專利名稱：骨吸收抑制用食品原材料的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有骨吸收抑制作用的乳蛋白質級分或乳蛋白質級分分解物。本發明的乳蛋白質級分或乳蛋白質級分分解物具有骨吸收抑制作用，因而作為以 骨疾病的預防或治療、骨強化等為目的的骨吸收抑制劑以及作為用于骨疾病的預防或治療 或者抑制骨吸收的藥品、飲食品和飼料的有效成分非常有用。
背景技術：
近年來，伴隨著高齡化，骨質疏松癥、骨折、腰痛等各種骨疾病具有增加的傾向。在 骨組織中，不斷進行著骨生成和骨吸收，在年輕時骨生成和骨吸收保持著良好的平衡，但隨 著年齡的增長，由于各種原因該平衡傾向于骨吸收(解偶聯)。并且，長時間持續該狀態的 話會使得骨組織變脆，導致發生骨質疏松癥、骨折、腰痛等各種骨疾病。認為如果能夠防止 該解偶聯，則能夠預防骨質疏松癥、骨折、腰痛等各種骨疾病。以往，作為防止解偶聯、預防或治療各種骨疾病的方法，曾進行了以下方法(1) 食物補鈣，(2)輕微運動，(3)日光浴，(4)藥物治療等。對于食物補鈣，使用碳酸鈣、磷酸鈣 等鈣鹽以及蛋殼、魚骨粉等天然鈣制劑。然而，它們未必能稱作適合經口攝取的原材料。對 于輕微運動而言，認為慢跑或散步等較佳，但體弱的情況下即便是輕微的運動也非常麻煩， 而且臥床的老人更是幾乎無法運動。從補充活化維生素D3的觀點來看，日光浴是很好的， 但僅靠日光浴是不夠的。藥物投與中使用Ia-羥基維生素D3、降鈣素制劑等，已知其對骨 質疏松癥的治療是有效的。然而，這些物質本身是藥品，不能作為食品原材料使用。本發明人等為了獲得能夠作為食品原材料使用的具有骨強化作用的物質，對存在 于乳中的骨強化因子進行了持續的探索。結果發現，從乳清蛋白質的水溶性級分除去了乳 清來源的鹽而得的蛋白質和肽混合物具有骨強化作用(例如，參照專利文獻1)。并且，發現 對該蛋白質和肽混合物的水溶液進行乙醇處理、加熱處理、加鹽處理、超濾膜處理而得的級 分具有促進成骨細胞增殖的作用和骨強化作用(例如，參照專利文獻2、3)。另外，發現存在 于乳中的堿性蛋白質具有促進成骨細胞增殖的作用、骨強化作用和防止骨吸收的作用(例 如，參照專利文獻4)。專利文獻1 日本專利3160862號公報專利文獻2 日本專利3092874號公報專利文獻3 日本特開平5-320066號公報專利文獻4 日本專利3112637號公報
發明內容
發明要解決的問題本發明發現了一種能夠作為食品原材料使用的、具有骨吸收抑制作用的乳蛋白質 級分或乳蛋白質級分分解物，其課題在于提供一種含有該具有骨吸收抑制作用的乳蛋白質 級分或乳蛋白質級分分解物的骨吸收抑制劑，以及提供配合有具有骨吸收抑制作用的乳蛋白質級分或乳蛋白質級分分解物的藥品、飲食品和飼料。用于解決問題的方案本發明人等嘗試對新的骨吸收抑制原材料進行探索，結果發現獲得了與以往的食品原材料相比顯示出更強的骨吸收抑制作用的級分。并且，基于這些見解，以致獲得了含有 該具有骨吸收抑制作用的乳蛋白質級分或乳蛋白質級分分解物的骨吸收抑制劑、以及配合 有具有骨吸收抑制作用的乳蛋白質級分或乳蛋白質級分分解物的藥品、飲食品和飼料。本發明為包含下述方案的發明。(A)涉及一種具有以下特性的乳蛋白質級分(1)其為乳來源；(2)其為含有在十二烷基磺酸鈉_聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中分子量在 12，000 16，000道爾頓范圍內的蛋白質的級分；(3)構成氨基酸的組成中含有18 20重量％的堿性氨基酸、且堿性氨基酸/酸性 氨基酸的比在0.7 0.9的范圍內；(4)具有骨吸收抑制作用。(B) 一種乳蛋白質級分分解物，其通過用蛋白酶將前述乳蛋白質級分分解而獲得。(C) 一種骨吸收抑制劑，其含有(A)所述的乳蛋白質級分或(B)所述的乳蛋白質級 分分解物。(D) 一種骨吸收抑制用藥品，其配合有(A)所述的乳蛋白質級分或(B)所述的乳蛋 白質級分分解物。(E) 一種骨吸收抑制用飲食品，其配合有(A)所述的乳蛋白質級分或(B)所述的乳 蛋白質級分分解物。(F) 一種骨吸收抑制用飼料，其配合有㈧所述的乳蛋白質級分或⑶所述的乳蛋 白質級分分解物。發明的效果本發明的以具有骨吸收抑制作用的乳蛋白質級分或乳蛋白質級分分解物為有效 成分的骨吸收抑制劑、以及配合有具有骨吸收抑制作用的乳蛋白質級分或乳蛋白質級分分 解物的藥品、飲食品和飼料，通過經口攝取，可在體內抑制骨吸收。因此，本發明的以乳蛋白 質級分為有效成分的骨吸收抑制劑、以及配合有具有骨吸收抑制作用的乳蛋白質級分的藥 品、飲食品和飼料，由于可在人或動物的生物體內抑制骨吸收，因而具有骨強化作用，且對 于抑制骨質疏松癥等骨量減少有效。
圖1所示為測定尿中骨吸收標志即脫氧吡啶啉(de0Xypyridin0line，DPD)量的尿 中總量和肌酸酐所對應的DPD濃度的結果的圖(試驗例2)。
具體實施例方式本發明涉及以具有骨吸收抑制作用的乳蛋白質級分或乳蛋白質級分分解物為有 效成分的骨吸收抑制劑、以及配合有具有骨吸收抑制作用的乳蛋白質級分或乳蛋白質級分 分解物的藥品、飲食品和飼料。
本發明的這種乳蛋白質級分例如能夠通過如下方式獲得使脫脂乳或乳清等乳原 料與陽離子交換樹脂接觸，用0. 3M的食鹽溶液清洗后，用0. 6M的食鹽洗脫液使吸附于該 樹脂上的乳蛋白質洗脫從而獲得。另外，作為鹽類，除了食鹽以外可以使用鉀鹽、銨鹽、磷 酸鹽、醋酸鹽、碳酸鹽等，通過將清洗液的離子強度適當調整為0. 3 0. 4、將洗脫溶液的離 子強度適當調整為0. 55 0. 65，能夠獲得本發明的乳蛋白質級分。另外，還可以通過將該 洗脫級分回收，利用反滲透(RO)膜或電滲析(ED)法等進行脫鹽和濃縮，并根據需要進行 干燥來獲得。作為反滲透(RO)膜，可以例示Desal-3 (Desalination公司制)、HR-95 (Dow Danmark公司制)、NTR-729HF(日東電工公司制)等。另外，電滲析(ED)裝置可以例示Yuasa Ionics Inc.或日本煉水公司制的電滲析裝置。另外，作為獲得乳來源的微量蛋白質級分的方法，已知有如下方法在使乳或乳來 源的原料與陽離子交換體接觸后，用PH超過5、且離子強度超過0. 5的洗脫液使吸附于該 陽離子交換體上的堿性蛋白質級分洗脫，從而獲得乳來源的微量蛋白質級分的方法〔日本 特開平5-202098號公報〕；使用海藻酸凝膠而獲得的方法〔日本特開昭61-246198號公報〕； 使用無機多孔性顆粒從乳清中獲得的方法〔日本特開平1-86839號公報〕；使用硫酸化酯化 合物從乳中獲得的方法〔日本特開昭63-255300號公報〕等。本發明中，以這樣的方法可以 獲得乳來源的蛋白質級分。這樣回收的乳蛋白質級分通常可以通過冷凍干燥等粉末化后使用。本發明中使用的具有骨吸收抑制作用的乳蛋白質級分優選其構成氨基酸的組成中含有18 20重量％的堿性氨基酸、且堿性氨基酸/酸性氨基酸的比在0. 7 0. 9的 范圍內。若在該范圍之外的話，無法發揮本申請發明的效果。另外，本發明品為以分子量 12，000 16，000道爾頓、等電點10以上的蛋白質為主要成分的蛋白質混合物。乳蛋白質級分分解物具有與乳蛋白質級分同樣的氨基酸組成，例如，可以通過使 胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等蛋白酶作用于通過上述方法獲得的乳蛋白質級分，進 而根據需要用胰酶等蛋白酶作用，從而能夠獲得平均分子量在4，000以下的分解物。另外， 乳蛋白質級分分解物通常可以通過冷凍干燥等粉末化后使用。作為成為具有骨吸收抑制作用的乳蛋白質級分的供給源的乳或乳來源的原料，可 以使用牛乳、人乳、山羊乳、羊乳等乳，可以直接使用這些乳，或者也可以使用這些乳的還元 乳、脫脂乳、乳清等。在投與本發明的骨吸收抑制劑時，可以將作為有效成分的具有骨吸收抑制作用的 乳蛋白質級分或乳蛋白質級分分解物以其原本的狀態使用，也可以根據常規方法制劑為粉 末劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、飲用劑等而使用。此外，還可以將這些乳蛋白質級分或乳蛋白 質級分分解物直接或者制劑化后，將其配合到營養劑或飲食品等中，從而謀求抑制骨吸收。 另外，本發明的乳蛋白質級分或乳蛋白質級分分解物對于熱比較穩定，因而還能夠在通常 進行的加熱殺菌條件下加熱殺菌。本發明中，為了發揮骨吸收抑制作用，可以考慮體重、性別和年齡等而適當確定配 合量，通常在成人的情況下，可以將本發明品即乳蛋白質級分或乳蛋白質級分分解物的配 合量等調整為每天攝取1 50mg。這樣，本發明品在低用量下也具有效果。通過經口攝取 將本發明的具有骨吸收抑制作用的成分制成骨吸收抑制劑、或者配合有其的藥品、飲食品 和飼料，從而發揮骨吸收抑制作用。
以下，示出參考例、實施例和試驗例來詳細說明本發明，但它們僅僅例示出本發明 的實施方式，本發明并不受這些例子的任何限制。[參考例1]
根據以下方法(參照日本專利第3112637號)，調制可確認骨強化效果的市售乳蛋 白質級分。用去離子水充分清洗填充有0. 5升作為陽離子交換樹脂的磺化Chitopearl (富士 紡績制)的直徑IOcm的柱。以流速lOOml/min使50升未殺菌脫脂乳通過該柱后，用去離 子水充分清洗該柱，使含有0. 95M氯化鈉的0. 05M磷酸緩沖液(ρΗ7. 0) 2. 5升通過該柱從而 使吸附于樹脂上的蛋白質洗脫。然后，通過反滲透(RO)膜處理對該洗脫液脫鹽、濃縮后，進 行冷凍干燥，獲得粉末狀的乳蛋白質級分。重復該操作2次，獲得104g的蛋白質級分。該 蛋白質級分的等電點為7. O 8. 5，該蛋白質級分中所含的堿性氨基酸為17. 8%。實施例1用去離子水充分清洗填充有0. 5升作為陽離子交換樹脂的磺化Chitopearl (富 士紡績制)的直徑IOcm的柱。以流速lOOml/min使50升未殺菌脫脂乳通過該柱后，用含 有0. 3M氯化鈉的0.05M磷酸緩沖液(pH7.0)充分清洗該柱，然后，使含有0. 55M氯化鈉的 0.05M磷酸緩沖液(pH7. 0)2. 5升通過該柱從而使吸附于樹脂上的蛋白質洗脫。然后，通過 反滲透(RO)膜處理對該洗脫液脫鹽、濃縮后，進行冷凍干燥，獲得粉末狀的乳蛋白質級分。 進行5次該操作，獲得37. 4g的乳蛋白質級分。該級分的分子量為12，OOO 16，OOO道爾 頓，等電點為10以上，該乳蛋白質級分中所含的構成氨基酸中，堿性氨基酸為18 20%。 另外，堿性氨基酸/酸性氨基酸的比為0. 7 0. 9。實施例2用去離子水充分清洗填充有0. 5升作為陽離子交換樹脂的磺化Chitopearl (富士 紡績制)的直徑IOcm的柱。以流速lOOml/min使50升未殺菌脫脂乳通過該柱后，用含有 0. 4M氯化鈉的0. 05M磷酸緩沖液(ρΗ7. 0)充分清洗該柱，使含有0. 65M氯化鈉的0. 05M磷 酸緩沖液(PH7. 0)2. 5升通過該柱從而使吸附于樹脂上的蛋白質洗脫。然后，通過反滲透 (RO)膜處理對該洗脫液脫鹽、濃縮后，進行冷凍干燥，獲得粉末狀的乳蛋白質級分。進行3 次該操作，獲得22. Sg的乳蛋白質級分。該級分的分子量為12，OOO 16，OOO道爾頓，等電 點為10以上，該乳蛋白質級分中所含的構成氨基酸中，堿性氨基酸為18 20%。另外，堿 性氨基酸/酸性氨基酸的比為0. 7 0. 9。實施例3將實施例1中得到的乳蛋白質級分37. 4g溶解于10升蒸餾水中后，以2%的濃度 添加胃蛋白酶(關東化學制)，在37°C下邊攪拌1小時邊進行水解。接著，用氫氧化鈉溶液 中和至PH6.8后，添加胰酶(Sigma公司制)，在37°C下反應2小時。反應后，在80°C下 加熱處理10分鐘而使酶失活，然后獲得乳蛋白質級分分解物36. 2g。實施例4將實施例2中得到的乳蛋白質級分22. 8g溶解于8升蒸餾水中后，以2%的濃度添 加胰蛋白酶(關東化學制)，在37°C下邊攪拌1小時邊進行水解。接著，用氫氧化鈉溶液中 和至PH6.6后，添加胰酶(Sigma公司制)，在37°C下反應2小時。反應后，在80°C下加 熱處理10分鐘而使酶失活，然后獲得乳蛋白質級分分解物21. lg。
[試驗例1]關于參考例1和實施例1中得到的各乳蛋白質級分，按照高田等的方法[Takada， Y. et al.，Bone and Mineral, vol. 17，pp. 347-359，1992]對骨吸收抑制作用進行了研究。 將出生后10 20天的ICR系小鼠的長骨摘出，除去軟組織后，將骨在含5%胎牛血清的 α -MEM溶液中機械性粉碎，得到包含破骨細胞的全部骨髓細胞。將該細胞通過含5%胎牛 血清的α-MEM溶液在象牙片上點出約2Χ IO6個細胞。數小時后，加入添加了試驗試樣的 含5%牛胎血清的α-MEM溶液，培養5天，研究存活的破骨細胞的骨吸收活性。另外，骨吸 收的評價通過如下方式來進行，即培養后，剝離象牙片上的細胞，用蘇木精染色，通過圖像 解析來測定骨吸收窩的面積。以試樣空白作為對照，以對照的骨吸收窩的面積為100%時的 各試樣的面積％來表示骨吸收活性。其結果如表1所示。
表 1 可確認與對照組和參考例1中得到的乳蛋白質級分相比，本發明的乳蛋白質級 分(實施例1)具有顯著的骨吸收抑制作用。[試驗例2]關于參考例1和實施例1中得到的各乳蛋白質級分，通過動物實驗研究了骨吸收 抑制作用。動物實驗中使用了 6周齡的Wistar系雌性大鼠。在1周的預備飼育后，實施卵 巢摘除手術，然后以低鈣飼料(鈣含量0.3% )飼育5周，處于恢復期間，然后，供于動物實 驗。另外，摘除了卵巢、并以低鈣飼料(AIN-76baSe)飼育了 5周的大鼠明顯處于骨質疏松 癥的狀態。將產生了該骨質疏松癥狀態的大鼠以1組8只分別分配到下述3個試驗組未 添加乳蛋白質級分的對照組(A組)、添加了 0. 1重量％的參考例1中得到的乳蛋白質級分 的投與組(B組)、添加了 0.1重量％的實施例1中得到的乳蛋白質級分的投與組(C組)， 分別用表2所示的試驗飼料飼育4個月。另外，用酪蛋白調整各試驗飼料的氮含量，使其具 有相同的氮含量(17. 06% )0表 2 對于飼育了 4個月的大鼠，在最后的1周，用代謝籠回收尿，用 osteolinks "DPD"(Sumitomo Seiyaku Biomedical Co. ,Ltd.制造)測定尿中存在的骨吸 收標志即脫氧吡啶啉(DPD)量(尿中總量)。此外，當用每天的排泄量不依賴于尿量的肌酸 酐量來修正上述DPD濃度時，能夠算出作為不依賴于尿量的骨吸收標志的更準確的DPD量。 這里，尿中的肌酸酐濃度用Creatinine-testWako (和光純藥工業公司制造)進行測定，通 過算出肌酸酐對應的DPD濃度而進行了修正。投與4個月后的尿中骨吸收標志即脫氧吡啶 啉(DPD)的尿中總量和肌酸酐對應的DPD濃度的測定結果，如圖1所示。由此可知，在1周 的DPD總量和肌酸酐修正后的DPD濃度的任一者方面，與對照組(A組未添加乳蛋白質級 分)相比，參考例1中得到的乳蛋白質級分投與組(B組)、實施例1中得到的乳蛋白質級分 投與組(C組)均表現出較低的值。雖然參考例1中得到的乳蛋白質也確認出具有骨吸收 抑制效果，但本發明品的該作用明顯更強。另外，雖然沒有示出實驗結果，但在使用了實施例3和實施例4中得到的乳蛋白質 級分分解物的情況下也確認到了同樣的效果。實施例5在IOOmg實施例1中得到的乳蛋白質級分中添加93. 4g水合晶體葡萄糖、5g碳酸 鈣、Ig糖酯、0. 5g香料，混和，然后壓片制成片狀，制造本發明的骨吸收抑制劑。實施例6以表3所示的組成混合各成分并制成生面團，成形后進行烘焙，制造骨吸收抑制 用餅干。
表 3_小麥粉50. 0 (重量％ )砂糖20. 0食鹽0. 5人造黃油12. 5蛋12. 1水4. 0碳酸氫鈉0. 1碳酸氫銨0. 2碳酸鈣0. 5乳蛋白質級分粉末(實施例1) 0. 1_實施例7制造表4所示的組成的骨吸收抑制用果汁飲料。表 4_混合異構化糖15. 0 (重量％ )果汁10. 0檸檬酸0. 5乳蛋白質級分粉末(實施例1) 0. 5香料0. 1 丐0. 1/K73.8_實施例8根據表5所示的配方混合原料，制造骨吸收抑制用狗飼育飼料。表 5_乳蛋白質級分粉末(實施例1) 2. 5(重量％ )脫脂乳粉13. 5豆餅12. 0豆油4. 0玉米油2. 0棕櫚油27. 0玉米淀粉14. 0小麥粉9.0麩皮2.0維生素混 合物9.0
礦物質混合物2.0纖維素3.0_實施例9以表6所示的組成混合各成分，加壓成形，調制配合有實施例3中得到的乳蛋白質級分分解物的骨吸收抑制用片劑。表 6_水合晶體葡萄糖59.4(重量％)乳蛋白質級分分解物(實施例3)16. 0玉米淀粉12.0纖維素4.0玉米油4.0維生素混合物(含膽堿)1. 0礦物質混合物3.6_實施例10以表7所示的組成混合各成分，在乳化溫度85°C下乳化，調制配合有實施例4中得 到的乳蛋白質級分分解物的骨吸收抑制用加工乳酪。表 7_高達干酪43.0(重量％)切達干酪43.0檸檬酸鈉2.0乳蛋白質級分分解物(實施例4) 0. 5乳來源的鈣1.0/K10. 5_產業上的可利用性本發明的乳蛋白質級分或乳蛋白質級分分解物由于具有骨吸收抑制作用，而且對 于抑制骨質疏松癥等骨量減少有效，因此，能夠制成以具有骨吸收抑制作用的乳蛋白質級 分或乳蛋白質級分分解物為有效成分的骨吸收抑制劑、以及配合有具有骨吸收抑制作用的 乳蛋白質級分或乳蛋白質級分分解物的骨吸收抑制用藥品、飲食品和飼料使用。
權利要求
一種乳蛋白質級分，其具有以下(1)～(4)的特性(1)其為乳來源；(2)其為含有在十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中分子量在12,000～16,000道爾頓范圍內的蛋白質的級分；(3)構成氨基酸的組成中含有18～20重量％的堿性氨基酸、且堿性氨基酸/酸性氨基酸的比在0.7～0.9的范圍內；(4)具有骨吸收抑制作用。
2.一種乳蛋白質級分分解物，其通過用蛋白酶將權利要求1所述的乳蛋白質級分分解 而獲得。
3.一種骨吸收抑制劑，其含有權利要求1所述的乳蛋白質級分或權利要求2所述的乳 蛋白質級分分解物。
4.一種骨吸收抑制用藥品，其配合有權利要求1所述的乳蛋白質級分或權利要求2所 述的乳蛋白質級分分解物。
5.一種骨吸收抑制用飲食品，其配合有權利要求1所述的乳蛋白質級分或權利要求2 所述的乳蛋白質級分分解物。
6.一種骨吸收抑制用飼料，其配合有權利要求1所述的乳蛋白質級分或權利要求2所 述的乳蛋白質級分分解物。
全文摘要
本發明的具有以下(1)～(4)特性的乳蛋白質級分，其骨吸收抑制作用優異、在骨疾病的預防或治療中非常有用。(1)其為乳來源。(2)其為含有分子量在12,000～16,000道爾頓范圍內的蛋白質的級分。(3)構成氨基酸的組成中含有18～20重量％的堿性氨基酸、且堿性氨基酸/酸性氨基酸的比在0.7～0.9的范圍內。(4)具有骨吸收抑制作用。
文檔編號C07K14/47GK101868475SQ200880114098
公開日2010年10月20日 申請日期2008年10月28日 優先權日2007年11月1日
發明者上辻大輔, 小野愛子, 日暮聰志, 松山博昭, 森田如一, 芹澤篤 申請人:雪印乳業株式會社