或9(口)孵育的空白細胞，以及用2(眷)或9(_)孵育的Ac， ManNAz 細胞。圖7示出了細胞標記程序的毒性評價和與化合物9環化加成反應的實施方案。將 在(a)不存在Ac4ManNAz (25微摩爾)或(b)存在Ac4ManNAz (25微摩爾)的條件下生長3 天的Jurkat細胞用化合物9 (0-100微摩爾)在室溫下孵育1小時。將細胞洗滌三次，然后 用用與熒光素綴合的抗生物素蛋白在4°C下孵育15分鐘，此后將細胞洗滌三次。在該程序 過程中用臺盼藍排斥法在不同時間點評價細胞活力在用9孵育之后(黑)、在抗生物素蛋 白-FITC孵育之后(灰)和在完成程序之后(白)。對于空白和Ac4ManNAz處理的細胞兩 者，在相同條件下用Cu1Cl(ImM)處理導致大約98%的細胞死亡。圖8示出了用化合物9和抗生物素蛋白-Alexa Fluor 488標記的細胞的實施方 案的熒光圖像。將在不存在Ac4ManNAz (100微摩爾)(d_f)或存在Ac4ManNAz (100微摩爾) (a-c)的情況下生長3天的CHO細胞用化合物9 (30微摩爾)在4°C下(a，d)或室溫下(b、c、 e、f)孵育1小時。接著，將細胞用抗生物素蛋白-Alexa Fluor 488在4°C下孵育15分鐘， 并在洗滌、固定以及用遠紅外熒光染料TO-PRO將核染色之后，進行成像(a、b、d、e)，或者在 洗滌之后，在37°C下孵育1小時，然后進行固定、核染色，以及成像(c、f)。融合(merged) 表示將用Alexa Fluor (488納米(nm))和T0-PR0-3碘化物(633nm)標記的細胞的圖像融合。圖9示出了包含炔烴片段、可裂解連接基片段和生物素化片段的示例性化合物。圖10示出了方案4 示例性反應條件:a)DMF,80°C,70% ；b)硫代乙酸鉀(KSAc)， DMF,60°C,90% ；c)NH2NH2,乙醇(EtOH)，回流，95 % ；d)N, N-二異丙基乙胺(DIPEA)，DMF, 0°C, 56% ；e)DIPEA，DMF，室溫，85%。圖11示出了方案5 示例性反應條件a)對甲苯磺酸(TsOH)，室溫，81 % ；b)DMF, 80°C,86% ；c)0. IN HCl，EtOH，室溫，90% ；d)9, NaH, DMF,0°C,88% ；e)0. IN HCl，EtOH，室 溫，88% ;f) CCl4, PPh3，二氯甲烷(DCM)，室溫，96% ;g) KSAc, DMF, 60°C ,90%;h) NH2NH2, EtOH, 回流，95% ；然后(Boc)20，TEA，Et0H，91% ;i)20% TFA，DCM，室溫，95% ； j) DIPEA, DMF, 0°C ； 然后(Boc)2O, TEA, EtOH, 60% (經兩個步驟)；k)20% TFA, DCM，室溫，然后 8 DIPEA，DMF， 室溫，80% (經兩個步驟)。圖12示出了示例性可裂解連接基。圖13示出了示例性的炔烴和反應性二烯烴。圖14 示出 了方案 6 示例性反應條件:a)TMSCH2N2, BF3OEt2, DCM, _10°C，3 小時， 71% ；b) NaBH45I 1 EtOH/THF，室溫，7 小時，100% ;C) Br2, CHCl3,室溫，0. 5 小時，58% ;d) LDA，THF，0. 5 小時，57%;e)戴斯-馬丁 (Dess-Martin)試劑，DCM，0. 5h ；f)氯甲酸 4-硝基 苯酯，吡啶，DCM，18小時，92% ；g)三甘醇-1，8-二胺，TEA，DCM，室溫，3小時，80% ；h)溴乙 酸，NaH，THF, 22% ；i)三甘醇-1，8-二胺，HATU 偶聯劑，DIPEA，DMF，室溫，2 小時，75% ； j) N-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙基}-2-氨基氧基-乙酰胺，Ac0H，l 1 DCM/ Me0H，63%。圖15示出了化合物61-68和二階常數。圖16 示出 了方案 7 示例性的試劑和條件:a) LiAlH4, AlCl3, Et20,0°C, 61 % ;b) Br2, CHCl3,0°C, 58% ；c)叔丁醇鉀(t-Bu0K)，THF，室溫，25%。圖17示出了方案8 示例性的試劑和條件a)TEA，CH2Cl2,室溫，77%。圖18示出了方案9 示例性的試劑和條件a)NaH，芐基溴，DMF，室溫，59% ；b)乙 酸酐(Ac2O),吡啶，室溫，81%。圖 19 示出 了方案 10 :a) LDAjEt3SiCl, THF，室溫，85% ；b) SELECTFLU0R 氟化試劑， DMF，室溫，66% c) LDA，Et3SiCl, THF，室溫，79% ;d) SELECTFLU0R 氟化試劑，DMF，室溫，51% ； e) NaBH4, EtOH，室溫，78% ；f) Br2, CHCl3,0°C, 46% ；g)c)t_Bu0K，THF，室溫，49%。圖20示出了用于藥物傳遞的共聚物膠束的使用。A)聚酯和聚乙二醇基團在水中 自組裝。B)官能化共聚物膠束作為藥物傳遞裝置。C)共聚物膠束的肟改性的炔烴衍生物。圖21示出了用4- 二苯并環辛炔官能團(functionality)制備大分子。圖22示出了 4- 二苯并環辛炔醇與各種硝酮的環化加成。將化合物以6mN的終濃 度按1 1摩爾比混合，并進行反應，持續規定的時間。說明性實施方案的詳述諸如本文所述的那些炔烴之類的炔烴可以與至少一種1，3-偶極-官能化合物在 環化反應中反應，以形成雜環化合物。在優選實施方案中，在基本上不存在添加的催化劑 (例如Cu(I))的情況下進行該反應。示例性1，3-偶極-官能化合物包括但不限于疊氮官 能化合物、氧化腈官能化合物、硝酮官能化合物、氧化偶氮官能化合物和/或酰基重氮官能化合物。示例性炔烴包括下式的炔烴 其中各R1獨立地選自氫、鹵素、羥基、烷氧基、硝酸根、亞硝酸根、硫酸根和 C1-C10有機基團(優選C1-C10有機結構部分(moiety))；各R2獨立地選自氫、鹵素、羥基、 烷氧基、硝酸根、亞硝酸根、硫酸根和C1-C10有機基團(優選C1-C10有機結構部分)；X表 示C = 0、C = N-OR3、C = N-NR3R4、CH0R3或CHNHR3 ；且各R3和R4獨立地表示氫或有機基團 (在某些實施方案中表示有機結構部分)。在優選實施方案中，各R1表示氫和/或各R2表 示氫。任選地，R3包括共價結合的有機染料(例如熒光染料)。對于本發明來說，本文所使用的術語“有機基團”指烴基，將其分類為脂族基團、環 狀基團或脂族基團和環狀基團的組合(例如烷芳基和芳烷基)。在本發明的上下文中，本發 明化合物的適合有機基團是不干涉炔烴與1，3-偶極-官能化合物形成雜環化合物的反應 的那些基團。在本發明的上下文中，術語“脂族基團”指飽和或不飽和的直鏈或支鏈烴基。 該術語用來涵蓋例如烷基、烯基和炔基。術語“烷基”指飽和的直鏈或支鏈一價烴基，包括 例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、叔丁基、戊基、庚基等。術語“烯基”指具有一個或多個烯 屬不飽和基團(即碳_碳雙鍵)的不飽和的直鏈或支鏈一價烴基，如乙烯基。術語“炔基” 指具有一個或多個碳_碳三鍵的不飽和的直鏈或支鏈一價烴基。術語“環狀基團”指閉環烴 基，將其分類為脂環族基、芳族基或雜環基團。術語“脂環族基”指具有與脂族基的那些性 質類似的性質的環狀烴基團。術語“芳族基”或“芳基”指單核或多核芳族烴基。術語“雜 環基團”指閉環烴類，其中環中的一個或多個原子是非碳元素(例如氮、氧、硫等)。作為簡化貫穿本申請中所使用的某些術語的討論和敘述的方式，使用術語“基團” 和“結構部分”來在允許取代或可被取代的化學種類(chemical species)與不允許取代或 不可被取代的化學種類之間進行區分。因此，當術語“基團”用來描述化學取代基時，所述化 學物質包括未被取代的基團和具有非過氧化0、N、S、Si或F原子的基團(例如在鏈以及羰 基或其他常規取代基中)。當使用術語“結構部分”來描述化合物或取代基時，僅僅有意包 括未被取代的化學物質。例如短語“烷基”有意不僅包括純的開鏈飽和烴烷基取代基，例如 甲基、乙基、丙基、叔丁基等，而且包括攜帶本領域已知的其他取代基的烷基取代基，所述其 他取代基例如是羥基、烷氧基、烷基磺酰基、鹵素原子、氰基、硝基、氨基、羧基等。因此，“烷 基”包括醚基、商代烷基、硝基烷基、羧基烷基、羥烷基、磺基烷基等。另一方面，短語“烷基 結構部分”限于僅僅包括純的開鏈飽和烴烷基取代基，例如甲基、乙基、丙基、叔丁基等。式I的炔烴通常是有張力的環狀炔烴。令人驚奇地發現，與其他有張力的環狀炔 烴(例如其中X表示CH2)相比，本文所述的式I的炔烴(例如其中X表示C = 0、C = N-0R3、 C = N-NR3R4、CH0R3或CHNHR3 ；且各R3和R4獨立地表示氫或有機基團)對1，3-偶極-官能
13化合物具有更高的反應性。在式I的炔烴的某些實施方案中，X可表示C = N-0R3，其中R3是有機基團。例如， R3可以具有式_(CH2)aC(0) Y，其中:a是1-3 ；Y表示0H或NHR5 ；且R5表示氫或含伯胺的有 機基團的生物素化產物。含伯胺的基團可例如具有式-(CH2CH20)b (CH2)。-Ld- (CH2CH20) e (CH2) fNH2 和 / 或-(CD2CD20)b(CD2)c_Ld-(CD2CD20)e(CD2)fNH2，其中 b = 0-100 (例如 10-100) ；c =
0-100(優選 l-io) ；d = 0-100 (優選 1-10) ；e = 0-100(例如 10-100) ；f = 0_100(優選
1-10)；以及L是任選的可裂解連接基(例如二硫基(disulfide))。在式I的炔烴的某些實施方案中，X可表示CH0R3，其中R3選自烷基、芳基、烷芳 基和芳烷基。例如R3可具有式-C(0) Z，其中Z表示烷基、OR6或NHR7 ；以及R6和R7各自獨 立地選自烷基、芳基、烷芳基和芳烷基。在某些實施方案中，R7可以是含伯胺的有機基團的 生物素化產物。含伯胺的有機基團可以例如具有式_(CH2CH20)b(CH2)。-Ld-(CH2CH20) e (CH2) fNH2 和 / 或-(CD2CD20)b(CD2)c_Ld-(CD2CD20)e(CD2)fNH2，其中 b = 0-100 (例如 10-100) ；c =
1-10)；以及L是任選的可裂解連接基(例如二硫基)。式I的示例性炔烴是其中X表示C = 0的物質(species)，下式的炔烴 式I的另一示例性炔烴是其中X表示CH0H的物質，下式的炔烴 式I的另一示例性炔烴是其中X表示CHNH2的物質，下式的炔烴
式VI。式I的另一示例性炔烴是其中X表示C = N-0R3的物質，下式的炔烴
14 其中R3表示氫或有機基團(在某些實施方案中表示有機結構部分)。另外的示例性炔烴包括炔烴，其具有包含至少兩個末端的可裂解連接基片段； 連接于可裂解連接基片段的第一末端的炔烴片段；以及連接于可裂解連接基片段的生物素 化片段。在某些實施方案中，炔烴片段包括有張力的環狀炔烴片段。在某些實施方案中，炔 烴進一步包含至少一種重質同位素。任選地，炔烴進一步包含至少一個可檢測標記(例如 熒光標記)。在式I的炔烴的某些實施方案中，X可表示聚合基團或共聚基團。對于其中X表 示共聚基團的實施方案，共聚基團可以包括親水片段(hydrophilic segment)和疏水片段 (hydrophobic segment)。例如共聚基團可以包括式-[CH2CH20]n_[C(0) (CH2) 50]m_H 的片段， 其中n = 0-100 (例如10-100)，且m = 0-100 (例如10-100)。通常將其上的水滴或水溶液 滴表現小于90度的接觸角的表面稱為“親水性的”。疏水性材料與水的接觸角通常大于90 度。本文還公開了制備式I的炔烴的示例性方法。在一個實施方案中，該方法包括將 下式的烯烴溴化 獲得下式的二溴化物
式XV; 將式XV的二溴化物脫去溴化氫，獲得下式的炔烴
式I,其中各R1獨立地選自氫、鹵素、羥基、烷氧基、硝酸根、亞硝酸根、硫酸根和 C1-C10有機基團；各R2獨立地選自氫、鹵素、羥基、烷氧基、硝酸根、亞硝酸根、硫酸根和 C1-C10 有機基團；X 表示 C = 0、C = N-OR3、C = N-NR3R4、CH0R3 或 CHNHR3 ；以及 R3 和 R4 獨 立地表示氫或有機基團(例如其可包含可裂解連接基)。各種1，3-偶極-官能化合物可以用來與本文所公開的炔烴反應。本文所使用的 "1,3-偶極-官能化合物”意圖包括連接有至少一個1，3_偶極基團的化合物。本文所使用 的“1，3-偶極基團”有意指具有三原子Ji電子系統的基團，所述系統含有在3個原子上離 域的4個電子。示例性1，3-偶極基團包括但不限于疊氮基團、氧化腈基團、硝酮基團、氧化 偶氮基團和酰基重氮基團。在某些實施方案中，1，3-偶極-官能化合物可以是生物分子，其 上連接有至少一個1，3_偶極基團。任選地，至少一個1，3_偶極-官能化合物可以包括可 檢測標記(例如免疫測定標記或親合標記)。可將一種或多種1，3-偶極-官能化合物(例如疊氮官能化合物、氧化腈官能化合 物、硝酮官能化合物和氧化偶氮官能化合物和/或酰基重氮官能化合物)與本文所描述的 炔烴在有效在環化反應中反應且形成雜環化合物的條件下結合(combined)。優選地，有效 形成雜環化合物的條件可以包括基本上不存在添加的催化劑。有效形成雜環化合物的條件 還可以包括存在或不存在各種溶劑，包括但不限于水性溶劑(例如水)和非水溶劑；質子和 非質子溶劑；極性和非極性溶劑；以及它們的組合。雜環化合物可以在寬的溫度范圍內形 成，其中當牽涉生物分子時，0-40°C (在某些實施方案中為23-37°C)的溫度范圍是特別有 用的。便利地，反應時間可以短于1天，有時為1個小時或甚至更短。在某些實施方案中，可以在活細胞內或在活細胞的表面上發生一種或多種1， 3_偶極-官能化合物與炔烴之間的環化反應。可以在體內或體外發生此類反應。本文所用 的術語“體內”指受試者體內的反應。本文所用的術語“體外”指已從受試者體中除去(例 如分離)的組織(例如細胞)中的反應。可除去的組織包括例如原代細胞(例如新近從受 試者取出且能夠在組織培養基中有限生長或維持的細胞)、培養細胞(例如能夠在組織培 養基中擴展生長或維持的細胞)和它們的組合。1，3-偶極-官能化合物的示例性實施方案是式R8_N3的疊氮官能化合物(例如由 化合價結構R8-_N-N = N+來表示)，其中R8表示有機基團(例如生物分子)。任選地，R8可 以包括可檢測標記(例如親合標記)。式R8-N3的疊氮官能化合物與式I的示例性炔烴的環化反應可以得到一種或多種
下式的雜環化合物 其中各R1獨立地選自氫、鹵素、羥基、烷氧基、硝酸根、亞硝酸根、硫酸根和 C1-C10有機基團；各R2獨立地選自氫、鹵素、羥基、烷氧基、硝酸根、亞硝酸根、硫酸根和 C1-C10 有機基團；X 表示 C = 0、C = N-OR3、C = N-NR3R4、CH0R3 或 CHNHR3 ；各 R3 和 R4 獨立 地表示氫或有機基團(例如，其可包括可裂解連接基)；以及R8表示有機基團(例如，其可 包括生物分子和任選的可裂解連接基)。1,3-偶極-官能化合物的另一示例性實施方案是式R8-CN0的氧化腈官能化合物 (例如由化合價結構R8-+C = N-0_來表示)，其中R8表示有機基團(例如生物分子)。任選 地，R8可以包括可檢測標記(例如親合標記)。式R8-CN0的氧化腈官能化合物與式I的示例性炔烴的環化反應可以得到
多種下式的雜環化合物 其中各R1獨立地選自氫、鹵素、羥基、烷氧基、硝酸根、亞硝酸根、硫酸根和 C1-C10有機基團；各R2獨立地選自氫、鹵素、羥基、烷氧基、硝酸根、亞硝酸根、硫酸根和 C1-C10 有機基團；X 表示 C = 0、C = N-OR3、C = N-NR3R4、CH0R3 或 CHNHR3 ；各 R3 和 R4 獨立 地表示氫或有機基團(例如，其可包括可裂解連接基)；以及R8表示有機基團(例如，其可 包括生物分子和任選的可裂解連接基)。1，3-偶極-官能化合物的另一示例性實施方案是式(R^CNOOO的硝酮官能化 合物(例如由化合價結構O^hCz+MR^-O—來表示)，其中各R1(l獨立地表示氫或有機基 團，條件是至少一個R1(l表示有機基團(例如生物分子)。任選地，至少一個R1(l可以包括可 檢測標記(例如親合標記)。式(R^CNOOO的硝酮官能化合物與式I的示例性炔烴的環化反應可以得到一
種或多種下式的雜環化合物 其中各R1獨立地選自氫、鹵素、羥基、烷氧基、硝酸根、亞硝酸根、硫酸根和 C1-C10有機基團；各R2獨立地選自氫、鹵素、羥基、烷氧基、硝酸根、亞硝酸根、硫酸根和 C1-C10 有機基團；X 表示 C = 0、C = N-0R3、C = N-NR3R\CH0R3 或 CHNHR3 ；各 R3、R4 和 R10 獨 立地表示氫或有機基團，條件是至少一個R"1表示有機基團(例如，其可包括生物分子和任 選的可裂解連接基)。1,3-偶極-官能化合物的另一個示例性實施方案是式R1(I-NN(R1(I) 0的氧化偶氮官 能化合物(例如由化合價結構R1(I_N = +N(R10) -0—來表示)，其中各獨立地表示氫或有機 基團，條件是至少一個R1CI表示有機基團(例如生物分子)。任選地，至少一個R1(l可以包括 可檢測標記(例如親合標記)。式儼-剛 "1)。的氧化偶氮官能化合物與式I的示例性炔烴的環化反應可以得到 一種或多種下式的雜環化合物 其中各R1獨立地選自氫、鹵素、羥基、烷氧基、硝酸根、亞硝酸根、硫酸根和 C1-C10有機基團；各R2獨立地選自氫、鹵素、羥基、烷氧基、硝酸根、亞硝酸根、硫酸根和 C1-C10 有機基團；X 表示 C = 0、C = N-0R3、C = N-NR3R\CH0R3 或 CHNHR3 ；各 R3、R4 和 R10 獨 立地表示氫或有機基團，條件是至少一個R"1表示有機基團(例如，其可包括生物分子和任 選的可裂解連接基)。對于其中形成自炔烴與一種或多種1，3-偶極_官能化合物之間的環化反應的雜 環化合物包括可檢測標記的實施方案，可以使用可檢測標記來檢測雜環化合物。例如，對于 其中可檢測標記為親合標記的實施方案，可以使用親和性結合(例如親合色譜)來檢測雜 環化合物。另外，對于形成自炔烴與一種或多種1，3_偶極_官能化合物之間的環化反應的 雜環化合物包括生物素化片段的實施方案，可以通過使雜環化合物與結合生物素的化合物 (例如抗生物素蛋白和/或鏈霉抗生物素蛋白)接觸來結合雜環化合物。此外，可以通過本文所述的方法來檢測結合的雜環化合物。本文所公開的炔烴與1，3-偶極_官能化合物之間的環化反應可以用于各種應用。 例如，本文所公開的炔烴可以連接于基材的表面。在某些實施方案中，炔烴的x基團表示與 基材表面的連接點。本領域技術人員將認識到，可有利地選擇x基團，以包括官能團(例如 生物素、活化酯、活化碳酸酯等)，從而能夠通過各種反應將炔烴連接于官能基材(例如胺 官能團、硫醇官能團等)。具有連接于其表面的炔烴的基材可以與1，3_偶極-官能化合物反應，以形成雜環 化合物，有效地將1，3-偶極-官能化合物化學與基材結合。此類基材可以為例如樹脂、凝 膠、納米顆粒(例如包括磁性納米顆粒)或它們的組合的形式。在某些實施方案中，此類基 材可以為微陣列或甚至三維基質或腳手架的形式。示例性三維基質包括但不限于以商品名 ALGIMATRIX 3D培養系統、GELTRIX基質和GIBC0三維腳手架購得的那些三維基質，全部可 從Invitrogen(Carlsbad，CA)購得。此類三維基質可尤其有用于包括細胞培養的應用。通過使1，3_偶極-官能生物分子與具有連接于其表面的炔烴的基材在有效用于 形成雜環化合物的環化反應的條件下接觸，可以將1，3-偶極-官能生物分子(例如1，3-偶 極-官能肽、蛋白、糖蛋白、核酸、脂質、糖類、寡糖和/或多糖)固定在基材表面上，優選共 價鍵連接于基材表面。優選地，有效形成雜環化合物的條件可以包括基本上不存在添加的 催化劑。有效形成雜環化合物的條件還可以包括存在或不存在各種溶劑，包括但不限于水 性溶劑(例如水和其他生物學流體)和非水性溶劑；質子和非質子溶劑；極性和非極性溶 劑；和它們的組合。雜環化合物可以在寬溫度范圍內形成，其中溫度范圍0-40°C (在某些 實施方案中為23-37°C )是特別有用的。便利地，反應時間可以短于一天，有時為一個小時 或甚至更短。例如，當基材為三維基質的形式，且1，3-偶極_官能生物分子為1，3-偶極_官能 蛋白(例如疊氮官能蛋白)時，該環化反應可以得到具有固定于三維基質上的蛋白的制品。 此類基質可以具有各種用途，包括但不限于分離和/或固定細胞系。對于這些應用特別有 用的蛋白包括但不限于膠原、纖連蛋白、明膠、層粘連蛋白、玻連蛋白和/或其他常用于細 胞鋪板(cell plating)的蛋白。對于另一例子，1,3-偶極_官能化合物與其中x表示聚合基團或共聚基團的式 i的炔烴之間的環化反應可用于例如控制如下文所述的藥物的傳遞。例如，其中x表示包 括親水片段和疏水片段的共聚基團的式I的炔烴可以與聚合物或共聚物共混。此外，當其 中x表示包括親水片段和疏水片段的共聚基團的式i的炔烴與具有親水片段和疏水片段 的共聚物共混時，可以形成共聚物膠束。尤其有用的具有親水片段和疏水片段的共聚物包 括式r9o-[ch2ch2o]p-[c(o) (ch2)5o]。-h的那些共聚物，其中r9表示烷基(例如甲基)，p = 0-100 (例如 1-100)，以及 0 = 0-100 (例如 1-100)。包括如上文所述的式I的炔烴的共聚物膠束可以有利地用于控制藥物的傳遞。例 如，包括式I的炔烴的共聚物膠束可以與至少一種1，3_偶極-官能藥物結合(combined)， 并允許在有效形成雜環化合物的條件下反應，將藥物連接于共聚物膠束。參見例如 Nishiyama 等人’ Adv. Polym. Sci. 2006,193 :67_101 ；Gaucher 等人’ J. Control. Release 2005，109 169-188 ；Choi 等人，J. Dispersion Sci. Tech. 2003,24 :475_487 ；Lavasanifar 等人’ Adv. Drug Delivery Rev. 2002,54 169-190 MR Rosier ^A, Adv. Drug DeliveryRev.2001,53 :95_108。此外，因為其不需要有毒催化劑(如銅)，由本發明提供的新穎環化加成反應可以 用于活細胞的標記。例如，可首先用疊氮官能前體代謝性標記細胞，以產生疊氮官能生物分 子(也稱為生物綴合物)，如疊氮官能糖蛋白(也稱為糖綴合物)。然后可以使所述細胞與 式I的炔烴在溶液中或在如上所述的基材上，在允許在細胞表面上標記(通過環化加成反 應)疊氮官能生物分子的條件下接觸。可以在細胞表面上檢測到所得三唑綴合物，或者它 可以被細胞內吞，并在細胞內被檢測到。式I的炔烴也可以用于成像應用，包括例如作為核磁共振成像(MRI)的試劑。對于 另一個例子，式I的炔烴可以含有熒光標記。式I的炔烴還可用于利用質譜的定性或定量 蛋白質組學和糖組學應用。可以選擇式I的炔烴，以含有一種或多種重質同位素，例如氘、 13C、15N、35S等，然后可用于標記和/或固定如本文所述的疊氮官能生物分子。式I的炔烴還可以用于諸如疫苗之類的應用。例如，式I的炔烴可以與疊氮官能 蛋白(例如疊氮官能碳水化合物、疊氮官能肽和/或疊氮官能糖肽)反應，且所得三唑綴合 物可以用作疫苗的載體蛋白。通過以下實施例來說明本發明。應理解，特定的實施例、材料、量和程序根據如本 文所闡述的本發明的范圍和精神廣義地來解釋。
實施例實施例1顯現由不含銅的快速Huisgen環化加成獲得的活細胞的代謝性標記的糖綴合物生物系統中極其罕見的疊氮化物作為生物綴合的有吸引力的化學處理手 段(chemical handles)出 現(Kolb 禾口 Sharpless， Drug Discovery Today 2003,8 1128-1137 ；Dedola 等人，Org.Biomol. Chem. 20075 1006-1017 ；Moses 禾口 Moorhouse， Chem. Soc. Rev. 2007，36 :1249-1262 ；Nandivada 等人，Adv. Mater. 2007，19 :2197_2208 ； Wu和Fokin，Aldrichimica Acta 2007,40:7-17)。尤其，用于獲得穩定的三唑類的疊氮 化物與末端炔烴的Cu1-催化的1，3_偶極環化加成(Rostovtsev等人，Angew. Chem. 2002， 114 2708-2711 ；Rostovtsev 等人，Angew. Chem. Int. Ed. 2002,41 2596-2599 ；Tornoe 等人，J. Org. Chem. 2002,67 =3057-3064)已經用于各種生物分子的標記(Chin等人， Science 2003，301 :964_967 ；Wang 等人，J. Am. Chem. Soc. 2003，125 :3192_3193 ；Kho 等 人，Proc. Natl. Acad. Sci USA 2004，101 12479-12484 ；Gierlich 等人，Org. Lett. 2006， 8 3639-3642 ；Link 等人，Proc. Natl. Acad. Sci USA 2006，103 10180-10185)、基于活性的 蛋白譜(activity-based protein profiling) (Speers 等人，J. Am. Chem. Soc. 2003,125 4686-4687)以及微陣列和小分子文庫的化學合成(Sun等人，Bioconjugate Chem. 2006, 17 52-57)。用于將疊氮化物安裝到生物分子中的一種有吸引力的方法以代謝性標記為基 礎，其中通過使用細胞生物合成機制將含有疊氮化物的生物合成前體并入到生物分子中 (Prescher 和 Bertozzi，Nat. Chem. Biol. 2005，1 :13_21)。該方法已經用于用各種反應性探 針標記活體系統的蛋白、聚糖和脂質。這些探針可以促進糖類選擇性糖蛋白的定位和鑒定 糖基化部位(Hanson等人，J. Am. Chem. Soc. 2007，129 :7266_7267)。炔烴探針已經用于疊氮
20化物改性的生物分子的細胞表面成像，一種特別有吸引力的方法包括通過[3+2]環化加成 從無熒光前體產生熒光探針(Sivakumar等人，Org. Lett. 2004,6 =4603-4606)。Cu1催化劑的細胞毒性排除了其中細胞必需保持存活的應用(Link和Tirrel， J.Am. Chem. Soc. 2003，125 11164-11165)，因此對于不含 Cu1 的[3+2]環化加成存在著 巨大的需求(Turner 等人，J. Am. Chem. Soc. 1973,95 790-792 ；Agard 等人，J. Am. Chem. Soc. 2004，126 15046-15047 ；vanBerkel 等人，Chem-BioChem 2007,8 1504-1508)。在這 方面，可以通過環張力來活化炔烴，例如，將炔烴限制在八元環內產生了 18 kcalmor1的張 力，在與疊氮化物的[3+2]環化加成時，在過渡狀態(transition state)下釋放所述張力 的許多(部分)(Turner 等人，J. Am. Chem. Soc. 1973,95 790-792 ；Agard 等人，J. Am. Chem. Soc. 2004,126 :15046-15047)。結果，環辛炔(例如1)與疊氮化物在室溫下反應，不需要催 化劑(圖1)。該應力促進的環化加成已經用于標記生物分子，而沒有可觀察到的細胞毒性 (Agard等人，J. Am. Chem. Soc. 2004，126 15046-15047)。然而該方法的范圍因為反應速率 緩慢而受到限制(Agard等人，ACS Chem. Biol. 2006,1 :644_648)。將吸電子基團附加到辛 炔環上可增加張力促進的環化加成的速率；然而，目前的用膦2的Staudinger連接提供了 用疊氮化物標記細胞表面的最有吸引力的試劑。據認為，4- 二苯并環辛炔醇(如化合物3)對于用疊氮化物標記活細胞是理想的， 因為預期芳族環施加額外的環張力并且與炔烴綴合，由此增加用疊氮化物的無金屬[2+3] 環化加成中的炔烴的反應性。然而該化合物具有優異的穩定性，因為芳族環的鄰位氫原子 保護炔烴不受親核性攻擊。此外，3的羥基提供了用于摻混標記(如熒光探針和生物素)的 處理手段。可從已知的(方法)(Jung等人，J. Org. Chem. 1978，43 =3698-3701 Jung 和 Miller, J.Am. Chem. Soc. 1981，103 1984-1992)容易地制備化合物 3 將 3-羥基-1,2:5, 6- 二苯并環辛-1，5，7-三烯(4)，通過保護羥基為TBS醚，獲得5，將5溴化，以60%的收率 獲得二溴化物6 (方案1 ；圖2)。在后來的轉化過程中失去TBS保護基，但在對醇4進行溴 化時具有低收率。通過用LDA在THF中于0°C處理，將6去除溴化氫(Seitz等人，Angew. Chem. 1969,81 :427_428 ；Seitz 等人，Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1969,8 :447_448)，以 45% 的收率獲得目標環辛炔3。化合物3具有優異的長貨架壽命，在處理之后不與親核體(如硫醇和胺)反應。 然而，一經暴露于疊氮化物，就發生快速反應，以高收率獲得相應的三唑。例如，通過相應的 含疊氮基的糖和氨基酸衍生物與3在甲醇中反應30分鐘，以定量收率獲得作為區域異構 體的三唑10-13(方案2 ；圖3和圖4)。使用屯NMR譜法，通過芐基質子信號的積分來監測 3與芐基疊氮在甲醇中和在水/乙腈的混合物(1 4v/v)中的反應進程，并且分別測定了 0. 17m—1 s—1和2. Sm^s-1的二階速率常數。與3在乙腈/水中的反應速率常數大約比與辛炔 1的反應速率常數大三個數量級。已經確立了 3的優異反應性，我們將注意力集中在經生物素改性的4-二苯并環辛 炔醇的制備(9 ；方案1 ；圖2)。此類試劑應使得在用含疊氮基的生物合成前體代謝性標記 細胞，隨后與9環化加成和用經熒光探針改性的抗生物素蛋白處理之后，有可能顯現生物 分子。或者，與9的糖綴合物的生物素化使得有可能使用固定在固體載體上的抗生物素蛋 白來分離這些衍生物，用于糖組學研究。可以容易地通過兩步反應來制備化合物9，該兩步反應涉及用氯甲酸4-硝基苯酯處理3，獲得活化中間體7，隨后與8進行即時反應。還可以 用熒光標記將4- 二苯并環辛炔醇(9)官能化，以獲得熒光衍生物(方案3 ；圖5)。接著，在25微摩爾N-疊氮基乙酰基甘露糖胺(AqManNAz)的存在下，將Jurkat細 胞培養三天，以將N-疊氮基乙酰基唾液酸(SiaNAz)結構部分(moieties)代謝性引入到糖 蛋白中(Luchansky 和 Bertozzi，Chem-BioChem 2004，5 1706-1709)。作為陰性對照，使用 在不存在AqManNAz下生長的Jurkat細胞。將細胞暴露于30微摩爾的化合物9溶液，持續 各種時段，在洗滌之后，用抗生物素蛋白-異硫氰酸熒光素(FITC)在4°C下將細胞染色15 分鐘。通過測量細胞溶解產物的熒光強度來確定兩步驟細胞表面標記的效率。為了比較， 也通過與生物素改性的膦2進行Staudinger連接，隨后用抗生物素蛋白-FITC處理來標記 細胞表面的疊氮基結構部分。在60分鐘的孵育時間之后，用9的標記幾乎完全(圖6a)。有趣的是，在相同條件下，膦2 (Agard 等人，ACS Chem. Biol. 2006,1 :644_648)獲 得明顯更低的熒光強度，這表明通過Staudinger連接的細胞表面標記更慢且效率更低。在 每一種情況下，對照細胞表現出非常低的熒光強度，這證明背景標記是可忽略的。已發現， 用9的兩步驟標記方法對細胞活力沒有影響，如通過形態學和臺盼藍排斥法所確定的(數 據沒有示出；圖7)。通過用各種濃度的2和9孵育細胞，隨后用抗生物素蛋白_FTIC(圖6b)染色來研 究細胞表面標記的濃度依賴性。正如所預期的，顯示疊氮基結構部分的細胞顯示了熒光強 度的劑量依賴性增加。在3微摩爾的9下實現了可靠的熒光標記；然而，在30到100微摩 爾的濃度下獲得了最佳的結果。在高于100微摩爾的濃度下，由于9的有限溶解度，沒有觀 察到標記的增加。接著，將注意力集中于通過共焦顯微鏡術顯現活細胞的含疊氮基的糖綴合物。 因此，在Ac4ManNAz(100微摩爾)的存在下，將粘附性中國倉鼠卵巢(CH0)細胞培養3 天。將所得的細胞表面疊氮基結構部分用9(30微摩爾)處理1小時，然后用抗生物素蛋 白-AlexaFluor 488在4°C下處理15分鐘。正如所預期的，僅僅在表面處觀察到染色(圖 8)，并且在環境溫度或4°C下進行時，該標記程序同等有效。此外，空白細胞顯示出很低的熒 光染色，這證實了背景標記是可以忽略的。通過內吞作用使細胞表面糖綴合物不斷地再循環，并且為了監測該過程，使代謝 性標記的細胞與9和抗生物素蛋白-AleXaFluor488按照標準規程反應，并在37°C下孵育1 小時，然后通過共焦顯微鏡術來檢查。我們觀察到，顯著量的標記糖蛋白已經內在化進入膜 泡區室(vesicular compartments)中。在這些研究完成時，Bertozzi及其同事報道了二氟化環辛炔(DIF0)，其以與化合 物3幾乎相同的反應速率與疊氮化物反應(Baskin等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2007， 104:16793-16797)。連接于AlexaFluor的DIF0用于調查聚糖運輸的動力學。已發現，在 孵育1小時之后，標記的聚糖與用于內涵體和高爾基體的標記共定位。4-二苯并環辛炔醇(如3和9)對于研究人員來說具有幾個有利特征，例如容易化 學合成以及通過芳族結構部分的官能化而進一步增強環化加成速率的可能性。芳族環的改 性還可以提供令人興奮的獲得在用含疊氮基的化合物進行[3+2]環化加成時變成有熒光 性的試劑的機會，這將使得有可能實時監測糖蛋白和其他生物分子在活細胞中的運輸。一般方法和材料
化學品購自Aldrich和Fluka，并且無需進一步純化而使用。從CaH2蒸餾出 (distilled) 二氯甲烷，在分子篩4人上儲存。從P205中蒸餾出吡啶，并在分子篩4人上儲 存。從鈉中蒸餾出THF。所有反應在無水條件下在氬氣氛中進行。通過薄層色譜(TLC)在 Kieselgel 60 F254(Merck)上監測反應。通過在紫外(UV)光(254nm)下進行檢查或者通 過用甲醇中的5%硫酸進行炭化來進行檢測。在硅膠(Merck，70-230目)上進行快速色譜。 Iatrobeads(60微米)購自Bioscan。在Varian Merc 300光譜儀上以及在配備有Sun工作 站的Varian 500和600MHz光譜儀上記錄咕NMR(ID, 2D)和13C NMR。在CDC13中記錄咕和 13C NMR波譜，并且以相對于作為受保護的化合物的內標的溶劑峰CH，8 7. 24 ；13C, 8 77. 0) 的ppm給出化學位移(5)。使用二氫苯甲酸作為基質，在VOYAGER-DE Applied Biosystems 上記錄負離子基質輔助激光解吸附電離飛行時間(質譜)(MALDI-T0F)。通過使用THF中 的2，5-二羥基-苯甲酸作為基質，以正模式，使用￥(^46￡1 Applied Biosystems獲得 高分辨率質譜。3-叔丁基-二甲基甲硅烷基-氧基-1，2:5，6-二苯并環辛-1，5，7-三烯(5)將叔丁基二甲基氯硅烷(tert-Butyldimethyl silyl chloride) (3. 0g,20mmol) 添加到4 (2. 2g，lOmmol)在CH2Cl2(20mL)和吡啶(5mL)的混合物中的攪拌溶液中。在室溫下 攪拌6小時之后，將反應混合物用水稀釋，并用CH2Cl2(40mL)萃取。合并的有機萃取物用水 和鹽水洗滌，然后干燥(MgS04)。將溶劑減壓蒸發，通過硅膠柱色譜(己烷/乙酸乙酯，7/1， v/v)純化殘留物，獲得 5(2. 9g，87% )。NMR(300MHz，CDC13) : S 7. 60 (1H，芳族化合物)， 7. 32-7. 11(7H，芳族化合物),6. 93 (1H, d, J = 7. 5Hz, CH = CH)，6. 85 (1H, d, J = 7. 5Hz, CH =CH), 5. 51 (1H, dd, J = 6. 3,9. 6Hz, CHOSi), 3. 54 (1H, dd, J = 6. 3,9. 6Hz, CH2)，3. 21 (1H, dd, J = 6. 3,9. 6Hz, CH)，0. 96 (3H, s, CH3)，0. 95 (3H, s, CH3)，0. 94 (3H, s, CH3)，0. 10 (3H, s, CH3)，0. 07 (3H, s, CH3) ； 13CNMR(75MHz, CDC13) 8 148. 0，141. 6，140. 8，139. 2，138. 3，135. 5， 135. 0，134. 9，133. 0，131. 9,131. 6，130. 9，130. 8，130. 2,77. 0,52. 1,34. 5,30. 7,30. 5， 23. 1,5. 8,0. 1 ；MALDI HRMS :m/z 359. 1811[M+Na+]。C22H28Na0Si 的計算值 359. 1807。3-羥基-7，8-二溴-1，2:5，6-二苯并環辛烯(6)在0°C下，將溴(0.8g，5mmol)的 CHC13 溶液滴加到 5 (1. 7g，5mmol)的 CHCl3(30mL) 溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌12小時，直到反應完全(通過TLC監測)。所得混合 物用飽和硫代硫酸鈉水溶液(15mL)洗滌，并干燥(MgS04)。將該溶劑減壓蒸發，通過硅膠柱 色譜(己烷/CH2C12，7/1，v/v)純化殘留物，獲得 6(1. 2g，60% )。NMR(300MHz, CDC13) 6 7. 54-7. 47 (2H，芳族化合物)，7. 31-6. 72 (6H，芳族化合物)，5. 77 (1H, d，J = 5. 4Hz， CHBr)，5. 22 (1H, dd, J = 3. 6，15. 9Hz, CH0H)，5. 19 (1H, d, J = 5. 4Hz, CHBr)，3. 50 (1H, dd, J =3. 6,15. 9Hz, CH2), 2. 75 (1H, dd, J = 3. 6，15. 9Hz，CH2) ；13C 匪R(75MHz，CDC13) 8 141.3， 140. 0，137. 2，134. 0，133. 4，131. 5，131. 3，130. 9，127. 8，126. 2，123. 7，121. 3,76. 5,70. 0， 62. 3，32. 2 ；MALDI HRMS :m/z 402. 9313[M+Na+]。C16H14Br2Na0 的計算值 402. 9309。3-羥基-7，8-二脫氫-1，2:5，6-二苯并環辛烯(3)在室溫下，在氬氣氛下，向6(1. lg,3mmol)的四氫呋喃(50mL)溶液中滴加溶于四 氫呋喃中的二異丙基酰胺鋰(2.0M)，(5mL)。將反應混合物在室溫下攪拌2小時，此后，將 它傾入冰水(50mL)中，并將所得混合物用CH2C12(2 x 100mL)萃取。合并的萃取物用水和 鹽水洗滌，然后干燥(MgS04)。將溶劑減壓蒸發，通過硅膠柱色譜(己烷/乙酸乙酯，5/l，v/
23v)純化殘留物，獲得 3(0. 30g,45% )。NMR(300MHz, CDC13) 8 7. 67 (1H，芳族化合物)， 7. 37-7. 18 (7H，芳族化合物)，4. 57 (1H, dd，J = 2. 1，14. 7Hz, CHOH)，3. 04 (1H, dd，J = 2. 1，
14.7Hz, CH2), 2. 86 (1H, dd, J = 2. 1，14. 7Hz, CH2) ； 13C 匪R(75MHz，CDC13) 8 154. 5，150. 6， 128. 6，127. 1,1127. 0，126. 0，125. 8，125. 1,124. 7，123. 0，122. 7,121. 7, 111. 9,109. 6， 74. 2,47. 7。碳酸7，8- 二脫氫-1，2 5，6- 二苯并環辛烯_3_基酯4_硝基苯基酯(7)向3(0. 22g，lmmol)的 CH2C12 (30mL)溶液中添加氯甲酸 4-硝基苯酯(0. 4g,2mmol) 和吡啶(0. 4ml,5mmol)。在環境溫度下攪拌4小時之后，將反應混合物用鹽水(2X10mL)洗 滌，并將有機層干燥(MgS04)。將溶劑減壓蒸發，通過硅膠柱色譜(己烷/乙酸乙酯，10/1， v/v)純化殘留物，獲得 7(0. 34g,89% )。NMR(300MHz, CDC13) 6 8. 23-8. 18(2H，芳族化 合物)，7. 56-7. 54 (2H，芳族化合物)，7. 46-7. 18 (8H，芳族化合物)，5. 52 (1H，dd，J = 3. 9，
15.3Hz, CHOH)，3. 26 (1H, dd, J = 3. 9，15. 3Hz, CH2)，2. 97 (1H, dd, J = 3. 9，15. 3Hz, CH2)； 13CNMR(75MHz, CDC13) 8 154. 5，150. 7，149. 1,148. 7，129. 0，127. 4，127. 3，126. 7，126. 5， 125. 5，125. 2，124. 3，124. 0，122. 6，122. 4，120. 8，120. 6，120. 2，112. 2，108. 5,80. 6,44. 8 ； MALDI HRMS :m/z 408. 0852 [M+Na+]。C23H15NNa05 的計算值 408. 0848。碳酸7，8_ 二脫氫-1，2:5，6_ 二苯并環辛烯-3-基酯，8，-生物素基胺 (biotinylamine)-3' ,6' -二氧雜辛烷 1，-酰胺(9)在氬氣氛下，向8(37mg，0. 1 讓ol)和 NEt3 (30mg，0. 3讓ol)在 DMF(lOmL)中的溶液 中添加7(39mg，0. lmmol)。在環境溫度下將反應混合物攪拌過夜之后，減壓除去溶劑，通過 硅膠柱色譜(CH2C12/CH30H，20/1，v/v)純化殘留物，獲得 9 (44mg，71 % )。NMR(500MHz, CD30D) 8 7. 59 (1H，芳族化合物)，7. 42-7. 33 (7H，芳族化合物)，5. 44，(1H，dd，J = 5. 0， 14. 1Hz, CHOH)，4. 60，4. 46 (m, 2H, CHNH)，4. 24 (s,4H, 0CH2CH20)，3. 72 (m, 4H, 0CH2)，3. 64 (m, 2H，CH2NH)，3. 55 (m, 1H，CHS)，3. 33 (dd, 1H, J1 = 12. 0Hz, J2 = 4. 8Hz, 1H，CHHexoS)，3. 23 (t, 2H, J = 6Hz，CH2-NH2)，3. 22，(lH，dd，J = 5. 0，14. 1Hz，CH2)，2. 88，(lH，dd，J = 5. 0，14. 1Hz, CH2)，2. 68 (d，1H，J = 12.45Hz，CHHendoS)，2. 20 (t，2H，J = 7. 5Hz, CH2C0)，8 1. 4(m,6H, 生物素 _CH2)。13CNMR(75MHz，CD30D) 8 175. 0，164. 9，156. 9，152. 5，151. 3，129. 9，128. 2， 128. 1,127. 2，127. 1,126. 0，125. 7，123. 8，121. 2,112. 7，109. 8,76. 8,70. 2,70. 1,69. 8， 69. 4,62. 1,60. 4,55. 8,54. 6,46. 0,42. 6,40. 6,39. 9,39. 1,35. 5,28. 6,28. 3,25. 6，17. 5，
16.1,12. 0 ；MALDI HRMS :m/z 643. 2575 [M+Na+]。C33H4(lN4Na06S 的計算值 643. 2566。用于與碳水化合物和肽的點擊反應的一般程序將3-羥基-7，8-二脫氫-1，2:5，6-二苯并環辛烯(2. 2mg，0. Olmmol)溶于 CH30H(lmL)中，并添加疊氮化物(3-疊氮基丙基2，3，4，6-四-0-乙酸酯-a-D-吡喃甘露 糖苷，1-0-[二甲基(1，1，2_三甲基丙基)甲硅烷基]_4，6-0-異丙叉基-2-疊氮基-2-脫 氧-3 -D-吡喃葡萄糖，4，7，8-三-0-乙酰基-5-乙酰氨基-9-疊氮基-2，3-無水-3,5, 9_三-脫氧-D-甘油-D-半乳糖-壬-2-烯酸甲酯以及4-疊氮基-N-[ (1，1- 二甲基乙氧 基)羰基]-L-苯丙氨酸，1.0當量)。通過TLC監測反應，在室溫下將反應混合物攪拌30 分鐘之后，反應已進行完全。減壓蒸發溶劑，通過硅膠柱色譜純化殘留物，分別以定量收率 獲得所需產物10-13。化合物10 ；1H NMR (500MHz, CDC1J 8 7. 83 (1H, m，芳族化合物)，7. 58-6. 99 (7H,m,芳族化合物)，5. 33-4. 98 (4H, m, 2_H，3_H，4_H，CH0H)，4. 90-4. 61 (1H, m, 1-H) ,4. 26,
4.10 (2H, m, 6-H)，3. 93 (1H, m, 5_H)，3. 70-3. 60 (2H, m, 0CH2CH2)，3. 58-3. 41 (2H, m, CH2N)， 3. 31，3. 20，3. 06，2. 91 (2H, m, CH0HCH2) ,2. 35-1. 94(12H, m, CH3C0)，1. 38-1. 14 (2H, m, CH2CH2N) ； 13CNMR(75MHz, CDC13) 8 170. 9，170. 2，148. 5，146. 9，145. 5，144. 9，141. 2， 139. 3，138. 0，136. 7，135. 5，133. 8，133. 0，132. 3，131. 6，130. 3，129. 5，129. 0，128. 3，
127.7, 127. 2, 126. 5, 125. 0, 124. 2,98. 0,97. 4,70. 1,69. 5,68. 8,66. 2,65. 4,64. 9, 64. 4,62. 6,47. 0,45. 1,40. 5,32. 1,31. 1,30. 6,29. 9,22. 9,20. 9，14. 3 ；MALDI HRMS :m/ z674. 2330 [M+Na+]。C33H37N3NaOn 的計算值 674. 2326。化合物11;屮 NMR(500MHz，CDC13) : S 7. 80，7. 65 (1H，d，J = 7. 5Hz，芳族化合 物)，7. 48-7. 06 (7H,芳族化合物)，5. 82，5. 72，5. 60，5. 48 (1H, d, J = 7. 09Hz, 1-H)，，
5.13-4. 60 (1H, m, CHOH)，4. 40-4. 20 (2H, m, 2_H 3_H)，4. 10-3. 90 (2H, m, 5_H，6-H)， 3. 89-3. 63 (1H, m, 6-H)，3. 54-3. 40 (2H, m, 4_H，HCHCHOH)，3. 07，2. 66 (1H, m, HCHCHOH)， 1. 54-1. 20 (6H, m, CH(CH3) C (CH3) 2)，0. 98-0. 60(13H, m, 2 CH3, CH(CH3)2) ,0. 35-0. 19 (6H, m, Si (CH3)2) ； 13C NMR(75MHz, CDC13) 8 151. 0，149. 2，148. 5，148. 0，146. 1，145. 3，142. 4， 141. 6，140. 8，139. 4，138. 1, 136. 6，135. 7，134. 9，133. 4，132. 4，131. 6，130. 6，129. 5，
128.9，127. 3，103. 5，100. 4,99. 8,80. 6,73. 3,70. 9,69. 3,68. 8,65. 5,50. 1,46. 6,45. 4， 44. 4, 37. 3, 33. 3, 32. 5, 28. 4, 23. 4,22. 6,21. 9,4. 6，1. 4,0. 7,0. 0 ；MALDI HRMS :m/z 630. 2980 [M+Na+]。C33H45N3Na06Si 的計算值 630. 2975。化合物12 ；1H NMR (500MHz, CDC13) 6 7. 95-7. 69 (1H, m,芳族化合物)， 7. 60-7. 03 (7H, m,芳族化合物)，6. 77-6. 26 (1H, m)，5. 98-8. 81 (1H, m)，5. 80-5. 61 (1H, m)， 5. 58-5. 33 (1H, m)，5. 32-5. 16 (2H, m)，5. 16-4. 94 (1H, m)，4. 93-4. 80 (1H, m)，4. 69-4. 34 (1H, m) ,4. 24-4. 06 (1H, m) , 3. 95-3. 60 (3H, m) , 3. 53-2. 90 (2H, m) , 2. 32-1. 57 (12H, m)； 13C NMR(75MHz, CDC13) 8 169. 6，160. 5，147. 8，145. 5，145. 1, 144. 6，143. 9，140. 5， 138. 7，138. 2，137. 1，135. 7，134. 5，133. 5，132. 7，132. 2，131. 8，131. 2，130. 8，129. 5，
129.0, 128. 3, 127. 7, 127. 2, 126. 5, 125. 9, 124. 8, 122. 7, 108. 0, 107. 5,75. 1,69. 6, 68. 8,67. 1,66. 6,52. 8,51. 7,47. 3,46. 4,45. 3,28. 7,28. 3,22. 0，19. 8 ；MALDI HRMS :m/z 699. 2282 [M+Na+]。C34H36N4NaOn 的計算值 699. 2278。化合物13 ；屮 NMR(300MHz, CD30D) 8 7. 8-6. 8(12H，m,芳族化合物)，5. 33， 5.17(lH，dd，J = 5.1，10.5Hz CHOH)，4. 37 (1H，m，CHC00H)，3. 8，3. 233. 77，3. 20 (2H， m, CH2CH0H) ,3. 21,2. 93 (2H, m, CH2CHNH)，1. 35 (9H，m, C(CH3)3) ；13C NMR(75MHz, CD30D)
8 156. 6，145. 1,414. 3，139. 6，139. 4，138. 0，137. 3，136. 1,135. 3，135. 0，133. 7，133. 4， 132. 1, 131. 7, 130. 6，130. 3，130. 0，129. 5，129. 2，128. 8，128. 3，128. 0，127. 6，126. 9， 126. 6，126. 6, 126. 2, 125. 3, 125. 1, 124. 8,79. 4,76. 8,76. 2,68. 6,58. 5, 54. 9,46. 2, 40. 5,37. 1,29. 6,29. 3,27. 5 ；MALDIHRMS :m/z 549. 2118[M+Na+]。C3。H3。N4Na05 的計算值 549.2114。N-Boc_3，6-二氧雜辛烷-1，8_ 二胺在室溫下，經2小時時期將二碳酸二叔丁酯(di-Boc) (6g，28mmol，0. 5當量)的 CH2Cl2(100mL)溶液滴加到三(乙二醇)-1，8_ 二胺(7. 6g,56mmol)和二異丙基乙胺(10mL, 57mmol)的混合物中。將反應混合物攪拌6小時，此后，將它真空濃縮。通過快速硅膠柱色譜(CH2C12/CH30H, 10/1, ν/ν)純化，獲得 N-Boc-3，6-二氧雜辛烷-1，8-二胺(4. lg，58% )。 1H NMR (300MHz, CD30D) δ 3. 6(s，4H)，3. 54(t，2H)，3. 53(t，2H)，3. 24 (t，2Η)，2. 8 (t，2Η)， 1. 4(s，9H) ；MALDIHRMS :m/z 271. 1641 [M+Na+]。C11H24N2NaO4 的計算值 271. 1634。N-Boc-N'-生物素基_3，6-二氧雜辛烷-1，8-二胺將維生素H(生物素)(2. 2g，9mmol)、六氟磷0-苯并三唑-1-基-N，N，N，，N，-四 甲基脲鐺(HBTU) (3g,8mmol)和 DIPEA(1. 8mL，IOmmol)在 DMF(IOOmL)中的溶液在室溫下 攪拌10分鐘，然后滴加到N-Boc-3，6-二氧雜辛烷-1，8-二胺(1. 5g，6mmol，1)的溶液中。 將反應混合物在室溫下攪拌1小時，此后，真空脫除DMF，獲得油狀殘留物，通過快速硅膠柱 色譜(CH2C12/CH30H，25/1，ν/ν)純化該殘留物，獲得N-Boc-N’ -生物素基_3，6-二氧雜辛 烷-1,8-二胺(2. Og, 90% )。1H NMR(300MHz, CD30D) δ 4. 5 (m, 1H), 4. 3 (m, 1H)，3. 6 (s，4H)， 3. 54 (tt,4H)，3. 39 (t,2H)，3. 26 (t,2H)，2. 9 (dd, 1H)，2. 7 (d, 1H)，2. 2 (t,2H)，1. 7-1. 5 (m, 8H)，1. 4(s，9H) ；MALDI HRMS :m/z 497. 2416 [M+Na+]。C21H38N4NaO6S 的計算值 497. 2410。N-生物素基-3，6-二氧雜辛烷-1，8-二胺(8)將N-Boc-N，-生物素基-3，6-二氧雜辛烷-1，8-二胺(1.9g，4mmol)溶于50% TFA 的CH2Cl2(20mL)溶液中，并在室溫下攪拌1小時。減壓蒸發溶劑，獲得油狀殘留物，通過快 速硅膠柱色譜(CH2C12/CH30H，10/1，ν/ν)將其純化，獲得 7(1. 3g，92% )。1H NMR(300MHz, DMS0-d6) δ 7. 85 (t，1H，J = 5. 7Hz，NHCO)，6. 42，6. 35 (s，2H，NH)，4. 29，4. 11 (m，2H，CHNH)， 3. 5 (s，4H，OCH2CH2O)，3. 3 (m, 4H, OCH2)，3. 16 (m, 2H, CH2NH)，3. 10 (m, 1H, CHS)，2. 81 (dd, 1H, Jl = 12. 0Hz, J2 = 4·8Ηζ，1Η，CHHexoS)，2. 64 (t，2Η，J = 6Hz, CH2-NH2)，2· 52 (d，1H， J = 12. 45Hz，CHHendoS)，2· 06(t，2H，J = 7. 5Hz，CH2CO)，1. 6 (s，2H，NH2)，δ 1. 4(m,6H, 生物素-CH2) ； 13C NMR(75MHz，DMS0-d6) δ 171. 9,160. 6,71. 7,71. 6,69. 5,69. 1,64. 4, 59. 2,55. 0,54. 2,40. 7,38. 4,35. 1,28. 4,28. 1,25. 2 ；MALDI HRMS :m/z 397. 1892 [M+Na+]。 C16H30N4NaO4S 的計算值 397. 1885。生物學實驗用試劑將合成化合物2和9在DMF中重構，并在80°C下儲存。DMF的終濃度從不超過 0. 56%，以避免毒性效應。細胞表面疊氮化物的標記和通過熒光強度的檢測將人Jurkat細胞(克隆E6-1 ；ATCC)在含有L-谷氨酰胺(2mM)的RPMI 1640培 養基(ATCC)中培養，所述培養基被調節至含有碳酸氫鈉(1.5g L—1)、葡萄糖(4. 5g L-1)、 HEPES(IOmM)和丙酮酸鈉(1. OmM)，并且補充有青霉素(IOOu mL—1)/鏈霉素(100微克mL—1 ； Mediatech)和胎牛血清(FBS, 10%;Hyclone) 在潮濕的5% CO2氣氛下于37°C保持細胞。 使Jurkat細胞在全乙酰化N-疊氮基乙酰基甘露糖胺(Ac4ManNaz ；終濃度25微摩爾)的存 在下生長3天，導致將相應的N-疊氮基乙酰基唾液酸(SiaNAz)代謝并入到它們的細胞表 面糖蛋白中。將攜帶疊氮化物的Jurkat細胞和未處理的對照細胞用標記緩沖液(DPBS，補 充有FBS (1 % ))中的生物素化化合物2和9 (0-100微摩爾)在室溫下孵育0-180分鐘。所 述細胞用標記緩沖液洗滌三次，然后用與熒光素綴合的抗生物素蛋白(Molecular Probes) 在4°C下孵育15分鐘。在三次洗滌和細胞溶解之后，使用微板閱讀器(BMG Labtech)分析 細胞溶解產物的熒光強度(485eX/520em)。數據點按一式三份收集，代表三個獨立的實驗。 在臺盼藍排斥程序中的不同時間點評價細胞活力。
細胞的標記和基于熒光顯微鏡術的檢測將中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(克隆K1;ATCC)在含有L-谷氨酰胺(2mM)的 Kaighn' s改良型Ham' s F-12培養基中培養，所述培養基被調節至含有碳酸氫鈉(1. 5g L—1)，并且補充有青霉素(IOOu mL—1)/鏈霉素(100微克mL—1)和FBS(10%)。在潮濕的5% CO2氣氛下于37°C保持細胞。使CHO細胞在Ac4ManNaz (終濃度100微摩爾)的存在下生長 3天，導致將SiaNAz代謝并入到它們的細胞表面糖蛋白中。然后將攜帶疊氮化物的CHO細胞 和未處理的對照細胞轉移到蓋玻片上，在它們的初始培養基中培養36小時。活的CHO細胞 用生物素化化合物9 (30微摩爾)在標記緩沖液(DPBS，補充有FBS(1% ))在4°C下或在室 溫下處理1小時，隨后用與Alexa Fluor 488 (Molecular Probes)綴合的抗生物素蛋白在 4°C下孵育15分鐘。將細胞用標記緩沖液洗滌三次，用甲醛(3.7%的PBS溶液)固定或在 固定之前于37°C下孵育1小時。細胞核用遠紅外熒光T0-PR0-3染料(Molecular Probes) 標jE0 在成i"象之前，細胞用 PermaFluor (Thermo Electron Corporation)固定。在 Zeiss Axioplan2熒光顯微鏡上進行初始分析。使用60X(NA1.42)油浸物鏡來獲取共焦圖像。在 ζ軸向(z dimensions)上收集光段的堆疊(stack)。以對于各目的的計算最佳值為基礎的 步長為0.25到0.5微米。隨后，各堆疊被折疊為(collapsed into)單一圖像(ζ軸投影)。 使用 ImageJ 1. 39f 軟件(National Institutes of Health，USA)和 Adobe Photoshop CS3 擴展版10. O (Adobe Systems Incorporated)進行離線分析，從而同等處理所有圖像。實施例2含有生物素和可裂解連接基的炔烴試劑生物系統中極其罕見的疊氮化物作為生物綴合的有吸引力的化學處理手段出 現(Dedola 等人，Org. Biomol. Chem. 2007，5，1006 ；Kolb 禾口 Sharpless，Drug Dis. Today 2003，8，1128 ；Moses 禾口 Moorhouse，Chem. Soc. Rev. 2007，36，1249 ；Nandivada 等人，Adv. Mater. 2007,19,2197 ；Wu 和 Fokin，Aldrichimica ACTA 2007，40，7 ;Agard 等人，ACS Chem. Biol. 2006，1，644)。尤其，用于獲得穩定的三唑的Cu(I)催化的疊氮化物與末端炔烴的 1，3_偶極環化加成已經用于標記各種生物分子，包括蛋白、核酸、脂質和糖類(Chin等人， Science 2003，301，964 ；Gierlich 等人，Org. Lett. 2006，8，3639 ；Kho 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 2004，101，12479 ；Link 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 2006，103，10180 ；Wang 等人， J. Am. Chem. Soc. 2003，125，3192)。環化加成也已用于基于活性的蛋白譜(Speers等人， J. Am. Chem. Soc. 2003，125，4686)、酶活性的監測以及微陣列和小分子文庫的化學合成(Sun 等人，Bioconjugate Chem. 2006,17, 52)。用于將疊氮化物安裝到生物分子中的一種有吸引力的方法以代謝性標記為基礎， 其中使用細胞生物合成機制將含有疊氮化物的生物合成前體并入生物分子中(Prescher 和Bertozzi, Nat. Chem. Biol. 2005，1，13)。該方法已經用于用各種反應性探針標記生命 系統的蛋白、聚糖和脂質。這些探針可以促進糖類選擇性糖蛋白的定位和鑒定糖基化部位 (Hanson等人，J. Am. Chem. Soc. 2007，129，7266)。炔烴探針已經用于疊氮化物改性的生物 分子的細胞表面成像，一種特別有吸引力的方法涉及通過[3+2]環化加成，從無熒光前體 產生熒光探針(Sivakumar 等人，Org. Lett. 2004，6，4603)。我們在這里描述包括炔烴片段、可裂解連接基片段和生物素的試劑。預期此類化 合物對于生物學研究是有價值的。因此，該試劑的炔烴片段可與各種含有疊氮化物片段的生物分子反應，以獲得穩定的三唑加合物。生物素片段提供了通過使用固定的抗生物素蛋 白的親和色譜來取回標記的化合物的機會。可裂解連接基允許釋放標記和捕捉的生物分 子，用于分析。例如，可以通過標準蛋白質組學或糖組學分析來表征釋放的蛋白或糖蛋白 (Too, Expert Rev. Proteomics 2007,4,603 ；Bantscheff 等人，Anal. Bioanal. Chem. 2007, 389，1017 ;Lau等人，Proteomics 2007，7，2787)。蛋白和糖蛋白的釋放比先前報道的連接 于固定抗生物素蛋白的生物分子的分析(Hanson等人，J. Am. Chem. Soc. 2007，129，7266)實 用得多。化合物21是該新類試劑的一個實例(圖9)。它含有用于與疊氮化物、二硫化物 (其可以用還原劑如二硫蘇糖醇(DTT)裂解)和生物素反應的4-二苯并環辛醇片段。在蛋白質組學上，生物系統的生理狀態之間的差別的定量是有技術挑戰性的任務 (Too, Expert Rev. Proteomics 2007,4,603 ；Bantscheff 等人，Anal. Bioanal. Chem. 2007, 389，1017 ；Lau等人，Proteomics 2007，7，2787)。另外，對于使用染料和熒光團的差別蛋白 凝膠或印跡染色的經典方法，基于質譜的定量方法正得到普及。后者方法中的大多數采用 差別穩定同位素標記來產生可通過質譜儀來識別的具體質量標記(mass tag)，且同時提供 定量的基礎。可以通過(i)代謝標記、( )化學手段、(iii)酶促法或(iv)通過用合成肽 標準形成尖峰而將這些質量標記引入到蛋白或肽中。由炔烴、可裂解連接基和生物素組成的試劑可以用于將質量標記引入到蛋白、糖 蛋白和其他含有疊氮化物片段的生物分子中。因此，通過使用試劑例如21和22，可以引入 不同的質量標記，以定量蛋白、糖蛋白、糖肽、肽和碳水化合物。21和22的化學合成分別在 方案4和5(圖10和11)中描述。在圖12中描述了各種炔結構部分、可裂解連接基和生物 素衍生物，在圖13中描述了炔烴和反應性二烯烴衍生物。實施例3用于標記活細胞和納米顆粒的快速點擊反應用于制備4- 二苯并環辛炔醇和使用該化合物用于制備含胺的點擊試劑的替換方 ^去(alterative approach)0可以通過替換的合成路線(方案6;圖14)來制備4-二苯并環辛炔醇45。因此， 在-10°c下，在含于CH2Cl2 (20ml)的BF3 .OEt2的存在下，將已知的二苯并環庚烯酮(41)用三 甲基甲硅烷基重氮甲烷處理，以良好的收率獲得6H- 二苯并[a，e]環辛三烯_5_酮(42)。在 乙醇和THF的混合物中用硼氫化鈉還原酮42，獲得醇43，可通過以下方式將其轉化為4- 二 苯并環辛炔醇45 將雙鍵溴化，隨后通過含于THF中的LDA處理將所得化合物44消除。可 通過采用戴斯_馬丁試劑將化合物45氧化為相應的酮46。將化合物45和46轉化為含胺的衍生物49、50和51。這些化合物的吸引之處在 于能容易地用各種探針(如熒光標記和生物素)將其衍生化。此外，該胺提供連接于聚合 物載體的容易的化學處理手段。因此，通過與氯甲酸4-硝基-苯酯(0.4g，2mmol)和吡啶 反應將醇45轉化為對硝基苯酯49。通過使49與過量的三(乙二醇)-1，8_ 二胺反應來獲 得目標化合物49。通過以下方式獲得化合物50 在二異丙基酰胺鋰的存在下，使46與溴 乙酸在四氫呋喃中反應，隨后在偶聯試劑HATU和堿DIPEA的存在下，將所得酸48與三(乙 二醇)-1，8_ 二胺在DMF中縮合。最后，通過在乙酸的存在下，使酮51與N-{2-[2-(2-氨 基-乙氧基)-乙氧基]-乙基} -2-氨基氧基-乙酰胺(84mg，0. 251mmol)在甲醇和二氯甲 烷的混合物中進行肟形成反應來制備衍生物51。51的一個特征是肟連接基可通過用酸的水溶液處理而裂解，以將捕捉的化合物從點擊試劑中脫離。實驗6H-二苯并[a，e]環辛三烯_5_酮(42)。在_10°C下，經1小時向二苯并環庚烯酮 41(2. 888g, 14. Ommol)和 BF3 · OEt2 (2. 59ml，21. Ommol)在 CH2Cl2 (30ml)中的攪拌溶液中滴 加三甲基甲硅烷基重氮甲烷(10. 5ml,21.9mmol)的CH2Cl2(20ml)溶液。將混合物在_10°C 下攪拌2小時，然后傾入冰水中。水層用CH2Cl2 (3 X 100ml)萃取，并將有機層合并。合并的 有機層用鹽水洗滌，并干燥(MgS04)。減壓除去溶劑，通過快速硅膠色譜(2 1-1 2 ν/ ν己烷/CH2Cl2)純化粗產物，獲得灰白色固體狀的產物(2. 220g，72% )。1H NMR(300MHz, CDCl3) δ 8. 26 (1Η, q, J = 1. 4，6. 6Hz)，7. 13-7. 43 (7H, m)，7. 05 (2H, q，J = 3· 8，12. 9Ηζ)， 4. 06 (2Η, s)。13C NMR (75MHz，CDCl3) : δ 196. 6，136. 9，136. 3，135. 4，133. 8，133. 1，132. 4， 131. 4，130. 6，129. 3，128. 8，128. 0，127. 3，126. 9，48. 4。MALDI HRMS :m/z [M+Na+]。C6H12NaO 的計算值243· 0786(Chaffms，S. ；Brettreich, Μ. ；Wudl，F. Synthesis 2002，1191-1194)。5，6-二氫-二苯并[a，e]環辛烯-5-醇(43)。在室溫下，向 42 (2. 203g，IOmmol) 在1 1 Et0H/THF(120ml)中緩慢加入硼氫化鈉(0. 757g，20mmol)，將反應混合物在室溫下 攪拌7小時。TLC顯示反應完全，通過緩慢加入乙酸(1ml)，將反應混合物猝滅。蒸發溶劑， 將殘留物溶于CH2Cl2(IOOml)和鹽水(IOOml)中，用CH2Cl2 (4X 100ml)萃取。將有機相合 并，干燥(MgSO4)，蒸發，獲得白色固體狀的產物(2. 223g，100% )，其未經進一步純化而直接 在下一步反應中使用。1H NMR(300MHz,CDCl3) δ 7. 50 (1H，m)，7. 14-7. 30 (7H，m)，6. 90 (2H， q, J = 2. 7，12. 0Hz) ,5. 31 (1H, q, J = 6. 3，10. OHz)，3· 41 (2Η, m)。13C NMR(75MHz, CDCl3) δ 141. 7，136. 7，136. 2，134. 5，131. 7，131. 5，130. 1，129. 9，129. 3，128. 7，127. 4，127. 2，
126.9,125. 9,74. 4,42. I0 MALDI HRMS :m/z [M+Na+]。C16H14NaO 的計算值245. 0942。11，12-二溴-5，6，11，12-四氫-二苯并[a，e]環辛烯-5-醇(44)。在室溫下， 向 43(2. 223g，1 Ommol)在 1 1 CHCl3(50ml)中的攪拌溶液中滴加溴(0. 512ml, 1 Ommol)， 將反應混合物在室溫下攪拌0.5小時。TLC顯示反應完全，在室溫下，減壓除去溶劑。通 過快速硅膠色譜(2 1-1 2 ν/ν己烷/CH2Cl2)純化殘留物，獲得淺黃色油狀的產物 (2. 220g,58% )。1H NMR(300MHz, CDCl3) δ 7. 54-7. 47 (2Η，芳族化合物)，7· 31-6. 72 (6Η，芳 族化合物)，5. 77 (1Η, d, J = 5. 4Hz, CHBr)，5. 22 (1H, dd, J = 3. 6，15. 9Hz, CH0H)，5. 19 (1H, d, J = 5. 4Hz, CHBr)，3. 50 (1H, dd, J = 3. 6，15. 9Hz, CH2)，2. 75 (1H, dd, J = 3. 6，15. 9Hz, CH2)。13C NMR (75MHz, CDCl3) δ 141. 3，140. 0，137. 2，134. 0，133. 4，131. 5，131. 3，130. 9，
127.8，126. 2，123. 7，121. 3，76. 5，70. 0，62. 3，32. 2。MALDI HRMS :m/z 402. 9313 [M+Na+]。 C6H14Br2NaO 的計算值402. 9309。5，6-二氫-11，12-二脫氫-二苯并[a，e]環辛烯_5_醇(45)。在室溫下，在氬 氣氛下，向44(1.528g，4mm0l)的四氫呋喃(40ml)攪拌溶液中滴加含于四氫呋喃的二異 丙基酰胺鋰(2. 0M) (8ml, 16mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌0. 5小時，此后，通過滴加 水(0.5ml)將該反應混合物猝滅。減壓蒸發溶劑，通過快速硅膠色譜(2 1-0 1 ν/ ν己烷/CH2Cl2)純化殘留物，獲得白色固體狀的產物(0. 503g，57% )。1H NMR(300MHz, CDCl3) S 7. 67 (1H，芳族化合物)，7. 37-7. 18 (7H，芳族化合物)，4. 57 (1H，dd，J = 2. 1， 14. 7Hz, CH0H)，3· 04 (1Η, dd，J = 2· 1，14. 7Hz, CH2), 2. 86 (1H, dd，J = 2· 1，14. 7Hz, CH2)。 13C NMR(75MHz, CDCl3) δ 154. 5，150. 6，128. 6，127. 1，1127. 0，126. 0，125. 8，125. 1，124. 7，
29123. 0，122. 7，121. 7，111. 9，109. 6,74. 2,47. 7。6H-11,12-二脫氫-二苯并[a，e]環辛三烯 _5_ 酮(46)。向 45 (0. 172g，0. 781mmol) 的CH2Cl2 (40ml)攪拌溶液中加入戴斯-馬丁試劑(0. 397g，0. 937mmol)。將反應混合物在 室溫下攪拌0.5小時，TLC顯示反應完全。將反應混合物過濾通過短的硅膠墊，用CH2Cl2 洗滌。濃縮濾液，通過快速硅膠色譜(1 1-0 lv/v己烷/CH2Cl2)純化殘留物，獲得白 色固體狀的產物(0. 158g,93% ) ο 1H NMR(300MHz, CDCl3) δ 7. 29-7. 57 (8H，m)，4. 17 (1H， d, J = 10. 6Ηζ)，3· 64 (1Η, J = 10. 6Hz)。13C NMR(75MHz, CDCl3) δ 200. 4，154. 7，148. 2， 131. 21 (2C)，131. 18，129. 3，128. 2，127. 8，126. 3，125. 9，122. 2，111. 1，109. 4,49. 3。MALDI HRMS :m/z [M+Na+]。C16H10NaO 的計算值:241· 0629。碳酸5，6_ 二氫-11，12-二脫氫-二苯并[a，e]環辛烯-5-基酯4_硝基-苯 酯(47)。向45(0. 22g，lmmol)的CH2Cl2 (30mL)溶液中加入氯甲酸4-硝基-苯酯(0. 4g， 2mmol)和吡啶(0. 4ml，5mmol)。在環境溫度下攪拌4小時之后，用鹽水(2xl0mL)洗滌反應 混合物，將有機層干燥(MgS04)。減壓蒸發溶劑，通過硅膠柱色譜(己烷/乙酸乙酯，10/1， ν/ν)純化殘留物，獲得 47(0. 34g,89% )。1H NMR(300MHz, CDCl3) δ 8. 23-8. 18(2Η，芳族化 合物)，7. 56-7. 54 (2Η，芳族化合物)，7. 46-7. 18 (8Η，芳族化合物)，5. 52 (1Η，dd，J = 3. 9， 15. 3Hz, CH0H)，3. 26 (1H, dd，J = 3. 9，15. 3Hz, CH2)，2. 97 (1H, dd, J = 3· 9，15. 3Hz, CH2)。 13C NMR(75MHz, CDCl3) δ 154. 5，150. 7，149. 1,148. 7，129. 0，127. 4，127. 3，126. 7，126. 5， 125. 5，125. 2，124. 3，124. 0，122. 6，122. 4，120. 8，120. 6，120. 2，112. 2，108. 5,80. 6,44. 8。 MALDI HRMS :m/z 408. 0852 [M+Na+]。C23H15NNaO5 的計算值408· 0848。(5，6-二氫-11，12-二脫氫-二苯并[a，e]環辛烯-5-基氧基)_乙酸(48)。在 0°c下，向溴乙酸(0. 280g，2mmol)的四氫呋喃(40ml)攪拌溶液中緩慢加入氫化鈉(60%油 分散體，0. 120g, 3. Ommol)。將混合物在0°C下攪拌10分鐘，然后加入45 (0. 220g, 1. Ommo 1)。 將混合物在0°C下攪拌另外10分鐘，然后溫熱至室溫并攪拌1天。通過一滴HOAc將反應猝 滅。過濾通過短硅膠墊，用EtOAc洗滌，然后減壓濃縮。通過快速硅膠色譜(1 0-1 1 CH2Cl2/EtOAc)純化殘留物，獲得白色固體狀的產物(0. 60g,22% ) 1H NMR(300MHz, CDCl3) δ 7. 69 (1Η, d, J = 7. 7Hz)，7. 49 (1H, d, J = 6. 7Hz)，7. 41 (1H, m)，7. 27-7. 35 (5H, m)，4. 25 (1H, m)，4. 15 (2H, d, J = 8. OHz)，3. 30 (1H, dd, J = 2.2，14. 8Hz)，2. 72 (1H, dd, J = 3. 6，14. 8Hz)。13C NMR (75MHz, CDCl3) δ 154. 5，150. 6，128. 6，127. 1，1127. 0，126. 0， 125. 8，125. 1,124. 7，123. 0，122. 7，121. 7，111. 9，109. 6,74. 2,47. 7。MALDI HRMS :m/z 301. 0838 [M+Na+]。C18H14NaO3 的計算值301. 0841。{2-[2-(2-氨基-乙氧基)_乙氧基]-乙基}_氨基甲酸5，6- 二脫氫-11，12- 二 脫氫_ 二苯并[a，e]環辛烯-5-基酯(49)。在室溫下，向47(0. 077g，0. 2mmol)和三(乙 二醇)-1，8_ 二胺(0. 293ml, 2mmol)在 CH2Cl2(20ml)中的攪拌溶液中加入 Et3N(0. 139ml， 1. Ommol)。將反應混合物在室溫下攪拌3小時，此后，減壓脫除溶劑。通過快速Iatrobeads 色譜(flash chromatography on Iatrobeads) (8-30 % v/v Me0H/CH2Cl2)純化殘留物， 獲得淺黃色固體狀的產物(0. 063g,80% ) ο 1H NMR(300MHz, CDCl3) δ 7. 51 (1Η, d，J = 7. 3Hz)，7. 24-7. 37 (7H, m)，5. 81 (1H，s, NH) ,5. 48, (1H, br)，3. 50-3. 68 (8H, m)，3. 39 (2H, m)，3. 16 (1H, d, J = 14. 8Hz)，2. 91 (2H, br)，2. 88 (1H, d, J = 14. 8Hz)，2. 57 (2H, br, NH2)。 13C NMR (75MHz, CDCl3) δ 155. 7，152. 2，151. 1,130. 0，128. 1，128. 0，127. 2，127. 1，126. 3，
30126.0，123. 9，123. 8，121. 3，113. 0，110. 0,76. 7,72. 8,70. 3,70. 2,70. 1,70. 0,46. 2,41. 5， 41. 0。MALDI HRMS :m/z 417. 1746 [M+Na+]。C23H26N2NaO4 的計算值417. 1790。N- {2- [2- (2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙基} _2_ (5，6_ 二氫 _11，12- 二脫氫-二 苯并[a，e]環辛烯-5-基氧基)-乙酰胺(50)。在室溫下，向48 (5. 6mg, 0. 02mmol)和三 (乙二醇)-l，8-二胺(0. 0292ml,0. 2mmol)在DMF(3ml)中的攪拌溶液中加入HATU偶聯試 劑(7. 6mg，0. 02mmol)和DIPEA(0. 0348ml,0. 2mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌2小時， 此后減壓除去溶劑。通過快速Iatrobeads色譜(8_30% v/v MeOH/CH2Cl2)純化殘留物，獲 得無色油狀的產物。MALDI HRMS :m/z 431. 1916[M+Na+]。C24H28N2NaO4 的計算值431. 1947。N-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)_乙氧基]-乙基}_2-(6Η_11，12-二脫氫-二苯并 [a,e]環辛烯-5-亞基氨基氧基)-乙酰胺(51)。將 46 (46mg，0. 211mmol)、N_ {2_[2_ (2-氨 基-乙氧基)-乙氧基]-乙基}-2-氨基氧基-乙酰胺(84mg，0. 251mmol)和乙酸(0. 1ml) 在1 1 v/v Me0H/CH2Cl2(4ml)中的溶液在室溫下攪拌2天。減壓脫除溶劑，通過快速 Iatrobeads色譜(4_15% v/v MeOH/CH2Cl2)純化殘留物，獲得淺黃色固體狀的產物(56mg， 63% )。MALDI HRMS :m/z 444. 1835[M+Na+]。C24H27N3NaO4 的計算值444· 1899。4- 二苯并環辛炔醇衍生物的環化加成的反應動力學。制備4-二苯并環辛炔醇(61)的許多類似物(63-68)，通過1H NMR波譜中的芐基 質子信號的積分來確定這些改性對與芐基疊氮的環化加成的反應速率的影響。圖15示出 了化合物61-68的二階常數。令人驚奇的發現是，不具有羥基官能團的化合物62比類似的 4- 二苯并環辛炔醇(61)反應慢大約70倍。61的羥基的酰化(例如在化合物63和64中) 導致反應速率的緩慢下降。61的烷基化(例如在化合物65中)也導致更慢的反應速率。 具有偕-二氟的化合物66以與化合物61類似的速率反應。有趣地，酮67以比1稍高的反 應速率發生反應。肟68具有與61類似的反應速率。這些結果證明，61的羥基的改性可對 環化加成的速率產生劇烈影響。實驗70 的合成。向 LiAlH4 (0. 38g，IOmmol)和 AlCl3(1. 3g，IOmmol)在 Et2O(IOOmL)中 的攪拌溶液中加入69(1. lg,5mmol)。將反應物在0°C下保持12小時，然后用水(IOOml)將 它猝滅。水層用醚(4X 100ml)萃取，合并的有機萃取物用水(IOOml)和鹽水(IOOml)洗滌。 通過柱色譜(己烷/CH2Cl2, 2/1，v/v)純化粗產物，獲得兩種70(0. 63g，61 % ；方案7 ；圖16)。 1H NMR(CDCl3, 300MHz) δ :6. 90-7. 21 (m，8Η，芳族化合物)，6. 67 (s，2Η，CH = CH), 3. 11 (s, 4H，-CH2-CH2-)。13C 匪R(75MHz，CDC13) δ :140· 0，136. 9，131. 6，130. 3，130. 1，128. 7，128. 5，
127.1，125. 6。HRMS, C16H14Na 的計算值(M+Na) :229· 0993。實測值:229· 1003。71 的合成。在 0°C下，將溴(0. 4g,2. 5mmol)的 CHCl3 (IOmL)溶液滴加到 70 (0. 5g， 2. 5mmol)的CHCl3(20mL)溶液中。將反應混合物在室溫下攪拌12小時，直到反應完全為 止(通過TLC監測)。所得混合物用飽和硫代硫酸鈉水溶液(15mL)洗滌，干燥(MgSO4)。 減壓蒸發溶劑，通過硅膠柱色譜(己烷/CH2Cl2,10/1，v/v)純化殘留物，獲得71(0. 53g， 58% ；方案 7 ；圖 16)。1H NMR(CDCl3, 300MHz) δ :7. 06-7. 52 (m，8Η，芳族化合物)，5. 79 (s， 2H，Ph-CH-Br)，3. 05(dd，2H，PhHCH)，2. 84(m，2H，PhHCH)。13C NMR(75MHz，CDCl3) δ :141.8， 138. 7，131. 3，130. 6，129. 3，126. 6,35. 7。62的合成。在室溫下，在氬氣氛下，向71 (0. 36g，lmmol)的四氫呋喃(20mL)溶液中滴加含于四氫呋喃的t-Bu0K(2. 0M)，(2mL)。將反應混合物在室溫下攪拌2小時，此后，將 其傾入冰水(IOmL)中，所得混合物用CH2Cl2(2X50mL)萃取。合并的萃取物用水、鹽水洗滌， 干燥(MgSO4)，將溶劑減壓蒸發。通過硅膠柱色譜(己烷/CH2Cl2, 2/1，ν/ν)純化殘留物，以 獲得 62(50mg，25% ；方案 7 ；圖 16)。1H WR(CDC13，300MHz) δ :7. 29-7. 14(m，8H，芳族化合 物)，3· 28-3. 15 (m, 2H, -HCH-HCH-)，2. 40-2. 27 (m, 2H, -HCH-HCH-)。13C NMR(75MHz, CDCl3) δ :153. 8，129. 6，127. 9，126. 7，126. 3，124. 2，111. 8,36. 7。63 的合成。向 72(38mg，0. lmmol)的 CH2Cl2(15mL)攪拌溶液中加入 73(15mg， 0. 2mmol)和TEA(lOyL)。將反應混合物在室溫下攪拌12小時。減壓蒸發溶劑，通過硅 膠柱色譜(CH2C12/CH30H，20/1，ν/ν)純化殘留物，獲得 63 (25mg，77 % ；方案 8 ；圖 17)。1H 匪R (CDCl3, 300MHz) δ :6. 94-7. 43 (m，8Η，芳族化合物)，5. 42 (m，1Η，Ph-CH-O)，3. 61 (m，2H， CH2OH)，3. 30(m，2H，CH2NH)，3. 08 (dd, 1H, J = 15. 0，1. 8Hz, PhHCH)，2. 84 (dd, 1H, J = 15. 0，
3.9Hz，PhHCH)，1· 53-1. 68 (m，2H，CH2CH2OH)。13C 匪R(75MHz，CDCl3) δ :150· 8，149. 1，128. 9， 128. 0，127. 0，126. 1, 126. 0，125. 9，125.8，125. 3，125. 1, 125. 0，122. 8，122.6，120. 3， 111. 9,108. 9,58. 6,45,2,36. 8,36. 7,31. 60 HRMS，C20H19O3Na 計算值(M+Na) :344· 1263。實 測值344. 1896。64的合成。向61 (22mg，0. lmmol)的吡啶(4mL)攪拌溶液中加入Ac2O (ImL)。將反 應混合物在室溫下攪拌12小時。減壓蒸發溶劑，通過硅膠柱色譜(己烷/CH2Cl2,1/1, ν/ν) 純化殘留物，獲得 64 (21mg，81% ；方案 9 ；圖 18)。1H NMR(CDCl3, 300ΜΗζ) δ :7· 43-7. 17 (m， 8H，芳族化合物)，5. 49 (m, 1H，Ph-CH-OAc)，3. 06 (dd, 1H, J = 15. 6,2. 4Hz，PhHCH)，2. 84 (dd, 1H, J = 15. 6,2. 4Hz, PhHCH)，2. 17 (s，3H，CH3)。13C NMR(75MHz, CDCl3) δ : 169. 9，151. 3， 151. 1，130. 1，128. 3，128. 1，127. 4，127. 3，126. 5，126. 2，124. 0，121. 6，113. 2，110. 0,76. 6， 46. 5，21. 4。C18H14O2Na (M+Na)的 HRMS 計算值 285. 0891。實測值285. 1005。65 的合成。向 61 (22mg，0. lmmol)的 DMF(2mL)攪拌溶液中加入 NaH(8mg， 0. 2mmol)，將混合物在室溫下攪拌1小時，然后加入芐基溴(BnBr，34mg，0. 2mmol)。將反 應混合物在室溫下攪拌12小時。將溶劑減壓蒸發，通過硅膠柱色譜(己烷/CH2Cl2, 2/1， ν/ν)純化殘留物，獲得 65 (18mg，59% ；方案 9;圖 18)。1H NMR(CDCl3, 300ΜΗζ) δ 7. 70 (m, 1H，芳族化合物)，7· 39-7. 17(111，13!1，芳族化合物)，4· 55(dd，2H，J = 11.6,3. OHz, CH2Ph),
4.26 (m, 1H, Ph-CH-OBn), 3. 23 (dd, 1H, J = 15. 0,2. 4Hz, PhHCH), 2. 84 (dd, 1H, J = 15. 0, 2. 4Hz,PhHCH)。13C NMR(75MHz,CDCl3) δ :152. 6，151. 1，137. 3，128. 4，127. 3，127. 1，127. 0， 126. 5，126. 2，125. 8，125. 7，125. 1，125. 0，123. 6，123. 0，120. 5, 111. 8，109. 5,81. 5,71. 0， 46. I0 C23H18ONa (M+Na)的 HRMS，計算值333. 1255。實測值333. 1905。74的合成。在室溫下，使用注射泵經1小時向LDA(20ml，40mmol，2. OM THF溶液) 的THF(200mL)攪拌溶液中加入酮69 (4. 4g,20mmol)的THF(40mL)溶液。在室溫下攪拌另外 20分鐘之后，加入三乙基氯硅烷(6. 7ml，40mmol)。將該溶液在室溫下攪拌1小時。將反應 混合物在旋轉蒸發儀上濃縮，通過柱色譜(己烷/CH2Cl2,10/1，ν/ν)直接純化粗產物，獲得 透明的油 74(5. 8g，85%;方案 10 ；圖 19)。1H ^R(CDC13，300MHz) δ :7. 25-6. 95 (m，8Η，芳族 化合物)，6· 72(t，2H，J = 7. 0Hz,CH = CH), 6. 11 (s，1H, J = 7. 0Hz，CH = C)，0· 87-0. 82 (m, 9H, CH2-CH3)，0· 61-0. 48 (m，6H，CH2-CH3)。13C NMR(75MHz, CDCl3) δ 151. 9，138. 2，137. 3， 137. 2，136. 7，136. 5，134. 0，132. 6，130. 1, 129. 3，129. 0，128. 6，128. 0，127. 1, 127. 0，126. 2,112. 7,6. 9,5. I0 C22H26OSiNa(M+Na)的 HRMS 計算值357. 1651。實測值357. 1993。75的合成。在0°C下，經由加樣漏斗經10分鐘，向商品名為SELECTFLU0R， 得自Air Products (AlIentown, PA)的氟化試劑(1_氯甲基_4_氟_1，4_ 二氮雜雙環 (diazoniabicyclo) [2.2.2]辛烷雙 _(四氟硼酸酯))(6. 3g，18mmol)在 DMF(20ml)中的 攪拌溶液中加入硅烯醇醚(silyl enol ether) 74 (5. Og，15mmol)的DMF (20ml)溶液。經 30分鐘，邊攪拌邊使反應物緩慢溫熱至室溫，然后用水(IOOmL)將其猝滅。水層用醚(4 X 100ml)萃取，合并的有機萃取物用水(3 X IOOmL)和鹽水(1 X 200mL)洗滌。通過柱色譜 (己烷/CH2Cl2,1/1，ν/ν)純化粗產物，獲得 75(2. 4g，66%;方案 10 ；圖 19)。1H NMR (CDCl3, 300MHz) δ :7. 80-7. 06(m，8H，芳族化合物)，6. 85(s，2H，CH = CH)，4. 41-4. 36 (m，1H， CHF)。13C NMR(75MHz, CDCl3) δ :196· 4，152. 8，144. 1，140. 4，138. 5，135. 8，135. 5，135. 4， 131. 5，129. 6，128. 3，127. 7，126. 9，125. 3，124. 6，124. 1,63. 6,56. 9 ； 19F (CDCl3, 283MHz) δ :-109. 1 (s，IF)。C16H11FONa(M+Na)的 HRMS 計算值261. 0692。實測值261. 1237。76的合成。室溫下，使用注射泵，經1小時向LDA(10ml，20mmol，2. OM THF溶液) 的THF(IOOmL)攪拌溶液中加入酮75 (2. 4g，IOmrnol)的THF(20mL)溶液。在室溫下攪拌 另外20分鐘之后，加入三乙基氯硅烷(3.3ml，20mmol)。將該溶液在室溫下攪拌1小時。 將反應混合物在旋轉蒸發儀上濃縮，通過柱色譜(己烷/CH2Cl2, 5/1，ν/ν)直接純化粗產 物，獲得透明油 76(2. 8g，79% ；方案 10 ；圖 19)。1H NMR(CDC13，300ΜΗζ) δ :7. 41(m，2H，芳 族化合物)，7. 22 (m, 4H，芳族化合物)，7. 08 (m, 2H，芳族化合物)，6. 91 (s，2H，CH = CH)， 0.94(t，9H，J = 7. 8Hz, CH2-CH3)，0· 63 (m，6H，CH2-CH3)。13C NMR(75MHz, CDCl3) δ :145.8， 142. 6，137. 3，137. 2，136. 3，136. 1,134. 2，133. 3，132. 6，132. 1，130. 1, 130. 0，129. 6，
129.3，128. 9，128. 8，128. 7，128. 5，128. 2，127. 5，127. 4,6. 7,6. 3,5. 2 ；19F (CDCl3, 283MHz) δ -lll. 978 (s，IF)。C22H23FOSiNa(M+Na)的 HRMS 計算值:373· 1400。實測值:373· 1522。77的合成。在0°C下，經由加樣漏斗，經10分鐘向SELECTFLU0R氟化試劑(3. 5. g, IOmmol)的DMF (15ml)攪拌溶液中加入硅烯醇醚76 (2. 8g，8mmol)的DMF(IOml)溶液。 經30分鐘，邊攪拌邊使反應物緩慢溫熱至室溫，然后用水(IOOmL)將其猝滅。水層用醚 (4 X IOOmL)萃取，合并的有機萃取物用水(3 X IOOmL)和鹽水(1 X IOOmL)洗滌。通 過柱色譜(CH2Cl2)純化粗產物，獲得77 (l.Og，51 % ；方案10 ；圖19)。1H NMR (CDCl3, 300MHz) δ :8.05(m，lH，芳族化合物)，7. 69 (m，1H，芳族化合物)，7. 51 (m，1H，芳族化合 物)，7. 39-7. 21(m，5H，芳族化合物)，6. 92 (d，1H，CH = CH, J = 14. 8Hz)，6. 73 (d, 1H, CH =CH, J = 14. 8Hz)。13C NMR(75MHz, CDCl3) δ :188· 1，134. 6，133. 6，132. 8，132. 3，131. 1，
130.8，130. 5，130. 1,129. 8，129. 6，129. 3，126. 8，15. 0，124. 8,115. 3 ；19F (CDCl3, 283MHz) δ -llO. 1 (s，2F)。C16H10F2ONa(M+Na)的 HRMS 計算值:279· 0597。實測值:279· 1032。78的合成。經5分鐘，向77(1. 0g,4mmol)的EtOH(30mL)攪拌溶液中加入 NaBH4(C). 3g，8mmol)。將反應物在室溫下保持2小時，然后用水(100ml)將其猝滅。水層 用CH2Cl2 (3 X IOOmL)萃取，合并的有機萃取物用水(IOOmL)和鹽水(IOOmL)洗滌。通過 柱色譜(己烷/Et0Ac，5/l，ν/ν)純化粗產物，獲得78(0. 78g，78% ；方案10;圖19)。1H 匪R(CDCl3, 300MHz) δ :7. 02-7. 74 (m，8Η，芳族化合物)，6. 94 (d，1Η，J = 12. 3Hz，CH = CH)， 6. 85 (d, 1H, J = 12. 3Hz，CH = CH), 5. 60 (m, 1H，Ph-CH-OH)，2. 82 (m, 1H，0H)。13C 匪R(75MHz， CDCl3) δ :136. 0，135. 9，135. 0，133. 8，131. 2，130. 6，130. 0，128. 1,127. 9，126. 8，124. 6，121.5，121. 4 ； 19F(CDCl3, 282ΜΗζ) δ :-69· 8 (d, IF, J = 259. 4Hz) ,-111. 7 (dd, IF, J = 259. 4， 21. 4Hz)。C6H12F2ONa (M+Na)的 HRMS 計算值:281· 0754。實測值:281· 1122。79的合成。在0°C下，向溴(0. 16g,l. Ommol)的CHCl3(IOmL)攪拌溶液中滴加 78(0. 25g，1. Ommol)的CHCl3(IOmL)溶液。將反應混合物在室溫下攪拌12小時，直到反應 完全(通過TLC監測)。所得混合物用飽和硫代硫酸鈉水溶液(IOmL)洗滌，干燥(MgS04)。 減壓蒸發溶劑，通過硅膠柱色譜(己烷/Et0AC，8/l，v/v)純化殘留物，獲得79(0. 19g,46%； 方案 10;圖 19)。1H NMR (CDCl3, 300MHz) δ :6. 96-7. 82 (m，8Η，芳族化合物)，5. 62 (d，1Η，J =10. 8Hz, Ph-CH-Br), 5. 17 (d, 1H, J = 10. 8Hz, PhHCH)。13C NMR(75MHz, CDCl3) δ :132· 7， 132. 4，131. 0，130. 8，129. 2，129. 0，128，128. 4，128. 3，127. 8，125. 4，123. 8，111. 5,57. 3， 56. 5,50. 5 ；19F (CDCl3, 282MHz) δ -98. 8 (d, IF, J = 341. 1Hz),-110. 4 (d, IF, J = 341. 1Hz)。66的合成。在室溫下，在氬氣氛下，向79(40mg，0. lmmol)的四氫呋喃(IOmL)攪拌 溶液中滴加含于四氫呋喃的t-Bu0K(2. 0M)，(0. 5mL)。將反應混合物在室溫下攪拌6小時， 此后，將其傾入冰水(IOmL)中，所得混合物用CH2Cl2(2 X 50mL)萃取。合并的萃取物用水、 鹽水洗滌，干燥(MgSO4),減壓蒸發溶劑。通過硅膠柱色譜(己烷/Et0AC，5/l，v/v)純化殘留 物，獲得 66(10mg，49% ；方案 10 ；圖 19)。1H NMR(CDCl3, 300ΜΗζ) δ :7. 19-7. 92 (m，8Η，芳族 化合物)，5· 39(d，1H，J = 23. 4，10. 8Hz，-CH-0H)。13C 匪R(75MHz，CDCl3) δ : 131. 3，129. 5， 129. 4，128. 4，127. 9，127. 5，126. 8，126. 6，125. 9，125. 7，124. 8，124. 5，120. 3，107. 3,82. 8 ； 19F (CDCl3, 282MHz) δ :-91. 5 (d, IF, J = 253. 8Hz)，-103. 4 (d, IF, J = 253. 8Hz)。(6H-11，12_ 二脫氫-二苯并[a，e]環辛烯_5_亞基氨基氧基)-乙酸(68)。將 6H-11，12-二脫氫-二苯并[a, e]環辛三烯_5_酮67 (21. 8mg，0. lmmol)和(羧甲基)羥 基胺半鹽酸鹽(21. 8mg，0. 2mmol)在 1 1 0. 02 v/v/v Me0H/CH2Cl2/H0Ac (8ml)中的溶 液在室溫下攪拌2天。減壓脫除溶劑，通過快速硅膠色譜(EtOAc)純化殘留物，獲得白色固 體狀的產物(17. 8mg,61% )。1H NMR(300MHz, CDCl3) δ 7. 54(lH，d，J = 7. 4Hz)，7· 46 (1Η, d, J = 7. 4Ηζ)，7. 18-7. 39 (6Η, m)，4. 53 (2Η, m)，4. 23 (1H, d, J = 12. 8Hz)，3. 16 (1H, d, J =12.8Hz)。13C NMR(75MHz, CDCl3) δ 175. 2 & 173. 6，154. 1153. 2，130. 7，129. 5，19. 3， 129. 2，129. 1，128. 1，128. 0，127. 1，126. 9，125. 5，125. 2，122. 7，113. 9，111. 2,84. 7,68. 3 & 67. 1,35. 0 & 33.2。MALDI HRMS :m/z 314. 0810 [M+Na+]。C8H13NNaO3 的計算值314. 0793。使用與4- 二苯并環辛炔醇環化加成對大分子和納米材料的改性用于獲得穩定三唑的Cu(I)催化的疊氮化物與末端炔烴的1，3_偶極環化加成已 經用于標記各種生物分子，包括蛋白、核酸、脂質和糖類。該反應也已用于改性聚合物和納 米級材料。去除高度細胞毒性的Cu(I)的潛在難度使得用于綴合生物或醫學應用的化合物 或材料的1，3-偶極環化加成的使用變復雜。使用4-二苯并環辛炔醇代替末端炔烴用于與 疊氮化物的環化加成應克服該問題。為了證明4- 二苯并環辛炔醇在生物綴合中的用途，制備嵌段共聚物83和84。采 用這些材料在水中形成有機膠束，結果顯示，這些材料的4-二苯并環辛炔片段可與含疊氮 基的分子反應(圖20A，B)。眾所周知，由聚酯和聚乙二醇嵌段組成的嵌段共聚物在水中自組裝，形成有機膠 束。這些納米材料作為藥物傳遞裝置引人注意。用例如組織或腫瘤靶向結構部分將有機膠 束衍生化可以獲得智能藥物傳遞裝置。另外，用熒光標記或MRI試劑(如生物素)將有機
34膠束改性，對于成像目的來說是有價值的(圖20C)。聚乙二醇甲基醚(81)或疊氮化物(82) (MW約2000Da)與己內酯在催化量的SnOct 的存在下的共聚合分別獲得共聚物83和84(方案11，圖21)。用三苯基膦還原84的疊氮 基片段，使所得聚合物85的胺與86和87反應，分別獲得二苯并環辛基衍生物88和89。將 溶于少量THF中的83和88或89的混合物(9/1，w/w)加到水中。Cryo-TEM顯示，形成了 直徑大約為40人的有機膠束。所得膠束用含疊氮基的糖類90孵育，在24小時的反應時間 之后，通過滲析除去未反應的糖類。通過用TFA水解，隨后通過高pH陰離子交換色譜進行 定量來對膠束分析糖含量。確定大約45%的環辛炔被糖類改性。預期化合物84也可用于形成膠束，與化合物環化加成的所得疊氮化物的疊氮基 結構部分用二苯并環辛基片段改性。實驗PEG44-b-PCL26 83的合成。如所報道那樣，合成PEG45-O-PCL23嵌段共聚物。在氬 氣氛下，將預定體積(12. OmL)的ε -己內酯單體置于容納一定量(9. Og)的PEG 81的燒瓶 中。然后，加入一滴SnOct。在冷卻到液氮溫度之后，將燒瓶抽空12小時，密封，并在130°C 下保持24小時。將合成的聚合物溶于THF中，通過用冷的己烷沉淀來回收，并在室溫下真 空干燥。相對于PEG81的聚合度，通過1H NMR來計算PCL的聚合度。疊氮化物-PEG44-b_PCL26 84的合成。采用具有一些修改的先前報道的用于制 備PEG-b-PCL的方法，在氬氣流下，于130°C，通過單罐陽離子開環聚合來合成疊氮化 物-PEG-b-PCL。簡言之，在氮氣氛下，將預定體積(3.3mL)的ε -己內酯單體置于容納預稱 重量(2. 5g)的疊氮化物-PEG-OH 82的燒瓶內。然后，加入一滴SnOct。在冷卻到液氮溫度之 后，將燒瓶抽空，密封，并在130°C下保持24小時。然后將合成的聚合物溶于THF中，通過沉 淀到冷的己烷中來回收，并在室溫下真空干燥。通過1H NMR來測定疊氮化物-PE044-b-PCL26 84嵌段共聚物的數均分子量(Mn)。胺-PEG44-b_PCL26 85的合成。將Pd/C(10wt. % /活性炭，50mg)加入到疊氮化 物-PEG44-b-PCL2684 (200mg)在EtOH和HOAc (50 μ L)中的溶液中，此后，使H2鼓泡通過溶液 1小時，隨后在H2氣氛下攪拌16小時。將混合物過濾，真空濃縮。然后將殘留物溶于THF 中，通過沉淀到冷的己烷中來回收，在室溫下真空干燥，獲得胺-PEG44-b-PCL26 85。DID0-PE0-PCL共聚物(88)。在室溫下，向碳酸5，6_ 二氫-11，12-二脫氫-二苯并 [a, e]環辛烯-5-基酯 4-硝基-苯酯 86 (11. 6mg, 0. 03mmol)和共聚物 85 (98mg, 0. 02mmol) 在CH2Cl2(IOml)中的攪拌溶液中加入Et3N(0.014ml，0. Immo 1)。將反應混合物在室溫下攪 拌過夜，此后，減壓脫除溶劑。通過尺寸排阻色譜(SEC)在LH-20柱上(1 1 v/v MeOH/ CH2Cl2)純化殘留物，獲得淺黃色固體狀的產物(101mg，97% )。DID0-PE0-PCL 共聚物(89)。在室溫下，向(5，6_ 二氫-11，12-二脫氫-二苯并 [a, e]環辛烯-5-基氧基)-乙酸 88(8. 3mg，0. 03mmol)和共聚物 85 (98mg，0. 02mmol)在 DMF(15ml)中的攪拌溶液中加入 HATU 偶聯試劑(11. 4mg,0. 03mmol)和 DIPEA(0. 0104ml， 0. 06mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌5小時，此后減壓脫除溶劑。通過SEC色譜在LH-20 柱上(1 1 v/v MeOH/CH2Cl2)純化殘留物，獲得淺黃色固體狀的產物(100mg，96%)。二苯并環辛醇與各種1，3-偶極的環化加成已經發現，4- 二苯并環辛炔醇可在不存在催化劑或促進劑的情況下在環境溫度下與1，3-偶極(如硝酮和酰基重氮衍生物)反應，這可提供生物綴合反應的獨特機會。通過Dicken 等人，J. Org. Chem. 1982，47，2047-2051 ；和 Inouye 等人，Bull. Chem. Soc. Jpn. 1983，56，3541-3542中所公開的程序的修改程序來制備硝酮。將甲苯(20ml) 中的N-烷基羥基胺鹽酸鹽(lO.Ommol)、乙醛酸(0. 92g，10. Ommol)和碳酸氫鈉(1. 68g， 20. Ommol)在室溫下攪拌過夜。將固體過濾，并將濾液濃縮，獲得硝酮。然后將該硝酮未經 任何純化而直接使用。因此，將硝酮91-95與4- 二苯并環辛炔醇混合，在3分鐘到3. 5小時的反應時間 之后，以幾乎定量的收率分離相應的2，3- 二氫-異噁唑環化加成產物。從圖18中可以看 出，硝酮的化學性質對反應速率具有劇烈影響。尤其，缺電子硝酮93和94以比相應的疊氮 化物快得多的速率進行反應。實驗通過NMR計算二階速率常數的一般方法。將基材單獨溶解于適當溶劑中，在6mM濃度下按1 1混合。通過起始原料的消 失和如由在多個化學位移下的積分所測定的兩種區域異構產物的出現來監測轉化百分率。 通過繪制1/[基材]與時間的關系曲線和線性回歸分析來測定反應的二階速率常數。二階 速率常數相當于所確定的斜率的一半。本文引用的所有專利、專利申請、出版物和可獲得的電子材料(例如GenBank氨基 酸和核苷酸序列提交(submissions)；以及蛋白數據庫(pdb)提交)的全部公開內容通過 引用并入本文。前述詳細說明和實施例僅僅為了清楚理解而給出。不應從其中理解不必要 的限制。本發明不限于所示出和描述的確切細節，因為本領域技術人員所顯而易見的變化 將包括在由權利要求書定義的本發明的范圍內。
權利要求
下式的炔烴其中各R1獨立地選自氫、鹵素、羥基、烷氧基、硝酸根、亞硝酸根、硫酸根和C1 C10有機基團；各R2獨立地選自氫、鹵素、羥基、烷氧基、硝酸根、亞硝酸根、硫酸根和C1 C10有機基團；X表示C＝O、C＝N OR3、C＝N NR3R4、CHOR3或CHNHR3；以及各R3和R4獨立地表示氫或有機基團。FPA00001186284500011.tif
2.權利要求1所述的炔烴，其中各R1表示氫。
3.權利要求1或2的炔烴，其中各R2表示氫。
4.前述權利要求中任一項所述的炔烴，其中R3包含共價結合的有機染料。
5.權利要求4所述的炔烴，其中所述有機染料是熒光染料。
6.前述權利要求中任一項所述的炔烴，其中X表示C= N-OR3,且R3表示具有式_ (CH2) ac(o)Y的有機基團，其中a 是 1-3 ；Y表示OH或NHR5 ；以及R5表示氫或含伯胺的有機基團的生物素化產物。
7.權利要求6所述的炔烴，其中所述生物素化產物是式-(CH2CH2O)b(CH2) c-Ld-(CH2CH20)e(CH2)fNH2 和 / 或-(CD2CD2O)b(CD2) C-Ld-(CD2CD2O) e (CD2)fNH2 的含伯胺的基團 的生物素化產物，其中 b = 0-100 ；c = 0-100 ；d = 0-100 ；e = 0-100 ；f = 0-100 ；以及 L 是 任選的可裂解連接基。
8.權利要求7所述的炔烴，其中如果存在，所述可裂解連接基是二硫基。
9.權利要求1-5中任一項所述的炔烴，其中X表示CH0R3，其中R3選自烷基、芳基、烷芳 基禾口芳燒基。
10.權利要求9所述的炔烴，其中R3表示-C(0)z，其中Z表示烷基、OR6或NHR7 ；R6和R7各自獨立地選自烷基、芳基、烷芳基和芳烷基。
11.權利要求10所述的炔烴，其中R7是含伯胺的有機基團的生物素化產物。
12.權利要求11所述的炔烴，其中所述生物素化產物是式-(CH2CH2O)b(CH2) c-Ld-(CH2CH20)e(CH2)fNH2 和 / 或-(CD2CD2O)b(CD2) C-Ld-(CD2CD2O) e (CD2)fNH2 的含伯胺的基團 的生物素化產物，其中 b = 0-100 ；c = 0-100 ；d = 0-100 ；e = 0-100 ；f = 0-100 ；以及 L 是 任選的可裂解連接基。
13.權利要求12所述的炔烴，其中如果存在，所述可裂解連接基為二硫基。
14.權利要求1-5中任一項所述的炔烴，其中R3表示聚合基團或共聚基團。
15.權利要求14所述的炔烴，其中所述共聚基團包含親水片段和疏水片段。
16.權利要求14或15所述的炔烴，其中所述共聚基團包含式_[CH2CH20]n-[C(0) (CH2)5OJm-H 的片段，其中 η = 0-100 和 m = 0-100。
17.下式的炔烴 式IV。
18.下式的炔烴 式V。
19.下式的炔烴
20.下式的炔烴 式 VII，其中R3表示氫或有機基團。
21.組合物，其包含權利要求14-16中任一項所述的炔烴與聚合物或共聚物的共混物。
22.權利要求21所述的組合物，其中所述共聚物包含親水片段和疏水片段。
23.權利要求21或22所述的組合物，其中所述共聚物具有式R9O-[CH2CH2O]p-[C(O) (CH2)50]。-H，其中 R9 表示烷基，P = 0-100，以及 O = 0-100。
24.權利要求23所述的組合物，其中R9表示甲基。
25.權利要求21-24中任一項所述的組合物，其中所述組合物形成共聚物膠束。
26.用于控制藥物傳遞的方法，所述方法包括將至少一種1，3_偶極-官能藥物與權利要求25所述的包含炔烴的共聚物膠束結合；以及允許所述至少一種1，3_偶極-官能藥物與所述包含炔烴的共聚物膠束在有效形成雜環化合物的條件下反應
27.下式的化合物 團；式II 其中各R1獨立地選自氫、鹵素、羥基、烷氧基、硝酸根、亞硝酸根、硫酸根和Cl-Cio有機基 各R2獨立地選自氫、鹵素、羥基、烷氧基、硝酸根、亞硝酸根、硫酸根和Cl-ClO有機基團；X 表示 C = 0、C = N-OR3、C = N-NR3R4、CHOR3 或 CHNHR3 ； 各R3和R4獨立地表示氫或有機基團；以及 R8表示有機基團。
28.下式的化合物 團；式IX其中各R1獨立地選自氫、鹵素、羥基、烷氧基、硝酸根、亞硝酸根、硫酸根和Cl-Cio有機基 各R2獨立地選自氫、鹵素、羥基、烷氧基、硝酸根、亞硝酸根、硫酸根和Cl-ClO有機基團；X 表示 C = 0、C = N-OR3、C = N-NR3R4、CHOR3 或 CHNHR3 ； 各R3和R4獨立地表示氫或有機基團；以及 R8表示有機基團。
29.權利要求27或28所述的化合物，其中R8表示生物分子。
30.權利要求29所述的化合物，其中所述生物分子選自肽、蛋白、糖蛋白、核酸、脂質、 糖類、寡糖、多糖和它們的組合。
31.下式的化合物 其中各R1獨立地選自氫、鹵素、羥基、烷氧基、硝酸根、亞硝酸根、硫酸根和Cl-Cio有機基團；各R2獨立地選自氫、鹵素、羥基、烷氧基、硝酸根、亞硝酸根、硫酸根和Cl-Cio有機基團；X 表示 C = 0、C = N-OR3、C = N-NR3R4、CHOR3 或 CHNHR3 ；以及 各R3、R4和Rw獨立地表示氫或有機基團，條件是至少一個Rki表示有機基團。
32.下式的化合物 其中各R1獨立地選自氫、鹵素、羥基、烷氧基、硝酸根、亞硝酸根、硫酸根和Cl-ClO有 機基團；各R2獨立地選自氫、鹵素、羥基、烷氧基、硝酸根、亞硝酸根、硫酸根和Cl-ClO有機基團；X 表示 C = 0、C = N-OR3、C = N-NR3R4、CHOR3 或 CHNHR3 ；以及 各R3、R4和Rw獨立地表示氫或有機基團，條件是至少一個Rki表示有機基團。
33.權利要求31或32所述的化合物，其中表示有機基團的至少一個Rltl表示生物分子。
34.權利要求33所述的化合物，其中所述生物分子選自肽、蛋白、糖蛋白、核酸、脂質、 糖類、寡糖、多糖和它們的組合。
35.制備雜環化合物的方法，所述方法包括將至少一種1，3-偶極-官能化合物與至少一種權利要求1-20中任一項所述的炔烴結 合；以及允許所述至少一種1，3-偶極-官能化合物與所述至少一種炔烴在有效形成雜環化合 物的條件下反應。
36.權利要求35所述的方法，其中所述1，3_偶極-官能化合物選自疊氮官能化合物、 氧化腈官能化合物、硝酮官能化合物、氧化偶氮官能化合物、酰基重氮官能化合物和它們的組合。
37.權利要求35或36所述的方法，其中有效形成雜環化合物的條件包括基本上不存在 添加的催化劑。
38.權利要求35-37中任一項所述的方法，其中在活細胞內或活細胞表面上發生所述反應。
39.權利要求35-38中任一項所述的方法，其中所述至少一種1，3_偶極-官能化合物 包括1，3-偶極-官能化生物分子。
40.根據權利要求35-39中任一項所述的方法，其中所述至少一種1，3_偶極-官能化 合物包含可檢測的標記。
41.權利要求40所述的方法，其進一步包括檢測所述雜環化合物。
42.權利要求40或41所述的方法，其中所述可檢測的標記是親合標記。
43.權利要求42所述的方法，其進一步包括使用親合結合來分離所述雜環化合物。
44.炔烴，其包含包含至少兩個末端的可裂解連接基片段；連接于所述可裂解連接基片段的第一末端的炔烴片段；以及連接于可裂解的連接基片段的第二末端的生物素化片段。
45.權利要求44所述的炔烴，其中所述炔烴片段包括有張力的環狀炔烴片段。
46.權利要求44或45所述的炔烴，其進一步包括至少一種重質同位素。
47.權利要求44-46中任一項所述的炔烴，其進一步包含至少一種可檢測標記。
48.權利要求47所述的炔烴，其中所述可檢測的標記包括熒光標記。
49.雜環化合物，其通過權利要求44-48中任一項所述的至少一種炔烴與至少一種1， 3-偶極_官能化合物的反應而形成。
50.權利要求49所述的雜環化合物，其中所述1，3-偶極-官能化合物選自疊氮官能化 合物、氧化腈官能化合物、硝酮官能化合物、氧化偶氮官能化合物、酰基重氮官能化合物和 它們的組合。
51.制備雜環化合物的方法，所述方法包括將至少一種1，3-偶極-官能化合物與至少一種權利要求44-48中任一項所述的炔烴 結合；以及允許所述至少一種1，3_偶極-官能化合物與所述至少一種炔烴在有效形成所述雜環 化合物的條件下反應。
52.根據權利要求51所述的方法，其中所述1，3-偶極-官能化合物選自疊氮官能化合 物、氧化腈官能化合物、硝酮官能化合物、氧化偶氮官能化合物、酰基重氮官能化合物和它 們的組合。
53.權利要求51或52所述的方法，其中有效形成雜環化合物的條件包括基本上不存在 添加的催化劑。
54.權利要求51-53中任一項所述的方法，其中在活細胞內或活細胞的表面上發生所 述反應。6
55.權利要求51-54中任一項所述的方法，其中所述至少一種1，3_偶極-官能化合物 包括1，3-偶極-官能化生物分子。
56.權利要求51-55中任一項所述的方法，其進一步包括使所得雜環化合物與結合生 物素的化合物接觸。
57.權利要求56所述的方法，其中所述結合生物素的化合物包括抗生物素蛋白和/或 鏈霉抗生物素蛋白。
58.權利要求51-57中任一項所述的方法，其進一步包括檢測所述雜環化合物。
59.制備炔烴的方法，所述方法包括 將下式的烯烴溴化 獲得下式的二溴化物式XV; 將式XV的二溴化物脫去溴化氫，獲得下式的炔烴 式I，其中各R1獨立地選自氫、鹵素、羥基、烷氧基、硝酸根、亞硝酸根、硫酸根和Cl-Cio有機基團；各R2獨立地選自氫、鹵素、羥基、烷氧基、硝酸根、亞硝酸根、硫酸根和Cl-Cio有機基團；X 表示 C = 0、C = N-OR3、C = N-NR3R4、CHOR3 或 CHNHR3 ；以及 R3和R4獨立地表示氫或有機基團。
60.基材，在其表面上具有權利要求1-20中任一項所述的炔烴。
61.權利要求60所述的基材，其中所述基材為樹脂、凝膠、納米顆粒或它們的組合的形式。
62.權利要求60或61所述的基材，其中所述基材為三維基質。
63.權利要求60-62中任一項所述的基材，其中所述炔烴的X基團表示與基材表面的連 接點。
64.將生物分子固定在基材上的方法，所述方法包括 提供權利要求60-63中任一項所述的基材；使所述基材與1，3-偶極-官能生物分子在有效形成雜環化合物的條件下接觸。
65.權利要求64所述的方法，其中所述1，3-偶極官能生物分子選自疊氮官能生物分 子、氧化腈官能生物分子、硝酮官能生物分子、氧化偶氮官能生物分子、酰基重氮官能生物 分子和它們的組合。
66.權利要求64或65所述的方法，其中所述生物分子選自肽、蛋白、糖蛋白、核酸、脂 質、糖類、寡糖、多糖和它們的組合。
67.制品，其包含通過權利要求64-66中任一項所述的方法制備的固定生物分子。
68.制品，其包含固定于三維基質上的蛋白。
69.用于固定細胞的方法，所述方法包括 提供權利要求60-63中任一項所述的基材；使所述基材與包含1，3_偶極-官能生物分子的細胞在有效形成雜環化合物的條件下 接觸。
全文摘要
1，3-偶極-官能化合物(例如疊氮官能化合物)可與某些炔烴在環化反應中反應，以形成雜環化合物。還公開了有用的炔烴(例如有張力的環狀炔烴)和制備此類炔烴的方法。1，3-偶極-官能化合物與炔烴的反應可以用于各種應用，包括將生物分子固定于基材上。
文檔編號C07D249/18GK101925366SQ200880125596
公開日2010年12月22日 申請日期2008年11月21日 優先權日2007年11月21日
發明者G-J·布恩斯, M·沃爾菲特, 寧興海, 郭軍 申請人:喬治亞大學研究基金公司