保護性皮膚護理四肽的制作方法

專利名稱：保護性皮膚護理四肽的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有生物活性和治療活性的肽。具體而言，本發明涉及抑制皮膚中炎 性過程的四肽。這樣的四肽部分地通過減少響應紫外線(UV)暴露由皮膚上皮細胞和成纖 維細胞表達的白細胞介素(IL)-6和基質金屬蛋白酶(MMP)-l的量，來發揮該效果。本發 明進一步涉及使用這些四肽來治療影響皮膚和相關的粘膜表面的多種損傷(insult)的方法。
背景技術：
過度暴露于陽光是形成急性炎癥的重要的病原學因素，急性炎癥的特征為紅斑 和水腫。這類炎癥的長期結果包括加速的皮膚老化和較高的機會形成皮膚癌。已經顯示 由于急性暴露于紫外輻射導致的皮膚炎癥的特征為釋放包括神經肽、組胺、前列腺素、血清 素和氧自由基在內的多種因子，以及上調促炎細胞因子例如IL-1、IL-6和腫瘤壞死因子 a (TNF-a)。皮膚上皮細胞和角質形成細胞在UV暴露后在皮膚中通過產生數種上述因子 而在所觀察到的炎性過程中起重要作用。UV誘導炎癥的長期效應消極地改變皮膚功能。遭受數次炎癥急性發作的皮膚中創 傷愈合過程時間延遲，并可能不完美(例如增大的瘢痕)。而且，過度暴露的皮膚也更易于 起皺、干燥、變薄、松弛和更易于碰傷。導致這些不良作用的皮膚中的炎性過程是復雜的并 且可能包括數個途徑。紫外線由UVA和UVB射線組成。UVB是急性炎癥以及非黑素瘤皮膚癌的公 知原因。UVB-介導的表皮炎癥由促炎細胞因子例如IL-1、IL-6、IL-8和TNF-a指揮 (orchestrated)。因為UVB射線穿透表皮，所以細胞因子誘導可在角質形成細胞以及存在 于真皮上部中的成纖維細胞和內皮細胞中發生。然而，間質起源的這后兩種細胞類型也可 以從直接UV暴露以一些間接方式誘導成炎性狀態。響應UV刺激上皮細胞和角質形成細胞 表達的因子(即介體(mediator))可以給成纖維細胞和內皮細胞發信號以上調炎性途徑。 IL-6是一種這樣的介體。上皮細胞和成纖維細胞中細胞因子例如IL-6的誘導對加速皮膚光老化具有重要 作用，皮膚光老化通過起皺和松弛以及其他征候顯示自己。這些作用主要地由成纖維細胞 響應 IL-6信號表達的過量MMP-1 的刺激介導(Fagot et al. Arch Dermatol Res. 293 :576， 2002 ；Fagot et al. Photochem Photobiol. 79 :499，2004)。MMP-1 過量表達可以通過降解 細胞外基質(ECM)蛋白例如包含在皮膚結締組織中的膠原蛋白，明顯地改變皮膚結構完整 性。此外，ECM分解提高免疫細胞到UV暴露位置的募集 這增加的細胞活動是急性癥狀例 如紅斑和水腫，以及慢性癥狀例如皮膚硬化的主要原因，所述皮膚硬化是由于過量纖維蛋 白沉積引起的。考慮到響應UV暴露對皮膚 生理的這些深遠的不良作用，IL-6和MMP-1代表用于控制皮膚光老化的重要的分子標靶。控制光老化的一個方法是局部施用已知抑制一種或更多種信號通路的蛋白質，所 述信號通路在UV暴露后表現改變的活性。然而，大多數使用這類策略的嘗試沒有實現臨床 顯著的結果，這部分是由于與完整蛋白質或其大的片段的應用相關的困難。該失敗潛在的 一個問題涉及低效遞送蛋白質穿過表皮；大多數應用的蛋白質保持遠離負責開始光老化途 徑的細胞。其他的缺點涉及在施用后大的蛋白質的高度不穩定性和差的保留。除了這些固 有的消極特征以外，這些療法的發展也受到與制備大的蛋白質相關的復雜性和高成本的困 擾。因此，目前正在尋找較便宜和更有效的制劑。短生物活性肽代表治療和預防皮膚光老化的潛在有用的手段。除了較便宜和容易 生產和操作的直接利益之外，短肽也更好地被皮膚吸收和保持。對于預防皮膚光老化，期望 能抑制皮膚炎性過程的短肽(例如四肽)。盡管其他人先前已經檢測四肽對皮膚的作用，但是很少已經示出抑制皮膚中已知 由紫外輻射上調的炎性過程。例如1^11訪吐(美國專利號6，974，799)使用某些四肽-三肽 混合物聲稱反轉皮膚中的老化信號；然而，該混合物僅僅示出上調ECM生產，這是一種不能 預測預防陽光的有害作用的方法。以類似的風格，Sandberg等(美國專利號6，962，904) 教導應用彈性蛋白源的四肽來修復皮膚中的結締組織。Bissett等表明具體的四肽(美 國專利號6，284，802)可用于治療起皺；該應用的唯一基礎是從堿性成纖維細胞生長因子 (bFGF)的氨基酸序列衍生肽。同樣地，這些肽不能預期發揮抗炎活性，因為已知bFGF在 免疫細胞募集中起積極作用(Zittermann and Issekutz Am J Pathol. 168 :835，2006)。 Dussourd等(美國專利號6，211，155)描述的刺激表皮細胞增殖的四肽也不能預期抑制UV 誘導的炎癥。在另一方面，本發明提供下調皮膚中UV誘導的炎癥的四肽，因此，其發揮作用 以預防或處理光老化的主要病因學。

發明內容
本發明涉及包括脯氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸-X(P-Q-E-X)作為其氨基酸序列的 分離的肽，其中X是賴氨酸⑷或異亮氨酸⑴殘基。因此，四肽SEQ ID N0:14(PQEK)和 SEQ ID N0:15(PQEI)是本發明提供的分離的肽的實例。盡管本發明肽的氨基酸序列由上 述PQEX序列組成，但是肽可以包含除特異性序列以外的其他的特征。例如，本發明的具體 實施方式涉及酰胺化、脂化或與載體分子輟合的肽。本發明肽的其他實施方式包括至少一 個D-對映體形式的氨基酸殘基或至少一個在鄰近氨基酸殘基之間存在的非肽鍵。本發明更具體的實施方式包括具有SEQ ID NO :1(PQEK-NH2)和SEQ ID NO: 2(PQEI-NH2)給出的氨基酸序列的四肽。因此，這些肽構成具有如上所述的PQEX序列的肽 的修飾形式的實例。除了羧基端處的酰胺化之外，SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2給出的四 肽可以具有其他修飾。本發明也提供包含至少一種具有氨基酸序列PQEX的上述四肽連同藥學上可接受 載體的組合物。該組合物中的肽的濃度可以為大約0. 1 u g/mL到大約50y g/mL或大約 0. 1 U g/mL到大約20 u g/mL。本發明組合物的優選實施方式可以為氣溶膠、乳劑、液體、洗 液、霜劑、糊劑、膏劑、粉末或泡沫。該組合物的其他的優選實施方式包含至少一種具有SEQ IDN0:1、2、14或15給出的氨基酸序列的四肽。本發明的組合物可以包含多種形式的PQEX四肽，例如本文描述的那些。蛋白酶抑制劑可以包含在所有上述組合物中。本發明也涉及使用上述本發明的肽和藥物組合物的某些方法。特別地，本發明包 括治療哺乳動物中炎癥的方法，所述方法包括將治療有效量的本發明的組合物/肽施用到 炎癥部位持續一段有效量的時間的步驟。伴隨或源自擦破、水泡、燒傷、劃破、潰瘍、撞傷、皮 疹和瘢痕的炎癥適于用本發明的方法治療。本發明方法的優選實施方式使用至少一種上述 的肽，例如SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2，其濃度范圍從大約0. 1 u g/mL到大約50 u g/mL 或從大約0. 1 u g/mL到大約20 u g/mL。本發明方法的某些實施方式涉及治療在皮膚或相關組織中例如口腔內發生的炎 癥。本發明方法的的另一個實施方式涉及治療由于暴露于紫外線(UV)輻射而發生的皮膚 炎癥(例如曬斑)。例如，SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2給出的四肽可用于該優選實施方 式。本發明也涉及抑制細胞表達IL-6和/或MMP-1的方法。該方法包括將細胞暴露 于上文所述的肽的步驟。這樣暴露于肽導致這些炎性介體的一種或兩種的細胞表達減少。 暴露步驟可以通過將細胞與肽接觸進行，其可以伴隨簡單的溫育手段。可以單獨或組合用 于該方法的肽優選為 SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO :2。在本 方法的具體的實施方式中，IL-6或MMP-1的細胞表達是將細胞暴露于紫外輻射例如UVA和 /或UVB射線的結果。然而，本方法也適用于控制由于任何其他的炎癥相關的事件例如創傷 或燒傷而發生的IL-6和/或MMP-1的細胞表達。該方法的優選實施方式涉及源自皮膚的 細胞(例如原代細胞或無限增殖細胞，體外或先體外后體內)或以其他方式存在于皮膚中 的細胞(即體內)；這樣的細胞可以是皮膚上皮細胞、角質形成細胞和皮膚成纖維細胞。可 以使用任何類型的上皮細胞或成纖維細胞應用本方法的其他的實施方式。附圖描述

圖1示出UVB暴露后24小時，某些四肽(40 u g/mL)對人上皮細胞IL-6表達的作 用。“Ml"表示未照射對照細胞培養物(沒有肽處理)，并因此示出皮膚上皮細胞的基礎 IL-6表達水平。“UVB"表示照射對照細胞培養物(沒有肽處理)，并因此示出UVB暴露后 在上皮細胞中誘導的IL-6的水平。參考實施例3。圖2示出兩種不同濃度(10禾口 20 ii g/mL)的四肽P1422 (SEQ ID NO 1)和 P1423(SEQ ID NO :2)對用UVB處理的皮膚上皮細胞中IL-6誘導的作用。“對照〃表示 UVB-照射但是沒有接受肽的細胞。參考實施例3。圖 3 示出 10ii g/mL 的四肽 P1422(SEQ ID NO 1) (A)和 P1423(SEQ IDN0 2) (B)對 用UVB處理的角質形成細胞中IL-6誘導的作用。“對照"表示UVB照射的但是沒有接受 肽的細胞。“0D450"表示通過ELISA測量的相對的IL-6表達。參考實施例4。圖 4 示出 10ii g/mL 的四肽 P1422(SEQ ID NO 1) (A)和 P1423(SEQ IDN0 2) (B)對 用UVA處理的皮膚成纖維細胞中MMP-1誘導的作用。每種培養物產生的MMP-1的相對量使 用ELISA-產生的0D450吸收值測定。“對照"表示UVA照射的但是沒有接受肽的細胞。參 考實施例5。圖 5 示出 10ii g/mL 的四肽 P1422(SEQ ID NO 1) (A)和 P1423(SEQ IDN0 2) (B)對 根據用UVB處理的角質形成細胞調節的介質處理的皮膚成纖維細胞中MMP-1誘導的作用。 使用ELISA-產生的0D450吸收值測定每種培養物產生的MMP-1的相對量。“對照”表示在根據UVB照射的角質形成細胞調節的介質中溫育，但是沒有接受肽的細胞。參考實施例5。發明詳述本發明的肽是具有氨基酸序列脯氨酸_谷氨酰胺_谷氨酸-X(P-Q-E-X)的四肽， 其中X可以是賴氨酸⑷或異亮氨酸(I)。因此。本發明提供四肽PQEK(SEQ ID NO 14) 和 PQEI(SEQ ID N0:15)。SEQ ID N0:14 禾口 SEQID NO : 15 的非限定性實例分別是 SEQ ID N0:1和SEQ ID NO :2;后面的四肽在其各自的羧基端被酰胺化。僅僅作為參考的目的，發 明肽中的氨基酸殘基的三字母密碼是Pro (脯氨酸，P)、Gin (谷氨酰胺，Q)、Glu (谷氨酸 (glutamate)或谷氨酸(glutamic acid)，E)、Lys (賴氨酸，K)和 lie (異亮氨酸，I)。上述四肽引出的生物活性是抑制UV暴露部位處的皮膚炎癥。該活性部分地通過 肽對皮膚上皮細胞和成纖維細胞的IL-6分泌的負作用實現(參考實施例)。在該環境中 IL-6分泌是由于紫外輻射對這些細胞的作用。上述四肽對炎癥的抑制性活性進一步部分由 于其對成纖維細胞中MMP-1表達的負作用。考慮到本發明的四肽PQEK (SEQ ID NO 14)和 PQEI (SEQ ID NO 15)抑制 IL-6 產 生的能力，技術人員將意識到這些肽另外可用于治療由于UV暴露以外損傷引起的皮膚損 傷形式。此外，應該承認本發明的肽可用于治療粘膜組織的創傷。IL-6通過傷口部位處角 質形成細胞和成纖維細胞釋放，并且發信號用于免疫細胞滲入，這是可以實際上惡化愈合 和引起瘢痕的過程。在這種情況下通過運用本發明的肽進行IL-6表達的控制將改善這些 消極的傷口愈合過程。列出這些生物活性以對本發明的肽就如何在治療上應用提供指導； 然而，本發明不被以任何方式受限于肽功能的這些具體模式。肽本發明的四肽[例如PQEK (SEQ ID NO 14)禾口 PQEI (SEQ ID NO 15)]的每一個可 以包含L-或D-氨基酸對映體，也包含一種對映體形式或兩種形式組合的殘基。肽可進一步 增長或修飾，如下列非限定性實例中描述的，只要它們的一級氨基酸序列沒有改變；以這種 方式，肽由某種氨基酸序列組成，但是可包含某些修飾。肽的羧基端可以是酸性的(-C00H) 或酰胺化的(例如，-CONH2、-CONHR或-C0NR2)。相比于游離酸形式，羧基端酰胺化可使本 發明的肽對蛋白酶降解較不敏感，并增加它們的可溶性，因此提供增加的治療效力。為羧基 酰胺化的本發明的肽實例是SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2。肽也可以被脂化(lipidated)， 其可提供增強的皮膚穿透。一個或更多個連接每個肽的氨基酸的分子鍵可以是非肽鍵。這 樣的非肽鍵包括但不限于亞氨基、酯胼(ester hydrazine)、縮氨基脲(semicarbazoide) 和偶氮鍵。根據以上所述的肽的其他的實例是包含具有進一步修飾的SEQ N0:1和SEQ ID NO 2的那些(注意，SEQ ID N0 :1和2都已經羧基酰胺化)。可對本發明的四肽進行多種修飾，只要保持其一級氨基酸序列。可以使用一些修 飾增加肽效力，而其他的修飾可促進肽處理。典型的可以被修飾的肽功能基團包括羥基、氨 基、胍鹽、羧基和酰胺基團。這些基團的典型非限定性反應包括下列通過鹵代烷乙酰化羥 基；羧基的酯化、酰胺化或氫化(即還原為醇)；氨基(例如肽的伯胺基團或賴氨酸殘基的 氨基)的脫酰胺、酰化、烷化、芳基化。肽可以與可溶的或不可溶的載體分子輟合以按需要修該它們的可溶性性質，并增 加靶組織中的肽的局部濃度。可溶的載體分子的實例包括聚乙二醇(PEG)和聚乙烯吡咯烷 酮的聚合物；不可溶的聚合物的實例包括硅酸酯、聚苯乙烯和纖維素。肽也可以被微囊密封以在治療應用期間和之后增強它們的穩定性；一般地，使用聚酯和PEG微球體封裝和穩定 該肽。可以使用制備用于肽封裝的微球體的多種方法，這取決于待被封裝的肽組合物的 親水性或疏水性。這類方法的方案的實例見于Wang等(J. Control. Release 17:23,1991) 和美國專利號4，324，683，這兩者都通過引用以其全部并入本文。可以進行體外肽釋放研究 以確定并入微球體之后肽的相對可利用性。將微球體(200mg)懸浮于2. 5mL磷酸緩沖鹽水 中(PBS，pH 7.2)并在 37°C、100rpm 的環境培養箱搖動器(G-24, NewBrunswick Scientific Co. , Edison, N. J.)中攪動。在特定的采樣時間(前4天每天，和其后每隔一天)，完全地移 出緩沖溶液并用新鮮的PBS替換。使用Bradford方法或其他的通常用于蛋白質分析的適 當的定量分析測量PBS的肽內含物。提供下列過程和參數，其僅僅作為指導目的，并且是本領域普通技術人員所公知 的。所有公開的肽可以在Advanced ChemTech Apex 396Multiple Peptide Synthesizer± 使用標準Fmoc(9-芴甲氧羰基)固相化學合成。Apex 396裝備有40孔反應塊，以0. 15mmol 的規格同時產生多至40個肽。可以使用標準的氨基酸，制備肽作為酰胺化序列或游離酸序 列。首先洗滌樹脂，并用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)預膨脹。對Rink酰胺樹脂，膨脹時間為1 小時。用DMF中的25%哌啶移除Fmoc保護基25分鐘，在這之后，從樹脂完全洗出哌啶。為 了控制外消旋化過程，以0. 5MDMF中等摩爾的1-羥基-苯并三唑(HOBt)或1-羥基-7-氮 雜-苯并三唑(HOAt)溶液預活化Fmoc氨基酸單體。使用0-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1， 1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU) PyBop 或2- (1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基 脲六氟磷酸酯(HBTU)作為活化劑和在使用受阻堿(二異丙基乙胺)的堿性條件下2. 5-5. 0 倍摩爾過量的氨基酸，進行酰胺連接。該連接時間是1-1. 5小時，然后洗滌并再結合以在生 長肽鏈脫保護和繼續之前完成兩倍或三倍的連接。使用標準的Kaiser試驗監控連接效率。 在樹脂上完成肽合成之后，如上移除最后的Fmoc基團，并且留下序列作為游離堿形式。肽與樹脂的酸-不穩定連接的切割使用95%三氟乙酸(TFA)和水以及適當加入的 凈化劑完成。在使切割進行大約30分鐘到1小時后，立刻從切割區段移出釋放的肽并將其 轉移至管中，以在減壓下除去TFA。然后，準備通過高效液相色譜法(HPLC)，使用反相C18 柱和質譜，對肽進行純化和分析。使用LC/MS/MS系統(ABI API2000)完成一級序列證實和 制備純化。通常對于上述方案，可以使用本領域普通技術人員已知的任何方法可以產生肽， 例如在 Merrifield(J Am Chem Soc. 85 :2149，1963) ；Carpinoet al. (J Org Chem. 51 3732,1986) ；Merrifield et al. (Anal Chem. 38 :1905，1966)；或Kent et al. [High Yield Chemical Synthesis Of Biologically ActivePeptides On An Automated Peptide Synthesizer Of Novel Design, IN:PEPTIDES 1984(Ragnarsson, ed. )Almqvist and ffiksell Int.，Stockholm (Sweden)，pp. 185-188]中公開的那些方法，所有這些通過參考以 其全部并入本文。優選地，肽通過能將氨基酸連續加入生長肽鏈的機械產生。然而，肽也可 以使用標準溶液相方法制造，所述標準溶液相方法可用于大規模生產計劃。本發明可以包含一種或更多種蛋白酶抑制劑。可以選擇蛋白酶抑制劑以特異性地 靶向期望降解所選擇生物活性肽的蛋白酶；這樣的選擇基于生物活性肽的長度和/或序列 而確定。然而，蛋白酶抑制劑不必須以任何特異的方式選擇；例如包含兩種或更多的抑制劑的蛋白酶抑制劑混合物可用于本發明。對于本發明的某些實施方式，蛋白酶抑制劑不是特 異性抑制病毒的抑制劑。下列類型的蛋白酶抑制劑可以并入本發明絲氨酸蛋白酶抑制劑、 半胱氨酸蛋白酶抑制劑、天冬氨酸蛋白酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、巰基蛋白酶抑制劑和 蘇氨酸蛋白酶抑制劑。蛋白酶抑制劑是本領域公知的。可以并入本發明的蛋白酶抑制劑的非限定性實 例包括乙酰基-胃蛋白酶抑制劑、AEBSF(4-[2-氨乙基]苯磺酰氟)鹽酸鹽、ALLM(N-乙酰 基-Leu-Leu-Met)、ALLN(N-乙酰基-Leu-Leu-Nle-CHO)、抑氨肽酶肽(鏈霉菌屬)、￡ _ 氨 基-n-己酸、氨肽酶N抑制劑、a工-抗胰凝乳蛋白酶、抗痛素(antipain)(鹽酸鹽或二鹽酸 鹽)、a 2-抗纖溶酶、抗凝血酶III、a 1-抗胰蛋白酶、p-APMSF鹽酸鹽、抑肽酶(例如，來自 牛肺)、ATBI (11-殘基肽)、芐脒鹽酸鹽、苯丁抑制素、苯丁抑制素甲酯、鈣蛋白酶抑制蛋白、 calpeptin (鈣蛋白酶抑制劑)、羧肽酶抑制劑、胱天蛋白酶抑制劑、組織蛋白酶B抑制劑11、 組織蛋白酶G抑制劑I、組織蛋白酶抑制劑II、組織蛋白酶抑制劑III、組織蛋白酶抑制劑 I、組織蛋白酶K抑制劑I、組織蛋白酶K抑制劑11、組織蛋白酶K抑制劑III、組織蛋白酶L 抑制劑I、組織蛋白酶L抑制劑II、組織蛋白酶L抑制劑IV、組織蛋白酶L抑制劑V、組織蛋 白酶L抑制劑VI、組織蛋白酶S抑制劑、組織蛋白酶/枯草桿菌蛋白酶抑制劑、胰凝乳蛋白 酶抑制劑、胰凝乳蛋白酶抑制劑I、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、1，5-丹酰-glu-gly-arg-氯甲 基酮二鹽酸鹽、3，4_二氯異香豆素、異丙基氟磷酸、二肽基肽酶II抑制劑、二肽基肽酶IV抑 制劑I、二肽基肽酶IV抑制劑II、E-64蛋白酶抑制劑、大腸桿菌素(ecotin)、EDTA 二鈉鹽 二水合物、EDTA四鈉鹽、EGTA、彈性蛋白酶抑制劑I、彈性蛋白酶抑制劑II、彈性蛋白酶抑制 劑III、彈性酶抑制劑、6-脒基-2-萘基-4-胍基苯甲酸酯二甲烷磺酸鹽、glu-gly-arg-氯 甲基酮、2-胍基乙基巰基琥珀酸、六癸基磺酰氯、a-碘乙酰胺、激肽原、leuhistin、亮肽 素半硫酸鹽、a 2"巨球蛋白、DL-2-巰甲基-3-胍基乙基硫代丙酸、胃蛋白酶抑制劑A、苯 甲磺酰氟、膦酰二肽二鈉鹽、PPack II三氟醋酸鹽、PPack 二鹽酸鹽、脯氨酰內肽酶抑制 劑II、Na-甲苯磺酰-lys-氯甲基酮鹽酸鹽、Na-甲苯磺酰-phe_氯甲基酮、三肽基肽酶 II抑制劑、胰蛋白酶抑制劑(來自玉米或大豆)、D-Val-phe-lyS-氯甲基酮二鹽酸鹽、1， 3_ 二-(N-羧基苯甲酰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰)氨基丙酮、0-二氮雜菲、熊果酸(例如 迷迭香提出物)、凝血酸(4_[氨甲基]環己烷-1-羧酸)(臨床市場在美國為止血壞酸 (Cyklokapron)，在亞洲為氨甲環酸(Transamin))、Fmoc_Lys (Boc)、Fmoc_Arg (Pmc)、苯甲酰 基-Arg-硝基苯胺(1^廿031^11(16)、苯甲酰基-4『8-萘胺(naphthylamide)和a-2-巨球 蛋白(macroglobuline)。用于本發明的蛋白酶抑制劑可以是肽或蛋白質，例如酶。這樣的抑制劑的非限 定性實例是絲氨酸蛋白酶抑制劑，其包括a-1-抗胰蛋白酶、補體1-抑制劑、抗凝血酶、 a-1-抗胰凝乳蛋白酶、纖溶酶原激活物抑制劑1和神經絲抑蛋白。典型地并入皮膚護理制劑的組分是本領域公知的。除了生物活性肽組分，本發明 可以包含其他的活化劑，例如煙酰胺、植烷三醇、法呢醇、沒藥醇和水楊酸。預期某些另外的 活化劑將與生物活性肽組分協同作用，或者將增加該制劑的儲存期限。在組合物與動物或人皮膚接觸的位置，應該選擇適合于應用到角質組織的另外 的組分(即，穩定、低毒、低變應原性的)。CTFA化妝品成分手冊第二版(CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, SecondEdition) (1992)—其通過引用以其全部并入本文，描述在
8皮膚護理產業中通常使用的、適合應用于本發明的組合物中的多種非限定性美容劑和藥物 成分。這些成分的實例包括磨料、吸附劑、美容組分例如香精、色料、顏料/著色劑、精油、 皮膚感覺劑(skin sensates)、收斂劑等(例如丁香油、薄荷醇、樟腦、桉葉油、丁子香酚、 薄荷基乳酸鹽、北美金縷梅蒸餾物)、抗痤瘡劑(例如間苯二酚、硫、水楊酸、過氧化苯酰、 紅霉素、鋅)、抗結塊劑、消泡劑、抗微生物劑(例如丁基氨基甲酸碘代丙酯(iodopropyl butylcarbamate)、抗氧化劑、粘合劑、生物添加劑、緩沖劑、填充劑、螯合劑、化學添加劑、變 性劑、外用鎮痛藥、聚合物(例如二十烯和乙烯基吡咯烷酮的共聚物)、不透明劑、PH調節 劑、推進劑、還原劑、多價螯合劑、皮膚漂白和光亮劑(例如對苯二酚、曲酸、抗壞血酸、抗壞 血酸基磷酸鎂、抗壞血酸基葡糖胺)、皮膚調節劑(例如，保濕劑，包括混合的和封閉的)、皮 膚舒緩劑和/或皮膚愈合劑(例如泛醇和衍生物[例如乙基泛醇]、蘆薈、泛酸和其衍生物、 尿囊素、沒藥醇、甘草酸二鉀)、增稠劑、微粒材料、結構劑和維生素。這些劑的許多在美國專 利號6，492，326中詳細描述，其通過引用以其全部并入本文，特別是關于各種成分的描述。本發明的組合物可包含顆粒材料，優選地為金屬氧化物。這些顆粒可以是包被的 或未包被的、帶電荷的或不帶電荷的。可用于制備本發明的顆粒材料的非限定性實例包括 氯化氧鉍、氧化鐵、云母、硫酸鋇和Ti02處理的云母、硅石、尼龍、聚乙烯、滑石、苯乙烯、聚丙 烯、乙烯/丙烯酸共聚物、絹云母、氧化鋁、有機硅樹脂、硫酸鋇、碳酸鈣、醋酸纖維素、二氧 化鈦、聚甲基丙烯酸甲酯、和它們的混合物。無機顆粒材料例如Ti02、Zn0(氧化鋅)或&02 是從許多來源商業上可獲得的。優選地，顆粒材料以按重量計0.01%到2%的水平、更優選 地以按重量計0. 05%到1.5%的水平或進一步更優選的按重量計從0. 到的水平存 在于組合物中(所有測量為近似值)。本發明的組合物可包含選自保濕劑、增濕劑或皮膚調節劑的調節劑。可以使用這 些物質的許多種，并且每種物質可以以按組合物重量計0.01%到20%、更優選地0. 到 10%和進一步更優選地0.5%到7%的水平存在(所有劑量為近似值)。這些物質包括但不 限于胍；尿素；羥基乙酸和羥乙酸鹽(例如銨和季烷基銨)；水楊酸；乳酸和乳酸鹽(例如 銨和季烷基銨)；任何種類形式的蘆薈(例如蘆薈膠)；多羥基醇例如山梨糖醇、甘露糖醇、 木糖醇、赤蘚醇、甘油、己三醇、丁三醇、丙二醇、丁二醇和己二醇；聚乙二醇；糖(例如蜜二 糖)和淀粉；糖和淀粉衍生物(例如，烷氧化的葡萄糖、果糖、葡糖胺)；透明質酸；乳酰胺單 乙醇胺；乙酰胺單乙醇胺；泛醇；尿囊素；石油膏和它們的混合物。本發明的組合物可以包含結構劑(structuring agent)，其對于制備水包油型乳 劑是優選的。沒有被任何理論所限定，應該相信結構劑輔助給組合物提供流變特性，其有助 于組合物的穩定性。例如結構劑傾向于參與液晶凝膠網絡結構的形成。結構劑也可作為乳 化劑或表面活性劑起作用。該發明的優選的組合物包含按組合物重量計0. 到20%、更 優選地0. 到10%、進一步更優選地0.5%到9%的一種或更多種結構劑(所有測量為近 似值)。包括在本發明的優選的結構劑選自硬脂酸、棕櫚酸、硬脂醇、鯨蠟醇、山崳醇、具有 平均大約1到大約5個環氧乙烷單位的硬脂醇的聚乙二醇醚、具有平均大約1到大約5個環 氧乙烷單位的鯨蠟醇的聚乙二醇醚和它們的混合物。本發明更優選的結構劑選自硬脂醇、 鯨蠟醇、山崳醇、具有平均大約2個環氧乙烷單位的硬脂醇的聚乙二醇醚(硬脂醇聚醚_2)、 具有平均大約2個環氧乙烷單位的鯨蠟醇的聚乙二醇醚和它們的混合物。
應用方法本發明的另外的實施方式涉及應用以上描述的肽的方法，例如在制劑中或作為治 療劑。這些方法可包括應用單一肽或更多種肽組合。本發明的肽可用于治療和預防過度暴露于UV射線對皮膚的損害。同時，肽可用于 治療皮膚(表皮、真皮和皮下組織(hypodermis))和相關的粘膜組織的創傷。本發明肽對 于這些狀況的有益(salutary)作用部分涉及它們的抗炎性質。如在本文使用的，術語“相 關的粘膜組織”涉及以與皮膚相似的方式組織并包括上皮細胞的任何組織。這樣的組織的 實例是口、鼻咽、耳和泌尿生殖器的表面，以及眼睛的瞼結膜。相關的粘膜組織的其他實例 包括消化道全部的襯(lining) (S卩，內腔)，所述消化道包括食道、胃、小腸、大腸(結腸)和 直腸。這些后面的實例可以維持創傷/損傷非常像可以影響皮膚的那些，并且同樣地可以 用本發明靶向。可以影響這些組織并適合本發明的肽治療的創傷/損壞/損傷的實例是擦 破、水泡、燒傷、劃破、戳穿、潰瘍、撞傷、皮疹和瘢痕。術后組織創傷也可用該肽治療。盡管 炎癥幫助抵御在損傷部位的感染，但是提供良好的殺菌實踐消除了與使用本發明的肽阻斷 炎癥相關的任何缺點。本發明的肽也可用于預防或反轉老化對所有上述組織的影響。以相關的方式，肽 可以被用于暴露于多種外部因素例如陽光而受損的組織。與老化和暴露相關的皮膚虛弱無 力(skin debilitation)的實例是皮膚起皺、干燥、變薄、松弛和更易于碰傷。本發明也可 用作美容劑，在這點上使皮膚表現更年輕的外觀和質地，并且提供更好的功能。使用本發明的肽有效治療的其他的組織問題與過敏癥或自身免疫性相關，這兩者 都具有炎性成分。這樣的病包括皮炎、牛皮癬、硬皮病、天皰瘡和炎性腸病。在上述療法方法中用于遞送肽的組合物可以為氣溶膠、乳劑、液體、洗液、霜劑、糊 劑、膏劑、粉末、泡沫或其他的藥學上可接受的制劑形式。此外，肽可以使用較少包含的制 劑例如去離子水/蒸餾水、PBS或標準生理鹽水溶液遞送。一般而言，藥學上可接受的制劑 包括適合在人皮膚或粘膜表面上使用的任何載體。這樣的藥學上可接受的載體包括乙醇、 二甲亞砜、甘油、硅石、氧化鋁、淀粉和等同的載體和稀釋劑。任選地，制劑可具有美容呼吁 (cosmetic appeal)，和/或包括其他的試劑例如類視黃醇或其他的可以作為本發明肽的治 療作用的佐劑的肽。抗生素也可加到制劑中，以便抵御感染，從而發生最佳治愈過程。在組 合物中肽的濃度可以為大約0. 1 u g/mL到大約50 u g/mL或大約0. 1 u g/mL到大約20 u g/ mL;然而，使用的最終濃度可以在這些范圍外變化，這取決于傷口 /組織狀況的性質、本發 明肽的生物活性和獲得組合物吸收增加的何佐劑或技術的應用。這樣的確定在本領域普通 技術范圍內。可對人和動物進行本發明的肽和相關的組合物的施用，所述動物包括所有的哺乳 動物(例如，豬、牛、馬、綿羊、山羊、小鼠、大鼠、貓、狗、雪貂)。也可組合典型的材料和/或 實驗材料例如組織移植物、組織培養品、氧和敷料進行應用。一般而言，可以將組合物局部、 經口、經皮、全身或通過本領域普通技術人員已知的任何其他方法施用，以用于將本發明的 肽遞送到炎癥部位。也可在體外或以先體外后體內(exvivo)的方式將組合物例如應用到 在培養物中生長的細胞或患者移植物中。由于它們較小的尺寸，預期該肽能單獨地獲得一定程度的通過皮膚的滲透性；然 而，可以使用某些技術來增強該移動。例如，可將親脂(非極性)基團加入到該肽中，或者
10該肽可以在親脂賦形劑中遞送到皮膚，以便增強肽到達角質層以允許易位到下表皮層。以 這種方式，這樣的親脂修飾可被考慮為具有前藥效果。滲透增強劑例如已知的溶劑和表面 活性劑可用于賦形劑中以更好地肽吸收。預期可用于增強肽到達靶組織/損傷的具體技術 包括離子電滲療法、電泳和超聲。離子電滲療法的裝置由浸于電解質溶液中和置于皮膚上 的兩個電極組成。當運用電流通過電極時，跨越角質層產生驅動肽遞送的電場。電穿孔法 包括應用高壓電脈沖以增加滲透通過脂雙層膜。這在電流應用的持續時間和強度方面，不 同于離子電滲療法(離子電滲療法使用相對固定低壓電場)。相信電穿孔法的高壓電脈沖 在脂薄膜(lipid lamellae membranes)中誘導親水孔的可逆形成，這能提供高度的透過增 強。超聲將具有大于16kHz頻率的聲波應用到皮膚，這引起聲波通過的組織壓縮和膨脹。所 形成的壓力變化引起可增加肽透過的多種作用(例如，成穴、混合、溫度增加)。
本發明肽的其他特征、生產方式和應用例如在美國專利號6，974，799和 5，492，894中描述。這兩篇專利通過引用以其全部并入本文。引入下列實施例來顯示本發明的某些優選實施方式。
實施例開發本發明的目標是鑒定能下調炎性過程例如紫外輻射引出的那些炎性過程的、 小于500道爾頓的肽。小分子量的這類經鑒定肽將確保它們穿透皮膚上層的能力。從現有 技術推斷的下列理解部分地指導本發明的發展。1.紫外輻射引起導致細胞因子產生和后續誘導有助于皮膚光老化的成分的 炎癥。后面過程的某些標志是由于膠原蛋白分解導致的起皺、由于過度的角質形成細 胞增殖和纖維蛋白沉積導致的皮膚變厚、和由于黑色素超量生產導致的色素沉著過多 (hyper-pigmentation)。啟動UV誘導炎癥的因子是細胞因子，例如IL-1、IL-6、IL-8和 TNF- a。2.已經鑒定某些肽序列能抑制TRAF6(TNF受體-相關因子_6)與寬范圍的免疫 調控蛋白的結合，所述免疫調控蛋白包括人⑶40、Trance和IRAK(IL-1受體-相關激酶)。 這些TRAF6-相關的結合事件從TNF、IL-1和toll-樣受體家族蛋白傳遞刺激至NF_k B， 其是細胞免疫應答的中心調節子(regulator)。抑制這些TRAF6結合事件的肽具有通式 Pro-X-Glu-X-X-(芳香族/酸性氨基酸)[PXQXX-(芳香族/酸性)](SEQ IDN0 16)并且位 于數種TRAF6-相互作用蛋白內。3.因為幾個理由，含有序列PXQXX_(芳香族/酸性)的肽(SEQ ID NO 16)不能 用于對抗光老化。一個理由為，該肽必須并入融合蛋白內以發揮其抑制作用；這類大的蛋白 質不能有效地溶解跨過上皮層以達到炎性反應部位。同樣，在實踐水平上，具有抑制肽序列 的融合肽對于局部用產品的內含物來說太大并且太昂貴。4. NF-KB信號傳導通路是直接涉及促炎細胞因子調控和應力應答的主要的通路。 已經表明皮膚細胞暴露于多種NF-k B活化劑——包括TNF-a、脂多糖和紫外光——導致 抑制蛋白質I k B的磷酸化和降解。釋放的NF-K B隨后易位進入細胞核，在此調節細胞因 子表達。5.多種類型的膠原蛋白有助于細胞外基質包含在機體不同的結締組織中。這些不 同的膠原蛋白由成纖維細胞、其他的結締組織細胞和促炎細胞因子IL-1和TNF誘導的炎性細胞產生的特異性MMP所降解。明顯地相應炎性刺激釋放的IL-1、IL-6、TNF- a和干擾素 (IFN- a和IFN-y)是MMP潛在的誘導物。盡管MMP分泌的調節依賴于細胞類型和刺激，但 是已經顯示轉錄因子AP-1與在成纖維細胞中上調MMP-1直接相關。在體外和體內也已經 示出AP-1活性和隨后的皮膚中MMP表達通過紫外輻射誘導。基于這些理解，斷定盡管僅僅示出PXQXX-(芳香族/酸性)(SEQ IDN0 16)肽抑制 非-UV-誘導的炎性過程，但是可以設計能抑制UV-誘導的炎癥的相關序列，而不需要并入 融合蛋白內(即，該肽為短肽)。下面實施例1-5涉及該主題。實施例6涉及包含生物活性 肽的組合物中蛋白酶抑制劑的一般應用。實施例1 設計和合成與PXQXX-(芳香族/酸性)(SEQ ID NO 16}肽相關的肽。設計本發明肽的合理原則包括下列參數1.肽的長度為僅僅四個氨基酸(即小于500道爾頓的四肽)。2.從TRAF6-結合蛋白的保守結合結構域[PXQXX-(芳香族/酸性)](SEQ ID NO 16)選擇序列。3.四肽序列在PXQXX_(芳香族/酸性)(SEQ ID NO 16)的位置1保守為脯氨酸 并且在PXQXX-(芳香族/酸性)(SEQ ID NO 16)的位置3保守為谷氨酸。4.指定位置2和4為在天然發生的PXQXX_(芳香族/酸性)(SEQ IDN0 16)的形 式中這些位點處存在的氨基酸殘基a.位置 2 :Q、T、L、G、E、V 或 P ；b 位置 4 :I、M、D、V、N、S 或 T。5.為了產生另外的變化，也在位置4應用帶正電荷的殘基；這樣的氨基酸安排在 自然中是避免的。肽合成所有的肽使用標準Fmoc化學在Advanced ChemTech (Louisville, KY) Apex 396 Multiple Peptide Synthesizer上合成。首先洗滌Rink酰胺樹脂，并用DMF預 膨脹。用DMF中25%哌啶除去Fmoc保護基，在這之后，洗滌樹脂以除去痕量的哌啶。Fmoc 氨基酸單體在DMF中等摩爾的(0.5M)H0At或HOBt溶液中預活化。在使用阻礙堿(二異丙 基乙胺)的堿性條件下，使用HATU、PyBop或HBTU和2. 5到5倍摩爾過量的氨基酸進行酰 胺化連接。使用標準Kaiser試驗監控連接效率。肽從酸不穩定連接的切割使用95%三氟乙酸和水以及適當加入的凈化劑完成。在 從切割嵌段移出后，經由HPLC，使用反相C18柱和質譜，對這些肽進行純化和分析。使用LC/ MS/MS系統(ABI API2000)完成一級序列證實和制備純化。制備的肽的序列在表1中提供。
實施例2 細胞培養物和IL-6和MMP-1的檢測。人皮膚上皮細胞(ATCC CRL-2592)、角質形成細胞(ATCC CRL-2404)和皮膚成纖 維細胞(ATCC CRL-7481)用于本研究。將細胞接種于6孔平板中，并使其在被調節以包含 1. 5g/L碳酸氫鈉并補充有10%胎牛血清(FBS)的Dulbecco修改的Eagle培養基(DMEM ； 4mM L-谷氨酰胺，4.5g/L葡萄糖)中培養至> 95%匯合。對于角質形成細胞，細胞在補充 有5ng/mL的人重組上皮生長因子(EGF ；Invitrogen, Grand Island, NY)的角質形成細胞 生長培養基(沒有血清)中生長。在細胞單層達到>95%匯合時，細胞被在沒有血清的完 全培養基中血清饑餓或EGF饑餓24小時。使用照射波長分別設置在365或302nm的UVLMS 燈(4W型，3UV組件；Upland，CA)產生UVA或UVB。UV燈被置于組織培養板上方15cm處。 UV處理之前，組織培養基被替換為PBS，此之后，將細胞置于UVB燈(450 u ff/cm2,使用輻射 計測量)下35秒(上皮細胞和成纖維細胞)或25秒(角質形成細胞)。對于成纖維細胞 進行UVA處理(5001!1/(^2)30秒。在UV處理后，立即用包含或不包含指定濃度的肽的完全 培養基(無血清或EGF)替換PBS，并且在37°C、5%的C02下溫育平板15-24小時。然后，收 集細胞培養基，并在15000rpm下離心2分鐘以除去細胞碎片。分別使用人IL_6 (DIACL0NE， Stamford, CT)和 MMP-1 (Calbiochem，San Diego, CA)ELISA 試劑盒，根據制造商的指示，測 量培養基中IL-6和MMP-1水平。這些測量作為響應UV暴露的細胞炎性活性的指示。實施例3 篩選抗炎活性的肽在人皮膚上皮細胞中抑制UV-誘導的IL-6表達。如在圖1中所述，人上皮細胞響應UVB輻射上調IL-6表達。在表1中列出的所有 四肽以40 yg/mL進行篩選檢測對該響應的有效下調(數據未示出)。在第一個實驗中下調 IL-6表達的那些肽在第二個實驗中再次檢測，其結果在圖1中示出。在皮膚上皮細胞中，40iig/mL 的四肽 P1422(SEQ ID NO 1)和 P1423(SEQ ID NO: 2)都示出對UVB-誘導的IL-6表達的可再現的抑制。如在圖2中所示，這種下調對于這兩種 肽都是濃度依賴性的。10和20 u g/mL的P1422 (SEQ ID NO 1)分別減少IL-6水平的19% 和 25%;而 10 和 20ii g/mL 的 P1423(SEQ ID NO :2)分別減少 IL-6 水平的 10%和 20%。當細胞用除了 P1422(SEQ ID N0:1)和P1423(SEQ ID NO 2)以外的其他四肽處理時沒有觀察 到對IL-6表達的抑制作用，這一事實暗示新的抗炎活性在于特異性序列例如SEQ ID NO 14 和 SEQ ID NO :15。實施例4 篩選抗炎活性的肽在人皮膚角質形成細胞和成纖維細胞中抑制UV-誘 導的IL-6表達。公知地，UV-照射的表皮角質形成細胞和成纖維細胞釋放促炎細胞因子。因 此，除了皮膚上皮細胞外，這些細胞可有助于導致弱化光老化作用的級聯事件(cascade ofevents)。出于這些原因，檢測P1422(SEQ IDN0 :1)和P1423 (SEQ ID NO :2)對這些細胞類 型中UV-誘導的IL-6表達的抑制活性。如在圖3(A和B)中所示，這兩種四肽下調UVB-處 理的人角質形成細胞中IL-6的表達。這樣的肽-介導的IL-6下調在暴露于UVB后的人成纖維細胞中也是明顯的。 P1423(SEQ ID NO :2)_介導的IL-6表達的抑制是劑量依賴性的，因為與對照細胞IL-6產生 (沒有肽處理，數據沒有示出)相比，2、5和10 y g/mL的肽分別減少IL-6水平24%、30%和 48%。在成纖維細胞中，與對照細胞IL-6產生相比，10iig/mL的P1422(SEQ ID NO :1)減 少UV-刺激的IL-6表達30% ；然而，當運用低濃度的肽時，沒有觀察到顯著的IL-6減少。實施例5 篩選抗炎活性的肽在人皮膚成纖維細胞中抑制UV-誘導的MMP-1表 達。UV(UVA和UVB)輻射增加成纖維細胞中MMP-1表達和活性。響應UV暴露在人皮 膚中產生的大多數MMP源自定居(resident)成纖維細胞。因為MMP產生有助于皮膚中的 UV誘導的炎性反應(例如水腫)和其慢性效應(例如起皺)，抑制成纖維細胞MMP-1表達 將緩解陽光對皮膚的不良效果。懷著這個目的，進行實驗以確定四肽P1422(SEQ ID NO 1)和P1423 (SEQ ID NO: 2)對成纖維細胞中UV-誘導的MMP-1表達的作用。在UVA處理(500 u ff/cm2) 45秒后，用或 不用這些肽處理成纖維細胞。10ii g/mL的P1422(SEQ ID NO 1)和P1423 (SEQ ID NO 2) 都能下調UVA-誘導的MMP-1表達，如在圖4 (A和B)中所示的。Fagot等(2002、2004)已經示出UVB-刺激的角質形成細胞產生的細胞因子引起皮 膚成纖維細胞中MMP-1的旁分泌上調。通過在培養基一根據UVB處理的角質形成細胞調 節的一中溫育成纖維細胞，實驗模擬這種信號傳導方式。盡管MMP-1在以這樣處理的成纖 維細胞培養物中被上調，但是用四肽P1422(SEQ ID N0:1)或P1423(SEQ ID NO 2)培養的 那些表現出小得多的MMP-1誘導(圖5A和5B)。總之，這些研究表明基于TRAF6-結合結構域的某些四肽能夠下調紫外輻射誘導 的IL-6和MMP-1的水平。這些發現是令人驚奇的，因為紫外輻射誘導的這些炎性通路先前 不知道包括TRAF6-相關的信號傳導事件。這些短肽抑制的這兩種主要的炎癥介質(IL-6) 和效應物(MMP-1)顯示它們適用于預防和治療皮膚炎癥和其有害作用。^MM 6 甸.括蛋白Sfefflffel丨齊I丨的本發日月的實施方式本發明也涉及含有蛋白酶抑制劑和生物活性肽組合的皮膚護理制劑。預期這樣的 組合物對皮膚和其他上皮表面(例如粘膜表面)表現美容和治療活性。絲氨酸蛋白酶抑制 劑是本發明的實例成分。使用含有生物活性肽和蛋白酶抑制劑的組合物以實現皮膚治療和 美容改變的方法是本發明的另一方面。
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多種肽成分用于美容和皮膚護理行業以將一系列生物活性遞送到皮膚上和皮膚 內(表2)。已經很好地證明皮膚的外層一角質層(SC)，包含一系列能降解蛋白質和肽的 蛋白酶。當應用于皮膚時某些肽的生物活性在SC中發揮。因此，位于SC中的蛋白酶構成 實現包含生物活性肽的局部皮膚應用的充分治療和/或美容益處的障礙(barrier)。SC包括至少三個蛋白酶家族絲氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶。絲氨酸蛋 白酶(SP)包括表皮特異性蛋白酶激肽釋放酶_5 (也稱為SC胰蛋白酶，SCTE) (Brattsand and Egelrud，1999)和激肽釋放酶_7 (也稱為SC胰凝乳蛋白酶(chymotryptic enzyme)) (Hansson et al，1994)。這兩種激肽釋放酶都已知涉及脫皮過程(即皮膚脫落)。已在皮 膚中分離的另外的絲氨酸蛋白酶是纖維蛋白溶酶和尿激酶(Voegeli et al，2007)。SC巰 基蛋白酶(SCTP)和組織蛋白酶D分別是存在于SC中的半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶 (Bernard et al,2003 ；Horikoshi et al，1998)。SC的生物物理學特性和生物學特性的季節性變化被充分地證明。特別地，與慣常 遮蓋的皮膚相比，已證明冬季更嚴重地影響暴露的皮膚。而且，當缺乏抵抗力時，例如在干 燥皮膚條件下，面部SC顯示包含增加水平的促炎細胞因子和蛋白酶。Voegeli等(2007)通 過分析健康白種人對象在冬季和夏季期間連續膠帶剝離(consecutive tape stripping), 檢驗在面頰和前臂的SC的不同層中主要絲氨酸蛋白酶活性(激肽釋放酶_5、激肽釋放 酶-7、尿激酶、纖維蛋白溶酶和類胰蛋白酶樣酶)的分布。與在前臂SC中觀察的活性水平 相比，臉上的纖維蛋白溶酶、尿激酶和類胰蛋白酶的活性水平是大約5到8倍，而面頰上激 肽釋放酶_5和激肽釋放酶_7的活性水平是大約2到4倍。因此，與暴露于環境的那些區域 相比，保護的皮膚區域示出較少的蛋白酶活性，這可能指示在暴露的皮膚中的亞臨床炎癥。 Voegeli等(2007)也進行了下列理解(i)在正常健康的前臂皮膚中，外部SC顯示比在其 更深層中具有更大的絲氨酸蛋白酶活性；(ii)與前臂相比，尿激酶樣和纖維蛋白溶酶樣活 性在從面頰的SC剝離上升高，這證實纖維蛋白溶酶的原級聯活化；和(iii)SC中類胰蛋白 酶樣活性在來自面頰的樣品中也升高，這可能指示肥大細胞涉及屏障缺乏抵抗力皮膚和/ 或角質形成細胞合成新的類胰蛋白酶樣酶。因為在源自臨床上正常面頰的皮膚的SC中觀 察到尿激酶、纖維蛋白溶酶、激肽釋放酶_5、激肽釋放酶-7和類胰蛋白酶樣酶活性升高，所 以預計在表皮屏障削弱的皮膚狀況下這些酶甚至存在更高的活性。存在許多近來的研究，其將在SC中存在的蛋白酶與皮膚臨床病癥例如紅斑痤 疫禾口牛皮痛聯系起來(Borgono et al. ,2007 ；Yamasaki et al. ,2007 ；Pampalakis and Sotiropoulou,2007)。在這些情況中，所討論的蛋白酶是激肽釋放酶家族的胰蛋白酶樣絲 氨酸蛋白酶和胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶。蛋白酶在紅斑痤瘡中的作用可部分地基于宿 主先天免疫肽LL-37分解成促炎片段(Yamasaki et al，2007)。對于牛皮癬，對表層細胞脫 落負責的激肽釋放酶蛋白酶失去調控，并引起脫落增加，其導致脫皮，這發生于皮膚過度脫 落。這些狀況導致炎癥和其他的顯著的臨床癥狀。在亞臨床水平下，這些過程可導致皮膚 干燥、皮膚發紅、屏障功能破壞(導致皮膚水分損失)、細胞外基質破壞和過早的皮膚老化。 因此，應用能通過抑制皮膚蛋白酶減慢該過程的活性成分是明顯有價值的。肽活性成分用于美容和皮膚護理產品以提供能改善皮膚外觀、感覺和美學的生物 活性。這樣的生物活性肽也可用于治療學目的，例如在治療創傷或燒傷中。然而，如上所述， 皮膚傳遞(express)能降解蛋白質和肽的蛋白酶，因此阻止某些肽發揮它們的有益效果的能力。該SC定居蛋白酶的消極效果增加了關于炎癥和皮膚細胞周轉(turnover)的其消極 效果。這些問題被本發明的這樣的方面所克服，該方面部分涉及包含生物活性肽和蛋白酶 抑制劑的制劑。這樣的組合使皮膚護理制劑具有三個期望的特征(i)肽成分提供特異性 生物活性(例如抗炎、細胞刺激/增殖/遷移等)；(ii)蛋白酶抑制劑成分保護肽成分免于 降解，這導致延長的有益肽效果；和(iii)蛋白酶抑制劑成分減少蛋白酶對皮膚的一般消 極效果，例如發紅和脫皮。這持久的特征(iii)部分賦予對生物活性肽的保護，所述生物活 性肽對制劑應用部位是內源的；因此，蛋白酶抑制劑增加異位應用的肽和皮膚天然傳遞的 那些肽的活性。本發明在治療和美容制劑中提供增強肽活性的創新方法。這樣的肽功能增強通過 將目的肽與適當的蛋白酶抑制劑組合而獲得。不但蛋白酶抑制劑通過增加肽的半衰期來延 長治療活性，而且該抑制劑也防止從原來的皮膚蛋白質產生促炎片段。因此，這樣的肽和蛋 白酶抑制劑的組合提供具有三層水平效力的皮膚護理制劑。盡管每種成分一肽和蛋白酶 抑制劑一遞送其自己的有益效果，它們的組合協同使制劑比僅具有一種這些成分的制劑 更有效得多。本發明也提供顯著的成本效益。用于具有適當的蛋白酶抑制劑的組合的肽將顯示 更大的半衰期。因此，這樣的肽不必以當在不存在蛋白酶抑制劑情況下使用肽所需要的較 高水平供應。制備本發明的生物活性肽制劑的蛋白酶抑制劑的成本明顯小于生產實現制劑 的活性水平所必須的較高肽數量的成本。生物活性肽是本領域公知的；可并入在本發明的該方面那些生物活性肽的長度優 選小于200個氨基酸殘基，長度優選小于100個氨基酸殘基，長度優選小于50個氨基酸殘 基，長度優選小于45個氨基酸殘基，長度優選小于40個氨基酸殘基，長度優選小于35個氨 基酸殘基，長度優選小于30個氨基酸殘基，長度優選小于25個氨基酸殘基，長度優選小于 20個氨基酸殘基，長度優選小于15個氨基酸殘基，或長度優選小于10個氨基酸殘基。在本 發明中可以使用的其他生物活性肽的長度優選至少4、5、6、7、8或9個氨基酸殘基。可并入本發明的各種實施方式中的生物活性肽的非限定性實例是大量的，并且在 下列文獻中描述美國專利號6，255，282(參見其中的附圖3A/B和權利要求書)、美國專 利號6，303，568 (參見其中的表1)、美國專利號5，962，410 (參見其中的表1)、美國專利號 7，875，744 (參見其中的表1和權利要求書)、美國專利號7，407，940 (參見其中的表1和 權利要求書)、美國申請公開號20070299015 (申請系列號11/811，876)(參見其中的表1、 5和權利要求書)、申請系列號12/005，653 (參見其中的表1和權利要求書)，美國專利號 6，288，212 (參見其中的表1和單個權利要求)、美國專利號6，337，317 (參見其中權利要求 書)、美國專利號6，172，185 (參見其中的表1和權利要求書)和申請系列號61/000，815 (參 見其中的表1和權利要求書)；這些專利和申請的每一篇，特別是所指出的其部分通過參考 以其全部并入本文。在本申請公開的四肽(表1和SEQ ID NOs 14-15)也可并入本發明 的該方面。一種或更多種生物活性肽可用于本發明。盡管本發明主要涉及具有固有活性的 肽的結合，其可以或可以不依賴于肽位于的環境(即，肽僅僅當置于特定背景中時具有活 性)，不具有(或不知道具有)任何特定活性的肽也可用于本發明。可并入本發明的各種實施方式中的生物活性肽的其他非限定性實例在表2中列 出o
表2 目前市場可得的包括在皮膚護理產品中作為活性成分的某些肽a a用于本表的縮寫ACE，血管緊張肽I轉變酶；ECM，細胞外基質；HA，透明質酸； HGF，肝細胞生長因子；MMP，基質金屬蛋白酶；MSH，促黑激素；SNARE，可溶的NSF附著受體 (NSF，N-乙基馬來酰亞胺敏感因子)；TGF-0，轉化生長因于；TIMP，MMP的組織抑制齊[J。b M it ^ itL g :Atrium Biotechnologies (Quebec City, Canada), Grantlndustries(Elmwood, NJ) , Lipotec(Barcelona, Spain), Pentapharm(Basel, Switzerland), Procyte (Photomedix, Montgomeryvilie, PA), Sederma(LePerray en Yvelines, France)。研究目的
在結合生物活性肽的美容和治療皮膚護理產品中應用蛋白酶抑制劑以產生多種 益處方面還沒有被研究。因此，本發明目標是確定蛋白酶抑制劑是否可以保護合成的和固 有來源的生物活性肽免于蛋白水解的降解。這樣的蛋白酶抑制劑將為用于含有肽的皮膚護 理制劑的候選物。分析材料和方法下列蛋白酶抑制劑被鑒定在蛋白水解的條件下抑制生物活性肽分解的能力抑肽 酶(Sigma-Aldrich，St. Louis，M0)、氨甲環酸(Sigma-Aldrich)、過芐脒(Sigma-Aldrich)、 Fmoc-lys (Boc) (Chem-Impex，Chicago, IL)、Fmoc-arg (Pmc) (Chem-Impex)、苯甲酉先-arg-硝 基苯胺(Sigma-Aldrich)和苯甲酰-arg-萘酰胺(Sigma-Aldrich)。下列肽被用作代表性的皮膚護理生物活性成分肽和固有皮膚肽寡肽-10 (HB64) (P印tisyntha，Torrence，CA)，其為 FAKALKALLKALKAL-NH2(SEQ ID NO 17)的序列(參考美 國專利號 7，381，704)；六肽-21(HB 168) (Neo-MPS，San Diego, CA)，其為 FALLKL_NH2 (SEQ ID NO 18)的序列(參考美國專利號 7，381，704) ；HB1345 (Peptisyntha)，其為癸 酰-KFKWPW-NH2 (SEQ ID NO 19)(參考美國專利號 7，407，940)；禾口 LL-37 (LL⑶FFRKSKEKIG KEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES, SEQ ID NO 20)，其被 Johansson 等(1998)公開(通過引用以 其全部并入)。盡管HB64、HB168和HB1 345肽具有合成源，但是LL-37最初被限定為人細 胞固有表達的。下列蛋白酶用于實施本發明胰凝乳蛋白酶(Sigma-Aldrich)，其在酪氨酸、 色氨酸和苯丙氨酸的羧基末端切割氨基酸鏈；胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)，其在賴氨酸 和精氨酸的羧基末端切割氨基酸鏈，除了當其下一個氨基酸為脯氨酸時；彈性蛋白酶 (Sigma-Aldrich)，其為在小的、疏水氨基酸例如甘氨酸、丙氨酸和纈氨酸的羧基末端切割 氨基酸鏈的絲氨酸蛋白酶；激肽釋放酶(Sigma-Aldrich)，其為絲氨酸蛋白酶；纖維蛋白溶 酶(Sigma-Aldrich)，其為絲氨酸蛋白酶；和尿激酶，其為絲氨酸蛋白酶。測量肽降解的方法合成來源的肽和LL-37以在0. 5M MOPS pH 8. 5/0. 5M NaCl終緩沖液濃度中的 l-2mg/mL的濃度用于蛋白酶加工實驗中。蛋白酶以0. 020-0. 050mg/mL的濃度使用。實驗成對進行，一個用蛋白酶抑制劑和一個不用蛋白酶抑制劑。在從將蛋白酶加 入到肽的時刻(零時刻)大約1分鐘、1小時、4小時和24小時時間點，收集液相色譜/質 譜(LC/MS)波譜。使用開始于5%的乙腈并于25分鐘逐步上升到65%的乙腈的標準反相梯 度，收集LC/MS波譜。用XIC (extracted Ion Count)示蹤，監控肽親代離子，而用TIC (Total IonCount)示蹤觀察肽片段，如下所述。該研究中使用的蛋白酶最初溶于1M NaCl溶液中，而該肽溶于pH8. 5的1M M0PS 緩沖液中。將溶液平衡至37°C，然后以1 1的比率混合以開始每次實驗。也使用低緩沖 液濃度(0. 1M MOPS pH 8. 5和0. 2MNaCl)。對給定蛋白酶，在數個不同的濃度下(由低至高 從0. 02mg/mL到40mg/mL)檢測蛋白酶抑制劑。在該研究中使用的某些質譜過程在下面討論，用于描述表3 (下面)中的數據如何 產生和解釋的指導目的。在監控本發明的方法中使用質譜獲得三種不同的數據輸出A. TIC示蹤(Total Ion Count)，其是特定時間期間內通過柱/質譜儀的所有分子 量(所有分子)的讀出。
B. XIC示蹤(extracted Ion Count)，其是代表從TIC示蹤取出特定分子量的讀
出oC.質譜，其代表選自TIC或XIC示蹤的峰內的一定范圍的分子實體。因為這些過程是本領域已知的，所以下面的討論將限于描述在質譜實驗中觀察的 結果(即，數據沒有示出)。MM下列實例顯示上面描述的不同的質譜輸出可用于監控蛋白酶介導的合成肽(例 如HB64)和先天免疫肽(例如LL-37)的降解和其抑制。用于這些研究的質譜具有檢測極 限，在該檢測極限之下，分子的特異性分子量不能從TIC示蹤鑒定。在這些檢測下情況中， 假設檢測的肽完全地降解。獲得TIC示蹤以在23小時時間期間監視通過蛋白酶胰蛋白酶降解/消化寡 肽-10(HB64)。具體地說，肽降解通過LC/MS在零時刻、1小時和23小時測量。顯然TIC示 蹤中的母峰(parent peak)(代表全長的、未降解的肽)隨時間減少，并且各種分解產物的 峰隨時間強度增加。該胰蛋白酶-介導的蛋白質水解的初級消化產品是四肽ALLK(SEQ ID NO 21)。有趣地，TIC示蹤顯示在包括蛋白酶抑制劑抑肽酶的重復實驗中，保護親本肽抵抗 由蛋白酶降解。該結果與生物活性肽當與蛋白酶抑制劑組合應用于皮膚時，將保持其結構 并因此保持其功能一段較長的時間的預期相一致。因此，與僅含有相同濃度生物活性肽的 皮膚制劑相比，本發明更有效。同樣，即使選擇的生物活性肽由于長度和/或序列的原因而 沒有經歷蛋白水解的降解，包含蛋白酶抑制劑也將防止在制劑應用部位處天然表達的有益 肽的降解(即，有益的內源肽將被保護)。已經暴露于纖維蛋白溶酶僅僅1分鐘的肽LL-37的TIC示蹤足以使零時刻讀出。 在大約16分鐘保留時間檢測到完整LL-37肽的存在，其通過質譜讀出所證實；在899. 5、 1123. 4和1497.6amu(原子質量單位)的三個不同的峰分別代表同樣肽(LL-37)的不同的 電荷形式。在與纖維蛋白溶酶溫育1小時后，親本肽LL-37的分子量不可檢測，并且出現低保 留時間的TIC示蹤峰(11分鐘到13分鐘)。這些峰代表具有低至450的分子量的LL-37的 分解產物。檢測的LL-37的分解產物的精確序列基于在分子量上與該LL-37部分的精確匹 配被測定為RIVQR. IKDFLRNLVPRTES(SEQ ID NO :22)。觀測到三種不同電荷形式的SEQ ID NO :22，正如對全長LL-37所觀測的。重復利用LL-37和纖維蛋白溶酶的上述實驗，但是這次在反應中包括蛋白酶抑制 劑凝血酸。在1小時溫育期之后獲得該反應的TIC示蹤。在大約16. 5分鐘的保留時間時 獲得質譜。如在TIC示蹤和質譜兩者中都明顯的，LL-37的分解產物被產生；然而，重要地 是，完全的完整親本肽仍然可以以可感知的水平檢測為三個質譜峰，給出電荷差異。該結果 與使用不同肽/蛋白酶/抑制劑組合的上述分析的結果一致。因此，期望本發明的該方面 適用于生物活性肽和蛋白酶抑制劑的多種組合；該期望用在下面表3中的提出的證據進一 步確證。在另一個實驗中，在暴露于纖維蛋白溶酶4小時后，用TIC和XIC示蹤監控寡 肽-10(HB64)的降解。從該分析，顯然纖維蛋白溶酶靶向并降解HB64。XIC示蹤(在799. 5amu處)顯示盡管大多數HB64肽被降解，但是一些親本肽仍可以被檢測。當該反應包 括凝血酸時，通過TIC和XIC示蹤HB64肽保護纖維蛋白溶酶介導的蛋白質水解是明顯的。 事實上，與當肽與纖維蛋白溶酶單獨溫育時相比，通過XIC示蹤測定的反應中親本肽的量 為其5倍大。當考慮更寬范圍的蛋白酶、肽和蛋白酶抑制劑時，使用上述方法進行一系列的實 驗以測定本發明的實用性。來自該工作的數據總結在表3中。在任何具體時間點，如果沒 有可檢測的親本肽(即，不存在未降解的肽)，那么該時間點被記錄為肽降解需要的時間。表3 不同的蛋白酶抑制劑對不同的生物活性肽的保護效應 a所有肽以lmg/mL的終濃度使用。如在該實施例中所述，關于皮膚和肽分解的一些最重要的蛋白酶是纖維蛋白溶 酶、激肽釋放酶和尿激酶。本發明示出針對這些蛋白酶(例如表3)進行研究。重要地，檢測 的蛋白酶抑制劑具有優秀的安全性特征。例如，抑肽酶和凝血酸被用作凝血療法(clotting therapy)的全身性藥物，而熊果酸用作美容和草藥成分。本文的目的是鑒定能保護固有肽 和合成肽免于蛋白水解降解的試劑(或復數種試劑)；這樣的抑制劑可在皮膚護理產品中用于與生物活性肽組合。考慮到凝血酸對大量蛋白酶的抑制性作用、以及低制造成本、安全 性特征和溶解性，凝血酸是實踐本發明該方面的優選蛋白酶抑制劑。本文公幵和要求保護的所有組合物或方法可以制備或執行，而根據本公幵不需要 大量的實驗。盡管本發明的組合物和方法已經更具優選的實施方式進行描述，但是可對組 合物和/或方法以及在本文描述的方法中的步驟或步驟順序進行改變而沒有背離本發明 的原理、精神和范圍，這是對本領域技術人員顯而易見的。更具體地說，化學上和生理學上 都相關的某些試劑可以替代本文描述的試劑而達到相同或相似的結果，這是顯然地。對本 領域普通技術人員顯而易見的所有這類相似的替代和修改被認為在本發明的范圍內。在本申請鑒定的所有專利和申請通過引用以其全部并入本文。參考t獻Bernard D et al. (2003)，Analysis of proteins with caseinolytic activity in a human stratumcorneum extract revealed a yet unidentified cysteine protease and identified the co-called'7 stratum corneum thiol protease" as cathepsin L2， J. Invest. Dermatol. 120 :592_600.Borgono CA et al. (2007)，A potential role for multiple tissue kallikrein serine proteases inepidermal desquamation，J.Biol. Chem. 282 :3640_3652.Brattsand M and Egelrud T (1999), Purification，molecular cloning， and expression of a humanstraturn corneum trypsin-like serine protease with possible function in desquamation，J. Biol. Chem. 274 :30033_30040.Hansson L et al. (1994), Cloning, expression, and characterization of stratum corneumchymotryptic enzyme. A skin-specific human serine proteinase， J. Biol. Chem. 269 :19420_19426.Horikoshi T et al. (1998)， Isoforms of cathepsin D and human epidermal differentiation，Biochimie 80 :605_612.Johansson J et al. (1998),Conformation-dependent antibacterial activity of the naturallyoccurring human peptide LL-37, J.Biol. Chem. 273 :3718-3724.Pampalakis and Sotiropoulou(2007)， Tissue kallikrein proteolytic cascade pathways in normalphysiology and cancer，Biochim. Biophys. Acta.1776 22-31.Voegeli R et al. (2007),Profiling of serine protease activities in human stratum corneum anddetection of a stratum corneum tryptase-like enzyme, Int. J. Cosmet. Sci. 29 :191_200.Yamasaki K et al. (2007)， Increased serine protease activity and cathelicidin promotes skininflammation in rosacea, Nat. Med. 13 975~980.
權利要求
分離的肽，其中所述肽的氨基酸序列由脯氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸-X(P-Q-E-X)組成，其中X是賴氨酸(K)或異亮氨酸(I)。
2.權利要求1所述的肽，其中所述肽是酰胺化的、脂化的或與載體分子輟合的。
3.權利要求1所述的肽，其中所述肽在相鄰氨基酸殘基之間具有非肽鍵。
4.權利要求1所述的肽，其中所述肽具有D-對映體形式的氨基酸殘基。
5.權利要求1所述的肽，其中所述氨基酸序列由SEQID NO 14組成。
6.權利要求5所述的肽，其中所述肽是SEQID NO :1。
7.權利要求1所述的肽，其中所述氨基酸序列由SEQID N0:15組成。
8.權利要求7所述的肽，其中所述肽是SEQID NO :2。
9.組合物，其包含根據權利要求1所述的肽和藥學上可接受的載體。
10.權利要求9所述的組合物，其中所述肽以大約0.1 μ g/mL到大約50 μ g/mL范圍的 濃度存在。
11.權利要求9所述的組合物，其中所述組合物進一步包含蛋白酶抑制劑。
12.權利要求9所述的組合物，其中所述組合物為氣溶膠、乳劑、液體、洗液、霜劑、糊 齊U、膏劑、粉末或泡沫的形式。
13.權利要求9所述的組合物，其中所述肽是SEQID NO :1或SEQID NO :2。
14.治療哺乳動物中炎癥的方法，所述方法包括將治療有效量的權利要求9所述的組 合物施用到所述哺乳動物的炎癥部位持續足夠量的時間。
15.權利要求14所述的方法，其中所述炎癥位于所述哺乳動物的皮膚和相關粘膜組織中。
16.權利要求15所述的方法，其中所述炎癥位于皮膚中，并且由于暴露于紫外輻射。
17.權利要求16所述的方法，其中所述組合物的肽是SEQID NO 1或SEQ ID NO :2。
18.權利要求15所述的方法，其中所述炎癥部位是擦破、水泡、燒傷、劃破、潰瘍、撞傷、 皮疹或瘢痕。
19.權利要求14所述的方法，其中所述組合物的肽是SEQID NO :1或SEQ ID NO :2。
20.權利要求14所述的方法，其中所述治療有效量的組合物包含濃度范圍為大約 0. 1 μ g/mL 到大約 50 μ g/mL 的肽。
21.權利要求14所述的方法，其中所述組合物進一步包含蛋白酶抑制劑。
22.抑制細胞表達白細胞介素(IL)-6或基質金屬蛋白酶(MMP)-I的方法，所述方法包 括將所述細胞暴露于根據權利要求1所述的肽，其中所述細胞在暴露于所述肽之后顯示減 少的白細胞介素(IL)_6或基質金屬蛋白酶(MMP)-I的表達。
23.權利要求22所述的方法，其中所述細胞表達白細胞介素(IL)-6或基質金屬蛋白酶 (MMP)-I源自所述細胞暴露于紫外輻射。
24.權利要求22所述的方法，其中所述細胞是上皮細胞、角質形成細胞或成纖維細胞。
全文摘要
公開的本發明提供具有氨基酸序列脯氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸-X(P-Q-E-X)的四肽，其中X可以是賴氨酸(K)或異亮氨酸(I)。這些四肽抑制紫外光(UV)誘導的由皮膚上皮細胞和成纖維細胞表達促炎細胞因子白細胞介素-6(IL-6)。此外，四肽抑制通過直接暴露于紫外線或根據UV-處理的角質形成細胞調節的介質處理而誘導的成纖維細胞的基質金屬蛋白酶-1(MMP-1)的上調。四肽較小的尺寸和生物活性使它們適合于涉及炎性皮膚病癥的治療和用作皮膚護理產品中的活性成分。
文檔編號C07K5/10GK101855235SQ200880113774
公開日2010年10月6日 申請日期2008年10月28日 優先權日2007年10月29日
發明者L·張, S·M·哈里斯, T·J·法拉 申請人:赫里克斯生物醫療公司