專利名稱：用于生產琥珀酸的方法
技術領域：
本發明涉及在無氧條件下通過發酵來生產琥珀酸和/或琥珀酸根離子的方法。
背景技術：
琥珀酸(或丁二酸)是一種具有兩個羧基基團的有機酸，其半結構化學式 (semi-structural formula)為C00H-CH2_CH2-C00H，它在線粒體中作為一個三羧酸循環的 代謝中間產物參與了細胞代謝。它在化妝品、食品加工、藥物以及紡織品領域和塑料制品中具有多種應用。因此， 例如在生產1，4_ 丁二醇、四氫呋喃以及丁內酯時它被用作塑料制品的合成中間產物。從琥珀酸得到的新產品不斷地處于開發之中，包括聚酯的開發。總體上，琥珀酸酯具有成為新型“綠色”溶劑的潛力，它們能夠替代對人類和環境 更加有害的溶劑。從可再生的起始材料(在這種情況下在這一點上，通過發酵工藝)生產羧酸，例如 蘋果酸、琥珀酸或富馬酸，對于本領域的普通技術人員是已知的。琥珀酸鹽是在通過細菌生產丙酸鹽的無氧發酵中的一種代謝中間產物，但是這些 發酵工藝導致產生非常低的產率和滴度的琥珀酸。近年來，已經分離出多種生產琥珀酸的微生物，例如厭氧的瘤胃細菌棲瘤胃擬桿 菌(Bacteroides ruminicola)禾口口耆淀粉擬桿菌(Bacteroidesamylophilus)。然而，來自瘤 胃的生物在發酵工藝中是高度不穩定的，并且因此不用于工業生產琥珀酸。長期以來已知幾種酸(包括琥珀酸)的混合物是在葡萄糖和C02作為碳源存在 下由大腸桿菌發酵所生產的，正如1949年由JL Stokes的“Fermentation of glucose by suspensions of Escherichia coli ”，J. Bacteriol.，57 :147—158 所說明。然而，對于每摩 爾的發酵的葡萄糖，僅產生0.3至0. 4mol的琥珀酸。因此，對細菌(特別是大腸桿菌)進行了研究，這些細菌已經被遺傳修飾從而使消 耗了生產琥珀酸所需要的NADH的代謝途徑失活，并且從而激活了用于生產琥珀酸鹽(琥珀 酸的鹽)的代謝途徑。確切地，這個允許草酰乙酸鹽轉化成蘋果酸鹽、然后轉化成富馬酸鹽并且最終轉 化為琥珀酸鹽的發酵代謝途徑要求所產生每摩爾的琥珀酸鹽中具有2mol的NADH。所以，在 琥珀酸鹽的生產中主要的代謝瓶頸是NADH的細胞生物利用率。作為對這個困難的一種解決方案，文件US 7，223，567說明了使用一種重組大腸 桿菌菌株，它對于相同可獲得量的NADH過量地生產了琥珀酸鹽。大腸桿菌菌株SBS550MG pHL 413展示了使adhE和ldhA基因的產物(參與了消 耗NADH的途徑)失活以及使ack-pta基因和iclR基因的產物(激活乙醛酸途徑)失活， 并且含有一個過量表達外源PYC基因的質粒載體。Sanchez 等人的 文章(題目為〃 Novel pathway engineering design of theanaerobic central metabolic pathway in Escherichia coli to increase
4succinateyield and productivity" in Metabolic Engineering 7 (2005) 229-239)、美國 專利US 7，223，567以及美國專利申請US 2005/0042736已經發展了與該菌株相關聯的新 型培養和生產條件，以改進它的琥珀酸產率。本領域的普通技術人員正在不斷地尋找用于生產琥珀酸的新型的改進方法。具體 而言，本領域的普通技術人員尋找優化所獲得的產率和生產率。而且，常規的發酵方法導致 相當數量的二氧化碳廢物被釋放到空氣中，這顯然是不令人希望的。
發明內容
根據一方面，本發明涉及通過一種大腸桿菌菌株的無氧發酵來生產琥珀酸和/或 琥珀酸根離子的一種方法，該方法包括(A)在一個發酵罐中的一個碳源的一個發酵步驟，該步驟是通過提供CO2、使發酵 罐的多個通氣孔關閉下進行，這樣CO2的供給是由該菌株消耗的CO2來控制，在該碳源完全 耗盡之前隨后進行，(B)不供給CO2的該剩余碳源的一個發酵步驟，從而消耗殘余的C02。本領域的普通技術人員是熟悉發酵技術的(特別是如 Fermentation&Biochemical Engineering Handbook-principles， process design&equipment，2nd ed 1996 by Henry C. Vogel and Celeste L Todaro 中所說明)。發酵是一種生化反應，它總體上包含在微生物酶的作用下從一種有機底物中釋放 能量或生產某些感興趣的代謝產物。發酵總體上是在適合于發酵工藝的裝置(發酵罐)中進行的，即適合于在所希望 的條件下(使得有可能在適當地時控制培養基的氣體平衡，特別是通過氣體進口和/或 出口管、通氣孔、等等的裝置；使得有可能引入培養基以及其他物質的裝置；使得有可能控 制、調節、修飾其他類型的參數例如攪拌，溫度，pH、等等的裝置)培養微生物。本領域的普通技術人員還熟悉在無氧條件下的發酵。根據本發明，這是指在沒有 氧的培養條件。優選地，無氧培養條件是存在二氧化碳的培養條件。根據一個實施方案，在 CO2的存在下和/或供給CO2的無氧發酵條件是CO2飽和的發酵條件。在步驟(A)過程中“在完全耗盡碳源之前”這一表達是指在步驟(A)中的一個時 刻，其中該發酵培養基含有一個剩余量的碳源，該碳源在這個時刻借助于在溶液中可以獲 得的CO2 (以溶解的CO2或HCO3-的形式)可以由該菌株完全轉化為琥珀酸和/或琥珀酸鹽。在步驟(A)過程中，由于這個或這些發酵罐通氣口是關閉的并且CO2進料到發酵 罐得以保持，分批地進行CO2的供給，根據由該菌株所消耗的CO2對其進行自動調節用于生 產琥珀酸和/或琥珀酸鹽。術語“自動地調節”是指，假定在該發酵罐中(一個或多個通氣孔關閉)液相(發 酵培養基)與氣相(“大氣”)之間熱力學平衡的條件下，供給一個給定量的CO2僅僅可以 在由該菌株通過發酵(并且因此伴隨著琥珀酸和/或琥珀酸鹽的生產)消耗一個相同的量 之后出現。在步驟(B)過程中，不存在著CO2的供給，這意味著在步驟(A)過程中進行的CO2 供給被中斷。具體而言，這可以通過切斷CO2進料來進行。有利的是，根據本發明，在步驟(B)過程中的發酵消耗了存在于發酵培養基中的co2 (溶解的剩余物)和hco3_離子。根據一個優選的實施方案，在步驟(A)開始之前，通過注入進行C02的供給，其中 發酵罐通氣孔是開放的，從而達到用co2使該發酵培養基飽和。提及例子，通過以0. 15-0. 40vvm的流速(每分鐘每體積的培養基中的C02體積) 進行注入可以引入C02，優選地0. 3vvm.“用C02飽和發酵培養基”這一表達是指該培養基在對應的條件(溫度、pH、等等) 下含有溶解于其中的最大量的C02。例如，在37°C下在pH7下這可以對應于l_2g/l的濃度， 例如1. 5g/l的數量級的濃度。根據一個實施方案，步驟(A)和/或步驟(B)是在pH處于6. 0-7. 0、優選6. 4-6. 8、 優選6. 5-6.6的范圍內進行的。根據一個實施方案，該碳源是葡萄糖。根據一個實施方案，在步驟(A)開始時，該發酵培養基含有15_40g/l、優選地 15-25g/l、優選地15-20g/l的葡萄糖。根據一個實施方案，在步驟(B)開始時，該發酵培養基含有2_6g/l、優選地大約 4g/l的葡萄糖。根據一個優選的實施方案，這種大腸桿菌菌株是一個具有基因型 A adhE A ldhA A iclR A ackptaPYC的菌株。有利的是，這種基因型使得有可能在C02的存在 下通過發酵來促進琥珀酸的生成。符號A表示所討論的基因已經被失活，例如通過突變、 缺失、中斷、插入或減量調節，例如通過引入一個終止密碼子、導致閱讀框改變的插入或缺 失，一個點突變、等等。因此，A adhE A ldhA A iclR A ackptaPYC 基因型對應于- A adhE 醇脫氫酶的失活；-A ldhA 乳酸脫氫酶的失活；- A iclR 異檸檬酸裂合酶(也被稱作aceA)的失活；- A ackpta 乙酸激酶-磷酸轉乙酰酶的失活；-PYC 一種丙酮酸羧化酶基因的表達。這表明該菌株表達了 PYC基因，例如借助于 使用攜帶該基因的一個功能拷貝的質粒進行轉化，或通過PYC的一個功能拷貝的基因組整 合。有利的是，PYC基因是乳酸乳球菌的pyc基因。根據一個非常優選的實施方案，該大腸桿菌菌株是SBS550MG-pHL413菌株。該 菌株說明于 Sanchez et al.，MetabolicEngineering，7 (2005) 229-239 中，以及文件 US 7，223，567 和 US2005/0042736 中。根據一個方面，本發明涉及一種用于生產琥珀酸的方法，該方法包括(a)在有氧條件下培養一種大腸桿菌菌株的一個步驟，在此過程中通過向該培養 基中加入一種鎂化合物來調節PH，(b)在無氧條件下在C02存在下通過在發酵步驟(a)中培養的菌株的發酵來生產 琥珀酸根離子的一個步驟，(c)將在步驟(b)中形成的琥珀酸根離子轉化成琥珀酸的一個步驟。本領域的普通技術人員還熟悉在有氧條件下的發酵和培養。根據本發明，這是指 存在氧的培養條件。根據一個實施方案，這種氧來自大氣。
在步驟(a)中，由此存在著這種大腸桿菌菌株的生長和繁殖。因此，存在著生物量 的產生，即細胞群體的增加。該步驟典型地可以包括預培養的子步驟(subst印)。根據本發明，術語“調節pH”是指將這種培養基的pH值維持在一定范圍或選定的 數值內的動作。根據本發明，可以通過不同的方式來調節PH -在一個范圍內的調節將pH值維持在一定范圍的數值內。然后，該pH值可以隨 時間發生變化，然而并不偏離所考慮的范圍；-“低點”調節將pH值維持在一個閾值之上。然后，該pH值可以隨時間發生變 化，然而并不降到該閾值以下。-在一個單一的數值上的調節使pH值隨著時間持續地保持在該數值上。術語“加入一種化合物”是指將該化合物加入到這種培養基中。可以根據不同的 方法進行加入加入一種懸浮液和/或加入一種溶液和/或加入一種固體(例如，以粉末形 式)O根據一個實施方案，步驟(a)的鎂化合物是選自氧化鎂、氫氧化鎂以及碳酸鎂。氧化鎂、氫氧化鎂、或碳酸鎂能夠以粉末的形式或以懸浮液的形式，典型地以水性 懸浮液(例如，以20%至30%重量/體積的濃度)來加入。根據一個實施方案，步驟(a)和/或(b)是在一種含有所使用的碳源(典型地是 葡萄糖)的培養基中進行的，并且特別是以10至30g/l的濃度，例如20g/l。根據一個實施方案，在步驟(b)過程中，pH是通過向該發酵培養基中加入一種選 自如下組的化合物來調節的，該組的組成為鎂化合物類(例如，選自氧化鎂、氫氧化鎂以 及碳酸鎂)、鈣化合物類(例如，選自氧化鈣、氫氧化鈣以及碳酸鈣)、鉀化合物類(例如，選 自氫氧化鉀以及碳酸鉀)、銨化合物類(例如，選自氫氧化銨以及碳酸銨)以及鈉化合物類 (例如，選自氫氧化鈉以及碳酸鈉)、以及它們的混合物。根據一個實施方案，步驟(b)是在pH處于6. 0-7. 0、優選地6. 4-6. 8的范圍內進行 的。根據一個實施方案，步驟(c)包括一個酸化反應。特別地，這種酸化反應可以通過 加入至少一個酸來進行，這種酸選自正磷酸、草酸以及硫酸。根據一個實施方案，在步驟(b)過程中，pH是通過向該發酵培養基中加入一種選 自由鎂化合物類構成的組的化合物來調節的，由此形成了琥珀酸鎂。在這種情況下，步驟(c)可以包括(c-1)將在步驟(b)中形成的琥珀酸鎂轉化成琥珀酸鈉的一個步驟，以及(c-2)通過雙極電滲析將在步驟(c-1)中形成的琥珀酸鈉轉化成琥珀酸的一個步
馬聚o步驟(c-1)可以典型地通過加入碳酸鈉來進行。該碳酸鹽能夠以一種溶液或一種 粉末的形式，典型地以一種水性溶液的形式(例如，以1至2M的濃度)而加入。碳酸鎂(它 是不溶解的)發生沉淀。碳酸鎂可以在高溫下在烘箱中進行處理，例如在大于700°C的烘箱 中。這生成了 MgO和C02，它們中至少有一個可以被循環使用。碳酸鎂能夠可替代地以此狀態被回收。有利的是，琥珀酸鈉可以通過雙極電滲析 (這不是用琥珀酸鎂的例子)進行處理，生成氫氧化鈉和琥珀酸，它們是可以結晶的。而且， 這項雙極電滲析技術對于本領域的普通技術人員是熟知的。所產生的氫氧化鈉可以在適當
7時用之前從高溫烘箱中釋放的CO2進行再轉化，從而形成碳酸鈉。所有的步驟在圖3中表示 ο根據一個優選的實施方案，這種大腸桿菌菌株是一種具有 Δ adhE Δ IdhA Δ iclR Δ ackptaPYC的基因型的菌株。根據一個非常優選的實施方案，這種大 腸桿菌菌株是SBS550MG-pHL413菌株。根據另一個方面，本發明涉及一種生產琥珀酸的方法，該方法包括(i)通過在無氧條件下在CO2存在下的一種大腸桿菌菌株的發酵來生產琥珀酸鎂 的一個步驟，在該步驟的過程中通過向該發酵培養基中加入一種鎂化合物來調節PH，以及(ii)將在步驟(i)中形成的琥珀酸鎂轉化成琥珀酸的一個步驟。“調節pH”和“加入一種化合物”這些表達如以上所定義。根據一個實施方案，步驟(i)的鎂化合物是選自氧化鎂、氫氧化鎂以及碳酸鎂。優 選地，它是氧化鎂(氧化鎂，化學式為MgO)。氧化鎂、氫氧化鎂、或碳酸鎂能夠以粉末的形式或以一種懸浮液的形式、典型地以 一種水性懸浮液的形式(例如，以20%至30%重量/體積的濃度)而加入。根據一個實施方案，步驟⑴是在pH處于6. 0-7.0、優選地6. 4-6. 8、優選地 6. 5-6. 6的范圍內進行的。根據一個實施方案，步驟(i)和/或(ii)是在含有所使用的碳源(典型地是葡萄 糖)的培養基中進行的，并且特別是以10至30g/l的濃度，例如20g/l。根據一個實施方案，步驟(ii)包括一個酸化反應。該酸化反應能夠以不同的方式 來進行。根據一個實施方案，這種酸化反應是通過加入至少一個酸來進行的，這種酸選自正 磷酸、草酸以及硫酸。這些酸能夠以純的形式或以濃縮的水性溶液的形式來加入。根據另一個實施方案，步驟(ii)包括(ii-a)將在步驟(i)中形成的琥珀酸鎂轉化成琥珀酸鈉的一個步驟，以及(ii-b)通過雙極電滲析將在步驟(ii-a)中形成的琥珀酸鈉轉化成琥珀酸的一個步驟。這些步驟以上針對步驟(c-1)和(c-2)進行了說明。根據一個優選的實施方案，這種大腸桿菌菌株是一種具有 Δ adhE Δ IdhA Δ iclR Δ ackptaPYC基因型的菌株。根據一個非常優選的實施方案，這種大腸 桿菌菌株是SBS550MG-pHL413菌株。根據另一個方面，本發明涉及一種用于獲得琥珀酸的方法，該方法包括-一種用于生產琥珀酸和/或琥珀酸根離子的方法，例如選自如以上說明的那些；-一個將這些琥珀酸根離子酸化從而生成琥珀酸的步驟，例如通過向該葡萄汁中 加入一種強酸，-可任選地，一個純化該琥珀酸的步驟；以及-一個結晶該琥珀酸的步驟。根據一個實施方案，在以上說明的所有方法中，該純化步驟包括一個乙醇純化步 驟，它如下進行-這種酸化的葡萄汁的過濾(除去一種蛋白沉淀物)，例如通過一個布氏漏斗和/ 或通過過濾用土 (filtering earth),
-可任選地，通過在真空下蒸發對該濾液的濃縮(優選地，根據在大約2至8之間 的一個濃縮因子)，-乙醇(例如95%的乙醇)以1/1至5/1的比值的加入，從而引起這些鹽的沉淀 (這種琥珀酸仍然是可溶的)，-通過過濾對該鹽沉淀物進行的分離，例如通過一種膜_通過在真空下蒸發對該乙醇進行的回收，-在活性碳上的處理，并接著板框壓濾(platefiltration)，并且通過過濾用土的 過濾o
圖1展示了隨著用于調節pH的該化合物而變的、由無氧發酵來生產的琥珀酸性能 水平。圖2根據是否使用MgO或NaOH來調節pH而比較了生產動力學。圖3表示了一個用于生產琥珀酸的實施方案通過加入碳酸鈉將琥珀酸鎂轉化成 琥珀酸。本發明通過以下示例性的實施方案進行說明，對它沒有限制。
具體實施例方式實例1 根據兩種不同的供給C02的方法通過無氧發酵來生產琥珀酸，其中發酵罐 通氣口是打開或關閉的這種用于生產琥珀酸的方法包括-在錐形瓶中的一個預培養期，-在有氧條件下在一種培養基中(含有玉米漿作為氮源以及葡萄糖作為碳源)的 一個培養期，這一時期允許生物量的產生，以及-允許其本身生產琥珀酸的一個無氧期。在有氧和無氧條件下這些時期是在同一個發酵罐中進行的。所使用的菌株是 SBS550MG-pHL413 菌株。有氧期將SBS550MG-pHL413菌株在37°C下以125rpm搖動在一個錐形瓶中預培養17h。在 一個2升的具有2個隔板的錐形瓶中將該菌株接種到400ml培養基中。這種預培養培養基的組成如下
胰蛋白胨10g/l
酵母提取物5g/l
NaCl10g/l
抗生素
(氨比西林、羧芐西林、苯唑西林)67mg/l
將由此預培養的菌株放置在一個151的發酵下
葡萄糖開始時的2 g/Ι, +當第一個2 g/1被消耗時的2 g/1 玉米漿60 g/1鹽類和抗生素g/1(NH4)2SO40.25K2HPO40.7KH2PO41.2KCl2CaCl20.2MgSO40.25數比西林0.067生物素0.001硫胺素0.001通過在錐形瓶中預培養所得到的接種物代表了在該發酵罐中培養的培養基的總 體積的3%。在有氧期過程中這些培養條件是溫度為37°C、以500rpm攪拌、以Ivvm通氣并且無 PH調節(在對該培養基進行滅菌之前將該PH簡單地調節至7. 5)。無氧期ο使用連續供給CO2的科學實驗方案-將以下各項加入到該培養基中葡萄糖開始時的20g/l，+在24h時的15g/l，+ 在50h時的4g/l-發酵是在pH6.4下進行的，其中以0.3^!11(1/1/1^11)的流速連續注入CO2、發酵 罐通氣口打開，以250rpm進行攪拌。-在63.5h發酵結束，其中在該培養基中琥珀酸的最終滴度是30g/l。-所消耗的CO2 的全部量達到(0. 3vvmX60minX63. 5h/22. 4mol/lX44g/ mol)2245g/l，即形成了 73g/g的琥珀酸。-而且，在發酵結束時在該培養基中存在著濃度為2g/l的HCO3-(對應于1.5g/l的 CO2)。ο根據本發明的科學實驗方案該發酵的科學實驗方案與以上的相同，除了-在無氧期開始時，以0.3vvm的流速將CO2引入到該發酵罐中持續1分鐘從而將 從有氧期中得到的剩余空氣驅除，-將CO2系統的壓力降低到0.4巴，-將發酵罐通氣孔密封關閉從而防止CO2離開，-因此，在整個發酵中CO2的注入被精密地調節到它的消耗量，-當剩余的葡萄糖濃度達到4g/l時將CO2的注入停止，從而消耗了溶解于在培養 基中的剩余的hco3_。根據本發明的結果_在發酵結束時在該培養基中所產生的琥珀酸的終濃度為30g/l，這與連續供給 CO2得到的濃度相同；_在發酵結束時在該培養基中剩余的HC03_濃度為0. 3g/l(它代表了與連續供給
10C02所獲得的濃度相比85%的降低)；-C02的消耗開始時的0. 59g/l，+鍵合到琥珀酸上的6g/l，即0. 2g/g的酸(它代 表了與連續供給C02所獲得的濃度相比99. 7%的降低)。因此，有利的是根據本發明，在維持這種琥珀酸的產率同時避免了大量的二氧化 碳廢物_在一個封閉的反應器中進行工作自然地限制了這種廢物，并且-而且，在發酵結束時在該培養基中觀察到一種剩余的HC03_的濃度降低。然而， 在發酵結束時在該培養基中剩余的hco3-的酸化反應導致co2被放出。實例2 通過用一種無機培養基進行無氧發酵以及用不同的化合物(其中至少一 個是基于鎂的)調節PH來生產琥珀酸所使用的菌株是SBS550MG_pHL413菌株。在無氧條件下在發酵期過程中，使用不同的化合物將pH調節為6. 75:Na0H、NH3、 K0H、Ca0 或 Mg0o該科學實驗方案如下_在錐形瓶中預培養；-在一個發酵罐中傳代培養；-在一個發酵罐中生產2個時期o有氧期產生生物量，o無氧期在C02存在下生產琥珀酸。每一個步驟詳述如下在錐形瓶中預培養 -在37°C下孵育達到小于24h；-搖動125rpm;-體積在一個21的錐形瓶中500ml。在發酵罐中傳代培養
_ 接種物 6%;-37°C，攪拌450rpm，通氣lvvm ；-用5N NaOH 將 pH 調節至 6. 75 ；-持續時間大于20h。在發酵罐中生產2個時期有氧期產生生物量培養基葡萄糖開始時的10g/l，+當第一個10g/l被消耗時的10g/l -痕量元素和維生素相同的傳代培養；_ 接種物 13%;-37°C，攪拌450rpm，通氣lvvm ；-通過加入5NNaOH、對應地28%重量/體積的NH3、對應地5NK0H、對應地20%重 量/體積CaO、對應地20%重量/體積MgO將pH調節至6. 75。無氧期通過提供CO2生產琥珀酸-加入葡萄糖20g/l;-在0. 2vvm 下注入 CO2 ；-37°C，攪拌250rpm ；-通過加入5NNaOH、對應地28%重量/體積的NH3、對應地5NK0H、對應地20%重 量/體積的CaO、對應地20%重量/體積的MgO將pH調節至6. 75。對于每一個科學實驗方案，通過HPLC來測量所生產的琥珀酸的量值。結果示于圖1中，其中在整個短生產期中所獲得的生產率和產率對應于20g/l的葡萄糖的消耗。根據本發明出人意料地并且有利的是，為了在無氧發酵過程中調節pH，使用MgO 產生了最佳的性能水平，其中與使用最為有效的其他堿類(NaOH)所獲得的相比產率高 100%并且生產率以體積計算高2. 5倍。以下表格通過展示使用MgO也生成最佳的生物量產率、以及最低的共生物合成而 完成了該比較。 Sa=琥珀酸生產動力學通過加入MgO并且通過加入NaOH來比較pH的調節圖2比較了在氫氧化鈉或氧化鎂的存在下通過延長生產時所獲得的琥珀酸滴度 方面的變化。該項比較顯示了使用MgO的另一種未預期的優勢在琥珀酸的積聚過程中低程度 地減緩了該動力學。有利的是，與使用NaOH相比，使用MgO使得有可能增加琥珀酸的生產 率和生產速率。此外，使用MgO使得有可能達到大于50g/l的琥珀酸濃度(滴度)。實例3 生產琥珀酸并且在有氧生長期使用一種鎂化合物調節pH所使用的菌株是SBS550MG-pHL413菌株。對于預培養和傳代培養所使用的科學實驗方案與實例2中所說明的相同。對于發酵罐中的生產，根據本發明，在有氧培養期(該菌株進行生長，產生生物 量)使用MgO進行pH調節，而在無氧條件下在琥珀酸鹽生產期使用氫氧化鈉進行pH調節。其他工作條件與實例2的那些相同。通過“MgO然后NaOH”這一表達方式對此進行歸納，它表明使用加入MgO來進行該 有氧培養步驟，之后跟隨使用加入NaOH來進行一個無氧發酵步驟。以下表格比較了在這些pH調節條件下(“MgO然后NaOH”)所獲得的結果與在這 兩個時期中(“MgO然后MgO”或“NaOH然后NaOH”)僅僅使用MgO或僅僅使用NaOH時所獲 得的結果。 Sa=琥珀酸這些結果表明可能的是在生長期過程中通過僅使用MgO調節pH而獲得對在生產 期中性能水平的一種陽性作用。實例4 通過無氧發酵和酸化獲得琥珀酸所使用的菌株是SBS550MG-pHL413菌株。實例2的用于生產琥珀酸的方法(使用 MgO作為pH調節劑)之后跟隨一個通過加入不同酸的酸化反應的步驟-正磷酸通過磷酸鎂三堿式鹽(magnesiumphosphate tribasic)的(高度不溶 解的)的形成和沉淀來純化。在水相中每摩爾琥珀酸加入ImolH3PO4這導致了形成高度可 溶性的磷酸鎂一堿式鹽(magnesium phosphatemonobasic)。-草酸通過高度不溶解的草酸鎂的形成和沉淀來純化。不存在琥珀酸的損失。很 快地獲得了不含其平衡離子的琥珀酸。實例5 通過無氧發酵并且轉化成琥珀酸鈉來獲得琥珀酸所使用的菌株是SBS550MG-pHL413菌株。實例2的用于生產琥珀酸的方法(使用 MgO作為pH調節劑)之后跟隨一個通過碳酸鈉的加入來形成碳酸鎂和琥珀酸鈉的步驟。碳酸鎂(它是不溶解的)發生沉淀。不存在琥珀酸的損失。碳酸鎂可以在高溫下 在烘箱中進行處理，例如在大于700°C的烘箱中。這生成了 MgO和CO2，它們中至少有一個 可以被循環使用。然后，有利的是，可以將碳酸鎂回收。可以通過雙極電解對琥珀酸鈉進行處理，生成氫氧化鈉和琥珀酸，它們是可以結 晶的。氫氧化鈉可以使用之前從高溫烘箱中發出的CO2進行再轉化，從而形成碳酸鈉。所有的步驟示于圖3。實例6 通過無氧發酵、乙醇純化和結晶獲得琥珀酸在實例1中用于生產實琥珀酸的方法(使用NaOH作為pH調節劑)之后跟隨一個 如以下所說明的乙醇純化步驟-將發酵培養基(葡萄汁)離心(5000g，15min,20°C )(消除生物量)，-將95%的硫酸加入到清液中直至獲得pH1. 5，-將該葡萄汁過濾通過一個布氏漏斗，該布氏漏斗具有SeitzEK板和FW20過濾用 土(消除一種蛋白沉淀物)，-通過在真空下蒸發將該濾液濃縮(濃縮因子在大約2至8之間波動)，
14
-加入95%的乙醇，每體積濃縮濾液中具有2體積的乙醇，從而引起鹽類的沉淀 (琥珀酸仍然是可溶的)，-通過過濾通過一個3微米的微孔膜過濾來分離該鹽沉淀物，-通過在真空下蒸發來回收乙醇，-用活性炭進行處理(2%的PureflowC (基于干重)_80°C _1小時)，然后過濾通 過Seitz EK板和FW20過濾用土，-蒸發-結晶(Tp水浴75°C-剩余壓力60mbar-晶態的處理物質(crystalline cooked mass)的干物質為大約50% ),-冷卻該晶態的處理物質，在20°C下攪拌，-通過過濾通過一個3微米的微孔膜將這些晶體分離，-用軟化水使這些晶體澄清，-在真空下在60°C下將這些晶體干燥過夜。
權利要求
通過在無氧條件下的一個大腸桿菌菌株的發酵來生產琥珀酸和/或琥珀酸根離子的一種方法，該方法包括(A)在一個發酵罐中的一個碳源的一個發酵步驟，該步驟是通過提供CO2、使發酵罐的多個通氣孔關閉下進行，這樣CO2的供給是由該菌株消耗的CO2來控制，在該碳源完全耗盡之前隨后進行，(B)不供給CO2的該剩余碳源的一個發酵步驟，從而消耗殘余的CO2。
2.如權利要求1所述的方法，其中在步驟(A)開始時，該發酵培養基是用CO2飽和的。
3.如權利要求1和2之一所述的方法，其中步驟㈧和/或步驟⑶是在pH處于 6. 0-7. 0，優選地6. 4-6. 8的范圍內進行的。
4.如權利要求1至3中任何一項所述的方法，其中該碳源是葡萄糖，并且其中 在步驟(A)開始時，該發酵培養基含有15-40g/l的葡萄糖，并且在步驟(B)開始時，該發酵培養基含有2-6g/l的葡萄糖。
5.如權利要求1至4中任何一項所述的方法，其中該大腸桿菌菌株具有 Δ adhE Δ IdhA Δ iclR Δ ackptaPYC基因型；優選地該大腸桿菌菌株是SBS550MG_pHL413菌株。
6.一種用于獲得琥珀酸的方法，包括一種如權利要求1至5中任何一項所述的用于生產琥珀酸和/或琥珀酸根離子的方法；適當時，將這些琥珀酸根離子酸化以便生成琥珀酸； 一個純化該琥珀酸的步驟，優選是一個乙醇純化步驟；并且 可任選地，一個使該琥珀酸結晶的步驟。
7.一種用于生產琥珀酸的方法，該方法包括(a)在有氧條件下培養一個大腸桿菌菌株的一個步驟，在該步驟的過程中通過向該培 養基中加入一種鎂化合物來調節PH，(b)在無氧條件下在CO2存在下通過使步驟(a)中培養的菌株發酵來生產琥珀酸根離 子的一個步驟，(c)將在步驟(b)中形成的這些琥珀酸根離子轉化成琥珀酸的一個步驟。
8.如權利要求7所述的方法，其中在步驟(a)中該鎂化合物是選自氧化鎂、氫氧化鎂以 及碳酸鎂。
9.如權利要求7和8之一所述的方法，其中，在步驟(b)過程中，pH是通過向該發酵培 養基加入一種選自下組的化合物來調節的，該組的構成為鎂化合物類、鈣化合物類、鉀化 合物類、銨化合物類以及鈉化合物類，以及它們的混合物。
10.如權利要求7至9中任何一項所述的方法，其中步驟(b)是在pH處于6.0-7. 0、優 選6. 4-6.8的范圍內進行的。
11.如權利要求7至10中任何一項所述的方法，其中步驟(c)包括一個酸化反應。
12.如權利要求11所述的方法，其中該酸化反應是通過加入至少一種酸來進行的，這 種酸選自正磷酸、草酸以及硫酸。
13.如權利要求7至12中任何一項所述的方法，其中在步驟(b)的過程中，pH是通過 向該發酵培養基加入選自由鎂化合物類構成的組中的一種化合物來調節的，從而形成琥珀酸鎂，并且步驟(C)包括(c-1)將在步驟(b)中形成的琥珀酸鹽轉化成琥珀酸鈉的一個步驟，以及(c-2)通過雙極電滲析將在步驟(c-1)中形成的琥珀酸鈉轉化成琥珀酸的一個步驟。
14.如權利要求7至13中任何一項所述的方法，其中該大腸桿菌菌株具有 Δ adhE Δ IdhA Δ iclR Δ ackptaPYC基因型；優選地該大腸桿菌菌株是SBS550MG_pHL413菌 株。
15.一種用于獲得琥珀酸的方法，包括一種如權利要求7至14中任何一項所述用于生產琥珀酸的方法； 一個純化該琥珀酸的步驟，優選地是一個乙醇純化步驟；并且 可任選地，一個使該琥珀酸結晶的步驟。
16.一種用于生產琥珀酸的方法，包括(i)通過在無氧條件下在CO2存在下一個大腸桿菌菌株的發酵來生產琥珀酸鎂的一個 步驟，在該步驟的過程中通過向發酵培養基中加入一種鎂化合物來調節PH，并且 ( )將步驟(i)中形成的琥珀酸鎂轉化成琥珀酸的一個步驟。
17.如權利要求16所述的方法，其中在步驟(i)中該鎂化合物是選自氧化鎂、氫氧化鎂 以及碳酸鎂。
18.如權利要求16和17之一所述的方法，其中步驟(i)是在pH處于6.0-7. 0、優選地 6. 4-6.8的范圍內進行的。
19.如權利要求16至18中任何一項所述的方法，其中步驟(ii)包括一個酸化反應。
20.如權利要求19中所述的方法，其中該酸化反應是通過加入至少一種酸來進行的， 這種酸選自正磷酸、草酸以及硫酸。
21.如權利要求16至20中任何一項所述的方法，其中步驟(ii)包括 (ii-a)將在步驟(i)中形成的琥珀酸鎂轉化成琥珀酸鈉的一個步驟，以及(ii-b)通過雙極電滲析將步驟(ii-a)中形成的琥珀酸鈉轉化成琥珀酸的一個步驟。
22.如權利要求16至21中任何一項所述的方法，其中該大腸桿菌菌株具有 Δ adhE Δ IdhA Δ iclR Δ ackptaPYC基因型；優選地該大腸桿菌菌株是SBS550MG_pHL413菌 株。
23.一種用于獲得琥珀酸的方法，包括一種如權利要求16至22中任何一項所述用于生產琥珀酸的方法； 一個將該琥珀酸純化的步驟，優選地是一個乙醇純化步驟；并且 可任選地，一個使該琥珀酸結晶的步驟。
24.用于純化來自一種發酵的葡萄汁的琥珀酸和/或琥珀酸根離子的一種方法，該方 法包括一個通過將硫酸加入該葡萄汁將該琥珀酸離子酸化從而生成琥珀酸的步驟， 一個通過加入乙醇使該琥珀酸純化的步驟；并且 可任選地，一個結晶步驟。
全文摘要
本發明涉及通過在無氧條件下發酵用于生產琥珀酸和/或琥珀酸根離子的方法。
文檔編號C07C51/43GK101896613SQ200880121078
公開日2010年11月24日 申請日期2008年12月15日 優先權日2007年12月13日
發明者勞倫·塞格伊爾哈, 卡羅琳·瓦爾拉莫弗, 奧利弗·卡朗德, 弗雷德里克·德艾 申請人:羅蓋特公司